一、抗HCV不同位点核酶细胞内活性的比较（论文文献综述）
周颖[1]（2011）在《靶向T细胞受体CTLA-4的新型核酸干预分子初步研究》文中研究指明目的:Ribozyme和DNAzyme具有水解mRNA分子的功能,是阻断基因表达和抗病毒的重要工具。Ribozyme和DNAzyme研究中有两个技术关键。一个是Ribozyme和DNAzyme的作用效果问题,Ribozyme和DNAzyme的作用效果与mRNA的高级结构有关,即与作用靶点（target site）的可及性（accessibility）有关;另一个是Ribozyme和DNAzyme的递送（delivery）效率问题,高效的递送是Ribozyme和DNAzyme发挥作用的前提保证。疾病的基因治疗需要安全、高效、靶向性的分子载体。pRNA是从枯草杆菌分离得到的大小在30nm左右的小RNA分子（如图22）,极易穿过细胞膜,它既具备核酸的结构特性,也具有类似蛋白质的功能,能被设计成一种理想的非病毒型载体。pRNA分子载体具有安全、高效的特性,能够较长时间的作用于效应细胞,同时不会引起免疫反应和排斥现象,是基因治疗中非常有发展前景的理想的分子载体[1]。本实验通过构建CTLA4干预分子pRNA-Ribozyme,旨在重启T细胞激活和增殖;为放射性细胞免疫低下寻求免疫调节新方案。方法:首先扩增和克隆出CTLA4基因,体外转录RNA,采用RASS方法筛选CTLA4-mRNA的可及靶点并验证其有效性,然后确定Ribozyme的作用靶点,针对靶点设计并构建制备CTLA4-pRNA-Ribozyme的DNA质粒,制备CTLA4-pRNA-Ribozyme分子,在体外分析其切割活性,比较分析其优劣。pRNA携带效应分子Ribozyme具有明确的靶向性、主动识别结合和剪切基因RNA,但由于100nt以上的RNA分子化学合成较为困难,本实验采用分子生物学方法通过基因重组构建并制备170nt的pRNA-Ribozyme。依据pRNA序列和Ribozyme分子序列,采用PCR扩增和克隆重组,将pRNA-Ribozyme按照顺式连接开放式结构、和Ribozyme嵌入pRNA成封闭型内环结构,制备DNA质粒;再在体外转录制备pRNA-Ribozyme分子。结果:从小鼠脾脏扩增CTLA-4全基因、构建其克隆,采用RASS方法筛选获得了CTLA-4的mRNA靶点,验证了3个靶点有效;对有效靶点构建了pRNA-Rz分子、及其克隆;同时采用二种方式体外制备出了pRNA-Ribozyme分子并形成聚合体结构。重组制备的pRNA-Ribozyme通过pRNA载体可以被准确运输到作用靶点,即主动进入细胞、主动识别、主动切割mRNA,阻断CTLA-4基因表达,从而发挥Ribozyme的功能。体外制备出了特异高效的CTLA4-pRNA-Ribozyme。结论:获得小鼠CTLA-4全基因序列、并构建了基因克隆,筛选获得了CTLA-4的mRNA靶点3个靶点有效;对有效靶点构建了pRNA-Rz分子、及其克隆;体外生物合成制备出了pRNA-Ribozyme顺式连接开放式结构、和Ribozyme嵌入pRNA成封闭型内环结构pRNA-Ribozyme,并且对CTLA-4基因表达的抑制作用体外实验比较明显,体外生物合成制备的CTLA4-pRNA-Ribozyme的DNA质粒,为在细胞内表达提供了基础。
周颖,毛建平[2]（2010）在《Ribozyme和DNAzyme的基因治疗实验应用进展》文中研究指明Ribozyme和DNAzyme具有水解mRNA分子的功能,是阻断基因表达和抗病毒的重要工具。近年来,Ribozyme和DNAzyme在临床治疗研究中已经获得了长足进展,有许多成功的实例。比较了Ribozyme和DNAzyme的差异和特点,总结了它们在抗病毒、抗肿瘤、治疗遗传病、治疗神经系统疾病等方面的临床前研究、应用及进展。
牛俊奇,汪杨[3]（2007）在《病毒性肝炎基因治疗研究的现状》文中研究表明世界大多数国家人群中乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染率较高且极易慢性化,是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因,严重威胁人们健康,而我国是HBV、HCV感染的高发区。虽然近年在病毒性肝炎的抗病毒治疗方面取得了令人欣喜的进展,但目前临床上应用的抗病毒药物的不良反应较大,且获得的病毒持续抑制率并不令人满意。
刘波[4]（2007）在《CTE-RHA复合核酶的构建及抑制HCV RNA复制和相应蛋白表达的研究》文中研究说明目的构建实验所需的真核表达载体，特别是人源性tRNA val启动子驱动CTE介导的核酶高效表达载体pPHCV5-CR以及对应的无CTE介导的载体pPHCV5-R；建立HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株；探讨核酶和核酶-CTE复合物对丙型肝炎病毒亚基因组的影响，进一步探讨丙型肝炎治疗研究方向。研究方法1、构建相应的核酶载体合成CTE-DNA，设计、构建含tRNAval启动子的核酶和带有CTE的含tRNAval启动子的核酶。2、建立HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株在脂质体lipofectamine TM2000介导下，将含有HCV Subgenes的真核表达质粒pHCV BM4-5导入人肝癌细胞系QSR7701中，经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹法证实转染成功及其蛋白表达。3、观察四种质粒pPHCV5-R1、pPHCV5-R2、pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2对HCV Subgenomic Replicon稳定转染和表达的细胞株中HCV RNA和相应病毒蛋白表达的影响。结果1、经测序后证实，成功构建相应的核酶载体，为下一步实验奠定基础。2、经RT-PCR和Western Blot证实，成功建立稳定转染HCVSubgenomic Replicon和表达的细胞株。3、用构建的普通核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2和复合核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2瞬时转染含HCV亚基因复制子的稳定转染QSG7701细胞株，48小时后收集细胞进行RT-PCR和WesternBlot，RT-PCR（以β-actin为内对照）结果显示：pPHCV5-CR1转染组未见明显扩增目的条带，pPHCV5-R1转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组和空质粒转染组；pPHCV5-CR2转染组可见扩增目的条带，亮度低于未转染组和空质粒转染组，pPHCV5-R2转染组可见扩增目的条带，亮度与未转染组和空质粒转染组接近。这些提示：复合核酶（带有CTE）在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，复合核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。WesternBlot（以β-actin为内对照）结果显示：应用软件分析各组细胞目的蛋白表达量无明显差异，可能与瞬时转染作用时间短、蛋白表达变化不明显，也可能与实验重复次数少、可用数据少或者检测方法有关。结论新型核酶（带有CTE）在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，带CTE-核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率明显提高。
苏秀芬[5]（2007）在《小干涉RNA对丙型肝炎病毒复制和表达的抑制作用》文中提出病毒性丙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病。聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗丙型肝炎应答率大约是70%,但复发率较高,部分病人对治疗无应答,它们的副作用很大,人们迫切希望找到更有效的治疗方法。随着小干涉RNA（siRNA）技术的进步,应用RNA干涉（RNAi）对一些病毒感染性疾病如HIV感染的治疗研究取得一系列成功,把这一技术用于丙型肝炎的基因治疗,是一种值得探索的治疗丙型肝炎的手段。本研究构建了HCV NS5A真核表达质粒,建立了HCV NS5A在人肝细胞株HL-7702细胞中复制和表达系统,使其成为我们所设计的特异性siRNA抑制丙肝病毒复制的模型。设计构建针对HCV NS5A区中3个不同靶点的表达siRNA质粒,转染可表达HCV NS5A的HL-7702细胞,检测对HCV NS5A蛋白表达的影响,并测定它们的干涉效应。结果表明:特异性siRNA在细胞内显着抑制HCV的蛋白表达,抑制作用从第4天开始,具有序列特异性和高度选择性,且对细胞无毒性作用。本研究是特异性siRNA首次在细胞水平上针对HCV的NS5A复制子进行的研究,目前国内外尚未见报道,为进一步的体内实验和临床使用提供了重要的理论基础、技术路线和实验方法。
丁艳华[6]（2007）在《古菌组蛋白（HphA）介导小发夹RNA抑制HCV 5’NCR和C区表达的研究》文中研究指明全世界目前己有1.7亿HCV感染者,我国普通人群抗-HCV阳性率为3.2%。急性HCV感染者中,大约80%可发展为慢性持续感染,其中20%的患者经历20-30年将发展为肝硬化,1%-5%的患者可进展为肝细胞癌。HCV所导致的终末期肝病是重要的死亡原因之一,也是肝移植的原因。目前慢性丙型肝炎的标准治疗是干扰素联合利巴韦林,但有效率仅仅40%-80%左右,人们试图开发新型、高效的治疗药物来解决这一问题。自RNAi技术发现以来,已广泛应用于分子生物学领域的研究,并且已经证实其在细胞水平能有效抑制HIV、脊髓灰质炎病毒、HBV及HCV的复制和表达。本文构建了三个靶向（targeting to）HCV 5’NCR和C区的小发夹RNA质粒表达载体,与含有HCV 5’NCR和C区部分基因及荧光素酶报告基因的质粒共转染人肝细胞HL-7702。通过检测荧光素酶报告基因和Western blot来检测目的蛋白表达。发现靶向HCV 5’NCR NCR和靶向C区的shRNA能明显抑制HCV 5’NCR和C区的表达。目前小干涉RNA进行体内实验的主要障碍是缺乏安全有效的转基因载体。我们应用了一种非病毒类载体古菌组蛋白（HPhA）作为转基因载体。在实验中发现HPhA能与DNA结合,毒性很小,能在血清存在的条件下转染小干涉RNA表达质粒进入细胞抑制HCV 5’NCR和C区的表达。所以HPhA有潜力发展为适合体内实验的转基因载体。本文首次应用HPhA作为转基因载体,为小干涉RNA抗病毒基因治疗的体内实验提供了重要的理论基础、技术路线和实验方法。
牛俊奇,王峰,王美霞,华瑞,温小玉,田梅梅,郑锦辉[7]（2006）在《丙型病毒性肝炎基因治疗实验研究》文中指出目的:分别设计能特异切割HCV基因组的核酶、U1-嵌合体核酶、10-23脱氧核酶（10-23DNAzyme）及小干涉RNA,以期用于丙型肝炎的基因治疗。方法:（1）设计合成针对HCV RNA基因组非编码区及核心区特定位点的三种核酶,克隆入质粒载体pGEM并进行体外转录,对HCV基因组进行体外切割;（2）选择其中切割效率最高的核酶与U1小核核糖核酸构建成嵌合体核酶,观察在细胞水平对HCV RNA的切割效率;（3）设计合成针对HCV 5,-NCR区不同位点的10-23DNAzyme,观察不同镁离子浓度及时间下对HCV的切割效率。结果:核酶及U1小核核糖核酸嵌合体核酶在细胞水平对HCV RNA均具有切割活性,二者的切割活性基本相等;核酶的切割位点越靠近起始密码子则其切割效率越高;针对HCV基因组设计的小干涉RNA在细胞水平能有效抑HCV的复制和表达。结论:核酶、U1嵌合体核酶、10-23脱氧核酶在细胞水平中都显示了较高效的抗HCV作用,作为有前途的基因治疗药物可以进一步用于动物实验研究。
张岩[8]（2005）在《应用RNAi技术抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究》文中提出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原体之一。由HBV所引起的乙型肝炎是一种流行久远、传播广泛、危害严重的传染性疾病。目前全球慢性HBV感染者超过3亿5千万人。慢性HBV感染导致的肝炎肝硬化和肝癌等终末期肝病,已成为严重危害我国人民生命健康的主要疾病。乙肝疫苗的推广使用使乙肝免疫预防取得重大突破,但治疗上仍缺乏理想的抗病毒药物。目前在我国广泛应用的抗HBV药物主要有两类,α-干扰素和核苷类药物。但疗效均不理想,仍需探索新型有效的抗HBV的药物和方法。 HBV的基因组是一个带有部分单链区的环状双链DNA（dsDNA）分子,具有逆转录病毒的特性,其3.5kb前基因组RIgA既是DNA合成的模板,又是指导蛋白质合成的模板。HBV基因组高度重叠,因而针对HBV某一靶位点切割病毒的mRNA和前基因组RNA,可以有效阻断病毒蛋白质合成。在乙型肝炎基因治疗的探索中,应用反义寡核苷酸、核酶以及脱氧核酶抗HBV的研究曾经给人们带来令人鼓舞的结果,但终因许多难以克服的问题使深入研究难以继续。 近年RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术的出现,为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。RNAi是指由双链RNA(double-stranded RNA,
邓鑫,梁健[9]（2004）在《慢性病毒性肝炎的基因治疗研究现状》文中研究说明
成军[10]（2004）在《功能基因组学中的功能缺失研究策略》文中进行了进一步梳理0 引言在功能基因组学（functional genomics）研究中,阐明各种蛋白的结构和生物学功能是其核心任务,不仅是生物学的主要研究方向,而且也是医学研究的主要内容,毕竟细胞的功能和表型是由细胞中的蛋白来主导的,许多疾病都是蛋白结构与功能、表达水平与调节的异常引起的.研究蛋白的功能,常常通过改变蛋白的表达水平,观察细胞的生物学特性的变化,来研究蛋白相应的生物学功能.这种研究策略包括强制性地升高特定蛋白的表达水平,也包括蛋白表达水平的缺失.研究表明,在功能基因组研究中, 功能缺失（loss of function,LOF）策略具有特殊重要地位.
二、抗HCV不同位点核酶细胞内活性的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗HCV不同位点核酶细胞内活性的比较（论文提纲范文）
（1）靶向T细胞受体CTLA-4的新型核酸干预分子初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 小鼠T淋巴细胞受体CTLA-4基因的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 器材 |
| 1.1.2 动物及质粒载体 |
| 1.1.3 生物及化学试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR(cDNA第一链合成) |
| 1.2.3 CTLA-4扩增产物与EZ-T克隆载体的连接和转化 |
| 1.2.4 克隆的菌液PCR及酶切鉴定、测序及序列比较 |
| 1.2.5 体外转录制备CTLA4-mRNA |
| 2 实验结果 |
| 2.1 CTLA-4基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 小鼠心脏RT-PCR产物转化的菌液PCR鉴定 |
| 2.3 阳性克隆菌液PCR产物的酶切鉴定 |
| 2.4 测序及序列比对结果表明获得的基因为CTLA-4基因 |
| 3 讨论 |
| 第二部分小鼠T 淋巴细胞受体CTLA-4基因mRNA的靶点筛选和验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 器材 |
| 1.1.2 基因及质粒载体 |
| 1.1.3 生物及化学试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 设计合成寡核苷酸文库 |
| 1.2.2 体外转录 |
| 1.2.3 CTLA-4基因RNA的固定 |
| 1.2.4 CTLA-4基因RNA与寡核苷酸文库杂交 |
| 1.2.5 结合寡核苷酸文库序列的扩增 |
| 1.2.6 结合寡核苷酸文库序列的测定 |
| 1.2.7 序列比对和靶点的确认 |
| 1.2.8 靶点有效性的体外验证 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 基因转录模板产生 |
| 2.2 体外转录 |
| 2.3 RASS技术筛选获得的寡核苷酸文库序列 |
| 2.4 RASS获得的CTLA-4 mRNA结合文库序列 |
| 2.5 RASS筛选得到的CTLA-4基因结构靶点和体外验证靶点有效性结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分小鼠T淋巴细胞受体CTLA-4基因的新型干预分子pRNA引导型Ribozyme的构建和制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂及质粒载体 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 165 rRNA-Ribozyme的设计 |
| 1.2.2 pRNA 顺式连接开放型165 rRNA-Ribozyme分子的制备 |
| 1.2.3 165 rRNA-Ribozyme嵌入pRNA成自身环化闭合型分子的制备 |
| 1.2.4 165 rRNA-pRNA-Ribozyme聚合体的形成 |
| 1.2.5 165 rRNA-pRNA-Ribozyme体外对基因mRNA切割活性分析 |
| 1.2.6 CTLA4-pRNA-Ribozyme的设计与制备 |
| 1.2.7 三靶点CTLA4-pRNA-Ribozyme三聚体的设计与制备 |
| 1.2.8 CTLA4-pRNA-Ribozyme相关引物、序列设计 |
| 1.2.9 CTLA4-pRNA-Ribozyme体外切割活性分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 165 rRNA-Ribozyme的设计 |
| 2.2 165 rRNA-pRNA-Ribozyme顺式开放型结构的设计 |
| 2.3 Ribozyme 嵌入闭合型pRNA-Ribozyme结构的设计与制备 |
| 2.4 设计和制备的CTLA4-pRNA-Ribozyme |
| 2.5 CTLA4/165 rRNA-pRNA-Ribozyme聚合体分析 |
| 2.6 CTLA4/165 rRNA-pRNA-Ribozyme体外切割活性分析 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 英文缩略词表 |
| 附录2 在学期间研究成果目录 |
| 附录3 本人简历 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（2）Ribozyme和DNAzyme的基因治疗实验应用进展（论文提纲范文）
| 1 Ribozyme简介 |
| 2 Ribozyme的应用 |
| 2.1 抗病毒 |
| 2.1.1 抗HIV和艾滋病治疗 |
| 2.1.2 抗HBV和肝炎治疗 |
| 2.1.3 抗HPV感染 |
| 2.1.4 抗单纯疱疹病毒 |
| 2.2 抗肿瘤 |
| 2.2.1 白血病 |
| 2.2.2 神经胶质瘤 |
| 2.3 治疗神经系统疾病及其他疾病 |
| 2.4 抗移植排斥反应的研究进展 |
| 3 DNAzyme |
| 4 DNAzyme应用 |
| 4.1 抗病毒 |
| 4.1.1 抗HIV |
| 4.1.2 抗HBV |
| 4.1.3 抗人呼吸道合胞病毒 |
| 4.2 抗肿瘤 |
| 4.2.1 抑制平滑肌生长和血管生成 |
| 4.2.2 抑制肿瘤基因bcr/abl的表达 |
| 4.2.3 抑制恶性肿瘤 |
| 5 Ribozyme和DNAzyme临床应用一问题及其前景 |
（4）CTE-RHA复合核酶的构建及抑制HCV RNA复制和相应蛋白表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 含tRNA~(val)启动子的195位的核酶表达载体pPHCV5-R1的测序结果 |
| 3.2 含tRNA~(val)启动子的150位的核酶表达载体pPHCV5-R2的测序结果 |
| 3.3 以质粒pPSV-1为模板，经PCR获取目的基因，能顺利扩增出大小约173bp的条带 |
| 3.4 CTE介导的含tRNA~(val)启动子150位的核酶表达载体pPHCV5-CR2的测序结果 |
| 3.5 CTE介导的含tRNA~(val)启动子HCV5-NCR区195位的核酶表达载体pPHCV5-CR1的测序结果 |
| 3.6 质粒1.5%琼脂糖凝胶电泳图片及PCR鉴定结果 |
| 3.7 目标质粒P~(BM4-5 HCV)和空白质粒P~(RC/CMV)转染QSG7701细胞形成的阳性克隆图片 |
| 3.8 细胞总RNA1%琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.9 稳定转染细胞组RT-PCR鉴定 |
| 3.10 稳定转染细胞组westernBlotting鉴定 |
| 3.11 细胞总RNA1%琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.12 普通核酶和复合核酶对稳定转染的QSG7701细胞中HCV RNA的抑制作用 |
| 3.13 普通核酶和新核酶对稳定转染的QSG7701细胞中HCV蛋白表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
（5）小干涉RNA对丙型肝炎病毒复制和表达的抑制作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 RNA 干涉在抗病毒治疗中的应用研究进展 |
| 第二节 丙型肝炎基因治疗的研究进展 |
| 第二章 丙型肝炎N55A 基因真核表达载体的构建 |
| 第一节 实验材料和实验方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| （一） HCV N55A 基因的获取 |
| （二） 克隆载体pGEM-T/ HCV N55A 的构建 |
| （三） 表达载体pCI-neo/ HCV N55A 的构建 |
| 第二节 结果 |
| 一、HCV N55A 基因的PCR 结果 |
| 二、克隆载体pGEM-T/ HCV N55A 的双酶切结果 |
| 三、克隆载体pGEM-T/ HCV N55A 的测序结果 |
| 四、表达载体pCI-neo/ HCV N55A 的双酶切结果 |
| 第三章 HL-7702 细胞培养及pCI-neo/ HCV NS5A 表达质粒转染HL-7702 细胞 |
| 第一节 实验材料和实验方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| （一） 人肝细胞株HL-7702 细胞的复苏、传代与培养 |
| （二） 表达载体pCI-neo/ HCV N55A 转染HL-7702 细胞 |
| （三） 瞬时表达 HCV NS5A 蛋白细胞系的鉴定 |
| 第二节 结果 |
| 第四章 HCV N55A 不同位点表达siRNA 质粒的构建及对蛋白表达的影响 |
| 第一节 实验材料和实验方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| （一） 表达siRNA 质粒的制备 |
| （二） 转染条件 |
| （三） 表达siRNA 质粒转染含HCV N55A 基因的HL-7702 细胞 |
| 第二节 结果 |
| 一、表达siRNA 质粒测序结果 |
| 二、表达siRNA 质粒电泳结果 |
| 三、转染不同质粒对HCV N55A 蛋白表达的影响 |
| 第五章 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文、科研、获奖情况 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（6）古菌组蛋白（HphA）介导小发夹RNA抑制HCV 5’NCR和C区表达的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 绪论 |
| 第一章 慢性丙型肝炎治疗进展 |
| 一、丙型肝炎病毒分子生物学特点 |
| 二、目前的治疗 |
| 三、慢性丙型肝炎治疗的发展方向 |
| 四、正在研究中的新方法 |
| 第二章 RNA 干涉及其在抗病毒治疗中的研究进展 |
| 一、RNA 干涉的作用机制、设计原则和靶位点的选择 |
| 二、RNAi 的抗病毒作用研究 |
| 三、RNAi 抗病毒感染的途径和方法 |
| 四、小干涉RNA 的体内导入 |
| 第三章 前言 |
| 第二篇 实验研究 |
| 实验材料和实验方法 |
| 第一章 shRNA质粒表达载体的构建 |
| 第一节 实验方法 |
| 第二节 结果 |
| 第二章 质粒载体表达的shRNA抑制HCV 5'NCR和C区的表达 |
| 第一节 实验方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三章 古菌组蛋白介导的shRNA抑制HCV 5'NCR和C区表达 |
| 第一节 HphA 与DNA 结合实验 |
| 第二节 MTT 法检测重组蛋白HphA 对细胞的毒性 |
| 第三节 以古菌组蛋白为载体介导的shRNA质粒表达载体抑制HCV 5'NCR和C区表达 |
| 第三篇 讨论 |
| 一、小干涉RNA质粒表达载体 |
| 二、靶位点的选择 |
| 三、细胞模型 |
| 四、HCV特异性小干涉RNA的干涉效应 |
| 五、新型非病毒类载体古菌组蛋白 |
| 六、RNAi技术在抗HCV基因治疗中的应用前景 |
| 结论 |
| 本研究创新点及意义 |
| 1、靶位点选择 |
| 2、研究体系选择 |
| 3、新型载体的研究 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的论文及科研课题 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（8）应用RNAi技术抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验研究 |
| 第一部分 HepG2.2.15细胞的培养及鉴定 |
| 1 实验材料和实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 抗乙型肝炎病毒siRNA重组表达载体的构建 |
| 1 实验材料和实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 siRNA对HBV的抑制作用 |
| 1 实验材料和实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表和待发表的文章 |
| 致谢 |
四、抗HCV不同位点核酶细胞内活性的比较（论文参考文献）
- [1]靶向T细胞受体CTLA-4的新型核酸干预分子初步研究[D]. 周颖. 安徽医科大学, 2011(10)
- [2]Ribozyme和DNAzyme的基因治疗实验应用进展[J]. 周颖,毛建平. 中国生物工程杂志, 2010(06)
- [3]病毒性肝炎基因治疗研究的现状[J]. 牛俊奇,汪杨. 内科理论与实践, 2007(04)
- [4]CTE-RHA复合核酶的构建及抑制HCV RNA复制和相应蛋白表达的研究[D]. 刘波. 中南大学, 2007(05)
- [5]小干涉RNA对丙型肝炎病毒复制和表达的抑制作用[D]. 苏秀芬. 吉林大学, 2007(03)
- [6]古菌组蛋白（HphA）介导小发夹RNA抑制HCV 5’NCR和C区表达的研究[D]. 丁艳华. 吉林大学, 2007(03)
- [7]丙型病毒性肝炎基因治疗实验研究[A]. 牛俊奇,王峰,王美霞,华瑞,温小玉,田梅梅,郑锦辉. 增强自主创新能力 促进吉林经济发展——启明杯·吉林省第四届科学技术学术年会论文集（下册）, 2006
- [8]应用RNAi技术抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究[D]. 张岩. 第四军医大学, 2005(06)
- [9]慢性病毒性肝炎的基因治疗研究现状[J]. 邓鑫,梁健. 浙江中西医结合杂志, 2004(11)
- [10]功能基因组学中的功能缺失研究策略[J]. 成军. 世界华人消化杂志, 2004(10)