一、IFN-α对大鼠肝纤维化间质胶原酶基因表达的调控（论文文献综述）
娄莹莹[1]（2013）在《基于浊毒理论的肝复健方抗大鼠肝纤维化作用及机制研究》文中研究说明肝纤维化（Hepatic fibrosis,HF）是指各种致病因素所引起肝脏内细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的合成大于降解，致使ECM在肝脏内过度沉积，它是大多数慢性肝病所共有的病理特征，也是慢性肝炎进一步向肝硬化、肝癌发展的重要环节。肝纤维化是可被逆转的阶段，如能阻断和逆转肝纤维化的发生，就可阻止严重后果的发生。肝纤维化的形成是一个多因素、多环节、多阶段的复杂过程，其形成不是静止的，而是不断变化的动态过程。各种细胞因子形成的复杂调节网络，不断影响着肝纤维化的形成和转归。从细胞因子及其信号转导角度研究药物的作用机制，将不断深化肝纤维化的治疗学研究。瘦素（leptin）与肝纤维化的形成之间有着密切的关系，与瘦素受体结合后，激活相应的信号转导通路，促进肝纤维化的发生发展。目前临床上仍然缺乏确切特效的抗纤维化药物与方法。中医药具有多层次、多环节、多途径、多靶点的作用特点，在治疗肝纤维化方面取得了显着的成果。李佃贵教授提出浊毒内蕴，肝络瘀滞是肝纤维化的主要病机之一，并从浊毒论治肝纤维化，在此指导下确立肝复健方，取得显着疗效。既往临床及实验研究表明，肝复健方具有明显的阻断病毒性乙型肝炎慢性化、减轻肝纤维化及保护肝功能的作用。本课题继续在腹腔注射猪血清复制免疫性肝纤维化模型的基础上，观察肝复健方对大鼠肝组织病理形态学、肝纤四项、MMP-1、瘦素（leptin）及其受体（OB-Rb）、JAK2、STAT3的表达情况，探讨其对瘦素调控肝纤维化大鼠JAK2/STAT3信号转导通路的影响，旨在对本方抗HF的药效和可能的作用机制进一步的研究，为肝纤维化的预防与治疗提供理论依据。本实验分为以下五部分：第一部分浊毒理论与肝纤维化目的：探讨浊毒理论与肝纤维化的关系，明确其在肝纤维化中的重要地位，提出肝纤维化治疗的新观点与新方法。方法：通过温习、回顾、整理中医文献，并结合临床实践经验，提出浊毒理论，提出肝纤维化的新病机，系统总结了肝纤维化浊毒证证治规律。结果：提出了浊毒理论，明确了浊毒的概念、临床表现及致病特点。探讨了浊毒与肝纤维化的关系，总结出了肝纤维化浊毒证证治规律，从临床上验证了从浊毒治疗肝纤维化的可行性。结论：浊毒理论是中医学术体系的新的组成部分，是研究浊毒致病的病因、病机、诊断、治疗等理法方药的学科。浊毒与肝纤维化关系密切，是其发生发展的关键环节。第二部分肝复健方对肝纤维化大鼠病理形态学和血清标志物的影响目的：观察肝复健方对猪血清诱导的肝纤维化大鼠病理形态学及血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原含量的影响，探讨其抗纤维化的作用机制。方法：清洁级SD大鼠60只，雄性，体重200±20g。适应性喂养一周后随机分为正常对照组（Normal group）、模型组（Model group）、秋水仙碱组（Colchicine）、肝复健方低剂量组（GFJL group）、肝复健方中剂量组（GFJM group）、肝复健方高剂量组（GFJH group）六组，每组10只。每周二、周五上午8点，采用无菌未灭活的猪血清腹腔注射进行造模，连续8周。造模成功后正常对照组与模型组给予生理盐水（10ml/kg），日1次灌胃。GFJL组给予含生药1.4g/ml水煎剂灌胃；GFJM组给予含生药2.8g/ml水煎剂灌胃；GFJH组给予含生药4.2g/ml水煎剂灌胃（灌胃液体量为10ml/kg，1次/d）；秋水仙碱组给予0.154mg/kg·d灌胃，均至12周末。实验期间观察大鼠的一般情况。12周末采用腹主动脉取血，分离血清，用放射免疫分析法测定各组大鼠血清中HA、LN、PCIII、CIV水平。留取大鼠肝组织，采用苏木精-伊红染色（HE染色）和胶原纤维特殊染色法（Masson染色）观察肝组织病理形态学改变。结果：1一般情况正常对照组一般情况良好，精神状态好，活泼好动，大鼠食欲佳，进食量正常，皮毛光滑，体重逐渐增加。模型组大鼠精神萎靡、不喜活动，进食较正常组少，皮毛杂乱、黯淡无光泽、尿黄，个别大鼠鼻有出血，体重增长变慢。秋水仙碱及中药治疗各组大鼠精神状态、活动、进食量尚可，被毛光泽，体重有所增加，无特殊异常状态出现。2肝脏大体观察正常组大鼠肝脏质地较软，表面光滑，略呈深红色，有光泽，无任何斑点、突起，边缘锐利。模型组大鼠肝脏质地硬，表面欠光滑，部分标本表面粗糙，凹凸不平，颜色暗红，边缘钝。秋水仙碱及中药治疗组大鼠肝脏质较脆，表面较光滑，颜色基本正常，基本无斑点、突起等。3肝复健方对肝纤维化大鼠肝组织病理的影响正常组肝小叶结构清晰完整，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无变性坏死，未见纤维组织增生及炎性细胞浸润。模型组肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，肝细胞变性，部分肝细胞坏死，伴有中性粒细胞及淋巴细胞浸润，纤维组织大量增生，个别动物可见假小叶形成。秋水仙碱组与中药治疗各组肝脏损伤程度均较模型组轻，肝小叶结构破坏减轻，肝脏胶原纤维增生减轻，肝细胞水肿好转，变性情况明显改善，炎细胞浸润减少。肝复健方高剂量组肝脏结构改善最为明显。4肝复健方对肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV的影响与正常对照组相比，模型组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型对照组相比，12周末各药物干预组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平下降（P<0.05）。肝复健方高剂量组血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平显着性降低，优于秋水仙碱组、中剂量组及低剂量组（P＜0.05）；秋水仙碱组、肝复健中剂量组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）；秋水仙碱组与肝复健方低剂量组比较，血清HA、LN、PCⅢ、CIV水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：肝复健方能够改善大鼠的一般状况，显着降低大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原含量，促进ECM的降解，抑制纤维组织增生，改善肝纤维化大鼠的病理组织结构，恢复肝细胞损伤，达到抗肝纤维化的作用。第三部分肝复健方对肝纤维化大鼠瘦素及瘦素受体表达的影响目的：观察肝复健方对血清瘦素、肝组织瘦素及瘦素受体的影响，进一步明确瘦素在肝纤维化形成过程中的生物学效应以及化浊解毒法抗肝纤维化的深层作用机制。方法：放射免疫分析法检测血清瘦素（Leptin）水平，逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）技术检测肝组织瘦素（leptin）及瘦素受体（OB-Rb）的表达。结果：1肝复健方对大鼠血清Leptin水平的影响与正常对照组相比,模型对照组、各药物组血清瘦素水平明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）；与模型对照组相比，秋水仙碱组和肝复健方各剂量组血清瘦素水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。各药物治疗组比较，肝复健方高剂量组血清瘦素水平显着性降低，优于秋水仙碱组、中剂量组及低剂量组（P＜0.05），秋水仙碱组与中剂量组比较，无显着性差异（P﹥0.05）。秋水仙碱组与低剂量组比较，血清瘦素水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。2肝复健方对大鼠肝组织Leptin、OB-RbmRNA表达的影响与正常对照组相比，模型对照组、秋水仙碱组和肝复健方各剂量组Leptin、OB-RbmRNA的表达明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比，秋水仙碱组和肝复健方各剂量组Leptin、OB-RbmRNA表达明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。各药物治疗组比较，肝复健方高剂量组Leptin、OB-RbmRNA表达显着性降低，优于秋水仙碱组、中剂量组及低剂量组（P＜0.05），秋水仙碱组与中剂量组比较Leptin、OB-RbmRNA的表达有下降趋势，但均无显着性差异（P﹥0.05）。秋水仙碱组与低剂量组比较，Leptin、OB-RbmRNA的表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：瘦素是内生浊毒的物质基础之一，肝复健方能够有效降低肝纤维化模型大鼠瘦素及瘦素受体的表达，减少两者的结合，进而抑制下游信号转导通路，从而达到抗肝纤维化的作用。第四部分肝复健方对大鼠肝组织MMP-1表达的影响目的：观察肝复健方对HF大鼠肝脏MMP-1表达的影响，从分子水平探讨肝复健方抗肝纤维化的深层作用机理。方法：逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）技术检测肝组织MMP-1的表达。结果：与正常对照组相比，模型对照组、秋水仙碱组和肝复健方各剂量组MMP-1mRNA的表达均明显减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型对照组相比，秋水仙碱组和肝复健方各剂量组MMP-1mRNA表达明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。各药物治疗组比较，肝复健方高剂量组MMP-1mRNA的表达显着性增强，优于秋水仙碱组、中剂量组及低剂量组（P＜0.05），秋水仙碱组与中剂量组比较MMP-1mRNA的表达有增强趋势，但均无显着性差异（P﹥0.05）。秋水仙碱组与低剂量组比较，MMP-1mRNA的表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：肝复健方可以显着提高MMP-1mRNA的表达水平，通过抑制HSC合成和分泌瘦素，促进MMP-1的表达，从而使细胞外基质降解，阻碍肝纤维化进程。第五部分肝复健方对肝纤维化大鼠肝组织JAK2/STAT3信号转导通路的影响目的：观察肝复健方对HF大鼠肝脏JAK2、STAT3蛋白表达的影响，以进一步探讨肝复健方抗肝纤维化的深层作用机理，为临床防治肝纤维化提供理论依据方法：Western blot检测HF大鼠肝组织JAK2、STAT3的表达。结果：1肝复健方对大鼠肝组织JAK2蛋白表达的影响（1）所有实验组大鼠肝组织中JAK2的表达量均高于正常对照组（P<0.05）。（2）肝复健方各剂量组及秋水仙碱组与模型组相比JAK2的蛋白表达量显着性降低（P<0.05）。（3）肝复健方中剂量组与秋水仙碱组相比JAK2蛋白表达量均无显着性差异（P﹥0.05）；秋水仙碱组与肝复健方低剂量组相比JAK2蛋白的表达量有显着性降低（P<0.05），肝复健方高剂量组与秋水仙碱组相比，JAK2蛋白的表达量有显着性降低（P<0.05）。（4）肝复健方药不同剂量组之间比较，高剂量组JAK2蛋白的表达量优于中剂量组，中剂量组优于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。2肝复健方对大鼠肝组织STAT3蛋白表达的影响（1）所有实验组大鼠肝组织中STAT3的表达量均高于正常对照组（P<0.05）。（2）肝复健方各剂量组及秋水仙碱组与模型组相比STAT3的蛋白表达量有显着性降低（P<0.05）。（3）肝复健方中剂量组与秋水仙碱组相比STAT3蛋白表达量均无显着性差异（P﹥0.05）；秋水仙碱组与肝复健方低剂量组相比STAT3蛋白的表达量有显着性降低（P<0.05），肝复健方高剂量组与秋水仙碱组相比，STAT3蛋白的表达量有显着性降低（P<0.05）。（4）肝复健方药不同剂量组之间比较，高剂量组STAT3蛋白的表达量优于中剂量组，中剂量组优于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：肝复健方能够下调肝纤维化大鼠肝组织JAK2、STAT3的表达，进而抑制HSC活化、增殖，降低胶原的表达和分泌，最终起到抗肝纤维化的作用。瘦素调控的JAK2/STAT3信号转导通路是肝复健方抗肝纤维化的新的作用途径和作用靶点。
秦哲[2]（2012）在《黄芪发酵后主要有效成分变化分析及多糖对大鼠实验性肝纤维化影响》文中研究说明黄芪是临床常用中药，其主要成分黄芪多糖具有提高免疫力、抗病毒、抗菌、抗氧化、调节血糖、保肝护肾等多种药效作用。然而，由于生药黄芪中黄芪多糖提取得率较低而限制了其广泛应用。前期研究表明，生药黄芪经M-9菌株发酵后，发酵产物中粗多糖得率显着提高。但发酵黄芪的质量控制，药效成分的含量变化及其药理学作用有待研究。因此论文首次开展了发酵黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷的含量测定，发酵后黄芪皂苷和多糖的最佳提取工艺条件的优化及发酵黄芪多糖对实验性大鼠肝纤维化的影响并运用数字基因表达谱分析其作用机理。为今后发酵黄芪的药理学深入研究、开发利用及益生菌发酵转化机理的阐述提供理论依据。1.高效液相色谱法测定发酵黄芪和生药黄芪中黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量参照2010版《中国药典》黄芪有效成分含量测定方法，应用高效液相色谱法分别对发酵黄芪、生药黄芪中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量进行测定，结果为0.049%、0.087%、0.030%和0.040%。含有等量黄芪的发酵黄芪和生药黄芪中黄芪甲苷的含量分别为0.063%和0.087%，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量分别为0.038%和0.040%。结果提示，发酵前后毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量差异不显着，而发酵后黄芪甲苷的含量降低了27.6%。这两种成分的含量变化可为发酵黄芪产品的质量控制提供参考。2.发酵黄芪和生药黄芪中黄芪多糖和皂苷的提取分离及含量测定采用综合提取黄芪皂苷和黄芪多糖的方法并筛选提取工艺。黄芪皂苷和黄芪多糖最佳提取工艺条件为：称取一定量黄芪粗粉，用20倍量80%乙醇于80℃回流提取黄芪皂苷，烘干药渣用于黄芪多糖提取。A.黄芪皂苷提取工艺：醇提液制成浸膏后取适量溶于50倍量纯水，上样于AB-8大孔树脂柱，经80%乙醇洗脱得皂苷富集部位中皂苷含量达81.23%。B.通过比较温浸法、传统水煎法、纤维素酶法及饱和生石灰水法，优选出温浸法提取黄芪多糖，提取工艺为：药渣用20量纯水，80℃温浸提取4.5h，离心，浓缩，Sevag法除蛋白，透析，醇沉，无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤，烘干，得黄芪粗多糖。C.香草醛-硫酸法测得生药黄芪浸膏和发酵黄芪浸膏中皂苷含量分别为16.87%和10.81%，皂苷的提取率分别为0.0654%和0.0558%。苯酚-硫酸法测定多糖含量，发酵黄芪多糖（FAPS）含量及得率分别为66.59%，4.35%；生药黄芪多糖（APS）含量及得率分别为36.01%，2.73%。结果提示，黄芪经发酵后多糖含量及得率分别提高84.92%和59.34%，发酵后皂苷提取率降低17.20%。经薄层层析法测定FAPS中主要糖单组分为葡萄糖、甘露糖等，主要多糖组分为FAPS-2-1的糖含量为95.41%，其数均分子量为1,564,267Da，重均分子量为1,753,456Da。3. FAPS对大鼠实验性肝纤维化的作用及机制研究采用皮下注射CCl4的方法制备大鼠肝纤维化模型。造模同时给予不同药物干预，研究FAPS对大鼠肝纤维化的作用。雄性SD大鼠60只，随机分为6组，发酵黄芪高剂量组（FAPSH）200mg·kg-1·d-1，发酵黄芪中剂量组（FAPSM）100mg·kg-1·d-1，发酵黄芪低剂量组（FAPSL）50mg·kg-1·d-1，秋水仙碱组（Col.）0.2mg·kg-1·d-1，CCl4模型组和对照组给予等体积生理盐水，持续8周。结果得出，FAPS各剂量组大鼠体重均高于模型组，FAPS可显着降低小鼠血清中的ALT、AST、ALP活性（P<0.01），可显着降低肝组织中Hyp含量（P<0.05）及血清中HA，LN，CⅣ，PⅢNP的水平，使降低的GSH-Px （P<0.01）、T-AOC （P<0.05）和GST值显着升高，使异常升高的GSH和MDA含量趋于正常。尤其是FAPSH组各项抗肝纤维化指标均优于FAPSM和FAPSL。通过H.E.、Masson染色及透射电镜观察大鼠肝组织病理变化发现，模型组大鼠肝细胞脂肪空泡化和纤维化病变明显，给予不同药物干预的各组肝组织病理变化有所减轻。结果提示，FAPS对CCl4所致大鼠实验性肝纤维化有一定的修复作用，作用程度与剂量成一定的相关性，FAPSH(200mg·kg-1·d-1)与Col.(0.2mg·kg-1·d-1)防治肝纤维化效果相当，其原理可能与其抗氧化作用有关。4.各组大鼠肝组织数字基因表达谱差异分析应用数字基因表达谱技术建立对照组、模型组、Col.、FAPSL、FAPSM和FAPSH的肝脏表达谱，初步分析差异基因的表达和功能。结果表明，模型组与对照组表达谱差异基因总共有2324个（表达量上调基因2162个，下调基因162个），差异基因通过多个细胞生物学过程中的218个信号通路参与肝纤维化的形成，特别是引起PPAR信号通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、Jak-STAT信号通路中多个基因表达量表达量下调。Col.组、FAPSL组、FAPSM组、FAPSH组肝脏表达谱与CC14模型组进行比较，结果表明FAPS可显着抑制TGF-β、PPAR信号通路多个关键基因的上调而抑制HSCs的活化，特别是SCD-1基因表达量显着下调，表明FAPS可以显着降低肝脏SCD活性，推测FAPS对CCl4引起的肝纤维化的改善作用机制可能为通过抑制SCD活性，削弱单不饱和脂肪酸的生成来减少肝脏脂质蓄积从而抑制HSCs的活化。
张红[3]（2012）在《软肝冲剂对免疫性肝纤维化大鼠的实验研究》文中研究说明目的：研究中药复方软肝冲剂治疗肝纤维化的作用机理。材料与方法：将95只wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、秋水仙碱组和软肝冲剂高、中、低剂量组，除空白对照组外，其余组采用猪血清腹腔注射诱导免疫性肝纤维化模型，0.5ml/只,每周2次，连续5周后改为每周1次，共注射10周。各组于造模后第六周开始灌胃给药，软肝冲剂高、中、低剂量组分别按7.5g/kg、5g/kg、2.5g/kg灌胃；秋水仙碱组按0.1mg/kg灌胃；空白对照组和模型组给予0.9%生理盐水10ml/kg灌胃，日1次，至10周末结束。观察软肝冲剂各剂量组大鼠的肝功能指标（AST、ALT、TP、ALB），血清肝纤维化指标（HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C），以及肝细胞超微结构的变化，并用聚合酶链反应法检测TGF-β1mRNA的表达。结果：⑴肝功能指标：与空白对照组相比，模型组血清AST、ALT水平显着升高，TP、ALB含量明显降低（@P<0.01）。软肝冲剂各剂量组和秋水仙碱组血清AST、ALT水平及TP、ALB含量与模型组相比有极显着性差异（*P<0.01）。软肝冲剂各剂量组在降低血清AST、ALT水平方面明显优于秋水仙碱组（△P<0.01）。与秋水仙碱组相比，软肝冲剂高、中剂量组血清TP、ALB含量均有不同程度的上升，差异有统计学意义（△P<0.01或▽P<0.05）。而软肝冲剂低剂量组TP、ALB含量与秋水仙碱组相比无明显差异（P>0.05）。⑵肝纤维化指标：模型组血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ含量均明显高于正常对照组，经统计学处理有极显着性差异（@P<0.01）。软肝冲剂各剂量组和秋水仙碱组血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ含量与模型组比较均有不同程度的下降，差异显着（*P<0.01）。软肝冲剂高、中剂量组在降低血清HA、LN、Ⅳ-C和PCⅢ方面明显优于秋水仙碱组（▲P<0.01）。软肝冲剂小剂量组血清Ⅳ-C、PCⅢ含量明显低于秋水仙碱组（△P<0.05或▲P<0.01）；但血清HA和LN的含量高于秋水仙碱组（▲P<0.01或△P<0.05）。与秋水仙碱组和软肝冲剂中、低剂量组比较，软肝冲剂高剂量组血清HA、LN、Ⅳ-C、PCⅢ含量明显减少，有极显着性差异（＃P<0.01）。⑶肝细胞超微结构：模型组肝细胞固缩，细胞表面微绒毛明显减少，细胞间隙增宽；细胞核萎缩，核膜扩张；胞质内细胞器数量明显减少；线粒体电子密度增强，嵴消失，部分线粒体出现空泡样改变；粗面内质网重度扩张，表面核糖体脱落，糖原颗粒消失，溶酶体较少。秋水仙碱组肝细胞形态基本正常，有大量线粒体，嵴显示不清，粗面内质网较少，表面核糖体部分脱落，糖原颗粒增多，分散于细胞质中，可见大量大小不等的溶酶体颗粒。软肝冲剂高剂量组肝细胞形态完好，相邻细胞间排列较整齐，细胞器丰富，线粒体体积较小，数量较多，嵴清晰可见。软肝冲剂中剂量组肝细胞膜清晰，细胞核及核膜基本正常，细胞器较丰富，线粒体数量尚可，体积较小，偶见嵴，偶有空泡样改变。糖原颗粒较少。软肝冲剂低剂量组肝细胞轻度固缩，胞质内细胞器数量减少，线粒体数量较多，体积小，嵴不清晰。⑷分子生物学指标：与空白对照组相比，模型组TGF-β1mRNA的表达明显增加（@P<0.01）。与模型组比较，软肝冲剂各剂量组和秋水仙碱组的RI指数均有不同程度的下降，经统计学处理有极显着性差异（*P<0.01）。软肝冲剂各剂量组TGF-β1mRNA的表达明显低于秋水仙碱组（△P<0.01）。结论：软肝冲剂能有效的改善肝功能，抑制胶原合成，抑制TGF-β1mRNA的表达，对肝损伤后的超微结构有明显的保护作用，该药可以阻止甚至逆转肝纤维化进程。
杨欣[4]（2011）在《乙肝转阴颗粒对化学性肝损伤和慢性肝纤维的保护作用及其机制研究》文中研究说明目的:研究乙肝转阴颗粒（YGZYDG）对小鼠化学性肝损伤的保护作用及其机制。方法:分别采用四氯化碳（CCl4）皮下注射小鼠和D-半乳糖胺盐酸盐（D-GalN）腹腔注射小鼠,建立化学性肝损伤模型。各型肝损伤实验中,均把昆明种小鼠随机分为正常对照组（NC）,肝损伤模型组,YGZYDG高（YGZYDGH）、YGZYDG中（YGZYDGM）、YGZYDG低（YGZYDGL）剂量组,阳性对照组。观察小鼠肝脏重量指数,脾脏重量指数,胸腺重量指数;测定血清ALT、AST、碱性磷酸酶（AKP）活性,总抗氧化能力（T-AOC）以及血清白蛋白（Alb）含量;肝组织丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性。HE染色观察各组小鼠肝细胞损伤程度。结果:与模型组比较,YGZYDG对脾脏重量无明显影响,能减轻肝脏和胸腺重量;降低血清ALT、AST、AKP活性,肝组织MDA含量;提高T-AOC水平,增加血清Alb含量、肝组织SOD活性（P<0.01或P<0.05）;能够减轻肝细胞损伤程度。结论:YGZYDG对小鼠化学性肝损伤具有保护作用,其机制可能与其抗氧自由基、抑制脂质过氧化作用有关。目的:研究乙肝转阴颗粒（YGZYDG）对四氯化碳（Carbon tetra-Chloride, CCl4）所致大鼠肝纤维化的治疗作用,并探讨其作用机制。方法:Wistar大鼠随机分成两组,模型组大鼠采用50% CCl4花生油溶液i.g.造模,共8周,正常组用NS代替。将病理检查确认肝纤维化形成的Wistar大鼠50只,随机分成5组,分别给予相应药物进行干预,每日1次,连续5周。末次给药24 h后处死大鼠。（1）采集血清及肝组织,检测大鼠血清中ALT、AST和肝组织中Hyp、SOD、MDA、GSH-PX的含量。观察肝脏重量指数,脾脏重量指数,胸腺重量指数;（2）于肝左叶同一部位取肝组织约1 cm×1 cm×l cm大小,固定于4%多聚甲醛溶液,HE染色观察各组大鼠肝脏纤维程度。（3）以RT-PCR法检测肝组织中Col-I、TIMP-1、TGF-β1 mRNA的表达。结果:（1）与模型组比较,YGZYDG不同程度的降低肝指数和胸腺指数（P<0.01或P<0.05）;但对脾脏重量无明显影响。（2）与模型组比较,各剂量的乙肝转阴颗粒及阳性药能显着降低大鼠血清中CCl4所致异常升高的ALT和AST（P<0.01）;同时,各剂量的乙肝转阴颗粒能显着提高肝组织中异常降低的SOD、GSH-PX含量（P<0.05或P<0.01）,并显着降低异常升高的Hyp、MDA含量（P<0.05或P<0.01）。（3）HE染色病理结果显示,与模型组比较,乙肝转阴颗粒高、中、低剂量及阳性组大鼠肝脏纤维化程度明显减轻（P<0.05或P<0.01）。（4）YGZYDG各剂量组和阳性药均可不同程度地下调TIMP-1、TGF-β1 mRNA的表达（P<0.01）;YGZYDG高、中剂量组和阳性药可显着下调Col-I mRNA的表达（P<0.01）。结论:乙肝转阴颗粒对大鼠化学性肝损伤具有一定程度的治疗作用,其机制可能是清除自由基,抑制脂质过氧化,同时抑制胶原合成与沉积,减少细胞外基质（ECM）的沉积和促进ECM的降解。目的:研究乙肝转阴颗粒及其含药血清对HSC-T6增殖以及相关基因的的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞（HSC-T6）,MTT法检测乙肝转阴颗粒及其含药血清对HSC-T6的抑制作用。RT-PCR法测定其对Col-I、TIMP-1及TGF-β1mRNA表达的影响。结果:乙肝转阴颗粒及其含药血清可显着抑制HSC-T6的增殖;YGZYDG各浓度组可显着下调细胞Col-I、TIMP-1、TGF-β1mRNA的表达（P<0.01）;YGZYDGS各浓度组可显着下调细胞TIMP-1、TGF-β1mRNA的表达（P<0.01）;YGZYDGS高、中浓度组可下调细胞Col-I mRNA的表达（P<0.05或P<0.01）。结论乙肝转阴颗粒及其含药血清可抑制肝星状细胞增殖,并抑制胶原蛋白的生成、促进ECM的降解,这可能是其抗肝纤维化的作用机制之一。
王绍展[5]（2011）在《苦参碱结构修饰物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用及机制研究》文中进行了进一步梳理【研究背景及目的】肝纤维化（hepatic fibrosis,HF）是指在各种致病因子如炎症、损伤、药物、遗传因素等的作用下,活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞（myofibroblasts, MFs）增多,细胞外基质（extracellular matrix, ECM）大量沉积的病理改变。它是继发于各种形式慢性肝损伤之后组织修复过程中的代偿反应,亦是慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程。肝纤维化为一动态过程,属可逆性病变,因此,阻断、抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个重要目标。既往认为,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是肌成纤维细胞（myofibroblasts）的最主要来源。但是,晚近研究表明原位间质细胞、上皮细胞及内皮细胞,尤其是胆管细胞和肝细胞也被证明可通过上皮细胞间质转型（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）向肌成纤维细胞转化,表明肝实质的上皮细胞也参与肝纤维化进程。苦参碱是从中国传统中药苦参中提取的一种生物碱,目前的研究发现其抗炎,免疫调节,对小鼠急性肝损伤具有保护作用,并能抗大鼠实验性肝纤维化作用。虽然苦参碱的药理作用广泛,但是活性不高,需要对其进行结构改造,得到活性更强、毒性更低的衍生物。再者,苦参碱的药理作用机制不明确,特别是其靶标蛋白的研究仍是空白。本课题组前期研究发现,苦参碱的羰基氧原子被硫原子取代后,其药理活性大为增强,为此我们对苦参碱进行结构改造,得到40多个苦参碱衍生物。本研究首先对部分苦参碱衍生物进行抗RAW264.7细胞释放TNF-α作用和抑制NF-кB转录活性的筛选,挑选出药效高,毒性低的苦参碱衍生物-19（M-19）;接着对M-19治疗BDL和DMN诱导的大鼠实验性肝纤维化效果进行评价,并初步探讨M-19阻遏EMT进程是其抗肝纤维化的作用机制之一;对M-19抑制TGF-β1诱导原代培养肝细胞、原代培养肝星状细胞和肝星状细胞系HSC-T6细胞EMT进程的阻断,以及对HSC-T6细胞增殖抑制、凋亡诱导作用的研究,阐释M-19抗肝纤维化的多环节机制;通过连续亲和色谱法、竞争亲和色谱法结合MALDI-TOF-TOF质谱鉴定等技术,确证Mat及M-19的特异结合蛋白为核糖体蛋白S5（RPS5）。通过免疫组化和Real-time PCR检测RPS5在纤维化模型大鼠组织中表达变化,以及RPS5在原代肝星状细胞和HSC-T6细胞EMT中的作用研究,推测Mat及M-19可能通过抑制肝脏细胞RPS5的降解或表达水平的下降,而发挥抗肝纤维化作用。【实验方法】一、苦参碱衍生物抗RAW264.7细胞释放TNF-α和抑制NF-кB转录活性筛选（一）采用MTT法测定不同浓度的苦参碱及苦参碱衍生物处理24h,对RAW264.7细胞增殖活性的影响,以比较药物的细胞毒性作用,并确定安全的药理作用浓度范围。（二）分别采用细胞毒结晶紫法和ELISA法对LPS刺激的RAW264.7细胞上清中的TNF-α生物学活性和含量进行测定,比较苦参碱和一系列苦参碱衍生物对RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制作用,筛选出高活性衍生物。（三）采用双荧光素酶报告基因法,测定苦参碱衍生物对LPS刺激的RAW264.7细胞NF-кB转录活性的抑制作用,进一步比较药物的药理活性。二、苦参碱及苦参碱衍生物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用研究（一）苦参碱及苦参碱衍生物-19对BDL大鼠肝纤维化的抑制作用将雄性SD大鼠随机分为7组,假手术组6只,其余各组10只,分设假手术组、胆总管结扎组、苦参碱衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治疗组,苦参碱50mg/kg治疗组,氧化苦参碱50mg/kg治疗组。钝性分离并结扎胆总管,制备BDL肝纤维化模型。术后3d ,各药物组灌胃给予相应药物处理,假手术组和胆总管接扎组灌胃生理盐水。于接扎后第25d处死大鼠,碱水解法测定各组肝组织羟脯氨酸含量;HE染色观察纤维化程度,Masson和Sirius red染色以计算ECM含量。Real time RT-PCR及免疫组织化学法测定肝组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌激动蛋白（α-SMA）、钙粘附蛋白（E-cadherin）、HNF4α和TGF-β1等EMT相关基因的表达。（二）苦参碱及苦参碱衍生物-19对DMN损伤大鼠肝纤维化的抑制作用将雄性SD大鼠随机分为7组,对照组7只,其余各组每组10只,分设假手术组、胆总管结扎组、苦参碱衍生物-19 :12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg治疗组,苦参碱50mg/kg治疗组,氧化苦参碱50mg/kg治疗组。除空白对照组外,其余各组予1%DMN溶液按照10μg/kg的剂量腹腔注射,每周连续注射3次,共注射5w,制备DMN诱导的大鼠肝纤维化模型。于DMN注射第5w起各组灌胃给予相应药物治疗,空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水处理。药物治疗3w后处死,观察指标同BDL模型。三、M-19体外抗肝纤维化作用机制研究（一）M-19对原代肝细胞EMT抑制作用研究分离制备原代培养SD大鼠肝细胞,培养2 d后,换成含有2ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时设立空白对照组和M-19: 5 ,10,20 umol/L处理组。刺激48h后,提取细胞总RNA。Real time RT-PCR法检测肝细胞核因子4α（HNF4α）、上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）等基因mRNA水平。（二）M-19对原代肝星状细胞EMT抑制作用研究分离制备原代培养SD大鼠肝细胞,培养2 d后,换成含有2ng/ml TGF-β1无血清培养基,同时设立空白对照组和M-19: 5 ,10,20 umol/L处理组。刺激24h后,提取细胞总RNA。Real time RT-PCR法检测α-SMA、Vimentin和Collagen I等基因mRNA水平。（三）M-19对肝星状细胞系HSC-T6 EMT抑制作用研究HSC-T6细胞1.5×105/well分于6孔细胞培养板,培养24h后,加入2ng/ml TGF-β1刺激24h,同时设立空白对照组、苦参碱衍生物-19: 2.5,5,,10umol/L处理组。收集细胞,提取总RNA,Real time RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA、CollagenI和CollagenIII基因的mRNA水平（四）M-19对肝星状细胞系HSC-T6增殖抑制作用研究HSC-T6细胞1.5×104/well分于96孔细胞培养板,培养24h后,加入终浓度为0.8 , 4 , 10, 20, 40, 100 umol/L M-19,继续处理24h或48h。MTT法测定细胞的增殖活性（五）M-19诱导肝星状细胞系HSC-T6凋亡作用研究HSC-T6细胞1.5×104/well分于6孔细胞培养板,培养24h后,加入终浓度为10,20,40 umol/L的M-19,继续处理24h,收集细胞,流式细胞术检测凋亡率四、MAT和M-19特异结合蛋白的研究（一）连续亲和色谱法和竞争亲和色谱法分离苦参碱特异结合蛋白采用苦参碱共价结合树脂,从RAW264.7细胞和Jurkat细胞裂解液中分离苦参碱的特异结合蛋白;采用MALDI-TOF-TOF质谱鉴定特异结合蛋白的多肽序列,数据库分析特异结合蛋白为核糖体蛋白S5（RPS5）;再通过RPS5的抗体免疫印迹检测确证。（二）生物素亲和素系统分离M-19特异结合蛋白RPS5构建M-19共价结合生物素,与HSC-T6细胞共孵育6h,利用亲和素从细胞裂解液中分离M-19特异结合蛋白;通过RPS5的抗体免疫印迹检测确证（三）M-19与RPS5共定位分析构建M-19共价结合生物素（biotin-M-19）,与HSC-T6细胞共孵育6h,免疫细胞化学特异性双标biotin-M-19和RPS5,激光共聚焦共定位分析五、RPS5与肝纤维化关系研究（一）RPS5在肝纤维化模型中表达水平变化采用免疫组织化学和Real time RT-PCR技术,检测BDL和DMN致大鼠肝纤维化模型中RPS5蛋白和基因mRNA水平表达变化（二）RPS5在原代肝星状细胞活化过程中表达水平变化采用Real time RT-PCR技术,检测原代分离肝细胞在体外培养自发活化过程中,RPS5基因mRNA表达水平变化（三）TGF-β1刺激下HSC-T6细胞RPS5表达水平变化采用Western blot检测TGF-β1刺激HSC-T6细胞1,3,5,7d RPS5蛋白表达水平变化情况（四）RPS5 siRNA对HSC-T6细胞EMT的影响转染RPS5 siRNA序列si335于HSC-T6细胞,48h后检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达情况【实验结果】一、苦参碱及其衍生物抗RAW264.7细胞释放TNF-α和抑制NF-кB转录活性研究30μM的苦参碱衍生物-19,24,对RAW细胞增殖没有抑制作用,且在此浓度时对LPS刺激的RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制率分别为70.0%和83.6%（P<0.001）,效果高于其余药物。30μM的苦参碱衍生物-19,24处理组RAW264.7细胞NF-кB转录活性分别降低为LPS刺激组的48.2% （P=0.002）和52%（ P=0.002）。二、苦参碱及苦参碱衍生物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用研究（一）苦参碱及苦参碱衍生物-19对BDL大鼠肝纤维化的抑制作用M-19 50mg/kg治疗组与BDL模型组相比:肝组织羟脯氨酸含量（387.74±59.41μg/g） ,较模型对照组（564.18±104.27μg/g）显着减少（ P =0.0003）;肝组织胶原面积减少37% （P<0.001）;免疫组织化学检测显示TGF-β1、α-SAM和Desmin等蛋白表达显着下调,HNF4α的蛋白表达显着上调;Real-time PCR检测结果表明α-SAM、CollagenIII、TGF-β1等基因mRNA显着下降（P<0.05）,同时HNF4αmRNA水平显着上调（P<0.05）。（二）苦参碱及苦参碱衍生物-19对DMN大鼠肝纤维化的抑制作用M-19 50mg/kg治疗组肝组织羟脯氨酸含量（414.97±182.5μg/g） ,较模型对照组（720.3±289.3μg/g）显着减少（ P =0.021）。胶原面积较模型组减少64.5%（P =0.023）。免疫组织化学结果表明,M-19 50mg/kg治疗3w,能显着下调TGF-β1、α-SAM和Desmin的表达,同时上调HNF-4α,E-cadherin的表达。Real-time PCR检测结果表明M-19 50mg/kg治疗组与模型组相比α-SMA水平显着下降（P =0.013）,而Ecadherin水平显着上升（P =0.004）。三、M-19体外抗肝纤维化作用机制研究Real-time PCR检测结果表明:原代肝细胞经M-19 20μM处理48h, HNF4α和Ecadherin的mRNA水平分别为（87.8±3.7%）和（91.41±5.4%）,与TGF-β1 2ng/ml诱导组相比（68.3±6.9%, P =0.007 ）和（78.9±6.1%, P =0.006）显着升高。M-19能剂量依赖性的下调TGF-β1 2ng/ml诱导原代肝星状细胞α-SMA（P <0.001）、Vimentin（P =0.021）和CollagenImRNA（P =0.017）水平升高。对于TGF-β1 2ng/ml刺激的HSC-T6细胞,M19-10umol/L处理组能显着降低α-SMA（P =0.022）和CollagenII（IP<0.001）的mRNA水平,同时上调E-cadherin mRNA水平（P =0.007）。MTT检测结果表明M-19可浓度依赖性的抑制HSC-T6增殖,40umol/L的M-19分别处理HSC-T6细胞24h和48h,对细胞的增殖抑制率分别为79%和94.5%。流式细胞术检测HSC-T6细胞凋亡率发现,M-19 40umol/L处理24h,能诱导21.14%的HSC-T6细胞凋亡。四、MAT和M-19特异结合蛋白的研究采用连续亲和色谱法和竞争色谱法从Jurkat或RAW264.7细胞裂解液中分离出23KD的特异性结合蛋白条带;MALDI-TOF-TOF质谱鉴定特异结合蛋白的多肽序列片段YLPHSAGR ,LTNSMMMHGR,QAVDVSPLR等,与人核糖体蛋白S5（Ribosomal protein S 5,RPS5）匹配,Western blot检测结果确证RPS5为23KD处特异结合蛋白条带。由M-19共价结合生物素分离得到的HSC-T6细胞中特异结合蛋白,经Western blot确证同样为RPS5;免疫细胞化学双标技术检测表明,在HSC-T6细胞内M-19与RPS5特异性结合。五、RPS5与肝纤维化关系研究免疫组织化学和Real-time PCR检测结果表明,肝纤维化过程中RPS5表达下调,而M-19治疗组能显着抑制其下调。原代培养肝星状细胞自发活化过程中,RPS5 mRNA水平在第3d就降至64%,之后维持该水平至第7d。免疫印迹检测结果表明,TGF-β1 2ng/ml刺激7天,HSC-T6细胞RPS5的表达逐渐下调。转染RPS5 siRNA 335后,HSC-T6细胞Vimentin蛋白表达上调,同时E-cadherin表达下调。【结论】一、M-19和M-24对RAW264.7细胞的增殖活性抑制作用较小,对LPS刺激RAW细胞释放TNF-α抑制作用好于苦参碱及同类苦参碱衍生物,并具有抑制NF-кB转录活性作用。二、M-19可抑制BDL或DMN肝纤维化大鼠肝组织EMT进程,降低肝脏ECM沉积,具有抗肝纤维化作用。三、M-19抗肝纤维化作用机制与其抑制肝细胞和肝星状细胞的EMT进程,抑制肝星状细胞增殖,诱导肝星状细胞凋亡有关。四、核糖体蛋白S5是苦参碱和M-19的特异结合蛋白。五、核糖体蛋白S5的降低可促进EMT发生,导致肝纤维化。
罗大有[6]（2011）在《健脾软肝方抗肝纤维化机理的研究》文中研究说明肝纤维化是肝细胞受到炎症刺激及发生坏死时,肝脏内纤维结缔组织异常增生的一种慢性、渐进性的病理过程,是慢性肝病向肝硬化发展的必经环节。有资料表明,肝硬化病人已占我国内科总住院人数的4.3%-14.2%,其病死亡率在消化系统疾病中占居第二位,仅次于恶性肿瘤。肝纤维化是一种慢性、进行性、弥漫性的肝脏病变,各种肝脏病变长期反复发作均可以导致肝纤维化的生成。因此,能否延缓、阻断或逆转肝纤维化的发展,具有重大的研究和应用意义。健脾软肝方为现代组方,是根据传统中医理论“肝病实脾”的理论并结合科学辩证而生成的。健脾软肝方的组方中包含了太子参、黄芪、白术、土鳖虫、枳壳、甘草、等多种中药,本组方中的各单味药分别具有补脾益气燥湿,和中缓急,扶正化邪、活血化瘀、通络理气,柔肝调肝等作用。虽然健脾软肝方在临床上得到广泛的应用,但对健脾软肝方抗肝纤维化机理的研究相对较少。因此,以此作为本实验的研究基点。本研究首先通过确定健脾软肝方对四氯化碳大鼠肝纤维化模型的治疗作用,通过测定各药物组的肝指数,用赖氏法检测各组间ALT、AST的水平以及HE染色法评价各药物组和模型组间的肝纤维化程度。随后在同一模型中,检测健脾软肝方对大鼠肝纤维化模型中TGF-β/Smad通路、经典WNT通路和PI3K通路中相关因子的表达影响。在TGF-β/Smad通路的研究中,利用RT-PCR法检测健脾软肝方各剂量组中大鼠TGF-β1基因的表达水平,利用免疫组化法检测健脾软肝方各剂量组对TGF-β受体数目的影响,以及用western blot法检测各实验组中肝组织内SMAD3和SMAD7蛋白的表达。而在经典WNT通路的研究中,以PCR手段检测所有相关基因的表达,包括了WNT-3a蛋白、FRZ1和β-catenin,同时也检测了HNF-4和HNF-6基因的表达水平。在PI3K通路的研究中,主要是利用了RT-PCR法检测了PDGF和PI3K mRNA的表达水平,放免法检测各剂量组中大鼠血清的cAMP水平,并利用western blot法检测TIMP-1和MMP-3蛋白的表达水平。此后,再进一步研究脾脏功能的变化对肝纤维化的影响。利用四氯化碳大鼠肝纤维化脾次切除模型,用流式细胞仪来检测各药物组大鼠全血中CD4和CD8细胞亚群比例的变化,以及免疫扩散法检测大鼠血清中IgG的分泌水平。最后通过体外实验,在测定健脾软肝方在大鼠星状细胞HSC-T6细胞的半数毒性浓度。其TC50为0.128mg/ml,以此为基础分别设定三个剂量,分别是TC500. 1mg/ml, TC10 0.025mg/ml和TC0 0.00625mg/ml为实验药物浓度。用流式细胞仪以观察健脾软肝方对大鼠HSC细胞上TRAIL凋亡受体的影响。在本研究中,利用大鼠肝纤维化模型和体外HSC-T6星状细胞模型相结合,多种检测手段并从多个方面对健脾软肝方的机制进行阐述。通过四氯化碳大鼠肝纤维化模型确定健脾软肝方对肝纤维化的治疗作用。在实验中发现,与模型组相比,健脾软肝方高剂量110g·kg-1组和中剂量40g·kg-1组均有较好的抗肝纤维化作用。表现在能够明显降低肝纤维化大鼠的肝指数,降低ALT和AST水平并且缓解肝纤维化进程。而低剂量组20g·kg-1组对四氯化碳大鼠肝纤维化的治疗作用相对较弱。随后利用四氯化碳大鼠肝纤维化模型,从多个肝纤维化细胞／因子通路对健脾软肝方的机制进行研究。发现健脾软肝方对肝纤维化的TGF-β/Smad通路、经典WNT通路和PI3K通路均有调节作用。在TGF-β/Smad通路的研究中发现,健脾软肝方高剂量组、低剂量和中剂量组对肝纤维化大鼠中的TGF-β1的mRNA有明显的抑制作用,而且能显着下调TGF-β受体数目,并且能够上调SMAD3、下调SMAD7蛋白的表达,调节SMAD3/SMAD7比例。模型组中的TGF-β1受体的阳性比例达到了43%,而健脾软肝方高剂量组和中剂量组中均少于10%的阳性率,明显低于模型组。而SMAD3/SMAD7蛋白表达比例在模型组为2.01,而健脾软肝方高剂量组和中剂量组分别1.08、1.32,低剂量组则为1.63,显示低剂量组对调节SMAD蛋白的作用稍弱。在经典WNT通路的相关基因的表达中发现,健脾软肝方各剂量组对WNT-3α的表达均有抑制作用,但主要还是通过上调FRZ受体来达到肝纤维化的作用。同时,健脾软肝方还能直接抑制β-catenin的表达。此外,健脾软肝方高剂量组和中剂量组对HNF-4和HNF-6都具有诱导其表达的作用,与模型组相比,表达明显增强。在肝纤维化PI3K通路的研究中,主要以PDGF、PI3K基因的表达和TIMP-1、MMP-3蛋白的表达为切入点。发现健脾软肝方能够明显抑制PDGF、PI3K基因的转录水平,提高机体cAMP合成水平,并能调节TIMP-1和MMP-3的比例。在模型组中,肝纤维化的cAMP水平为47.69fmol/μl,高剂量组、中剂量组和低剂量组分别为86.57、76.87和69.88fmol/μl。在本研究中,也结合了中医理论“肝病实脾”,结合了大鼠肝纤维化中脾脏功能的异常是否与肝纤维化的进程相关。初步研究证实,在大鼠的肝纤维化模型中,大鼠的脾脏功能会出现紊乱,主要表现在CD细胞亚群的失调,IgG过度增高。显示在肝纤维化进程中,机体的自身的过度免疫或者脾脏功能的紊乱都对肝纤维化有加重作用。在该研究中,利用了四氯化碳大鼠肝纤维化脾次切除模型作为研究对象。发现在肝纤维化进程中,对大鼠脾脏进行次切除术能够明显降低大鼠过度的自身免疫,并且能够调节CD细胞亚群的比例。而健脾软肝方高剂量组和中剂量组均能有效调节机体的免疫能力,防止机体过度自身免疫所造成的肝损伤。其中模型组中的CD4/CD8仅有0.85,而脾次切除组为2.21,健脾软肝方高剂量组、中剂量组和低剂量组分别为2.36、2.25和1.82。最后在体外HSC-T6细胞系的研究中,利用流式细胞仪发现健脾软肝方在0.1mg/ml对细胞上TRAIL凋亡受体的表达有明显的诱导作用。与正常HSC-T6细胞组TRAIL的阳性率23.88%相比,健脾软肝方0.1mg/ml组与0.025mg/ml组的阳性率分别为39.14%、32.72%,分别升高15.26%和8.84%。综合上述,健脾软肝方可以通过多种渠道发挥抗肝纤维化的作用。健脾软肝方可以影响多种细胞信号通道的,可以从TGF-β/Smad通路、经典WNT通路和PI3K通路来抑制肝纤维化的进展。同时对机体的免疫功能具有调节作用,可以提高CD4/CD8细胞亚群的比例,并能减弱在肝纤维化过程中机体自身过度的免疫反应对肝脏造成的损伤。同时在凋亡方面,健脾软肝方可以直接上调活化HSC-T6细胞上的TRAIL凋亡受体,使活化的HSC-T6细胞进入程序性死亡阶段而发挥抗肝纤维化的作用。
骆欢欢[7]（2010）在《苦杏仁苷对HSC活化增殖及其相关细胞因子网络的作用》文中研究指明肝纤维化是一切慢性肝病共同的病理学基础,当肝细胞发生坏死,或受到炎症刺激时,肝内纤维结缔组织会大量增生,这一病理过程中较轻而可逆者称为肝纤维化,重者出现假小叶及结节形成则称为肝硬化。其间涉及多种细胞的活化增殖或变性、多种细胞因子功能的表现、大量细胞外基质（ECM）的分泌及细胞凋亡等复杂因素的病理生理过程。各种因素之间相互影响、相互交错,形成肝纤维化的动态变化网络。其中ECM成分合成和降解的失衡是导致肝组织重构、发生纤维化的直接原因,细胞因子及多肽类生长因子等调控因子是启动、调节肝纤维化发展的重要因素,细胞凋亡则是肝纤维化逆转的重要途径。肝星状细胞（HSC）是肝脏中的一种非实质细胞,位于Disse间隙内,形态不规则,胞体呈卵圆形,胞质富含维生素A脂滴,核周部分包埋在邻近肝细胞的隐窝内,其对肝脏的ECM产生、生长因子合成、基质重建以及窦孔改变等生理过程均可产生影响。研究发现,多种细胞、细胞因子、ECM和非肽类介质（如乙醇、活性氧等）参与HSC的激活和肝纤维化。当肝脏受到物理化学及生物因素刺激时,HSC失去类维生素A,旺盛增殖,合成和分泌大量的ECM成分,如胶原、蛋白多糖和糖蛋白等,细胞的结构也由星状转变为具有发达的粗面内质网和高尔基复合体的成纤维细胞样细胞或肌成纤维细胞（MFB）。桃仁性平,味甘、苦,有小毒,归心、肝、大肠经,为常用的活血化瘀中药,具有活血祛瘀,润肠通便之效,常用于各种肝病血瘀相关证型的复方治疗中。既往研究发现,桃仁提取物可通过增加肝血流量,促进I、Ⅲ和Ⅳ型胶原的降解,阻止Ⅰ、Ⅱ型前胶原的沉积,保护脂质过氧化损伤作用等预防肝纤维化的形成。苦杏仁苷为桃仁提取物最主要、最常见的药理成分,国内、外目前对其抗肝纤维化的药理研究较少,其开发和应用空间有待进一步挖掘。研究目的研究苦杏仁苷对HSC的活化增殖及相关细胞因子网络的作用,以期揭示苦杏仁苷抗纤维化的分子机制。研究方法1苦杏仁苷对HSC增殖及分泌ECM的影响1.1绘制HSC-T6的自然生长曲线将冷冻的HSC-T6细胞株复苏,恒温箱培养至细胞呈单层致密状,胰蛋白酶消化后传代,待细胞生长稳定后,MTT法绘制HSC-T6的自然生长曲线。1.2苦杏仁苷对HSC-T6增殖的影响细胞培养同前,加入低、中、高各剂量级苦杏仁苷,MTT法检测细胞生长情况。1.3苦杏仁苷对ECM合成的影响用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA,酶联免疫法（ELISA）和放射免疫法（RIA）分别检测Ⅰ型胶原和透明质酸含量。2苦杏仁苷对相关细胞因子网络的调节作用2.1苦杏仁苷对转化生长因子（TGF）-β1的影响苦杏仁苷对HSC-T6细胞TGF-β1m RNA的影响用RT-PCR检测,对HSC-T6细胞TGF-β1蛋白的影响用Western Blot法检测,对TGF-β1受体的影响采用流式细胞技术检测。苦杏仁苷对TGF-β1的下游效应递质结缔组织生长因子（CTGF）m RNA的影响用RT-PCR检测。2.2苦杏仁苷对血小板源性生长因子（PDGF）的影响苦杏仁苷对HSC-T6细胞PDGFm RNA的影响用RT-PCR检测,对HSC-T6细胞PDGF蛋白的影响用Western Blot法检测,对PDGF受体的影响采用流式细胞技术检测。苦杏仁苷对胰岛素样生长因子（IGF）m RNA的影响用RT-PCR检测。2.3苦杏仁苷对血管紧张素（Ang）Ⅱ刺激HSC活化的抑制作用苦杏仁苷对AngⅡ刺激HSC活化Ca2+效应的抑制作用采用激光扫瞄共焦显微镜（LSCM）检测,对AngⅡ刺激HSC活化TGF-β1m RNA的抑制作用用RT-PCR检测,对AngⅡ刺激HSC活化碱性成纤维生长因子（b FGF）表达的抑制作用用免疫组化法检测。2.4苦杏仁苷对干扰素（IFN）抑制HSC活化的促进作用苦杏仁苷对IFN抑制HSC活化TGF-β1mRNA的促进作用用RT-PCR检测。研究结果1苦杏仁苷对HSC增殖及分泌ECM的影响1.1苦杏仁苷对HSC-T6增殖的影响10-6mmol/L1mmol/L不同浓度苦杏仁苷作用的OD值比较,差异均无显着性意义（P>0.05）。正常组与各苦杏仁苷组比较,差异也无显着性意义（P>0.05）。在药物作用第5天时,各苦杏仁苷组的细胞生长曲线均未受到抑制,反而出现刺激促进生长增殖的效果,其OD值与正常组比较,差异均有显着性意义（P<0.05）。但在其他时间段（第1天、3天、7天）,苦杏仁苷各用药组的细胞生长曲线与正常组相近,其OD值与正常组比较,差异无显着性意义（P>0.05）。提示苦杏仁苷对HSC-T6的增殖可能未有抑制作用,也没有明显的细胞毒性作用。1.2苦杏仁苷对ECM合成的影响各苦杏仁苷组对Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA均有明显的抑制作用,与正常组比较,差异有显着性意义（P<0.05）。均以苦杏仁苷中剂量组最为明显,苦杏仁苷高剂量组次之,苦杏仁苷低剂量组再次之。提示苦杏仁苷对HSC-T6细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原m RNA表达有明显的抑制作用,但这种抑制作用不与剂量成正比。作用72h时,苦杏仁苷各剂量组Ⅰ型胶原分泌与正常组比较,差异均有显着性意义（P<0.05）,但苦杏仁苷各组组间比较,差异无显着性意义（P>0.05）。提示苦杏仁苷作用72h后对Ⅰ型胶原分泌有明显抑制作用,但这一作用也不呈现剂量依赖。正常组透明质酸分泌曲线与苦杏仁苷低剂量组稍有重叠,位置较苦杏仁苷高、中剂量组分泌曲线高,提示苦杏仁苷高、中剂量组均有抑制透明质酸分泌的趋势（P>0.05）,但效果并不显着。2苦杏仁苷对相关细胞因子网络的调节作用2.1苦杏仁苷对TGF-β1的影响乙醛组对TGF-βm RNA有一定促进作用,但与正常组比较,差异无显着性意义（P>0.05）。乙醛组对CTGFm RNA也有明显促进作用,与正常组比较,差异有显着性意义（P<0.05）。各苦杏仁苷组对TGF-βm RNA、CTGFm RNA则均有非常明显的抑制作用,与乙醛组比较,差异均有显着性意义（P<0.05）;各苦杏仁苷组组间比较,TGF-βm RNA差异均有显着性意义（P<0.05）,CTGFm RNA苦杏仁苷高、中剂量组与低剂量组比较,差异均有显着性意义（P<0.05）,但苦杏仁苷高、中剂量组组间比较,差异无显着性意义（P>0.05）。提示苦杏仁苷对乙醛作用下的HSC-T6细胞TGF-βm RNA及CTGF m RNA均有明显的抑制作用,且这种抑制作用与剂量成正比。乙醛组对TGF-β蛋白表达有明显促进作用,各苦杏仁苷组对TGF-β蛋白表达,无论在24h还是72h,则均有非常明显的抑制作用。24h时以苦杏仁苷高剂量组最为明显,苦杏仁苷中剂量组次之,苦杏仁苷低剂量组再次之;72h时以苦杏仁苷高剂量组最为明显,苦杏仁苷低剂量组次之,苦杏仁苷中剂量组再次之。提示苦杏仁苷对乙醛作用下的HSC-T6细胞TGF-β蛋白表达有明显的抑制作用,且这种抑制作用有可能与剂量成正比。正常组TGF-β1受体表达非常微弱,乙醛组对TGF-β1受体表达有明显促进作用;各苦杏仁苷组对TGF-β1受体表达均有明显的抑制作用,但苦杏仁苷高、中、低剂量组间不存在递进关系。提示乙醛可显着刺激HSC细胞TGF-β1受体表达,苦杏仁苷对乙醛作用下的HSC-T6细胞TGF-β1受体表达有明显的抑制作用,但这种抑制作用可能并不与剂量成正比。2.2苦杏仁苷对PDGF的影响苦杏仁苷高剂量组对PDGFm RNA、IGFm RNA有较明显的抑制作用,与正常组比较,差异有显着性意义（P<0.05）,与苦杏仁苷中、低剂量组比较,差异也有显着性意义（P<0.05）。但苦杏仁苷中、低剂量组未表现出抑制作用（P>0.05）。提示苦杏仁苷在高剂量对HSC-T6细胞PDGFm RNA和IGFm RNA有明显的抑制作用,但中、低剂量则无,可能这种抑制作用与剂量有关。各苦杏仁苷组对PDGF蛋白表达,无论在24h、48h还是72h,均有非常明显的抑制作用,各时间点均以苦杏仁苷高剂量组最为明显,苦杏仁苷中剂量组次之,苦杏仁苷低剂量组再次之。提示苦杏仁苷对HSC-T6细胞PDGF蛋白表达有明显的抑制作用,且这种抑制作用有可能与剂量成正比。正常组、各苦杏仁苷组PDGFR-α和PDGFR-β的表达都极其微弱,且均相差无几。2.3苦杏仁苷对AngⅡ刺激HSC活化的抑制作用LSCM下Ca2+荧光成像的HSC-T6细胞仍可部分表现普通倒置显微镜下的形态学特征,AngⅡ组Ca2+荧光强度非常明显,清晰可见;正常组强度也较明显,稍次于AngⅡ组;苦杏仁苷高剂量组强度也较强,稍次于AngⅡ组和正常组,但区别不甚明显;苦杏仁苷中、低剂量组强度明显减弱,并可见大量Ca2+噬斑出现。Ca2+荧光强度相对值的统计分析也反应上述结果。AngⅡ组对TGF-βm RNA有一定促进作用,但与正常组比较,差异无显着性意义（P>0.05）。各苦杏仁苷组对TGF-βm RNA则均有明显的抑制作用,与AngⅡ组比较,高、中剂量组差异均有显着性意义（P<0.05）,而低剂量组仅有抑制趋势,差异并无显着性意义（P>0.05）。提示AngⅡ可能存在一定的刺激HSC-T6细胞TGF-βm RNA作用,但不甚明显;而苦杏仁苷对AngⅡ作用下的HSC-T6细胞TGF-βm RNA有明显的抑制作用,且这种抑制作用与剂量成正比。AngⅡ组、正常组、各苦杏仁苷组均未见b FGF的阳性表达。2.4苦杏仁苷对干扰素IFN抑制HSC活化的促进作用IFN组对TGF-βm RNA有明显的抑制作用,与正常组比较,差异有显着性意义（P>0.05）;而苦杏仁苷各剂量组与正常组比较,差异无显着性意义（P>0.05）。苦杏仁苷中、低剂量组与IFN组比较,差异有显着性意义（P<0.05）;而苦杏仁苷高剂量组与IFN组比较,差异则无显着性意义（P>0.05）。提示IFN确实有强烈的抑制TGF-βm RNA效果;但苦杏仁苷对这一效果不但没有协同促进作用,反而对这一效果可能有一定的抑制作用。结论1苦杏仁苷对HSC增殖及分泌细胞外基质（ECM）的影响苦杏仁苷对HSC-T6的增殖可能未有抑制作用,且在第5天苦杏仁苷反而明显刺激HSC-T6的增殖,考虑可能由于苦杏仁苷对HSC-T6有提前生长曲线而促进凋亡的作用。同时,苦杏仁苷对HSC-T6没有明显的细胞毒性作用。苦杏仁苷对HSC-T6细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达有明显的抑制作用,但这种抑制作用不与剂量成正比;HSC-T6分泌Ⅰ型胶原作用的研究也印证了上述结果;苦杏仁苷对透明质酸分泌的抑制作用可能存在,但不显着。苦杏仁苷对HSC-T6细胞活化后的分泌功能有抑制作用,此可能是其抗肝纤维化的主要机制之一。2苦杏仁苷对相关细胞因子网络的调节作用加入乙醛刺激后的HSC-T6细胞TGF-βmRNA、CTGFmRNA有所增加,表明乙醛可刺激HSC增殖,导致纤维结缔组织增生和降解失去平衡,肝脏ECM异常沉积,是酒精性肝纤维化发生的关键因素。苦杏仁苷对TGF-βm RNA、CTGFm RNA均有非常明显的抑制作用,并且呈现剂量依赖模式;且TGF-β、CTGF具有相关系的变化趋势。苦杏仁苷对TGF-β蛋白及其受体表达均有明显的抑制作用,其中在蛋白表达的抑制作用方面,与对TGF-βm RNA影响一致的呈现一定的剂量依赖模式。在TGF-β受体的抑制作用方面,效果也较为显着,但不存在剂量依赖模式。苦杏仁苷对HSC-T6细胞TGF-β、CTGF细胞因子的序贯抑制作用,是其参与抗肝纤维化细胞因子网络的重要切入点。苦杏仁苷对PDGF、IGFm RNA均有明显的抑制作用,这种抑制作用可能与剂量有相关性,且PDGF、IGF具有相关系的变化趋势。苦杏仁苷组对PDGF蛋白表达的明显抑制作用也呈现出一定的剂量依赖的模式,与RT-PCR研究结果一致。但在PDGF受体的抑制作用方面,则未见明显效果。苦杏仁苷也可通过影响PDGF及IGF来参与抗肝纤维化细胞因子网络的调控。AngⅡ可能存在一定的刺激HSC-T6细胞活化Ca的效应,但不甚明显。这可能与AngⅡ刺激作用有限有关,也可能是由于其他因素导致HSC生物转化功能下降的原因。苦杏仁苷对AngⅡ作用下的HSC-T6细胞活化Ca2+效应有明显的抑制作用,可能是由于苦杏仁苷可以阻断或抑制HSC的AngⅡ信号转导通路,从而抑制了HSC内Ca2+升高的作用,并因此抑制了HSC的活化与增殖。AngⅡ还可能存在一定的刺激HSC-T6细胞TGF-βm RNA表达作用,但不甚明显,未及前面实验中的乙醛刺激。同样,AngⅡ也不能有效刺激b FGF蛋白的表达,也进一步说明了这一结果。而苦杏仁苷对AngⅡ作用下的HSC-T6细胞TGF-βm RNA表达有明显的抑制作用,且这种抑制作用与剂量成正比,再次证明了前文的研究结果。在肝纤维化发生发展的过程中,常伴有肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的异常激活,对病情发展起着重要的促进作用,故AngⅡ也是肝纤维化细胞因子网络的重要调控因子。而本研究证明,苦杏仁苷也可通过这一环节来起到抗肝纤维化的作用。IFN-γ对TGF-βm RNA有明显的抑制作用,但苦杏仁苷对IFN-γ的抗肝纤维化效果不但没有协同促进作用,反而可能有一定的抑制作用。
纪辉[8]（2010）在《姜黄素预防性治疗肝纤维化的机制》文中研究说明肝纤维化（hepatic fibrosis）是指各种致病因素引起肝脏损害和炎症,在修复过程中导致肝脏细胞外基质（extracellular matrix,ECM）异常增多和过度沉积的病理过程。肝纤维化是可以逆转的,对其逆转因素的研究可为了解肝纤维化进程及其发生机制提供重要线索。目前对肝纤维化的治疗尚无行之有效的方案,因此,肝纤维化防治仍是肝病治疗的重点难点。姜黄素（Curcumin）是从姜科姜黄属植物姜黄中提取的一种黄色酸性酚类物质,是姜黄发挥药理作用的主要活性成分。目前认为,姜黄素在防治肝纤维化过程中有非常广阔的应用前景,但对其姜黄素的作用机制及临床制剂方面的研究还有待进一步深入。本研究通过CCl4致肝损伤并导致肝纤维化的动物模型,并结合体外HSC培养,系统探讨姜黄素对大鼠实验性肝纤维化的防治作用,并对其机制作深入探讨,为姜黄素的应用提供理论依据。本研究主要得到以下结论:⑴姜黄素对CCl4所致大鼠肝损伤有保护作用,有利于维持肝脏正常形态,保护肝脏功能;⑵姜黄素体内、体外均显示出抑制肝脏过度表达ECM,从而实现其保护肝脏功能,维系肝脏正常结构的作用;⑶姜黄素可抑制重要的致纤维化因子TGF-β和CTGF mRNA的表达,提示TGF-β和CTGF是姜黄素防治肝纤维化的治疗靶点之一;⑷姜黄素可抑制实验性肝纤维化大鼠肝脏及体外培养HSC EGF的表达,从而抑制HSC增殖并促进其调亡;⑸MAPK途径是参与肝纤维化的重要信号转导途径之一,姜黄素可干扰其中多种信号蛋白的表达,从而抑制MAPK信号系统的功能,抑制或延缓肝纤维化的进程。总之,本研究结果显示,姜黄素对保护肝脏功能、延缓肝纤维化进程有重要作用,但该作用不是通过单一途径进行的,而是通过包括抑制MAPK信号通路在内的多个靶点实现的。
江远[9]（2009）在《铁沉积于HSC细胞与肝纤维化相关性研究及复方肝毒清的干预作用》文中研究指明一、目的铁沉积与肝纤维化的关系密切,其在肝纤维化的发生、持续及进展中发挥着重要作用。本研究以肝纤维化发生、发展的中心环节一肝星状细胞（HSC）活化为切入点,通过建立铁沉积HSC细胞模型,研究铁沉积于HSC细胞对HSC细胞α-SMA蛋白表达和Ⅰ型胶原、TGF-β1 mRNA的表达以及对HSC细胞凋亡的影响,开展铁沉积于HSC细胞对肝纤维化的影响及复方肝毒清干预作用的研究。用二甲基亚硝胺（DMN）建立大鼠肝纤维化模型,以大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白及肝组织肝铁浓度作为大鼠铁负载的评价指标,并通过普鲁士蓝和α-SMA双染色,对HSC细胞铁沉积进行定位,明确HSC细胞铁沉积与肝纤维化之间的联系;进一步通过研究HSC细胞活化相关因子TGFβ1 mRNA的表达,初步明确铁沉积于HSC细胞在大鼠肝纤维化中的作用。从组织病理学、细胞学及分子水平开展铁沉积于HSC细胞与肝纤维化的相关性研究,试图阐明铁沉积于HSC细胞促进肝纤维化的发病机理。体内外分别以中药汤剂复方肝毒清对铁沉积HSC细胞模型和DMN诱导的肝纤维化大鼠模型进行干预,试图阐明以扶正利湿解毒为治疗原则的复方肝毒清对铁沉积于HSC细胞促进肝纤维化的影响。二、方法（一）细胞实验:铁沉积于HSC细胞对肝纤维化的影响及复方肝毒清的干预作用1.建立铁沉积HSC细胞模型以HSC-T6细胞为模式细胞系,培养于6孔板,每孔中均置入1.8cm之正方形盖玻片（无菌处理）,将细胞分为铁沉积模型组、铁沉积模型+去铁铵组、正常对照组共3组,每组重复2孔。根据细胞毒性实验,选择25μM的柠檬酸铁胺（FAC）作为实验浓度。待细胞贴壁长满后铁沉积模型组中加入FAC;铁沉积模型+去铁铵组中分别按照摩尔数1:1加入FAC和去铁铵;正常对照组为正常培养的HSC-T6细胞。继续培养24 h后行普鲁士蓝染色。2.铁沉积于HSC细胞对其活化和转归的影响及去铁铵的干预作用HSC-T6细胞分为正常对照组、铁沉积模型组、50μM去铁铵组、25μM去铁铵组。正常对照组为正常培养的HSC-T6细胞,铁沉积模型组为经25μM FAC处理并证实铁沉积的HSC-T6细胞,50μM去铁铵组、25μM去铁铵组为分别经50μM和25μM去铁铵处理的HSC-T6细胞。继续培养24 h后,免疫组化检测α-SMA的表达;定量PCR法检测细胞Ⅰ型胶原、TGF-β1 mRNA的表达;TUNEL法检测HSC-T6细胞的凋亡;电镜观察HSC-T6细胞超微结构。3.复方肝毒清对铁沉积诱导HSC细胞活化和转归的干预作用HSC-T6细胞分为正常对照组、铁沉积模型组、铁沉积模型+中药组。正常对照组为正常培养的HSC-T6细胞,铁沉积模型组为经25μM FAC处理并证实铁沉积的HSC-T6细胞,铁沉积模型+中药组为复方肝毒清（按细胞毒性实验确定的最大无毒浓度）处理的铁沉积模型组HSC-T6细胞。温育24小时后,免疫组化检测α-SMA的表达;定量PCR法检测HSC-T6细胞TGF-β1 mRNA的表达;TUNEL法检测HSC-T6细胞的凋亡;电镜观察HSC-T6细胞超微结构。（二）动物实验:铁沉积于HSC细胞在DMN诱导大鼠肝纤维化中的作用及复方肝毒清的干预机理75只SD大鼠随机分为空白对照组（12只）、模型组（15只）、模型+去铁铵组（12只）、模型+秋水仙碱组（12只）、模型+中药复方肝毒清大剂量组（12只）、模型+中药复方肝毒清小剂量组（12只）共6组。铁沉积大鼠肝纤维化模型造模方法为:用生理盐水配制1:100（V/V）的二甲基亚硝胺（DMN）稀释溶液,每周前3天对大鼠进行腹腔注射,剂量为10μL DMN/kg体重,共4周,空白对照组腹腔注射生理盐水。从造模第2周开始,模型+秋水仙碱组按照秋水仙碱0.1mg/kg体重灌胃,1次/日×3周;模型+中药复方大、小剂量组分别以20g/kg、5g/kg体重灌胃,1次/日×3周。模型组及空白对照组均灌胃生理盐水10ml/kg,1次/日×3周。从造模第3周开始,模型+去铁铵组以去铁铵100mg/kg腹腔注射,3次/周×2周。从开始造模到试验结束观察记录动物死亡情况。实验结束时摘眼球取血收集血清,并取左前叶肝脏,部分置于Bouin’s固定液中固定,另取50mg左右肝组织洗净后置于Trizol中并冻存于—70℃待检,剩余部分—70℃冷冻保存。取肝组织左叶分别行HE染色、Masson染色、普鲁士蓝染色、普鲁士蓝和α-SMA双染色作组织病理学观察;电镜观察肝组织超微结构;ELISA法检测大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白;采用火焰原子吸收光谱法测定大鼠肝组织肝铁浓度;采用AU400型奥林巴斯全自动生化分析仪测定肝功能、血清铁和血脂;定量PCR法检测TGF-β1 mRNA的表达。三、结果（一）细胞实验:铁沉积于HSC细胞对肝纤维化的影响及复方肝毒清的干预作用1.建立铁沉积HSC细胞模型经普鲁士蓝染色后,镜下HSC细胞核呈红色,铁沉积模型组细胞可见蓝色铁颗粒沉积于细胞质中,铁沉积模型+去铁铵组细胞质中亦见不同程度蓝色铁颗粒沉积,但较铁沉积模型组明显减少。正常对照组细胞未见铁颗粒沉积。2.铁沉积于HSC细胞对其活化和转归的影响及去铁铵的干预作用免疫组化结果显示,镜下可见正常对照组HSC细胞明显活化,α-SMA大量表达。铁沉积模型组HSC细胞α-SMA亦大量表达。而去铁铵组HSC细胞α-SMA表达较正常对照组和铁沉积模型组明显减少,说明细胞活化受到不同程度抑制。HSC细胞Ⅰ型胶原、TGF-β1 mRNA表达结果显示,与对照组比较,铁沉积模型组Ⅰ型胶原mRNA表达显着增强（P＜0.01）,而TGF-β1 mRNA表达无显着差异（P＞0.05）。50μM去铁铵和25μM去铁铵均能下调Ⅰ型胶原、TGF-β1 mRNA的表达（P＜0.01）,且50μM去铁铵组优于25μM去铁铵组（P＜0.01）。提示去铁治疗能在转录水平抑制Ⅰ型胶原和TGF-β1的分泌。HSC细胞凋亡的病理结果显示,正常对照组、铁沉积模型组HSC细胞未见或仅见有较少细胞发生凋亡。而去铁铵组HSC细胞则见明显细胞凋亡,凋亡细胞的细胞核呈棕褐色,并可见凋亡小体。电镜结果显示,正常对照组HSC细胞内细胞器结构如线粒体、粗面内质网形态正常。铁沉积模型组出现大批双核细胞,细胞质中线粒体、内质网等细胞器明显减少。去铁铵组HSC细胞发生凋亡,其特点是凋亡细胞形态变小,核染色体堆积,线粒体、内质网等细胞器明显减少,代之以大量空泡。3.复方肝毒清对铁沉积诱导HSC细胞活化和转归的干预作用免疫组化结果显示,铁沉积模型+中药组HSC细胞α-SMA表达较正常对照组和铁沉积模型组明显减少,说明细胞活化受到不同程度抑制。HSC细胞TGF-β1 mRNA表达结果显示,铁沉积模型+中药组TGF-β1 mRNA的表达不同程度下调（P＜0.05）,提示中药复方能在转录水平抑制TGF-β1的分泌。HSC细胞凋亡的病理结果显示,铁沉积模型+中药组HSC细胞可见明显细胞凋亡,凋亡细胞的细胞核呈棕褐色,并可见凋亡小体。电镜结果显示,铁沉积模型+中药组HSC细胞发生凋亡,其特点是凋亡细胞形态变小,核染色体堆积,线粒体、内质网等细胞器明显减少,代之以大量空泡。（二）动物实验:铁沉积于HSC细胞在DMN诱导大鼠肝纤维化中的作用及复方肝毒清的干预机理1.DMN诱导的肝纤维化大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白的变化:对大鼠血清铁蛋白、转铁蛋白的检测发现,与对照组比较,模型组血清铁蛋白明显增加（P＜0.05）,模型+去铁铵组血清铁蛋白有所减少,但无统计学意义（P＞0.05）;而与模型组比较,模型+去铁铵组血清铁蛋白明显减少,有统计学意义（P＜0.01）。就转铁蛋白而言,与对照组比较,模型组血清转铁蛋白明显减少（P＜0.01）,模型+去铁铵组血清铁蛋白虽有所减少,但无统计学意义（P＞0.05）:与模型组比较,模型+去铁铵组血清转铁蛋白明显增加,有统计学意义（P=0.01）。结果表明,在铁沉积大鼠模型中,铁含量增加伴随着血清转铁蛋白水平减少。2.DMN诱导的肝纤维化大鼠肝组织肝铁浓度的变化:对大鼠肝组织肝铁浓度的检测发现,与对照组比较,模型组和模型+去铁铵组肝铁浓度明显增加（P＜0.01或P＜0.05）,而与模型组比较,模型+去铁铵组肝铁浓度明显减少（P＜0.05）。3.DMN诱导的肝纤维化大鼠中铁沉积于HSC细胞的组织病理学观察:普鲁士蓝染色结果显示,在模型组,深蓝色铁颗粒主要沿小叶间隔分布,且大部分铁沉积在细胞外;模型+去铁铵组铁颗粒分布较模型组有所减少;正常组肝细胞排列整齐,无铁负载。普鲁士蓝和α-SMA双染色结果显示,与深蓝色铁颗粒分布一致,在坏死区周围,可见大量α-SMA表达阳性的HSC细胞,并且铁颗粒沉积于HSC细胞中。4.去铁治疗和中药复方对DMN诱导的肝纤维化大鼠肝功能、血清铁和血脂的影响:大鼠肝功能、血清铁和血脂的检测结果发现,模型组ALT明显升高（P＜0.01）,同时ALB、G水平显着降低（P＜0.01）。去铁铵、秋水仙碱、中药大小剂量均能降低ALT水平,其中,去铁铵、中药大小剂量组优于秋水仙碱组（P＜0.01或P＜0.05）。就降低AST水平而言,去铁铵和中药小剂量组无显着差异（P＞0.05）,但均优于秋水仙碱组（P＜0.01或P＜0.05）。对于提升ALB水平,中药大剂量组优于去铁铵、秋水仙碱和中药小剂量组（P＜0.01或P＜0.05）。对于G而言,去铁铵、秋水仙碱、中药小剂量均能降低G水平（P＜0.01或P＜0.05）。另外,去铁铵能显着降低血清铁和TG水平（P＜0.01或P＜0.05）,而秋水仙碱和中药大小剂组均不能降低血清铁、TG和CHOL（P＞0.05）。5.去铁治疗和中药复方对DMN诱导的肝纤维化大鼠肝组织病理学的影响:HE染色结果显示,正常对照组肝脏肝板以中央静脉为中心呈条索状,向四周放射样排列,板间有不规则肝窦,分布规律,无胶原纤维存在。模型组肝细胞变性坏死,肝小叶结构破坏,纤维结缔组织增生,假小叶形成。在纤维化组织周围可见出血性坏死,并可见棕褐色颗粒样物质（铁）沉积在肝组织中。模型+去铁铵组、模型+秋水仙碱组、模型+中药大剂量组、模型+中药小剂量组肝细胞变性坏死有所减轻,纤维结缔组织、假小叶形成均不同程度减少。Masson染色结果显示,正常组仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维。模型组大鼠肝组织胶原增生明显,大量较厚的纤维间隔,向肝小叶内伸展,分割包绕肝组织,形成假小叶。模型+去铁铵组、模型+秋水仙碱组、模型+中药大剂量组、模型+中药小剂量组大鼠纤维组织增生程度明显减轻,纤维间隔变窄,着色浅,假小叶较少。电镜下观察,正常对照组大鼠肝细胞呈多面体,肝细胞内细胞器结构如线粒体、粗面内质网形态正常,肝细胞核为圆形或椭圆形,双层膜完整,核孔清楚。铁沉积模型组肝细胞内可见大量脂滴,Disse腔充满大量红细胞,其它肝细胞结构变化包括线粒体空泡化,内质网扩张,呈大囊泡。模型+去铁铵组肝细胞可见脂滴与红细胞明显减少,核染色体堆积,细胞形态变小,线粒体、内质网等细胞器明显减少。模型+秋水仙碱组、模型+中药大剂量组、模型+中药小剂量组脂肪变性和出血较铁沉积模型组不同程度减轻。6.去铁治疗和中药复方对DMN诱导的肝纤维化大鼠肝组织胶原的影响:对铁沉积大鼠肝组织胶原的Ridit分析显示,6组总体平均Ridit值不等或不全相等（χ2=44.2236,v=5,P＜0.01）。进一步进行多样本两两比较的秩和检验（采用Nemenyi法）,结果显示,与对照组比较,模型组、模型+秋水仙碱组、模型+中药小剂量组胶原沉积显着增强（P＜0.05）;但与模型组比较,模型+去铁铵组、模型+中药小剂量组胶原沉积明显减少（P＜0.05）;与模型+去铁铵组比较,模型+秋水仙碱组、模型+中药大剂量组、模型+中药小剂量组胶原沉积无显着差异（P＞0.05）。7.去铁治疗和中药复方对DMN诱导的肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1 mRNA表达的影响:大鼠肝组织TGF-β1 mRNA的表达结果显示,与对照组比较,模型组及其它各处理组TGF-β1 mRNA表达显着增强（P＜0.01）;但与模型组比较,模型+去铁铵组、模型+秋水仙碱组、模型+中药小剂量组、模型+中药大剂量组TGF-β1mRNA表达明显下降（P＜0.01）;对于下调TGF-β1 mRNA的表达,去铁铵、中药大、小剂量明显优于秋水仙碱（P＜0.01）;其中,模型+中药大剂量组与模型+中药小剂量组相比较,无显着差异（P＞0.05）。四、结论1.细胞实验:外源性铁能够沉积于HSC细胞,诱导HSC细胞活化并促进肝纤维化的持续进展。去铁铵能使HSC细胞活化受到不同程度抑制,甚至诱导其转为静止或发生细胞凋亡。复方肝毒清能在体外发挥抗肝纤维化作用,其机理与其通过抑制TGFβ1的分泌,抑制HSC细胞活化;诱导HSC细胞转为静止或发生细胞凋亡有关。2.动物实验:在DMN诱导的肝纤维化大鼠中,伴随着胶原的沉积和肝细胞变性坏死,铁不仅沉积于肝组织,而且铁沉积于HSC细胞;用去铁铵治疗后,肝组织铁沉积明显减少,肝组织胶原染色程度和肝细胞变性坏死明显减轻,TGF-β1 mRNA表达下调,提示肝组织铁沉积是DMN诱导的大鼠肝纤维化形成的促进因素之一,其机制与铁沉积于HSC细胞并促进HSC细胞活化有关。复方肝毒清能保护肝细胞,改善肝功能;在转录水平抑制TGFβ1的分泌,抑制HSC细胞活化;抑制胶原纤维的增生,从而起到抗肝纤维化作用。
李鹏[10]（2008）在《蓝玉簪颗粒对肝纤维化的治疗作用研究》文中研究表明目的纤维化（fibrosis）可发生于多种器官,引起器官内纤维结缔组织增生,实质细胞减少,持续进展可导致器官结构破坏和功能减退,直至器官衰竭,严重影响人类健康。器官纤维化（organ fibrosis）一直是世界医学的研究热点问题之一。糖皮质激素是目前治疗肝纤维化的常规用药物,但它可以引起严重的免疫系统紊乱和骨代谢疾病。目前开展的中药治疗纤维化的研究已初步显示了中药在防治各种器官（肺脏、肝脏、心脏等）纤维化方面的良好前景。蓝玉簪龙胆是一种藏族常用的治疗肺部感染的草药。我们的研究证实其在博莱霉素诱导的动物肺纤维化治疗中,具有对抗和治疗肺纤维化的作用,并且不具有糖皮质激素副作用（国家发明专利申请号:200510042636.3）。本实验的目的是用蓝玉簪颗粒对二甲基亚硝胺（DMN）诱导的实验性肝纤维化进行干预,并观察其对肝纤维化的治疗作用,初步探讨其作用机理,试图为临床肝纤维化的寻找新的药物。方法（1）30只大鼠随机分为5组,每组6只:正常对照组、二甲基亚硝胺模型组（DMN组）;蓝玉簪龙胆治疗组（LYZ组）;强的松治疗组（强的松组）;蓝玉簪龙胆+强的松治疗组（LYZ+强组）。参照JENKINS等介绍的制备DMN诱导大鼠肝纤维化模型的方法。同时正常对照组按2 ml/kg体重剂量腹腔注射生理盐水,DMN组、LYZ组、强的松组、LYZ+强组按2 ml/kg体重剂量腹腔注射（5 mg/L）DMN溶液,每周连续注射3 d,共4 wk。其中正常对照组按2 ml/kg体重剂量腹腔注射生理盐水,其余各组按2 ml/kg体重剂量腹腔注射（5 mg/L）DMN溶液,每周连续注射3 d,共4 wk,造模同时按分组给与药物干预。于建模后28d腹主动脉放血处死各组动物,迅速摘取肝脏,右叶肝制成组织匀浆进行生化检测,左叶肝投入10%甲醛中固定,常规包埋,切片,进行HE、MASSON染色,光学显微镜下观察观察纤维化的程度。肝组织匀浆后进行超氧化物歧化酶（SOD）、单胺氧化酶（MAO）活力、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量检测。血清用于谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）及透明质酸（HA）的测定。（2）42只大鼠随机分为6组:正常对照组6只;二甲基亚硝胺模型组6只（DMN组）;强的松治疗组6只（强的松组）;蓝玉簪颗粒高剂量组8只（KL高剂量组）;蓝玉簪颗粒中剂量组8只（KL中剂量组）;蓝玉簪颗粒低剂量组8只（KL低剂量组）。建立DMN诱导的肝纤维化动物模型,建模当日对各组动物进行治疗:正常对照组:每日按体重0.5ml/100g生理盐水灌胃;二甲基亚硝胺对照组（DMN组）:每日按体重0.5ml/100g生理盐水灌胃;强的松治疗组:将强的松片研成粉末,加蒸馏水配制成0.06%的溶液,参照文献按6mg/kg进行灌胃;蓝玉簪颗粒高剂量组（KL高剂量组）:蓝玉簪颗粒由第四军医大学第三附属医院药剂科制作,主要成分为蓝玉簪龙胆,辅以三七总苷。每日按4 g生药?kg体重灌胃;蓝玉簪颗粒中剂量组（KL中剂量组）:每日按2 g生药?kg体重灌胃;蓝玉簪颗粒低剂量组（KL低剂量组）:每日按1 g生药?kg体重灌胃。于建模后28d腹主动脉放血处死各组动物,迅速摘取肝脏,右叶肝制成组织匀浆进行生化检测,左叶肝投入10%甲醛中固定,常规包埋,切片,进行HE、MASSON染色,光学显微镜下观察观察纤维化的程度。肝组织匀浆后进行超氧化物歧化酶（SOD）、单胺氧化酶（MAO）活力、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量检测。血清用于谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）及透明质酸（HA）的测定。结果:（1）与正常对照组比较,模型对照组血清ALT与HA均明显增高, （P<0.05）。蓝玉簪治疗组（LYZ）较模型对照组ALT与HA明显下降（P<0.05）,强的松治疗组与蓝玉簪和强的松联合用药治疗组与模型对照组相比ALT和HA显着降低（P<0.05）。DMN组SOD、GSH活力均显着地低于正常对照组（P<0.05）,MAO活力显着的高于正常对照组,MDA也高于正常对照组,但没有显着差别;强的松组SOD、GSH活力显着低于正常对照组和LYZ组,与DMN组没有显着性差异, MAO、MDA活力显着地低于DMN对照组（P<0.05）,其中MDA活力也显着低于正常对照组。（2）与正常对照组比较,模型对照组血清ALT与HA均明显增高, （P<0.05）。蓝玉簪颗粒各治疗组较模型对照组ALT与HA明显下降（P<0.05）,强的松治疗组与模型对照组相比ALT和HA显着降低（P<0.05）。DMN组SOD、GSH活力均显着地低于正常对照组（P<0.05）,MAO、MDA活力显着的高于正常对照组,但没有显着差别;蓝玉簪颗粒高剂量组SOD、GSH活力显着地高于DMN组（P<0.05）,较正常对照组没有显着差别;MAO、MDA活力显着地低于DMN对照组（P<0.05）,与正常对照组没有显着性差异;强的松组SOD、GSH活力显着低于正常对照组和蓝玉簪颗粒组,与DMN组没有显着性差异, MAO、MDA活力显着地低于DMN对照组（P<0.05）,其中MDA活力也显着低于正常对照组;蓝玉簪颗粒治疗组较激素组效果明显,且有一定的剂量依赖性;HE和MASSON染色观察到肝纤维化程度改善。结论本课题的实验结果表明,蓝玉簪颗粒和强的松均对二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化有一定的预防、治疗作用。其中蓝玉簪颗粒可减轻肝组织中脂质过氧化反应,清除氧自由基并抑制其生成,并削弱炎症反应,减少炎症细胞的渗出,在肝纤维化形成的早期发挥作用,提示其治疗作用机理是通过改善氧化与抗氧化平衡,抑制炎症反应,以达到减轻或抑制肝纤维化的形成。
二、IFN-α对大鼠肝纤维化间质胶原酶基因表达的调控（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IFN-α对大鼠肝纤维化间质胶原酶基因表达的调控（论文提纲范文）
（1）基于浊毒理论的肝复健方抗大鼠肝纤维化作用及机制研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 浊毒理论与肝纤维化 |
| 浊毒理论的提出和形成 |
| 浊毒的致病特点 |
| 浊毒证的临床表现 |
| 肝纤维化浊毒证生物学基础研究 |
| 肝纤维化浊毒证证治规律研究 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肝复健方对肝纤维化大鼠病理形态学和血清标志物的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肝复健方对肝纤维化大鼠瘦素及瘦素受体表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 肝复健方对肝纤维化大鼠 MMP-1 表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 肝复健方对肝纤维化大鼠肝组织JAK2/STAT3信号转导通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 瘦素与肝纤维化 |
| 参考文献 |
| 综述二 肝纤维化中西医结合治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）黄芪发酵后主要有效成分变化分析及多糖对大鼠实验性肝纤维化影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 目录 |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 文献综述一黄芪多糖药理学研究进展 |
| 1 黄芪多糖的提取、分离研究进展 |
| 1.1 黄芪多糖的提取 |
| 1.2 黄芪多糖的分离纯化 |
| 2 黄芪多糖的成分分析 |
| 2.1 黄芪多糖的含量、纯度及分子量测定 |
| 2.2 黄芪多糖的单糖组成、结构分析 |
| 3 黄芪多糖的药理学研究进展 |
| 3.1 黄芪多糖对免疫系统的作用 |
| 3.2 黄芪多糖对血液及造血系统的影响 |
| 3.3 黄芪多糖对肝脏的作用 |
| 3.4 黄芪多糖对核酸代谢的影响 |
| 3.5 黄芪多糖对抗氧化损伤的作用 |
| 文献综述二肝纤维化机制研究进展 |
| 1 ECM 的产生 |
| 1.1 AngⅡ受体介导的信号转导途径与 ECM 的产生 |
| 1.2 bFGF 与 ECM 的产生 |
| 2 HSCs 的生物学特性 |
| 2.1 |
| 2.1.1 脂肪细胞因子与 HSCs 的活化 |
| 2.1.2 Jak-STAT 信号转导途径与 HSCs 的活化 |
| 2.1.3 TGF-β与 HSCs 的活化 |
| 2.1.4 PDGF 与 HSCs 的活化 |
| 2.1.5 Mef2 与 HSCs 的活化 |
| 2.1.6 HSCs 的激活 |
| 2.1.7 LIM 与 HSCs 的活化 |
| 2.2 对 HSCs 激活起抑制作用的因素 |
| 2.2.1 PPAR 途径 |
| 2.2.2 TNF-α |
| 2.2.3 RAR/RXR 受体介导的信号转导途径 |
| 2.2.4 FXR 介导的信号转导途径 |
| 2.2.5 C/EBPs 介导的信号转导途径 |
| 2.3 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.1 NF-κB 途径与 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.2 FXR 与 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.3 内生性大麻酚与 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.4 HGF 与 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.5 脂联素与 HSCs 的凋亡 |
| 2.3.6 NK 细胞与 HSCs 的凋亡 |
| 选题意义与研究思路 |
| 第二章 高效液相法测定发酵黄芪及生药黄芪中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 样品及标准品 |
| 2.3.1 样品 |
| 2.3.2 标准品 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 薄层层析法定性鉴别发酵黄芪和生药黄芪中黄芪甲苷及黄芪总皂苷 |
| 2.4.2 高效液相色谱法测定发酵黄芪和生药黄芪中黄芪甲苷的含量 |
| 2.4.2.1 色谱条件及系统适用性试验 |
| 2.4.2.2 供试品溶液的制备 |
| 2.4.2.3 对照品溶液的制备 |
| 2.3.2.4 线性关系考察 |
| 2.4.3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定 |
| 2.4.3.1 色谱条件及系统适用性试验 |
| 2.4.3.2 供试品溶液的制备 |
| 2.4.3.3 对照品溶液的制备 |
| 2.4.3.4 线性关系考察 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 薄层层析法定性鉴别发酵黄芪和生药黄芪中黄芪甲苷及黄芪总皂苷 |
| 3.2 黄芪甲苷含量测定结果 |
| 3.3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 发酵黄芪和生药黄芪多糖和皂苷的提取分离 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 发酵黄芪和生药黄芪中黄芪皂苷的提取分离研究 |
| 2.3.1.1 实验材料的准备 |
| 2.3.1.2 发酵黄芪与生药黄芪浸膏化学成分研究 |
| 2.3.1.3 发酵黄芪与生药黄芪浸膏收率及黄芪皂苷提取率 |
| 2.3.1.4 大孔吸附树脂含水量的测定 |
| 2.3.1.5 大孔吸附树脂对黄芪皂苷的静态吸附与解吸实验 |
| 2.3.1.6 大孔吸附树脂对黄芪皂苷的动态吸附实验 |
| 2.3.1.7 香草醛-硫酸法测定黄芪皂苷含量 |
| 2.3.2 发酵黄芪和生药黄芪中黄芪多糖的提取分离及含量测定 |
| 2.3.2.1 实验材料的准备 |
| 2.3.2.2 不同工艺对发酵黄芪和生药黄芪多糖的提取效果的影响 |
| 2.3.2.3 苯酚-硫酸法测定多糖含量 |
| 2.3.3 发酵黄芪多糖的纯化及基本性质研究 |
| 2.3.3.1 发酵黄芪多糖的柱层析分离 |
| 2.3.3.2 薄层法考察发酵黄芪多糖中单糖组分 |
| 2.3.3.3 高效凝胶渗透色谱法测定发酵黄芪多糖主要组分的分子量 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 发酵黄芪和生药黄芪中黄芪皂苷的提取分离研究 |
| 3.1.1 发酵黄芪与生药黄芪浸膏化学成分研究 |
| 3.1.2 发酵黄芪与生药黄芪浸膏收率及浸膏中黄芪皂苷提取率 |
| 3.1.3 大孔吸附树脂含水量的测定结果 |
| 3.1.4 香草醛-硫酸法测定黄芪皂苷含量标准曲线方程 |
| 3.1.5 大孔吸附树脂对黄芪皂苷的静态吸附实验 |
| 3.1.6 大孔吸附树脂对黄芪皂苷的动态吸附实验 |
| 3.2 发酵黄芪和生药黄芪中黄芪多糖的提取分离纯化及含量测定 |
| 3.2.1 不同工艺对发酵黄芪和生药黄芪多糖的提取效果的影响 |
| 3.2.2 DEAE-52 分离发酵黄芪多糖 |
| 3.2.3 薄层法鉴别 FAPS-2 和 FAPS-3 中单糖组分 |
| 3.2.4 高效凝胶渗透色谱法(HPGPC-ELSD) 计算葡聚糖标准品的回归方程 |
| 3.2.5 FAPS-2 的分子量测定 |
| 3.2.6 Sephadex G100 柱层析对 FAPS-2 的洗脱曲线 |
| 3.2.7. FAPS-2-1 的分子量测定 |
| 3.2.8 FAPS、FAPS-2 和 FAPS-2-1 的总糖百分含量 |
| 4 讨论 |
| 第四章 FAPS 对实验性大鼠脂肪性肝纤维化的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 FAPS 的制备 |
| 2.4 实验动物分组 |
| 2.5 检测指标测定 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 FAPS 对大鼠体重的影响 |
| 3.2 FAPS 对肝纤维化大鼠血清 ALT、AST 和 ALP 的影响 |
| 3.3 FAPS 对肝纤维化大鼠血清中 PⅢNP、CⅣ、LN、HA 及肝组织中 Hyp 含量的影响 |
| 3.4 FAPS 对肝纤维化大鼠肝组织 T-AOC、GSH、MDA 和蛋白含量的影响 |
| 3.5 FAPS 对肝纤维化大鼠血清 GSH-Px、GST 活性的影响 |
| 3.6 FAPS 对大鼠肝纤维化的组织病理学影响 |
| 3.6.1 H.E.染色 |
| 3.6.2 Masson 染色 |
| 3.6.3 透射电镜观察 |
| 4 讨论 |
| 第五章 不同组别大鼠肝纤维化的数字基因表达谱差异分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 主要仪器与设备 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 大鼠肝脏样品的采集及送检 |
| 2.4.2 大鼠肝脏 RNA 的提取方法 |
| 2.4.3 Total RNA 质量检测 |
| 2.4.4 数字化基因表达谱测序 |
| 2.4.5 测序结果分析 |
| 2.4.5.1 Clean Tag 的对比统计 |
| 2.4.5.2 差异表达基因的筛选方法 |
| 2.4.5.3 差异基因表达模式聚类分析 |
| 2.4.5.4 Gene Ontology 功能显着性富集分析 |
| 2.4.5.5 Pathway 显着性富集分析 |
| 2.4.5.6 文献挖掘获得已知肝纤维化相关基因 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Total RNA 质量检测 |
| 3.2 测序质量评估 |
| 3.3 测序饱和度分析 |
| 3.4 Clean Tags 分析 |
| 3.4.1 Clean Tags 拷贝数分布统计 |
| 3.4.2 Clean Tags 与参考基因组比对 |
| 3.4.2.1 参考基因来源 |
| 3.4.2.2 Clean Tags 比对的结果统计 |
| 3.5 差异表达基因的筛选及分析 |
| 3.5.1 差异统计分析 |
| 3.5.2 差异基因聚类分析 |
| 3.5.3 差异基因 GO 功能分析 |
| 3.5.4 差异基因 Pathway 显着性富集分析 |
| 3.5.6 文献挖掘获得已知肝纤维化相关基因 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DGE 的建立和分析 |
| 4.2 表达差异基因结果分析 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 有待解决的问题 |
| 附图 |
| 附图说明 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（3）软肝冲剂对免疫性肝纤维化大鼠的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1.中医对肝纤维化的认识 |
| 2.现代医学对肝纤维化的认识 |
| 3.中医药治疗 |
| 4.西医治疗 |
| 5.中西医结合治疗 |
| 6.结语 |
| 1 材料及方法 |
| 2 实验指标 |
| 3 统计学处理方法 |
| 4 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）乙肝转阴颗粒对化学性肝损伤和慢性肝纤维的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 乙肝转阴颗粒对小鼠化学性肝损伤的保护作用的研究 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 体内实验乙肝转阴颗粒抗大鼠肝纤维化作用及其机制的研究 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 实验一 乙肝转阴颗粒对肝纤维化大鼠生化指标及形态学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 乙肝转阴颗粒对肝纤维化大鼠肝组织相关基因表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 体外实验乙肝转阴颗粒及其含药血清对肝星状细胞的影响 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 实验一 乙肝转阴颗粒及其含药血清对肝星状细胞增殖的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 乙肝转阴颗粒及其含药血清对肝星状细胞相关基因表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述:肝纤维形成机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）苦参碱结构修饰物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 苦参碱及其衍生物抗炎活性筛选 |
| 一、材料与方法 |
| 二、试验结果 |
| 三、 讨论 |
| 第二部分 苦参碱衍生物-19 抗实验性大鼠肝纤维化作用研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二 、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 苦参碱及苦参碱衍生物-19 特异性结合蛋白的研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、 实验结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 论文参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（6）健脾软肝方抗肝纤维化机理的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第1章 文献研究 |
| 1 抗肝纤维化机理研究进展 |
| 1.1 与肝纤维化相关的细胞因子的研究 |
| 1.2 肝纤维化激活通路的研究 |
| 1.3 细胞凋亡途径 |
| 2 肝纤维化动物模型的研究 |
| 2.1 四氯化碳(CCL4)诱导的肝纤维化模型 |
| 2.2 二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化模型 |
| 2.3 异种动物血清和蛋白诱导的肝纤维化模型 |
| 2.4 乙醇诱导肝纤维化模型 |
| 2.5 胆管阻塞行肝纤维化模型 |
| 2.6 血吸虫虫卵诱发肝纤维化模型 |
| 3 抗肝纤维化药物的研究进展 |
| 3.1 国外抗肝纤维化药物研究进展 |
| 3.2 中医药抗肝纤维化研究进展 |
| 3.3 抗肝纤维化中医理论的研究进展 |
| 第2章 实验研究 |
| 2.1 健脾软肝方在四氯化碳大鼠肝纤维化模型中的治疗作用 |
| 2.1.1 试剂和仪器 |
| 2.1.2 实验方法和步骤 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.2 健脾软肝方对肝纤维化细胞信号转导通路的影响 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.3 健脾软肝方对四氯化碳肝纤维化大鼠免疫系统的影响 |
| 2.3.1 试剂和仪器 |
| 2.3.2 实验方法和步骤 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.4 健脾软肝方对HSC细胞凋亡调控的影响 |
| 2.4.1 试剂和仪器 |
| 2.4.2 实验方法和步骤 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.4.4 结论 |
| 2.5 实验结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 实验相关图表 |
| 附录二 英文简缩词 |
| 致谢 |
（7）苦杏仁苷对HSC活化增殖及其相关细胞因子网络的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 肝星状细胞 |
| 1 正常状态下HSC的功能 |
| 2 持续激活后HSC的功能 |
| 第二章 肝星状细胞与肝纤维化 |
| 1 肝纤维化形成的三步激活模式 |
| 2 肝星状细胞的活化增殖与肝纤维化 |
| 3 肝星状细胞凋亡与肝纤维化 |
| 第三章 常见活血化瘀中药抗肝纤维化作用 |
| 1 丹参 |
| 2 赤芍 |
| 3 桃仁 |
| 4 红花 |
| 5 姜黄 |
| 6 水蛭 |
| 7 虎杖 |
| 8 郁金 |
| 9 川芎 |
| 第四章 桃仁提取物苦杏仁苷抗肝纤维化作用 |
| 1 桃仁的主要化学成分 |
| 2 桃仁提取物的抗肝纤维化作用 |
| 3 桃仁复方的研究 |
| 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 苦杏仁苷对HSC-T6细胞增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 苦杏仁苷对HSC-T6细胞分泌作用的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 苦杏仁苷对HSC-T6细胞TGF-β、CTGFm RNA的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 苦杏仁苷对HSC-T6细胞TGF-β及其受体表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 苦杏仁苷对HSC-T6细胞PDGF、IGFm RNA的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第六章 苦杏仁苷对HSC-T6细胞PDGF及其受体表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第七章 苦杏仁苷对AngⅡ刺激HSC-T6细胞Ca2+效应的抑制作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第八章苦杏仁苷对AngⅡ刺激HSC-T6细胞活化TGF-βm RNA及分泌b FGF的抑制作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第九章 苦杏仁苷对IFN-γ抑制HSC-T6细胞活化 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 英文缩略词注解 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）姜黄素预防性治疗肝纤维化的机制（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 肝纤维化研究进展 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 肝纤维化的发生与逆转 |
| 1.3 HSC 在肝纤维化发生发展中的作用 |
| 1.3.1 HSC 形态和功能 |
| 1.3.2 持续激活的HSC 的特性 |
| 1.3.3 视黄醇的丢失 |
| 1.3.4 迁移及化学趋化性 |
| 1.3.5 致肝纤维化作用 |
| 1.3.6 ECM 的降解 |
| 1.3.7 细胞因子的释放 |
| 1.3.8 活化的HSC 的转归 |
| 1.4 HSC 参与肝纤维化过程 |
| 1.4.1 肝星状细胞活化的启动阶段 |
| 1.4.2 肝星状细胞活化的持续阶段 |
| 1.4.3 ECM 对HSC 的影响 |
| 1.5 与肝纤维化有关的细胞因子 |
| 1.5.1 PDGF |
| 1.5.2 EGF |
| 1.5.3 胰岛素样生长因子 |
| 1.5.4 FGF |
| 1.5.5 TGF-β |
| 1.5.6 IFN |
| 1.5.7 IL |
| 1.5.8 TNF-α |
| 1.5.9 结缔组织生长因子 |
| 第2章 中草药在肝纤维化治疗中的作用及机制 |
| 2.1 苦参素 |
| 2.2 丹酚酸B |
| 2.3 牛磺酸 |
| 2.4 水飞蓟素 |
| 2.5 三七皂苷 |
| 2.6 姜黄素 |
| 第3章 姜黄素防治肝纤维化作用及机制 |
| 3.1 影响肝星状细胞活化、增殖及凋亡 |
| 3.2 抑制细胞外基质的产生，促进其降解 |
| 3.3 抗肝损伤作用 |
| 第4章 姜黄素抗大鼠肝纤维化实验研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 体内实验 |
| 4.2.5 体外实验 |
| 4.2.6 统计学方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 体内实验 |
| 4.3.2 体外实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 姜黄素对大鼠肝脏结构和功能具有保护作用 |
| 4.4.2 姜黄素抑制大鼠HSC 的增殖并促进其凋亡 |
| 4.4.3 姜黄素对肝纤维化大鼠ECM 代谢的影响 |
| 4.4.4 TGF-β、CTGF 与EGF 参与了姜黄素对肝纤维化的遏制作用 |
| 4.4.5 有丝分裂原活化蛋白激酶家族与实验性肝纤维化的关系 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 导师及作者简介 |
（9）铁沉积于HSC细胞与肝纤维化相关性研究及复方肝毒清的干预作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 文献研究 |
| 一、肝纤维化发生机理的研究进展 |
| 1 HSC细胞与肝纤维化 |
| 1.1 HSC细胞活化与肝纤维化 |
| 1.2 HSC细胞凋亡与肝纤维化 |
| 2 ECM在HSC细胞活化与转归中的作用 |
| 3 铁沉积与肝纤维化 |
| 3.1 铁的转运机制 |
| 3.2 铁的肝毒性机理 |
| 3.3 铁沉积与肝纤维化 |
| 二、肝纤维化治疗的研究进展 |
| (一) 肝纤维化的西医治疗研究 |
| (二) 肝纤维化的中医治疗研究 |
| 实验研究 |
| 一、细胞实验:铁沉积于HSC细胞对肝纤维化的影响及复方肝毒清的干预作用 |
| (一) 建立铁沉积HSC细胞模型 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| (二) 铁沉积于HSC细胞对其活化和转归的影响及去铁铵的干预作用 |
| 1.材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (三) 复方肝毒清对铁沉积HSC细胞活化和转归的干预作用 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 二、动物实验:铁沉积于HSC细胞在DMN诱导大鼠肝纤维化中的作用及复方肝毒清的干预机理 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 对肝纤维化动物模型的评价 |
| 3.2 铁沉积在大鼠肝纤维化中的作用 |
| 3.2.1 对铁蛋白、转铁蛋白及肝铁浓度的评价 |
| 3.2.2 对TGF β_1的评价 |
| 3.2.3 铁沉积在大鼠肝纤维化中的作用 |
| 3.3 铁沉积于HSC细胞对大鼠肝纤维化的影响 |
| 3.4 复方肝毒清防治肝纤维化的作用机理 |
| 3.4.1 复方肝毒清的组方特点 |
| 3.4.2 复方肝毒清组成药物的现代药理研究 |
| 3.4.3 复方肝毒清防治肝纤维化的作用机理 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、附图 |
| 二、本文主要缩略词 |
| 研究生在学期间发表论文及科研资助项目 |
| 致谢 |
（10）蓝玉簪颗粒对肝纤维化的治疗作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验研究 |
| 1.蓝玉簪龙胆对二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化治疗作用的研究 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2. 蓝玉簪颗粒对大鼠肝纤维化药理作用的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、IFN-α对大鼠肝纤维化间质胶原酶基因表达的调控（论文参考文献）
- [1]基于浊毒理论的肝复健方抗大鼠肝纤维化作用及机制研究[D]. 娄莹莹. 河北医科大学, 2013(10)
- [2]黄芪发酵后主要有效成分变化分析及多糖对大鼠实验性肝纤维化影响[D]. 秦哲. 甘肃农业大学, 2012(11)
- [3]软肝冲剂对免疫性肝纤维化大鼠的实验研究[D]. 张红. 辽宁中医药大学, 2012(06)
- [4]乙肝转阴颗粒对化学性肝损伤和慢性肝纤维的保护作用及其机制研究[D]. 杨欣. 广西医科大学, 2011(08)
- [5]苦参碱结构修饰物-19抗大鼠实验性肝纤维化作用及机制研究[D]. 王绍展. 第二军医大学, 2011(09)
- [6]健脾软肝方抗肝纤维化机理的研究[D]. 罗大有. 广州中医药大学, 2011(10)
- [7]苦杏仁苷对HSC活化增殖及其相关细胞因子网络的作用[D]. 骆欢欢. 广州中医药大学, 2010(06)
- [8]姜黄素预防性治疗肝纤维化的机制[D]. 纪辉. 吉林大学, 2010(08)
- [9]铁沉积于HSC细胞与肝纤维化相关性研究及复方肝毒清的干预作用[D]. 江远. 广州中医药大学, 2009(10)
- [10]蓝玉簪颗粒对肝纤维化的治疗作用研究[D]. 李鹏. 第四军医大学, 2008(02)