一、酶促生物转化丙酮酸生产的研究（论文文献综述）
罗磊[1]（2021）在《级联法合成去甲基麻黄素的研究》文中进行了进一步梳理去甲基麻黄素（norephedrine/NE）是一种多功能应用的手性胺化合物,广泛应用于化工及医药等领域。其合成路线是有挑战性的,生物法合成NE具有反应条件温和、绿色高效及产物光学纯度高等优点,逐渐成为合成NE的热点,但目前报道的生物法合成NE方法较少,且具有底物载量低,效率低等劣势。本研究通过级联乙醛羟酸合成酶（AHAS I）催化缩合反应和胺脱氢酶（BbAmDH）催化还原胺化反应,以廉价底物苯甲醛、丙酮酸和NH4Cl为原料,构建了去甲基麻黄素的生物合成新途径。具体研究内容如下:（1）在麻黄碱脱氢酶（EDH）N端添加Mbp标签,实现了EDH的可溶性表达,然后成功克隆表达了用于合成去甲基麻黄素前体物质L-苯基乙酰基甲醇（L-Phenylacetylcarbinol/R-PAC）的3个酶,分别为丙酮酸脱羧酶（PDC）、乙醛羟酸合成酶（AHAS I）和麻黄碱脱氢酶（EDH）。通过比较PDC、AHAS I和EDH合成去甲基麻黄素前体物质R-PAC的效率,最终选择AHAS I合成去甲基麻黄素前体物质R-PAC。优化AHAS I催化缩醛反应合成R-PAC的反应条件,最终确定其最适合反应条件:40 mg·m L-1 E.coli BL21/p ET28a-AHAS I,30℃,p H 7,40 mmol·L-1苯甲醛。（2）通过以胺脱氢酶Gk Am DH序列为模板,在NCBI数据库中进行序列比对,发现一株对R-PAC有活力的胺脱氢酶BbAmDH,并引入突变位点N276C,使其对R-PAC活力由3.2 U/mg变为4.3 U/mg,然后测定了BbAmDH及其突变体的酶学性质。并优化了胺脱氢酶(BbAmDHN276C)以R-PAC为底物催化还原胺化反应合成去甲基麻黄素（NE）的反应条件。最终确定其最适合反应条件:40℃、p H 9.5和50 mg·m L-1 E.coli BL21/p ET28a-BbAmDHN276C。（3）以苯甲醛、丙酮酸和NH4Cl为原料分步法合成了去甲基麻黄素,苯甲醛转化率达到99%;NE的产率为83.7%。然后又在一锅法中合成了去甲基麻黄素,并优化了一锅法的反应条件,确定其最适合反应条件为40℃、p H 8.5和0.7 mol·L-1 NH4Cl,此时苯甲醛转化率达到83%;NE的产率为67.5%。（4）在一锅法中,R-PAC浓度始终维持在较低水平,可利用补料策略解决AHAS I的底产物抑制作用。利用流加底物苯甲醛的策略,发现随着反应时间延长,流加的苯甲醛逐渐积累,致使反应效率下降;然后利用同时流加底物苯甲醛和E.coli BL21/p ET28a-AHAS I细胞的策略,发现积累的苯甲醛很快被消耗,有效解除了AHAS I的底物和产物抑制作用,使得苯甲醛转化率从83%提高到90%,NE产率从67.5%提高到75%。相比分步法,反应12 h,苯甲醛批次反应浓度从40 mmol·L-1提高到100 mmol·L-1,NE的时空产率提高2.5倍。
阮小波[2]（2021）在《多酶级联转化L-酪氨酸生产酪醇的研究》文中认为酪醇（tyrosol）是一种具有药理活性的苯乙醇衍生物,是羟基酪醇和红景天苷等功能性化合物的前体,广泛应用于医药、化妆品和食品行业。传统的植物提取和化学合成存在提取收率低、反应条件苛刻以及纯化工艺复杂等缺点。生物酶转化法具有反应温和、转化率高、环境污染小等优点,是一种有潜力的酪醇生产方式。本研究通过模拟酿酒酵母Ehrlich pathway设计了一个级联途径,全细胞催化L-酪氨酸合成酪醇。确定多酶反应中的限速酶后,通过模块化组装以及对限速酶丙酮酸脱羧酶（PDC）重复表达,协调路径酶的表达水平,使L-氨基酸脱氨酶（LAAD）、丙酮酸脱羧酶（PDC）、乙醇脱氢酶（ADH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）具有良好的协同性。再将优化的重组菌结合树脂,通过原位产物分离进一步提高酪醇产量。主要研究内容如下:（1）设计和构建级联生产酪醇的路径。首先,基于Ehrlich pathway的转氨、脱羧和还原三步反应,引出脱氨-脱羧-还原,并为还原反应构建了辅因子再生系统;其次,筛选获得Proteus mirabilis来源的L-氨基酸脱氨酶（Pm LAAD）、Candida tropicails来源的丙酮酸脱羧酶（Ct PDC）、Saccharomyces cerevisiae来源的乙醇脱氢酶（Sc ADH6）和Bacillus megaterium来源的葡萄糖脱氢酶（Bm GDH）作为级联反应的路径酶;然后,体外级联催化反应检测到产物酪醇的生成,验证了该级联路径的可行性;最后,通过测定四酶的动力学参数,鉴定PDC为该级联反应的限速酶。（2）多酶级联路径的组装和优化。构建Pm LAAD、Ct PDC、Sc ADH6和Bm GDH的共表达菌株,全细胞转化验证体内级联反应的可行性。将四酶以双质粒共表达的方式构建了一系列共表达菌株,使用4种具有不同拷贝数的质粒调节四个酶的相对活性,平衡各酶的反应速率。比较12株菌株（E.coli 01-12）的酪醇合成能力,最佳酪醇合成菌株E.coli 07在提高底物浓度时出现中间产物对羟基苯丙酮酸（4-HPP）的积累,检测全细胞中LAAD与PDC的酶活比为1:0.8,体外实验表明,调节两酶的酶活比达到1:1.5,级联体系中各酶催化实现平衡;基于体外优化结果,利用基因重复表达策略提高PDC表达水平,获得E.coli 07-2菌株,酶活比例提高到1:1.5。以菌株E.coli 07-2进行发酵工艺优化和转化条件优化,30 g·L-1L-酪氨酸为底物时转化率为95.5%。此外,发现影响产量进一步提高的限制因素为产物抑制,产物浓度达到22 g·L-1能够完全抑制细胞的转化。（3）产物原位分离法提高酪醇产量。通过比较对产物酪醇和底物L-酪氨酸的吸附能力筛得树脂XAD4,该树脂对吸附酪醇有较高的特异性;其次,优化了树脂的添加量,其中10%（干重,w/v）的XAD4能够吸附17.5 g·L-1的酪醇;高浓度乙醇条件下能够有效解吸树脂上的酪醇,此外,解吸时长对酪醇的收率也存在影响,使用3倍体积量的无水乙醇两批次解吸8 h,收率为97.8%;接着,摇瓶转化考察了不同底物浓度对树脂吸附转化的影响。最终,使用E.coli 07-2结合树脂XAD4规模化制备酪醇,总产量32 h达到35.7 g·L-1,转化率为93.6%。
龚磊[3]（2020）在《化学—酶法催化生物质原料合成β-羟基-α-氨基酸的研究》文中研究表明羟醛缩合反应能够增长碳链,并且可以产生支链,在有机化学合成领域具有重要地位,其中β-羟基-α-氨基酸是一类可用于构筑多种生物活性天然产物和药物的重要合成砌块分子。本文针对苏氨酸醛缩酶对产物β-羟基-α-氨基酸Cβ位选择性不高、反应转化率低以及绿色可持续制造的应用等问题,通过对羟醛缩合反应的调控与优化以及建立以生物质为原料的化学-酶法生产工艺,实现了β-羟基-α-氨基酸的绿色高效合成。具体研究成果如下:（1）开发了基于2,4-二硝基苯肼（DNPH）的高通量筛选方法用于苏氨酸醛缩酶（TAs）羟醛缩合活力的测定。以对甲砜基苯甲醛（MSB）为模式底物,在λ=485 nm处有特征吸收峰。对该方法的专属性、线性范围、检测限、加标回收率、稳定性、准确度以及对反应体系的适用性进行了评估。以来自Alcaligenes xylosoxidans的D-苏氨酸醛缩酶（Ax DTA）为模板酶,利用新建立的DNPH法应用其定点饱和突变文库的高通量筛选,经过初筛和复筛获得了2个对MSB活力提高的突变体Ax DTAD321C和Ax DTAN101G,酶活力分别提高了1.5和1.3倍。利用该方法对Ax DTA及其突变体在羟醛缩合反应中的催化性能进行了高通量表征,对动力学参数、底物谱及反应进程进行了评价和分析。突变体Ax DTAD321C的kcat/Km值(0.84 s–1·m M–1)提高了58%。在对于脂肪醛、芳香醛和杂环醛等19种底物进行研究发现Ax DTA突变体对醛的接受范围比亲本更大。Ax DTAD321C和Ax DTAN101G催化MSB和甘氨酸的缩合反应的转化率比Ax DTA分别高13.9%和9.1%。因此,DNPH法在TAs的高通量筛选及羟醛缩合反应的表征中具有良好的应用前景。（2）通过基因挖掘技术和DNPH法筛选获得了酶活力和非对映体过量值（de值）较高的来自Achromobacter piechaudii的D-苏氨酸醛缩酶（Ap DTA）,对其最适p H、最适反应温度、最适p H和温度稳定性等酶学性质进行研究。结果显示Ap DTA裂解和缩合活力的最适p H都为8.0,Ap DTA缩合活力最适温度为30℃。当p H 6.0时,Ap DTA裂解活力稳定性最好,而p H 8.0时,缩合活力稳定性最好。Ap DTA在4–30℃范围内具有较好的热稳定性。磷酸吡哆醛（PLP）和Mn2+是Ap DTA所需的辅因子和金属离子,其最适添加量均为50μM。Ap DTA的Vmax值为40μmol·min–1·mg–1,Km值为30 m M,kcat值为27 s–1,kcat/Km值为0.9 m M–1·s–1。Ap DTA具有广泛的底物谱但对于体积较大和长链底物没有活力。在10℃,p H 6.0,加酶量为2 U和以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为助溶剂的条件下,对5 m M MSB底物进行缩合反应,获得最大产率和de值分别为60%和95%。当p H 7.0时,Ap DTA水相动力学拆分D,L-threo-对甲砜基苯丝氨酸（D,L-threo-MSPS）的转化率和对映选择性分别为45.2%和81%。当加入1,2-二氯乙烷和环己酮作为有机介质时,得到50%转化率以及对映选择性ee%>99%。（3）为了拓展β-羟基-α-氨基酸的合成应用以及实现其绿色可持续制造,以固体废弃物粉煤灰为载体,合成了一种新型固体酸催化剂SO42–/Sn O2-Al2O3-CFA,并对其进行了SEM、FTIR、XRD、BET、EDAX和NH3-TPD物理表征。当反应体系为20 g·L–1木糖水解液,2.0 wt%SO42–/Sn O2-Al2O3-CFA,甲苯为有机介质（1:1,v:v）,NH4Cl为助剂（100 m M）,在180℃下反应搅拌反应30 min后糠醛产率最高为84.7%,木糖转化率为93.5%。固体酸催化剂可循环使用5批次,糠醛产率没有显着降低。利用生物质糠醛的原位酶法转化生成呋喃丝氨酸（FLSE）,实现了化学-酶法的级联工艺,在p H 8.0,反应温度30℃,50μM PLP且不添加金属离子的条件下将50 m M糠醛完全转化。因此,该化学-酶多步反应有效实现了从生物质到高附加值化学品的转化,具有潜在的应用价值。（4）为了进一步提高生物质原料的利用率以及实现过程更经济环保,开发了新型磁性固体酸催化剂Fe3O4@MCM-41/SO42–用于玉米芯高效地制备糠醛,对该固体酸进行了SEM、FTIR、XRD、BET、EDAX、VSM和Py-IR表征分析。在100 g·L–1玉米芯,2 wt%Fe3O4@MCM-41/SO42–和180℃条件下,反应40 min后得到最高糠醛浓度为72m M;调节p H至8.0后直接加入固定化E.coli Pp LTA全细胞(相当于20 g·L–1湿细胞)制备手性FLSE,最终产率为73.6%,ee%>99%,de值为20%（threo）。该策略实现了中间物的分离最小化,减少了操作时间并提高了反应效率。固体酸预处理后的玉米芯酶解可得到葡萄糖浓度为45 g·L–1,是未处理的2.5倍,提高了酶解效率和原料利用率。固体酸和固定化全细胞催化剂可简单地从体系中分离,可重复再生使用5批次,具有良好的可重复利用性和稳定性。该化学-酶催化过程提供了从化石燃料转向生物质原料的可能性,可应用于呋喃衍生物的合成。
李国四[4]（2020）在《生物催化级联反应制备丙酮酸及L-酪氨酸衍生物》文中研究说明丙酮酸作为重要的原料和中间体,广泛应用于化工、医药、农业等领域。传统的酒石酸脱水脱羧法生产工艺操作简单,但存在污染严重、产率低、原料消耗大等问题,导致丙酮酸及其衍生产品价格较高。近年来,丙酮酸的生物法制造技术由于原料成本低、反应条件温和、产品安全可靠等优点,引起产业界的广泛关注。生物法包括糖质原料发酵法和乳酸的酶催化氧化法两类。由于细胞内与丙酮酸相关的代谢途径活跃,限制了丙酮酸发酵水平的提高,而且由于丙酮酸在水溶液中溶解度大,从成分复杂的发酵液中分离丙酮酸成本较高,发酵法生产丙酮酸一直难以大规模工业化。以短链L-2-羟基酸氧化酶为基础的生物催化法由于无需添加昂贵的辅酶、催化体系简单且产品分离纯化方便,具有较好的工业应用前景。但是,催化的过程中产生的副产物过氧化氢容易将丙酮酸氧化成乙酸和二氧化碳,导致产率的降低。光学纯L-酪氨酸及其衍生物常被用于合成一些重要的药物,例如帕金森药L-多巴和抗肿瘤药物沙弗拉霉素A等。化学从头合成酪氨酸衍生物需要多个步骤,最终产物也是外消旋体,需要进行后期的拆分。酪氨酸酚裂解酶可直接催化丙酮酸、苯酚衍生物和氨生成L-酪氨酸衍生物,是一种极具前景的L-酪氨酸衍生物绿色合成途径。但是由于供体底物丙酮酸成本较高且不稳定,该方法和化学法相比竞争性仍不显着。生物催化级联反应因为具有克服中间产物的毒性和不稳定性、降低中间底物和产物分离纯化成本以及提高催化效率等优点,已经被广泛应用于高附加值化学品的合成。针对上述问题,本论文开发了两种催化级联反应体系:1)将短链L-2-羟基酸氧化酶催化的乳酸氧化脱氢反应和过氧化氢酶催化的过氧化氢分解反应相偶联,构建了能够将廉价的生物基原料L-乳酸氧化成丙酮酸的大肠杆菌全细胞催化剂。2)将上述体系进一步与酪氨酸酚裂解酶催化的C-C耦合反应相偶联,构建了一种包含L-2-羟基酸氧化酶、过氧化氢酶以及酪氨酸酚裂解酶的三酶级联反应体系,以L-乳酸和苯酚衍生物为出发底物,一锅法制备L-酪氨酸衍生物。首先,通过文献调研以及基因挖掘克隆了6种短链L-2-羟基酸氧化酶以及10种单功能过氧化氢酶,并分别从中筛选出催化活力高且稳定性好的来源于Aerococcus viridans 的乳酸氧化酶 AvLOX 以及来源于 Ureibacillus thermospAhaericus的过氧化氢酶UtCAT。其中,AvLOX在大肠杆菌中表达时包涵体比例较高,为了提高酶活,采用降低表达温度和诱导剂浓度、RBS序列定向进化和共表达分子伴侣的策略增强其可溶性表达。通过降低表达温度和诱导剂浓度,可溶性提高了3.4倍,酶活提高了48.9%;通过对RBS序列定向进化,成功获得了有利于AvLOX可溶性表达的RBS突变序列GGGGGC,携有该突变序列的重组菌E coli-pET28a-T7rbsAvLOX中目标酶的可溶性提高了 1.7倍,酶活提高了62.7%;在此基础上,进一步共表达分子伴侣GroES-GroEL,可溶性提高了 1.8倍,酶活提高了43.1%,最终AvLOX可溶性由8.5%提高到89.2%,酶活由4.5 U/mL提高到15.6 U/mL。然后,采用UtCAT与AvLOX粗酶液构建了胞外的双酶级联反应体系,确定了 UtCAT与AvLOX的酶活最优配比为300:1,以500 mM L-乳酸为底物收率能够达到92.3%,是不添加过氧化氢酶时（7.3%）时的12.6倍。为了简化工艺、提高偶联效率和降低成本,将AvLOX与UtCAT在E.coli BL21（DE3）内进行共表达,以pET28a-T7rbsAvLOX为质粒骨架构建了胞内双酶级联的全细胞催化剂。采用三种不同的单质粒共表达策略,其中共表达菌株五.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT双酶表达效果最好。为了进一步提高过氧化氢酶酶活,利用RBS计算软件对UtCAT基因前的RBS序列进行重新设计,获得了翻译起始速率显着增强的序列RBS3,可使UtCAT酶活提高了 1.8倍,最终共表达菌株E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbsUtCAT 中 UtCAT 和 AvLOX 的酶活分别达到4127.3 U/mL 和 12.6 U/ml（酶活比 328:1）。对 E.coli-pET-28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT的催化工艺进行了优化,获得的最佳的工艺条件为:反应温度37℃C,体系pH7.0,菌体添加量20 g/L以及0.7 Mpa氧气压力,其中氧气浓度是L-乳酸氧化反应的限制因素。在该条件下,500mML-乳酸仅需要1.5h即可被转化,收率达到92.2%。同时,考虑到维持氧气压力对设备有一定要求,在常压条件下建立了底物分批补料催化工艺,在L-乳酸总浓度为600 mM的反应中丙酮酸收率能够达到90.8%。然后,表达了来源于Symbiobacterium toebii的热稳定型酪氨酸酚裂解酶（Thermophilic tyrosine-phenol lyase,TTPL）并分析了 底物谱,发现 TTPL 可以催化苯酚、以及邻位时OH和F的2-羟基苯酚和2-氟-苯酚,但是将邻位取代基换成Cl、Br、CH3以及OCH3后TTPL就丧失了对底物的催化能力。为增强TTPL对不同底物的适应性,对其进行理性设计改造。基于同源建模与分子对接模拟分析,通过定点突变将TTPL中对底物特异性起决定作用的口袋进行扩大,构建了10个突变株,从中成功筛选出3个对2-甲基苯酚有较高催化活力的突变株F37V、T126S和M380V。底物特异性研究表明,突变株F37V和M380V表现出更宽的底物谱以及不错的催化活力。最后,以2-氟-苯酚为模式底物,构建了基于AvLOX、UtCAT以及TTPL M380V的三酶级联反应体系,其最佳的工艺条件为:反应温度40℃,体系pH 8.0,E.coli-pET28a-T7rbsAvLOX-rbs3UtCAT 与E.coli-pET28a-TTPLM380V 菌体添加比为1:2,湿菌添加总量为25g/L,底物浓度为46mM,该条件下3-氟-L-酪氨酸的收率由83.1%提高到97.1%,ee值>99%。以此为基础,通过改变热稳定性酪氨酸酚裂解酶突变子种类,还可以催化合成5种其它L-酪氨酸衍生物,收率达到81.1-96.3%,ee值均大于99%。采用底物流加补料催化工艺,在0.5 L规模反应中,上述反应的底物酚转化率分别达到77.4～94.3%,产物浓度达到48.0～60.4g/L,成功解决了底物抑制、催化剂不稳定和收率低等问题,展示出良好的工业应用前景。
孙小雯[5]（2020）在《基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化》文中提出维生素K2是一类侧链长度不同的异戊烯基化甲萘醌产品的总称,属于衍生脂质。其中四烯甲萘醌（MK-4）在促进凝血和防治骨质疏松症方面具有良好的效果,在临床上具有较高的应用价值。大肠杆菌和毕赤酵母作为两种成熟高效的蛋白表达系统,已被成功地应用于多种异源蛋白的表达。本课题组已经在大肠杆菌中成功实现了 MK-1从无到有的生物合成,而侧链长度更长的MK-4的生物制造将是我们下一步要实现的目标。毕赤酵母表达系统具有繁殖迅速、易于高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后加工修饰,易获得可溶性活性重组蛋白等优点,尽管在毕赤酵母中尚未发现甲萘醌的生物合成途径,但这也可以在一定程度上避免复杂的分支途径和反馈调节机制对重构路径造成的不利影响。因此,为实现MK-4的高效生物制备,本研究运用合成生物学理念,基于多维度的信息整合,将高效的酶和生物合成途径整合到大肠杆菌和毕赤酵母底盘细胞中,构建以廉价的VK1或VK3为原料的MK-4高效生物制备的细胞工厂,并通过分析其优缺点以确定最佳的表达系统。研究工作有效拓展了 VK2生物合成的底盘细胞种类,为VK2等异戊烯基化产品的生物合成途径构建与优化提供了新的思路,具有重要的理论和应用价值。论文首先从物质和能量代谢角度出发在E.coli中重构MK-4代谢途径,通过MBP促溶标签实现古细菌来源的SaGGPPS催化的由IPP直接到GGPP的生物合成,在此基础上通过敲除pgi基因,调控EMP、PPP和EDP三条葡萄糖分解代谢途径的分配,强化胞内还原力NADPH的合成,使重组菌株胞内的MK-4含量达到0.78 mg/L。由于其合成能力未达预期,同时考虑到菌株稳定性和生物安全性等问题,将在毕赤酵母中开展后续的研究工作。通过对KEGG等数据库信息的整合,利用生物合成途径设计软件BioSynther,以VK3和IPP作为底物对MK-4的生物合成途径进行理性设计,并确定催化萘醌骨架与异戊烯基侧链聚合反应的关键酶HsUBIAD1。为了制定更好的蛋白表达策略,对该蛋白的理化性质、结构以及催化活性中心等进行了相关的生物信息学分析。利用生物信息学分析的结果,构建产HsUBIAD1蛋白的重组毕赤酵母,并结合多重筛选机制,获得高产重组毕赤酵母菌株GGU-23。然后在250 mL的摇瓶水平上,对筛选出的高产菌株GGU-23的基本发酵过程参数进行优化,并确定了24℃,初始pH 7.0,培养36h的摇瓶发酵工艺,优化后的GGU-23菌株的生物量达到31.0 g/L,较优化前提高了 6.9%,蛋白表达量提高了 4.8倍。为了表征HsUBIAD1的酶学性质,利用Ni-NTA亲和层析柱和重力型去盐柱从重组GGU-23菌株中获得纯化的HsUBIAD1蛋白,并进行初步的动力学分析,确定了体外的最佳酶促反应体系和条件:初始pH 7.0,31℃,当Mg2+参与的条件下,HsUBIAD1蛋白催化底物VK3异戊烯基化反应的活性最高,较优化前提高了 2.1倍,原因是Mg2+通过与蛋白的活性中心的关键氨基酸发生相互作用,改变其内部构象,使异戊烯基侧链与活性中心氨基酸残基的结合能力增强,进而促进酶促反应的进行。在GGU-23菌株全细胞催化的研究中,发现其具有催化外源VK1和VK3异戊烯基化反应合成MK-4的能力,当以VK3作为全细胞催化体系的底物时,胞内MK-4的含量达到2.03 mg/L,实现了初代重组毕赤酵母菌株从无到有合成MK-4的突破。为了获得新一代的细胞工厂,需要对初代细胞工厂的细胞性能进行优化,提高其MK-4的合成能力。通过构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体,将外源侧链合成途径的关键酶SaGGPPS整合到产MK-4的初代毕赤酵母细胞中,强化侧链合成前体GGPP的供给,使全细胞催化体系中MK-4的含量提高了 62.1%;再通过融合表达策略,将SaGGPPS与其上游的PpIDI蛋白进行融合表达,侧链合成途径得到了进一步的优化,MK-4的含量达到5.86 mg/L,较之前又提高了78.1%。实现了毕赤酵母菌株（GGU-GrIG）目标产物合成性能从低到高的优化。为了进一步挖掘优化后的毕赤酵母细胞工厂的应用潜力,继续对工程菌GGU-GrIG合成MK-4的全细胞催化工艺进行优化,摸索出最合适的工艺参数,即在30℃,250 rpm的条件下,从催化反应开始起每间隔6 h,向催化体系中添加40 mg/L VK3溶液,连续培养18 h最有利于MK-4的生物合成。工程菌经过优化,MK-4产量达到7.55 mg/L,较优化前提高了 28.8%,表现出良好的稳定性和应用潜力。
侯正杰[6]（2020）在《大肠杆菌N-乙酰神经氨酸合成途径的构建与优化》文中研究说明N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）是一种重要的功能性糖衍生物,因其独特的生理和生化性质,受到人们越来越多的关注,在食品和医药领域具有广泛的应用前景。为满足市场需求,迫切需要经济、高效的N-乙酰神经氨酸生产工艺。微生物发酵法具有可持续、低环境污染、低能源消耗和排放等优点,对工程菌进行合理的改造可以实现经济上的可行性以及高产量、高转化率和高生产强度的生物转化过程。本研究在实验室已构建的N-乙酰葡萄糖胺生产菌E.coli GLA-0基础上,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行N-乙酰神经氨酸合成途径的构建与优化,实现N-乙酰神经氨酸的高效微生物合成。（1）过表达去磷酸化酶基因yqaB,使出发菌的N-乙酰葡萄糖胺产量在摇瓶水平进一步提升了 13.92%。在此基础上敲除了nanATEK基因,阻断了 N-乙酰神经氨酸的分解途径。随后,对Neu5Ac合成途径关键酶N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶（AGE）的来源进行了筛选,比较了项圈藻来源的PT7-bA GE和集胞藻来源的PT7-slr1975的催化效果,根据摇瓶发酵结果确定项圈藻来源的PT7-bAGE优于集胞藻来源。最后,通过引入脑膜炎奈瑟菌的N-乙酰神经氨酸合成酶基因PT7-neuB,打通了 Neu5Ac的合成途径,获得的工程菌NEA-4摇瓶发酵Neu5Ac产量为3.2 g/L。（2）对Neu5Ac合成途径的两个关键酶AGE和NeuB进行了基因表达的优化,发酵结果显示PT7-bA GE与PT7-neuB的拷贝数分别为1、2时,NEA-6菌株的Neu5Ac产量最高,达到4.24 g/L。在此基础上,引入脑膜炎奈瑟菌的UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶来增加ManNAc的供应。摇瓶发酵结果显示,UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶的引入增加了 GlcNAc和ManNAc的积累,但Neu5Ac的积累量并没有提升,表明ManNAc的供应水平不是限制NEA-6菌株Neu5Ac产量进一步提升的因素。（3）在NEA-6菌株基础上进一步通过改造增强前体物PEP的供应。消除葡萄糖特异性PTS系统并引入运动发酵假单胞菌的葡萄糖易化蛋白Glf,Neu5Ac积累量为5.31 g/L,较NEA-6提高25.23%,DCW下降13.34%,单位细胞产量提高了 44.6%;过表达磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因pps,Neu5Ac积累量为5.89 g/L,较NEA-6提高39.15%,DCW下降了 31%,单位细胞产量提高了 99.8%;敲除丙酮酸激酶Ⅰ基因pykF,同时过表达PEP羧激酶基因pck,Neu5Ac积累量为5.24 g/L,较NEA-6提高23.58%,DCW下降了 26.24%,单位细胞产量提高了 67.7%。（4）通过敲除蛋白质乙酰转移酶基因patZ同时过表达乙酰辅酶A合成酶基因acs以期望达到减弱乙酸积累的目的,同时产生的乙酰辅酶A来供应合成GlcNAc的乙酰化反应以及TCA循环,促进前体物的合成以及细胞生长。摇瓶发酵结果表明△patZ::Ptrc-acs减少了发酵液中乙酸的积累,但是并没有对生物量的提升以及Neu5Ac的积累产生正向影响。本研究通过对N-乙酰葡萄糖胺生产菌进行合理的改造,最终获得一株以葡萄糖为底物高效合成N-乙酰神经氨酸的大肠杆菌工程菌E.coli NEA-10;以葡萄糖为单一碳源,经摇瓶补料分批发酵最终发酵液中N-乙酰神经氨酸积累量达到5.89 g/L,单位菌体产率可达到0.5 g/g DCW。
鹿承建[7]（2020）在《重组毕赤酵母全细胞转化L-乳酸合成丙酮酸钠的工艺研究》文中研究表明丙酮酸是生物体系中重要的有机小分子物质,是细胞进行氧化功能过程中起关键作用的中间产物,在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用,广泛应用于医药化工、食品工业、农用化学品和日用工业品等行业,对其商业需求不断增长。目前工业生产丙酮酸主要采用化学合成法和发酵法,但由于化学合成法和发酵法存在转化率低、副产物多、不易分离提取等问题,限制了丙酮酸的工业化生产。因此,开发新型全细胞转化法生产丙酮酸钠的工艺,实现产业化生产,具有重要的经济和社会意义。本课题以高产乙醇酸氧化酶的重组毕赤酵母GS115-GO为出发菌株,在5L发酵罐发酵过程中通过对接种量、p H、培养温度、甲醇诱导时间、甲醇浓度、甲醇开始诱导时间等工艺进行优化,提高重组毕赤酵母GS115-GO发酵液的菌体浓度和乙醇酸氧化酶的活力。在接种量15%、p H控制在4.5-5.0、发酵温度30℃、培养25h进行0.3-1.5g/L浓度的甲醇诱导,诱导30h条件下,重组毕赤酵母GS115-GO在5L发酵罐上发酵60h菌体湿重达到241.47g/L,提高了33.8%,乙醇酸氧化酶的活力可达8.9U/g,提高了59.3%。为了进一步研究该菌株的工业化应用价值,我们对重组毕赤酵母GS115-GO种子罐培养基进行优化、种子扩大培养和多级发酵工艺验证,再按照溶氧一致性原则,进行5T发酵罐重组毕赤酵母GS115-GO中试放大发酵60h,重组毕赤酵母GS115-GO的最大菌体湿重可达273.83g/L,比5L发酵水平提高13.4%,乙醇酸氧化酶活力为9.16U/g,比5L发酵水平提高2.92%。在重组毕赤酵母GS115-GO转化L-乳酸制备丙酮酸钠的过程中,首先对重组毕赤酵母GS115-GO的细胞透性化处理工艺进行优化,提高细胞的转化效率。最佳透性化处理工艺采用0.06%的苯扎氯铵处理60min。在此基础上对转化体系的底物L-乳酸浓度、细胞浓度、p H、转化温度等转化条件进行优化提高丙酮酸钠产率和L-乳酸转化率。在底物L-乳酸浓度为90g/L、重组毕赤酵母细胞浓度80g/L、p H值7.5-8.0,转化温度15℃条件下,丙酮酸钠的浓度达187.9g/L,L-乳酸转化率达91.15%,反应速率达到2.93g/L/h。针对全细胞生物催化法副产物少、分离纯化简单以及丙酮酸离子不稳定的特点,建立丙酮酸钠的提取纯化工艺,并对提取过程中脱色工艺、浓缩冷却结晶工艺和醇结晶工艺进行优化,制备的丙酮酸钠晶体,含量达99.8%,纯度达99.7%,收率达72%。本课题采用全细胞生物催化制备丙酮酸钠,副产物少,转化率高,对环境的污染小,符合绿色发展的观念。采用醇结晶的方式来提取纯化丙酮酸钠,工艺操作简单,节约生产成本。同时为丙酮酸钠的工业化应用奠定了基础,进一步满足国内外市场对丙酮酸钠产品的需求。
潘多涛[8]（2019）在《克雷伯氏杆菌发酵甘油生产1，3-丙二醇过程的代谢分析与优化》文中提出生物经济的蓬勃发展对以生产生物质化学品为代表的生物炼制提出了更高的要求。1,3-丙二醇（1,3-PD）是重要的化工原料,广泛应用于各个行业。近30年来,生物法发酵甘油生产1,3-PD备受人们关注,其具有绿色环保、可再生及废弃物资源化等优势,但相比于传统的化学生产方法,仍不具有成本优势,目前亟待解决的问题是甘油转化率和生产强度仍然不理想。本文针对克雷伯氏杆菌发酵甘油生产1,3-PD的过程,通过数学建模分析对其代谢过程进行了深入研究,预测发酵过程的动态行为,并提出优化控制策略,主要的研究内容如下:首先,将基因组尺度的通量平衡分析与胞外代谢物的动力学模型结合,构建了基于动态通量平衡分析的优化方法。经过计算分析获得了拓展的代谢途径,几个新增的重要节点包括:在二羟基丙酮（DHA）节点引入了能为系统提供更多还原当量的磷酸戊糖途径（PPP）;在3-磷酸甘油酸（3PG）节点存在合成氨基酸的支路;在三羧酸循环（TCA）中的α-酮戊二酸节点引入谷氨酸以及其他氨基酸的合成代谢途径,构建了更完整的通路。在此基础上,重点分析了代谢途径中关键节点支路的动态通量分布与1,3-PD产率的关系:DHA进入磷酸戊糖途径的动态通量变化与1,3-PD产率呈正相关;TCA循环途径中通量变化与产率成正相关。此外,发现TCA循环通过α-酮戊二酸和半胱氨酸与其他代谢途径形成复杂的耦合关系,与1,3-PD的产率构成相关性;氨基酸合成代谢途径中,辅酶四氢叶酸构成的反馈循环会对TCA的通量变化产生干扰。其次,利用整体建模方法克服发酵过程模型的不确定性,提高了模型的预测性能。通过灵敏度分析,确定对模型影响较大的参数作为整体建模的调节参数;经过对比选定适合的模型误差阈值,在可适范围内利用均匀采样方法生成尽可能多的等效参数集合,在并行计算的基础上开展整体建模的应用。结果显示,在连续发酵过程中,整体建模的预测值与实验测量值的平均相对误差由原来的11.90%降低为7.95%,显着优于常规单参数模拟结果,表明该方法能够有效提高模型预测能力。此外,分别确定了最优生产强度和产率以及对应的操作条件:在间歇过程中,最大生产强度为37.45 mmol·L-1·h-1、产率为0.70 mol·mol-1,对应的初始甘油浓度分别是1020 mmol·L-1和1070 mmol·L-1;在连续过程中,最大生产强度为93.94 mmol·L-1·h-1,对应的最佳操作条件是初始甘油浓度为780 mmol·L-1、稀释速率为0.23 h-1,而最优产率为0.68 mol·mol-1,对应的初始甘油浓度为880 mmol·L-1、稀释速率为 0.09 h-1。最后,通过数学函数连续性分析深入研究了单罐、双罐连续发酵的多稳态及振荡特性。在不同的初始甘油浓度或稀释速率下,系统均会出现多稳态现象,并通过双因素分析,得到多稳态出现的临界区域,该区域内部的稳态是不稳定的。之后,采用数学规划方法对双罐发酵过程中的两级稀释速率及初始甘油浓度进行了优化,得到了最佳操作条件:初始甘油浓度为900 mmol·L-1,#1反应器的稀释速率为0.21 h-1,#2反应器的稀释速率为1.37 h-1。此外,基于反馈控制理论,设计优化了受残余甘油和产物1,3-PD浓度影响的稀释速率控制策略,可作为实践中连续培养的进料方案。控制稀释速率可提高产物浓度,同时极大地缩短了系统达到稳定所需的时间。在单罐和双罐发酵过程中,调整时间分别从77.82/53.66 h缩短到31.24/22.68 h,可显着降低发酵初期阶段甘油的损耗,同时提高了生产强度。综上所述,通过数学模拟对克雷伯氏杆菌的甘油代谢途径的深入分析,克服了模型的不确定性,提高了模型的预测能力,优化控制发酵过程,这些工作为提高1,3-PD的发酵生产性能提供了理论指导,具有潜在的实践应用价值。
高凤[9]（2019）在《海栖热袍菌乙酰羟酸合酶活性检测新方法的建立及其催化反应的研究》文中指出乙酰羟酸合酶（Acetohydroxyacid synthase,AHAS,EC 4.1.3.18）是典型的硫胺素焦磷酸（Thiamine pyrophosphate,ThPP）依赖酶,它是催化生物体内异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸这三种支链氨基酸（Branched chain amino acids,BCAAs）生物合成的第一步反应的限速酶。这三种支链氨基酸均属必需氨基酸,细菌、真菌、植物等可自行合成,而动物及人自身无法完成它们的合成,必须通过食物获取。因此,乙酰羟酸合酶可作为抗菌素、除草剂等的有效筛选靶标。目前对于嗜极微生物AHAS的研究比较少。我们实验室保存的重组大肠杆菌中的外源AHAS基因来源于极端嗜热菌的模式生物--海栖热袍菌（Thermotoga maritima）,它的最适生长温度为80℃。这种出自海洋极端环境的极端嗜热菌,从它细胞内分离出的酶具有超常的生物学稳定性,可以在极端温度、pH值、压力和离子强度下表现出生物学活性,因此极端嗜热酶为生物催化和生物转化提供了更多的可能性。本课题主要包括两方面内容的研究:第一,建立了新的AHAS活性检测方法。我们用柱前衍生-HPLC法通过使用4-硝基邻苯二胺（4-Nitro-o-phenylenediamine,NPDA）和2,4-二硝基苯肼（2,4-Dinitrophenylhydrazine,DNPH）这两种已经比较成熟的衍生化试剂来分别衍生化和检测AHAS催化反应体系中的底物（α-酮酸类化合物）和产物（包括?-乙酰基-?-羟基羧酸类化合物、邻二酮类化合物、偶姻类化合物和醛类化合物等）,并通过量化反应过程中底物的消耗及产物的形成来计算酶的活性。相较于已有的比色法和气相色谱检测法,新建立的方法不但可以同时检测底物的剩余量和各种产物的生成量,使得反应体系中的化合物的组成更加明晰、准确之外,还克服了比色法无法同时准确检测双底物反应及气相色谱法操作繁琐且无法排除检测中的干扰问题等缺点。第二,通过利用上述方法并结合LC-MS测定发现,对于AHAS的两个天然底物丙酮酸和α-丁酮酸,除了常见的以丙酮酸为供体底物,丙酮酸或α-丁酮酸为受体底物进行催化反应这个众所公知的模式之外,海栖热袍菌AHAS（TmAHAS）还可以同时以α-丁酮酸为供体底物,丙酮酸或α-丁酮酸为受体底物进行酶促反应,这种反应模式导致该酶催化反应的产物构成非常复杂,除了主产物乙酰乳酸（或称α-乙酰基-α-羟基丙酸,AL）及α-乙酰基-α-羟基丁酸（AHB）外,还包括若干副产物。通过对AHAS催化反应的深入分析及查阅文献,再结合所建立的柱前衍生-HPLC法与LC-MS测定,成功确定了除了上述两种主产物以外的九种副产物,它们分别是两种醛类化合物乙醛和丙醛,三种邻二酮类化合物2,3-丁二酮、2,3-戊二酮和3,4-己二酮,以及四种偶姻类化合物乙偶姻（或称3-羟基-2-丁酮）、3-羟基-2-戊酮、2-羟基-3-戊酮和4-羟基-3-己酮。在本研究中,我们首先建立并评价了AHAS酶活性新的检测方法;其次,利用所建立的方法并结合LC-MS测定,系统地分析了TmAHAS催化的反应中底物的消耗及产物的形成及分布,在此基础上还探讨了TmAHAS催化反应的过程以及各产物形成的路径,这些实验结果都为进一步深入研究TmAHAS的催化机理及进一步拓宽其在不对称有机合成反应中的应用打下了坚实的基础。
汪磊[10]（2019）在《Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1菌株中2-溴硝基苯的代谢机理与相关应用研究》文中指出卤代硝基苯是一类具有广泛应用的重要化工生产中间体,同时它也是一种有毒物质,工业生产中的大量使用,造成含卤代硝基苯的工业污水排放日益增加,并在环境中积累,对生态和人类健康构成了严重威胁。目前已有较多关于氯代硝基苯生物降解研究报道,但溴代硝基苯的生物降解却尚未涉及。本研究发现2-氯硝基苯（2-chloronitrobenzene,2CNB）降解菌株Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1,能利用2-溴硝基苯（2-bromonitrobenzene,2BNB）为唯一碳源、氮源和能源生长,并对其代谢途径中的两个关键酶进行了研究:采用生物转化法验证了2BNB代谢过程中的第一个关键酶硝基芳烃双加氧酶（CnbAaAbAcAd）的功能,其能催化2BNB生成3-溴邻苯二酚,并释放出亚硝酸根;通过酶活测定证明了邻苯二酚1,2-双加氧酶是2BNB降解过程中的第二个关键酶,该酶由cnbC基因编码,可以将3-溴邻苯二酚开环转变为2-溴粘糠酸,同时对3-溴邻苯二酚、3-氯邻苯二酚、邻苯二酚以及3-甲基邻苯二酚都有较高的活性,表明其具有广泛的底物适应性。在研究2BNB降解过程中得到了中间代谢产物2-溴粘糠酸。粘糠酸是一种重要的化工中间原料,而卤族元素的加入会影响其理化性质,因此卤代粘糠酸具有潜在的工业应用前景,然而2-溴粘糠酸目前尚无生物法生产的报道。本研究利用邻苯二酚1,2-双加氧酶催化3-溴邻苯二酚生成2-溴粘糠酸,利用高效液相色谱从酶促反应液中分离纯化2-溴粘糠酸,并通过液相色谱-质谱联用与核磁共振验证了其正确性。P.stutzeri ZWLR2-1菌株中的硝基芳烃双加氧酶可以催化2BNB和2CNB生成相应的邻苯二酚,但是对3,4-二氯硝基苯（3,4-dichloronitrobenzene,34DCNB）却没有催化活性。研究表明硝基芳烃双加氧酶系的α亚基在氨基酸序列上具有很高的相似性,少数氨基酸序列的改变可能会影响其底物谱和催化活性。因此本研究通过对P.stutzeri ZWLR2-1菌株中的硝基芳烃双加氧酶α亚基中的4个氨基酸进行改变（204位的异亮氨酸变为亮氨酸;251位甲硫氨酸变为丝氨酸;258位天冬氨酸变为缬氨酸;350位缬氨酸变为苏氨酸）以期待改变此酶的催化活性,使其具备催化34DCNB的能力。结果发现突变后的双加氧酶对硝基芳烃化合物的催化活性会减弱,有的甚至丧失活性,但依然没有催化34DCNB的能力。本研究首次阐述了2BNB的生物降解途径,P.stutzeri ZWLR2-1菌株在代谢2CNB的同时还能降解2BNB,为溴代硝基苯的生物降解研究提供新思路;同时还首次报道了2-溴粘糠酸的制备纯化过程,为以后工业利用生物酶制备2-溴粘糠酸提供一种可行的理论依据。
二、酶促生物转化丙酮酸生产的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、酶促生物转化丙酮酸生产的研究（论文提纲范文）
（1）级联法合成去甲基麻黄素的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 去甲基麻黄素的概述 |
| 1.2 去甲基麻黄素的合成方法 |
| 1.2.1 抽提法 |
| 1.2.2 化学合成法 |
| 1.2.3 化学酶法 |
| 1.2.4 生物酶法 |
| 1.3 合成PAC的酶来源 |
| 1.4 以PAC为底物合成NE的酶来源 |
| 1.5 一锅法 |
| 1.6 论文的立题意义、主要研究内容 |
| 1.6.1 立题意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.1.5 培养基和溶液 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.2.1 酶活力测定方法 |
| 2.2.2 底产物检测方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 乙醛羟酸合成酶的克隆表达与构建 |
| 2.3.2 麻黄碱脱氢酶的克隆表达与构建 |
| 2.3.3 PDC、AHAS I和 EDH的诱导表达 |
| 2.3.4 R-PAC的生物转化 |
| 2.3.5 胺脱氢酶突变体的克隆表达与构建 |
| 2.3.6 BbAmDH及其突变体的诱导表达 |
| 2.3.7 BbAmDH及其突变体的分离纯化 |
| 2.3.8 BbAmDH及其突变体的动力学参数和酶学性质 |
| 2.3.9 NE的生物转化 |
| 2.3.10 一锅法合成NE |
| 2.3.11 NE的分离纯化与鉴定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 合成R-PAC的酶的表达 |
| 3.1.1 PDC、EDH和 AHAS I表达菌株的构建和表征 |
| 3.1.2 EDH的可溶性表达 |
| 3.2 酶促合成NE的前体物质R-PAC |
| 3.2.1 不同酶对合成R-PAC的影响 |
| 3.2.2 反应pH对缩合反应的影响 |
| 3.2.3 反应温度对缩合反应的影响 |
| 3.2.4 AHAS I细胞量对缩合反应的影响 |
| 3.2.5 底物苯甲醛浓度对缩合反应的影响 |
| 3.2.6 产物R-PAC对缩合反应的影响 |
| 3.2.7 R-PAC的生物转化过程曲线 |
| 3.3 胺脱氢酶的克隆表达及酶学性质的研究 |
| 3.3.1 BbAmDH的克隆表达及定向进化 |
| 3.3.2 BbAmDH及其突变体BbAmDH_(N276C)酶学性质的研究 |
| 3.4 胺脱氢酶催化合成NE |
| 3.4.1 反应pH对还原胺化反应的影响 |
| 3.4.2 反应温度对还原胺化反应的影响 |
| 3.4.3 BbAmDH细胞量对还原胺化反应的影响 |
| 3.4.4 分步法合成NE的过程曲线 |
| 3.5 一锅法合成NE的条件优化 |
| 3.5.1 反应pH对一锅法合成NE的影响 |
| 3.5.2 NH_4~+浓度对一锅法合成NE的影响: |
| 3.5.3 一锅法合成NE |
| 3.5.4 补料策略的应用 |
| 3.6 NE的分离纯化与鉴定 |
| 3.6.1 NE的分离与纯化 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）多酶级联转化L-酪氨酸生产酪醇的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 芳香醇的研究进展 |
| 1.1.1 芳香醇的理化性质及应用 |
| 1.1.2 芳香醇的制备方法 |
| 1.2 酪醇合成的研究进展 |
| 1.2.1 化学法合成酪醇的研究进展 |
| 1.2.2 生物法合成酪醇的研究进展 |
| 1.3 多酶级联是合成酪醇的有效方法 |
| 1.3.1 多酶级联反应及其类型简介 |
| 1.3.2 多酶级联反应在芳香醇合成中的应用 |
| 1.3.3 多酶级联反应中的辅酶再生 |
| 1.3.4 多酶级联合成酪醇的潜力与挑战 |
| 1.4 立题依据及研究意义 |
| 1.5 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 培养基与溶液 |
| 2.1.3 酶和试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 重组菌的构建 |
| 2.2.1 DNA基本操作 |
| 2.2.2 单酶重组菌株的构建 |
| 2.2.3 目的蛋白的诱导表达及纯化 |
| 2.2.4 多酶共表达菌株的构建 |
| 2.3 重组共表达菌株的生产与转化能力评价 |
| 2.3.1 菌株的培养及全细胞催化剂的制备 |
| 2.3.2 发酵产酶条件的优化 |
| 2.3.3 全细胞转化酪氨酸生产酪醇的转化条件优化 |
| 2.4 分析测定方法 |
| 2.4.1 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.4.2 酶活检测 |
| 2.4.3 L-酪氨酸、酪醇、对羟基苯丙酮酸及对羟基苯乙醛的测定方法 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 级联反应生产酪醇的路径设计和构建 |
| 3.1.1 级联路径的设计 |
| 3.1.2 路径酶的选择及单表达载体的构建 |
| 3.1.3 目的蛋白的纯化 |
| 3.1.4 体外级联路径的验证 |
| 3.1.5 限速步骤的确定 |
| 3.1.6 小结 |
| 3.2 多酶级联生产酪醇路径的组装和优化 |
| 3.2.1 共表达菌株的构建及验证 |
| 3.2.2 限速步骤的解除 |
| 3.2.3 全细胞转化L-酪氨酸生产酪醇的体系优化 |
| 3.2.4 产物对大肠杆菌细胞的抑制 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 产物原位分离法提高酪醇生物转化产量 |
| 3.3.1 树脂筛选 |
| 3.3.2 树脂XAD4 添加量优化 |
| 3.3.3 酪醇的洗脱 |
| 3.3.4 大孔树脂吸附生物转化合成酪醇 |
| 3.3.5 发酵罐中生物转化法合成酪醇 |
| 3.3.6 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录：检测图谱 |
（3）化学—酶法催化生物质原料合成β-羟基-α-氨基酸的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物催化的手性合成 |
| 1.2 手性非天然氨基酸 |
| 1.3 β-羟基-α-氨基酸 |
| 1.3.1 β-羟基-α-氨基酸概述 |
| 1.3.2 β-羟基-α-氨基酸的合成 |
| 1.3.3 β-羟基-α-氨基酸的应用 |
| 1.4 醛缩酶 |
| 1.4.1 醛缩酶概述 |
| 1.4.2 醛缩酶的分类 |
| 1.5 苏氨酸醛缩酶 |
| 1.5.1 苏氨酸醛缩酶概述 |
| 1.5.2 苏氨酸醛缩酶的结构与分子催化机制 |
| 1.5.3 苏氨酸醛缩酶的定向进化 |
| 1.6 木质生物质转化高附加值化学品 |
| 1.6.1 木质生物质转化利用概述 |
| 1.6.2 木质生物质的化学法转化 |
| 1.6.3 木质生物质的酶法转化 |
| 1.6.4 木质生物质的化学-酶法转化 |
| 1.7 本课题立题依据及主要研究内容 |
| 1.7.1 研究目的及意义 |
| 1.7.2 主要研究内容 |
| 第二章 建立苏氨酸醛缩酶缩合方向催化活性的高通量筛选方法 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 AxDTA的克隆、表达和纯化 |
| 2.2.4 分析方法 |
| 2.2.5 AxDTA最适反应pH的测定 |
| 2.2.6 DNPH法确定底物检测波长 |
| 2.2.7 线性范围和检测限 |
| 2.2.8 加标回收率 |
| 2.2.9 显色稳定性 |
| 2.2.10 皮尔逊相关系数 |
| 2.2.11 定点饱和突变文库的构建 |
| 2.2.12 DNPH法用于96孔板的高通量筛选突变文库 |
| 2.2.13 AxDTA及其突变体的酶学表征和催化反应 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 AxDTA工程菌的构建、表达和纯化 |
| 2.3.2 AxDTA最适反应pH |
| 2.3.3 最大吸收波长的确定 |
| 2.3.4 DNPH法检测MSB浓度的线性范围和检测限 |
| 2.3.5 DNPH法检测MSB浓度的加标回收率 |
| 2.3.6 DNPH法显色稳定性的验证 |
| 2.3.7 基于皮尔逊相关系数的DNPH法与HPLC法的相关性 |
| 2.3.8 AxDTA定点饱和突变文库的构建 |
| 2.3.9 DNPH法高通量筛选AxDTA定点饱和突变文库 |
| 2.3.10 DNPH法测定AxDTA及其突变体的酶学性质 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 D-苏氨酸醛缩酶的挖掘、表征及催化合成对甲砜基苯丝氨酸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 基因挖掘 |
| 3.2.4 基因组DNA的提取和鉴定 |
| 3.2.5 工程菌的构建、表达和纯化 |
| 3.2.6 新型DTA的筛选 |
| 3.2.7 ApDTA生物信息学分析 |
| 3.2.8 酶学性质的表征 |
| 3.2.9 影响羟醛缩合产率和非对映选择性的反应条件 |
| 3.2.10 动力学拆分的条件优化 |
| 3.2.11 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 基因挖掘和筛选新型DTA重组酶 |
| 3.3.2 ApDTA生物信息学分析 |
| 3.3.3 酶学性质表征 |
| 3.3.4 ApDTA催化羟醛缩合反应条件的优化 |
| 3.3.5 ApDTA催化动力学拆分反应条件的优化 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 生物基木糖化学-酶法合成呋喃丝氨酸的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 固体酸SO_4~(2-)/SnO_2-Al_2O_3-CFA的制备 |
| 4.2.4 重组大肠杆菌LTA的构建、表达和筛选 |
| 4.2.5 SO_4~(2-)/SnO_2-Al_2O_3-CFA催化CS木糖水解液转化为糠醛 |
| 4.2.6 E.coli PpLTA催化糠醛水解液合成FLSE |
| 4.2.7 固体酸催化剂和甲苯的回收再利用 |
| 4.2.8 固体酸催化剂的表征 |
| 4.2.9 分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 固体酸催化剂的制备 |
| 4.3.2 固体酸催化剂的表征 |
| 4.3.3 固体酸催化剂的加载量 |
| 4.3.4 有机溶剂对糠醛产率的影响 |
| 4.3.5 氯化盐助剂对糠醛产率的影响 |
| 4.3.6 反应温度和反应时间对糠醛产率的影响 |
| 4.3.7 重组大肠杆菌全细胞催化转化糠醛的条件优化 |
| 4.3.8 底物浓度对E.coli PpLTA催化转化糠醛的影响 |
| 4.3.9 固体酸催化剂和甲苯的回收和重复利用性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 生物质化学-酶法一锅合成呋喃丝氨酸的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2-)固体酸催化剂的制备 |
| 5.2.4 固体酸Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2-)催化转化玉米芯制备糠醛 |
| 5.2.5 化学-酶法不对称合成FLSE |
| 5.2.6 固体酸预处理玉米芯的酶解糖化 |
| 5.2.7 固体酸催化剂和固定化细胞的循环再利用 |
| 5.2.8 固体酸催化剂的表征 |
| 5.2.9 分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 各组分催化剂催化效率的评价 |
| 5.3.2 磁性固体酸Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2-)的表征 |
| 5.3.3 固体酸Fe_3O_4@MCM-41/SO_4~(2-)催化玉米芯制备糠醛 |
| 5.3.4 底物浓度和细胞浓度对E.coli PpLTA转化生成FLSE的影响 |
| 5.3.5 生物质糠醛原料一锅法合成制备手性FLSE |
| 5.3.6 纤维素酶解固体酸预处理的玉米芯 |
| 5.3.7 固体酸催化剂和固定化细胞的循环利用 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:定点饱和突变相关引物 |
| 附录B:~1H NMR图 |
| 附录C:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（4）生物催化级联反应制备丙酮酸及L-酪氨酸衍生物（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 丙酮酸 |
| 1.1.1 丙酮酸及其应用 |
| 1.1.2 丙酮酸的制备 |
| 1.1.2.1 化学合成法 |
| 1.1.2.2 生物法 |
| 1.1.3 丙酮酸的稳定性 |
| 1.2 L-酪氨酸及其衍生物 |
| 1.2.1 L-酪氨酸及其衍生物概论 |
| 1.2.2 L-酪氨酸及其衍生物的制备 |
| 1.2.2.1 化学合成法 |
| 1.2.2.2 酶催化法 |
| 1.3 短链L-2-羟基酸氧化酶 |
| 1.3.1 短链L-2-羟基酸氧化酶简介 |
| 1.3.2 短链L-2-羟基酸氧化酶结构特征与反应机制 |
| 1.4 过氧化氢酶 |
| 1.4.1 过氧化氢酶概述 |
| 1.4.2 过氧化氢酶的分类及结构特征 |
| 1.4.3 过氧化氢酶的催化机理 |
| 1.4.4 过氧化氢酶的来源 |
| 1.4.5 过氧化氢酶的应用 |
| 1.5 酪氨酸酚裂解酶 |
| 1.5.1 酪氨酸酚裂解酶概述 |
| 1.5.2 酪氨酸酚裂解酶的结构特征 |
| 1.5.3 酪氨酸分裂解酶催化机理 |
| 1.5.4 酪氨酸酚裂解酶的改造 |
| 1.5.5 酪氨酸酚裂解酶的应用 |
| 1.6 大肠杆菌表达优化 |
| 1.6.1 表达条件 |
| 1.6.2 宿主的选择 |
| 1.6.3 RBS (Ribosome binding site)序列 |
| 1.6.4 分子伴侣 |
| 1.7 生物催化级联反应 |
| 1.7.1 生物催化级联反应简介 |
| 1.7.2 级联反应在生物催化中的应用 |
| 1.7.2.1 辅酶再生 |
| 1.7.2.2 促进反应平衡 |
| 1.7.2.3 去除有毒副产物 |
| 1.8 本课题的研究思路与主要内容 |
| 第二章 短链L-2-羟基酸氧化酶的筛选及可溶性表达研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基与试剂配置 |
| 2.2.4 菌种和质粒 |
| 2.2.5 基因的扩增 |
| 2.2.6 表达载体与工程菌构建 |
| 2.2.7 重组大肠杆菌诱导产酶 |
| 2.2.8 大肠杆菌超声破碎及SDS-PAGE检测 |
| 2.2.9 蛋白质浓度的测定 |
| 2.2.10 蛋白纯化(重力柱法) |
| 2.2.11 酶活测定 |
| 2.2.12 酶学性质研究 |
| 2.2.13 RBS高通量筛选方法 |
| 2.2.14 分子伴侣与AvLOX共表达 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 短链L-2-羟基酸氧化酶的筛选 |
| 2.3.2 短链L-2-羟基酸氧化酶的热稳定性比较 |
| 2.3.4 乳酸氧化酶AvLOX酶学性质分析 |
| 2.3.4.1 最适温度与温度稳定性 |
| 2.3.4.2 最适pH与pH稳定性 |
| 2.3.5 增强AvLOX可溶性表达 |
| 2.3.5.1 宿主对AvLOX可溶性表达的影响 |
| 2.3.5.2 诱导温度对AvLOX可溶性表达的影响 |
| 2.3.5.3 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对AvLOX可溶性表达的影响 |
| 2.3.5.4 核糖体结合位点(RBS)对表达的影响 |
| 2.3.5.5 分子伴侣对表达的影响 |
| 2.3.5.6 乳酸氧化酶AvLOX可溶性表达前后对比 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 过氧化氢酶的筛选及体外双酶级联体系的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验药品与试剂 |
| 3.2.3 培养基与试剂配制 |
| 3.2.4 菌株和质粒 |
| 3.2.5 过氧化氢酶的克隆 |
| 3.2.6 表达载体与工程菌构建 |
| 3.2.7 重组大肠杆菌诱导产酶 |
| 3.2.8 大肠杆菌超声破碎及SDS-PAGE检测 |
| 3.2.9 蛋白纯化(重力柱法) |
| 3.2.10 酶活测定 |
| 3.2.11 半衰期测定 |
| 3.2.12 酶学性质研究 |
| 3.2.13 丙酮酸稳定性测试 |
| 3.2.14 双酶偶联体系的构建 |
| 3.2.15 分析方法 |
| (1) 液相检测方法 |
| (2) 反应收率计算 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 过氧化氢酶酶库的建立 |
| 3.3.2 过氧化氢酶的筛选 |
| 3.3.3 过氧化氢酶UtCAT的酶学性质分析 |
| 3.3.3.1 过氧化氢酶UtCAT的纯化 |
| 3.3.3.2 最适温度和温度稳定性 |
| 3.3.3.3 最适pH与pH稳定性 |
| 3.3.3.4 过氧化氢浓度对UtCAT酶活的影响 |
| 3.3.4 丙酮酸的稳定性 |
| 3.3.4.1 丙酮酸在过氧化氢溶液中的稳定性 |
| 3.3.4.2 丙酮酸在粗酶液中的稳定性 |
| 3.3.5 体外双酶偶联体系的构建 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 全细胞催化剂的构建及在丙酮酸制备中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验药品与试剂 |
| 4.2.3 培养基与试剂配制 |
| 4.2.4 菌种和质粒 |
| 4.2.5 乳酸氧化酶和过氧化氢酶酶活测定 |
| 4.2.6 液相检测 |
| 4.2.7 共表达重组质粒的构建 |
| 4.2.8 RBS序列设计 |
| 4.2.9 不同共表达菌株的催化效率对比 |
| 4.2.10 全细胞催化制备丙酮酸的优化 |
| 4.2.11 1L规模底物分批补料制备丙酮酸 |
| 4.2.12 丙酮钠的分离纯化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 AvLOX和UtCAT共表达策略 |
| 4.3.2 不同共表达策略下蛋白表达分析和活力测定 |
| 4.3.3 RBS序列优化后蛋白表达分析和活力测定 |
| 4.3.4 共表达菌株催化效率评估 |
| 4.3.5 全细胞催化制备丙酮酸工艺优化 |
| 4.3.5.5 底物浓度对催化的影响 |
| 4.3.5.6 常压下底物分批补料反应 |
| 4.3.6 丙酮酸的分离提纯 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 酪氨酸酚裂解酶克隆表达及理性改造 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验药品与试剂 |
| 5.2.3 培养基与试剂配制 |
| 5.2.4 菌种和质粒 |
| 5.2.5 重组表达质粒的构建 |
| 5.2.6 定点突变 |
| 5.2.7 重组大肠杆菌诱导产酶 |
| 5.2.8 多序列比对 |
| 5.2.9 同源建模与分子对接 |
| 5.2.10 标准品Rac-4b和d-g化学酶法合成 |
| 5.2.11 底物特异性研究 |
| 5.2.12 HPLC检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 酪氨酸酚裂解酶的克隆表达 |
| 5.3.2 酪氨酸酚裂解酶酶学特性研究 |
| 5.3.2.1 最适反应温度和温度稳定性 |
| 5.3.2.2 最适反应pH和pH稳定性 |
| 5.3.2.3 不同铵盐对酶活的影响 |
| 5.3.2.4 丙酮酸浓度对TTPL酶活的影响 |
| 5.3.2.5 酪氨酸酚裂解酶TTPL底物谱 |
| 5.3.3 基于结构-功能关系的TTPL理性设计 |
| 5.3.4 定点突变与活力测定 |
| 5.3.5 不同突变子的底物谱分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 三酶级联反应合成L-酪氨酸衍生物的工艺研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验仪器 |
| 6.2.2 实验药品与试剂 |
| 6.2.3 培养基与试剂配制 |
| 6.2.4 菌种和质粒 |
| 6.2.5 大肠杆菌诱导产酶 |
| 6.2.6 多酶体系的反应条件优化 |
| 6.2.7 离子交换色谱法纯化L4a-g |
| 6.2.8 L-4a-g光学纯度测定 |
| 6.2.9 酪氨酸衍生物L-4a-g产品鉴定 |
| 6.2.10 乳酸氧化酶、过氧化氢酶和酪氨酸酚裂解酶在苯酚中的稳定性 |
| 6.2.11 0.5 L规模底物流加补料反应制备酪氨酸 |
| 6.2.12 L-酪氨酸衍生物的纯化 |
| 6.2.13 HPLC检测方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 多酶级联反应催化合成3-氟-L-酪氨酸L4f |
| 6.3.2 AvLOX和TTTLM380V双酶配比对多酶催化3f的影响 |
| 6.3.3 菌体添加量对催化效率的影响 |
| 6.3.4 提高底物3f浓度的研究 |
| 6.3.5 优化前后工艺参数及指标对比 |
| 6.3.6 两步级联反应与一步C-C偶联的比较 |
| 6.3.7 一釜式两步级联反应合成酪氨酸衍生物L-4a-g |
| 6.3.8 0.5 L规模底物流加补料反应 |
| 6.3.9 L-酪氨酸衍生物产品的分离纯化 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 论文的创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（5）基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 维生素K |
| 1.1.1 维生素K的发现历程 |
| 1.1.2 维生素K的性质 |
| 1.1.3 维生素K2的功能与应用 |
| 1.1.4 维生素K2的生物合成 |
| 1.2 合成生物学及其应用 |
| 1.2.1 合成生物学的概念 |
| 1.2.2 合成生物学的研究内容 |
| 1.2.3 合成生物学的应用 |
| 1.3 蛋白表达系统 |
| 1.3.1 重组蛋白表达系统 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4 本论文研究的内容与意义 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第2章 大肠杆菌四烯甲萘醌生物合成途径的构建与优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 培养基和溶液 |
| 2.2.5 大肠杆菌MK-4生物合成途径的构建 |
| 2.2.6 利用Red重组系统无痕敲除大肠杆菌pgi基因 |
| 2.2.7 胞内产物的提取和检测 |
| 2.2.8 胞内NADPH含量的检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 大肠杆菌MK-4生物合成途径的构建 |
| 2.3.2 大肠杆菌pgi基因缺失菌株的构建 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 毕赤酵母四烯甲萘醌生物合成途径的理性设计 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 理性设计以VK3和IPP为底物的MK-4生物合成途径 |
| 3.2.2 MK-4生物合成途径中关键酶HsUBIAD1的生物信息学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 毕赤酵母MK-4生物合成途径的理性设计 |
| 3.3.2 MK-4生物合成途径中关键酶HsUBIAD1的生物信息学分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 毕赤酵母四烯甲萘醌生物合成途径的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种和质粒 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 培养基和溶液 |
| 4.2.5 HsUBIAD1蛋白表达载体的构建 |
| 4.2.6 构建产HsUBIAD1重组毕赤酵母 |
| 4.2.7 高产HsUBIAD1重组毕赤酵母的筛选 |
| 4.2.8 高产菌株蛋白表达条件的优化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 重组HsUBIAD1表达载体的构建 |
| 4.3.2 高产HsUBIAD1重组毕赤酵母的筛选 |
| 4.3.3 重组HsUBIAD1蛋白表达条件优化 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 重组HsUBIAD1蛋白的纯化和鉴定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种和质粒 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器设备 |
| 5.2.4 培养基和溶液 |
| 5.2.5 重组HsUBIAD1蛋白的纯化 |
| 5.2.6 重组HsUBIAD1蛋白的酶学分析 |
| 5.2.7 重组GGU-23菌株全细胞催化反应 |
| 5.2.8 异戊烯基化产物的提取与检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 重组HsUBIAD1蛋白的纯化 |
| 5.3.2 重组HsUBIAD1蛋白的催化活性 |
| 5.3.3 异戊烯基化产物的鉴定 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 毕赤酵母四烯甲萘醌侧链生物合成途径的优化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌种和质粒 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器设备 |
| 6.2.4 培养基和溶液 |
| 6.2.5 构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体 |
| 6.2.6 构建PpIDI和SaGGPPS融合表达载体 |
| 6.2.7 构建GGU-GrG和GGU-GrIG重组毕赤酵母 |
| 6.2.8 筛选GGU-GrG和GGU-GrIG重组毕赤酵母 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体 |
| 6.3.2 融合表达SaGGPPS和PpIDI强化侧链前体的供给 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 工程菌全细胞催化合成四烯甲萘醌的工艺优化 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 菌种和质粒 |
| 7.2.2 主要试剂 |
| 7.2.3 培养基和溶液 |
| 7.2.4 全细胞催化工艺的优化 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 全细胞催化工艺的优化 |
| 7.3.2 工程菌的传代稳定性 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 总结 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（6）大肠杆菌N-乙酰神经氨酸合成途径的构建与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 N-乙酰神经氨酸的功能与应用 |
| 1.2.1 食品领域 |
| 1.2.2 医药领域 |
| 1.3 N-乙酰神经氨酸的生产方法 |
| 1.3.1 天然原料提取法 |
| 1.3.2 多聚物水解法 |
| 1.3.3 化学法与酶法催化合成 |
| 1.3.4 全细胞生物催化法 |
| 1.3.5 微生物发酵法 |
| 1.4 N-乙酰神经氨酸微生物合成途径 |
| 1.5 国内外相关研究 |
| 1.5.1 关键酶的研究 |
| 1.5.2 模块化代谢工程改造 |
| 1.5.3 合成过程中的动态调控 |
| 1.5.4 生物传感器的应用 |
| 1.6 本研究的立题背景与研究内容 |
| 1.6.1 立题背景 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要溶液 |
| 2.2.4 抗生素与诱导剂 |
| 2.2.5 培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 质粒提取 |
| 2.3.2 基因组提取 |
| 2.3.3 感受态细胞制备及转化实验 |
| 2.3.4 基因PCR扩增 |
| 2.3.5 DNA片段提取与纯化 |
| 2.3.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.7 质粒的构建 |
| 2.3.8 CRISPR/Cas9基因编辑方法 |
| 2.3.9 工程菌发酵培养方法 |
| 2.3.10 生物量的测定 |
| 2.3.11 发酵液中各成分的测定方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 N-乙酰神经氨酸合成途径构建 |
| 3.1.1 过表达去磷酸化酶基因yqaB |
| 3.1.2 Neu5Ac分解代谢途径的阻断 |
| 3.1.3 N-乙酰神经氨酸差向异构酶的整合与筛选 |
| 3.1.4 N-乙酰神经氨酸合成酶的整合 |
| 3.1.5 关键酶AGE与NeuB表达量的优化 |
| 3.1.6 过表达UDP-N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶基因neuC |
| 3.2 磷酸烯醇式丙酮酸供应的增强 |
| 3.2.1 葡萄糖特异性PTS系统的消除 |
| 3.2.2 过表达磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因pps |
| 3.2.3 过表达PEP羧激酶基因pck与丙酮酸激酶Ⅰ基因pykF的敲除 |
| 3.3 副产物的减弱 |
| 3.3.1 patZ基因敲除以及acs基因的过表达 |
| 3.3.2 发酵验证patZ基因敲除以及acs基因过表达的影响 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 研究生期间所发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（7）重组毕赤酵母全细胞转化L-乳酸合成丙酮酸钠的工艺研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一节 丙酮酸 |
| 1.1 丙酮酸的结构和理化性质 |
| 1.2 丙酮酸(盐)的用途 |
| 第二节 丙酮酸的生产方法及生产概况 |
| 2.1 化学合成法 |
| 2.2 直接发酵法 |
| 2.3 酶转化法 |
| 第三节 丙酮酸的提取方法 |
| 3.1 减压蒸馏法 |
| 3.2 有机溶剂提取法 |
| 3.3 反渗透膜分离法 |
| 3.4 离子交换法 |
| 第四节 重组毕赤酵母发酵的关键控制 |
| 4.1 毕赤酵母碳源的影响 |
| 4.2 诱导时间的影响 |
| 4.3 发酵培养中pH的影响 |
| 第五节 细胞透性化技术研究进展 |
| 5.1 细胞透性化技术 |
| 5.2 细胞透性化方法 |
| 5.3 透性化细胞的应用 |
| 第六节 课题的研究内容及意义 |
| 6.1 课题研究意义 |
| 6.2 课题研究内容 |
| 第一章 重组毕赤酵母5L发酵罐发酵工艺优化 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.1 接种量对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力影响 |
| 3.2 pH对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.3 培养温度对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.4 诱导时间对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.5 甲醇浓度对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.6 开始诱导的时间对重组毕赤酵母生长及乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.7 重组毕赤酵母5L发酵罐菌体生长和发酵参数分析 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 第二章 重组毕赤酵母5T发酵罐中试放大工艺研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.1 三级种子发酵培养基的优化 |
| 3.2 三级发酵工艺对重组毕赤酵母生长和乙醇酸氧化酶活力的影响 |
| 3.3 重组毕赤酵母5T发酵罐菌体生长和发酵参数分析 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 第三章 重组毕赤酵母催化L-乳酸合成丙酮酸钠的转化工艺优化 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.1 细胞的透性化处理 |
| 3.2 重组毕赤酵母的重复使用次数对转化过程的影响 |
| 3.3 底物L-乳酸浓度对转化过程的影响 |
| 3.4 细胞浓度对转化过程的影响 |
| 3.5 pH对转化过程的影响 |
| 3.6 反应温度对转化过程的影响 |
| 3.7 重组毕赤酵母转化L-乳酸生成丙酮酸钠转化过程分析 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 第四章 丙酮酸钠提取纯化工艺的优化 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三节 结果与分析 |
| 3.1 丙酮酸钠溶解度的研究 |
| 3.2 丙酮酸钠发酵液的脱色工艺研究 |
| 3.3 丙酮酸钠转化液浓缩冷却结晶工艺的研究 |
| 3.4 丙酮酸钠结晶工艺的研究 |
| 3.5 丙酮酸钠分离纯化工艺流程 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）克雷伯氏杆菌发酵甘油生产1，3-丙二醇过程的代谢分析与优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 1,3-丙二醇的生产 |
| 1.2.1 化学法 |
| 1.2.2 生物法 |
| 1.2.3 发酵策略 |
| 1.3 甘油代谢动力学 |
| 1.3.1 系统生物学概述 |
| 1.3.2 甘油代谢工程 |
| 1.3.3 发酵过程建模 |
| 1.4 模型分析与优化控制 |
| 1.4.1 代谢通量分析 |
| 1.4.2 通量平衡分析 |
| 1.4.3 动态通量平衡分析 |
| 1.4.4 整体建模 |
| 1.4.5 分支分析 |
| 1.4.6 优化控制 |
| 1.5 研究思路 |
| 2 克雷伯氏杆菌发酵甘油过程的动态通量平衡分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 代谢途径拓展总览 |
| 2.3.1 底物过量条件下的动态通量分布 |
| 2.3.2 底物限制条件下的动态通量分布 |
| 2.4 关键节点通量对代谢的影响 |
| 2.4.1 二羟基丙酮(DHA)节点通量对代谢的影响 |
| 2.4.2 3-磷酸甘油酸(3PG)节点通量对代谢的影响 |
| 2.4.3 三羧酸循环(TCA)通量对代谢的影响 |
| 2.5 TCA中耦合途径对代谢的影响 |
| 2.5.1 α-酮戊二酸(Akg)的耦合途径 |
| 2.5.2 半胱氨酸(Cys)的耦合途径 |
| 2.6 节点分支通量分配对代谢的影响 |
| 2.7 本章小结 |
| 3 克雷伯氏杆菌发酵甘油产1,3-丙二醇过程的整体建模优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 模型的来源 |
| 3.2.2 整体建模等效参数的筛选 |
| 3.2.3 优化方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 参考参数的来源及特性 |
| 3.3.2 等效参数集合的筛选 |
| 3.3.3 等效参数的特性及预测性能分析 |
| 3.3.4 发酵过程的优化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 双反应器串联发酵过程的多稳态分析与优化控制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 模型的来源 |
| 4.2.2 稳态参数分支分析 |
| 4.2.3 操作条件优化 |
| 4.2.4 优化控制 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 单罐发酵过程的多稳态特性 |
| 4.3.2 单罐发酵过程的优化控制 |
| 4.3.3 双罐串联发酵过程的多稳态特性 |
| 4.3.4 双罐串联发酵过程的操作条件优化 |
| 4.3.5 双罐串联发酵过程的优化控制 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录代谢网络反应 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（9）海栖热袍菌乙酰羟酸合酶活性检测新方法的建立及其催化反应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 乙酰羟酸合酶概述 |
| 1.1.1 AHAS的分布 |
| 1.1.2 AHAS的功能和催化机制 |
| 1.2 海栖热袍菌与AHAS |
| 1.3 AHAS活性研究方法 |
| 1.4 4-硝基邻苯二胺与2,4-二硝基苯肼 |
| 1.4.1 4-硝基邻苯二胺 |
| 1.4.2 2,4-二硝基苯肼 |
| 1.4.3 以NPDA及 DNPH为衍生化试剂测定TmAHAS催化反应的原理 |
| 1.5 本课题的意义 |
| 第二章 重组TmAHAS的制备 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组工程菌的培养及TmAHAS的诱导表达 |
| 2.2.2 TmAHAS的纯化 |
| 2.2.3 SDS-PAGE鉴定TmAHAS |
| 2.2.4 TmAHAS浓度测定 |
| 2.2.5 TmAHAS活性测定 |
| 2.3 实验结果及讨论 |
| 2.3.1 重组TmAHAS的诱导表达及纯化结果 |
| 2.3.2 蛋白浓度标准曲线及浓度测定结果 |
| 2.3.3 紫外法测定蛋白活性标准曲线及活性测定结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 重组TmAHAS活性检测新方法的建立 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 确定HPLC检测最大吸收波长 |
| 3.2.2 优化HPLC分离条件 |
| 3.2.3 建立标准曲线 |
| 3.2.4 新方法检测TmAHAS活性 |
| 3.3 实验结果及讨论 |
| 3.3.1 确定HPLC检测最大吸收波长 |
| 3.3.2 HPLC分离条件优化 |
| 3.3.3 建立标准曲线 |
| 3.3.4 新方法检测TmAHAS活性的结果及与比色法检测结果的比较 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 重组TmAHAS催化双底物反应产物组成的分析 |
| 4.1 材料和仪器 |
| 4.1.1 试剂 |
| 4.1.2 仪器 |
| 4.1.3 主要试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 确定HPLC检测最大吸收波长 |
| 4.2.2 建立标准曲线 |
| 4.2.3 优化HPLC分离条件 |
| 4.2.4 酶催化的反应 |
| 4.2.5 LC-MS检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 NPDA衍生物紫外检测结果 |
| 4.3.2 建立标准曲线 |
| 4.3.3 HPLC分离条件优化 |
| 4.3.4 TmAHAS酶催化的反应结果分析 |
| 4.3.5 LC-MS检测结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 DNPH检测产物LC-MS鉴定结果图 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1菌株中2-溴硝基苯的代谢机理与相关应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 芳烃类化合物概述 |
| 1.1.1 芳烃化合物的代谢 |
| 1.1.2 芳烃化合物的微生物代谢途径 |
| 1.1.3 芳烃化合物的经典中心代谢途径 |
| 1.2 硝基芳烃化合物代谢 |
| 1.3 卤代硝基芳烃化合物代谢 |
| 1.4 环羟化双加氧酶 |
| 1.4.1 RHOs氧化酶 |
| 1.4.2 硝基芳烃双加氧酶 |
| 1.5 粘糠酸相关概述 |
| 1.5.1 粘糠酸简介 |
| 1.5.2 生物合成法制备粘糠酸 |
| 1.6 本研究的目的、意义及内容 |
| 第二章 Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1 菌株中2-溴硝基苯的代谢途径研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 菌株和质粒 |
| 2.2.3 试剂及药品 |
| 2.2.4 主要培养基及缓冲液 |
| 2.2.5 2-溴硝基苯毒性测定 |
| 2.2.6 降解2BNB菌株的筛选 |
| 2.2.7 P.stutzeri ZWLR2-1 菌株的活化及培养条件 |
| 2.2.8 P.stutzeri ZWLR2-1在2BNB和2CNB生长曲线测定 |
| 2.2.9 亚硝酸根浓度的测定 |
| 2.2.10 全细胞生物转化检测硝基芳烃双加氧酶活力 |
| 2.2.11 邻苯二酚1,2-双加氧酶基因的克隆与酶的纯化 |
| 2.2.12 邻苯二酚1,2-双加氧酶活力的检测 |
| 2.2.13 中间代谢产物的鉴别方法(HPLC,LC-MS) |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 2-溴硝基苯毒性测定 |
| 2.3.2 2BNB降解菌株的筛选 |
| 2.3.3 P.stutzeri ZWLR2-1 菌株利用2CNB、2BNB以及2FNB的生长情况 |
| 2.3.4 P.stutzeri ZWLR2-1 菌株利用2CNB和2BNB的生长曲线测定 |
| 2.3.5 E.coli DH5α [pUC18cnbAaAbAcAd]生物转化分析 |
| 2.3.6 邻苯二酚开环酶(CnbC)的开环活性测定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 利用溴邻苯二酚1,2-双加氧酶制备2-溴粘糠酸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 菌株和质粒 |
| 3.2.3 主要试剂及药品 |
| 3.2.4 主要培养基及缓冲液 |
| 3.2.5 2-溴粘糠酸的制备 |
| 3.2.6 利用核磁共振验证2-溴粘糠酸 |
| 3.2.7 2-溴粘糠酸摩尔吸光系数的测定 |
| 3.2.8 CnbC催化3-溴邻苯二酚生成2-溴粘糠酸的效率 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 2-溴粘糠酸的LC-MS鉴定结果 |
| 3.3.2 2-溴粘糠酸的核磁鉴定结果 |
| 3.3.3 酶促反应底物与产物及转化率之间的关系 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 硝基芳烃双加氧酶的基因改造 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 菌株、质粒及引物 |
| 4.2.3 主要试剂及药品 |
| 4.2.4 定点突变 |
| 4.2.5 生物转化 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 双加氧酶氨基酸序列比对 |
| 4.3.2 生物转化测定突变后的双加氧酶的活力 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 实验总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 实验展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
四、酶促生物转化丙酮酸生产的研究（论文参考文献）
- [1]级联法合成去甲基麻黄素的研究[D]. 罗磊. 江南大学, 2021(01)
- [2]多酶级联转化L-酪氨酸生产酪醇的研究[D]. 阮小波. 江南大学, 2021(01)
- [3]化学—酶法催化生物质原料合成β-羟基-α-氨基酸的研究[D]. 龚磊. 江南大学, 2020(04)
- [4]生物催化级联反应制备丙酮酸及L-酪氨酸衍生物[D]. 李国四. 浙江大学, 2020(05)
- [5]基于毕赤酵母底盘的维生素K2（MK-4）细胞工厂构建与优化[D]. 孙小雯. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [6]大肠杆菌N-乙酰神经氨酸合成途径的构建与优化[D]. 侯正杰. 天津科技大学, 2020(08)
- [7]重组毕赤酵母全细胞转化L-乳酸合成丙酮酸钠的工艺研究[D]. 鹿承建. 福建师范大学, 2020(12)
- [8]克雷伯氏杆菌发酵甘油生产1，3-丙二醇过程的代谢分析与优化[D]. 潘多涛. 大连理工大学, 2019(06)
- [9]海栖热袍菌乙酰羟酸合酶活性检测新方法的建立及其催化反应的研究[D]. 高凤. 西北大学, 2019(01)
- [10]Pseudomonas stutzeri ZWLR2-1菌株中2-溴硝基苯的代谢机理与相关应用研究[D]. 汪磊. 上海交通大学, 2019(06)