一、猪卵母细胞电激活参数的研究（论文文献综述）
刘聪[1]（2017）在《钙敏感受体参与猪卵母细胞成熟、激活及胚胎发育的研究》文中认为卵母细胞内外钙离子均在雌性生殖活动中发挥着非常重要的作用。细胞膜上钙离子受体（Calcium sensing receptor,CASR）的发现开辟了以细胞外游离钙离子作为一级信使调控细胞生殖活动的新的研究领域。本学位论文旨在探究CASR在猪卵母细胞体外成熟、激活及胚胎发育过程中的生理作用。首先,对CASR在猪卵母细胞体外成熟中的作用进行研究。通过Western blot和免疫荧光实验表明在成熟过程中添加促性腺激素,会上调卵母细胞的CASR表达水平和CASR的皮质区分布,但是添加表皮生长因子（Epidermal Growth Factor,EGF）却无此现象。在含有激素（添加单独卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone,FSH）;黄体生成素（Luteinizing hormone,LH）或者二者同时）的成熟液中添加CASR的激动剂NPS R-568会显着提高卵母细胞的核成熟率（73.80±1.55 vs 65.20±1.15;67.57±2.73 vs 59.00±1.00;79.05±0.76 vs 66.15±0.71;P<0.05）;而添加 CASR 的抑制剂NPS2390则会抑制核成熟。在卵母细胞成熟过程中添加CASR的激动剂NPS R-568后,会显着提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发生率（49.67±0.68 vs 38.14±1.56;p<0.05）。Western Blot结果显示,成熟过程中NPS R-568的添加会进一步提高卵母细胞MAPK3/1的活性。结果表明,CASR作为一个受促性腺激素调控的因子,通过MAPK3/1通路调控了猪卵母细胞成熟。其次,对CASR在猪的卵母细胞激活过程中的作用进行研究。Western Blot结果发现,在卵母细胞激活过程中细胞内CASR的表达明显上调;在培养液中添加CASR激动剂NPS R-568能够显着地促进卵母细胞激活后的原核形成率,表明CASR参与了卵母细胞激活过程。通过添加细胞内Ca2+的螯合剂BAPTA-AM,验证了 CASR在卵母细胞激活中的作用是依赖细胞内Ca2+来实现的。在卵母细胞激活过程中CASR的激活能显着地提高CaMKⅡ的磷酸化水平,而添加CaMKⅡ的抑制剂KN-93则会抑制CASR的表达。结果表明,在CASR与CaMKⅡ之间存在相互调节作用,二者共同参与调控了卵母细胞的激活过程。最后,对CASR在受精和早期胚胎发育过程中的作用进行研究。通过Reversed transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）发现,CASR在猪配子和不同发育阶段的胚胎上均有表达。通过在体外受精及胚胎发育过程中的添加CASR的激动剂NPS R-568和抑制剂NPS2390处理,发现CASR在促进精子穿膜和阻止多精受精以及促进胚胎发育发面都发挥了正向调节作用。结果表明,细胞外钙离子的细胞膜上受体CASR作为其效应因子调控了猪体外受精和早期胚胎发育过程。综上所述,在猪卵母细胞成熟过程中,CASR作为一个受促性腺激素调控的因子,通过MAPK3/1信号通路调控了卵母细胞成熟。在卵母细胞的激活过程中,CASR与CaMKⅡ发生相互调节作用,协同调控了卵母细胞的激活过程。在体外受精和胚胎发育过程中,CASR作为细胞外钙离子在卵母细胞膜上的效应因子调控了猪体外受精过程和早期胚胎发育。
刘帅[2]（2015）在《猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究》文中进行了进一步梳理卵胞质注射转基因（CI-MGT）具有操作简单、胚胎损伤小和胚胎体外停留时间短等优点,结合体内受精胚胎和高效基因编辑技术,最近被广泛应用于转基因动物生产中。单精子胞质内注射转基因（ICSI-MGT）适于大片段外源基因转移,并能有效解决猪体外受精胚胎多精子受精等问题,特别适用于转基因猪的生产。广西地处高温高湿的亚热带地区,为优化此种环境下猪胚胎和转基因技术体系,本研究在优化猪卵母细胞体外成熟、激活及胚胎培养条件的基础上,系统探讨了体外受精及孤雌激活胚胎CI-MGT和ICSI-MGT的相关影响因素,并对CI-MGT体外受精胚胎及ICSI-MGT胚胎生产转基因猪可行性进行了研究。研究结果如下：1.探讨了成熟液和胚胎培养液组分对猪卵母细胞成熟及胚胎发育效果的影响。结果显示,成熟基础液为TCM-199核成熟率和胚胎发育效率显着高于NCSU-37和PZM-3（P<0.05）。以TCM-199为成熟基础液,不加额外能量底物（PMt）的核成熟率和孤雌囊胚发育率分别为74.1土2.4%和29.3+1.3%,显着高于添加0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖（PMtsg）或0.91 mmol/L丙酮酸钠+3.05 mmol/L葡萄糖+0.1mg/mL谷氨酰胺（PMtsgg, P<0.05）。在成熟液中添加10 IU/mL eCG+15 IU/mL hCG组的核成熟率和胚胎发育效率显着高于添加0.5μg/mL FSH+0.5μg/mLLH或0.5μg/mL FSH+10 UI/mL hCG。成熟液中添加50 ng/mL EGF+10 ng/mL IGF-I组囊胚率显着高于添加10 ng/mL EGF和不添加组（P<0.05）。对猪卵母细胞体外成熟过程中核相变化研究显示,成熟培养38 h的核成熟率为57%（105/184）,40 h为43%（82/189）,42 h为48%（75/155）,44 h为59%（208/354）,46 h为70%（59/84）,48 h为62%（51/82）,50 h为74%（154/207）。在以PZM-3为基础液的胚胎培养液中添加0.277 mmol/L肌醇（PZMi）,其囊胚率显着高于添加0.34 mmol/L柠檬酸钠（PZMc）或0.34 mmol/L柠檬酸钠+0.277 mmol/L肌醇（PZMci, P<0.05）;添加0.5 mg/mL透明质酸组的囊胚率显着高于未添加组（P<0.05）；添加3 mg/mL BSA-FAF组的囊胚率显着高于添加BSA-V组（41.4士4.1%vs 36.7±3.8%,P<0.05）。培养液中BSA浓度增加至5 mg/mL或在培养96 h后加入10%FBS的囊胚率和囊胚孵化率均有所增加,但差异不显着。添加50 ng/mL IGF-I的囊胚率和囊胚细胞数高于未添加组,但差异不显着。2.探讨了激活方法对猪卵母细胞孤雌胚胎发育效果的影响。结果显示,卵母细胞经5 μmol/L离子霉素（Ion）激活5 min后,再分别在含2 mmol/L6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）,5μg/mL细胞松弛素B （CB）+10放线菌酮（CHX）,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP,5μg/mL CB+10μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP培养4 h的囊胚率显着高于在10μg/mL CHX培养4 h的囊胚率（29.7±1.1%、29.8±1.2%、30.4±1.6%和30.2±2.7%vs 15.8土1.5%,P<0.05）,但四组间囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着差异。当电脉电压为1.25KV/cm时3次电脉冲电激活的囊胚发育率显着高于2次电脉冲（P<0.05）,当电脉冲为3次时电场强度为0.80和1.00KV/cm的胚胎碎裂率显着低于1.20 KV/cm,且1.00 KV/cm组的囊胚率显着高于0.80和1.20 KV/cm组（P<0.05）。卵母细胞电激活后分别用5μg/mL CB+10 μg/mL CHX,5μg/mL CB+2 mmol/L 6-DMAP培养处理4 h的囊胚率（55.4±1.2%和50.4±2.9%）显着高于用2 mmol/L 6-DMAP （37.9±2.4%）,5 μg/mL CB+10 μg/mL CHX+2 mmol/L 6-DMAP （36.9±3.1%）培养处理4 h的囊胚发育率,亦显着高于单纯电激活处理（40.7±1.7%）和Ion激活后用2 mmol/L 6-DMAP （30.6±0.8%）培养处理4 h的囊胚发育率(P<0.05。电激活后,用5μg/mLCB培养处理4 h的囊胚率显着高于用5μg/mLCB培养处理4 h（54.0±4.1%vs 37.9±2.4%,P<0.05）,与7.5μg/mLCB组差异不显着,但7.5μg/mLCB组的ICM细胞数和ICM/TE均显着高于5 μg/mLCB组（P<0.05）。对胚胎核型进行分析结果表明,电激活后用7.5μg/mL CB+10 μg/mL CHX培养处理4 h的囊胚细胞二倍体率显着高于单纯电激活处理组（84.6% vs 40.0%,P<0.05）。3.研究了猪卵胞质内注射转基因的影响因素。孤雌激活卵胞质注射（PA-CI）的研究结果显示,注射外源RNA、外源RNA+1-4 U/μL RNA酶抑制剂对孤雌激活卵的囊胚率、ICM细胞数、TE细胞数及ICM/TE均无显着影响,表明可同时注射外源RNA和RNA酶抑制剂。注射100 ng/μL EGFP-N1 DNA的孤雌囊胚阳性率显着高于50 ng/μL和空注组,但囊胚率显着低于其余两组（33.9士1.1%vs 46.4±2.1%和50.5±1.9%,P<0.05）；注射100 ng/μL Talen-BMP15 RNA的囊胚率与50 ng/μL注射组和空注组差异不显着,表明注射DNA对胚胎毒性大于注射RNA。孤雌激活后5-18 h注射的囊胚率均显着低于注射后立刻激活或激活后立刻注射的囊胚率（P<0.05）。注射EGFP-N1线性化DNA的囊胚阳性率显着高于环状DNA（15.8±1.4%vs11.7±1.0%,P<0.05）,但两者胚胎发育率差异不显着,并且外源RNA注射组的囊胚率普遍高于注射DNA载体。当采用体外受精卵进行胞质内注射时（IVF-CI）,精卵孵育后5-18 h注射线性化EGFP-N1载体的囊胚率和囊胚细胞数差异均不显着,但5-6、8-9和11-12 h注射组胚胎阳性率显着高于14-15和17-18 h（12.6±0.6%,11.8土0.5%和13.6±0.6%vs 8.7±0.8%和6.5±1.0%,P<0.05）,表明外源DNA在猪雌雄原核形成期（约13 h）前注射的外源基因整合效率较高。注射40和50 ng/μL EGFP-N1 DNA组囊胚率显着高于100 ng/μL,与10、20、30ng/μL和空注组差异不显着,同时40、50和100 ng/pL组阳性率显着高于其余各组（P<0.05）。IVF卵注射GDF8 Cas9 mRNA/sgRNA的囊胚率显着低于PA卵（13.7±0.8%vs 52.6+3.1%,P<0.05）,但注射IVF卵的胚胎基因突变效率显着高于注射PA卵（25.0% vs3.8%,P<0.05）,表明Cas9/sgRNA系统可以通过注射猪IVF卵对猪的基因组进行编辑。4.系统研究了猪单精子胞质内注射转基因的影响因素。结果显示,10和20 ng/μL EGFP-N1 DNA与精子共孵育的囊胚率显着高于50和100 ng/μL（33.8±2.4%和31.0±0.9% vs 24.4±2.7和16.1±0.8%,P<0.05）,但20ng/μL孵育组胚胎阳性率显着高于10ng/μL（30.5±1.5%vs 16.3±1.5,P<0.05）。精子与外源基因孵育5、30和60 min囊胚率显着高于孵育24 h,但30和60 min组阳性率和囊胚阳性率显着高于5 min（P<0.05）。采用不同冷冻液（DPBS、 BTS和mNIM）冷冻精子对ICSI-MGT胚胎发育率无显着影响,但精子孵育液DPBS+EDTA （10 mmol/L EDTA）的囊胚率显着高于DPBS（27.8±0.7%vs 22.2±1.6%, P<0.05）, mNIM （10 mmol/L EDTA+123.0 mmol/L KCl）组的囊胚率显着高于DPBS+EDTA组（33.2±1.3%vs 27.8±0.7%,P<0.05）,表明孵育液中的EDTA和K+对注射后的胚胎发育有影响。精子超声+冻融处理和NaOH处理的囊胚率显着高于鲜精、A23187、超声、冻融和三次冻融处理组,超声+冻融和NaOH处理组的胚胎外源基因阳性率亦显着高于鲜精和A23187处理组。此外,卵母细胞激活后注射超声+冻融和NaOH处理精子的囊胚率显着高于激活前注射组（35.7±2.4%vs 30.2+0.6%；34.5±0.3% vs28.5±0.9%,P<0.05）,表明精子破膜与激活影响ICSI-MGT胚胎的发育。卵母细胞激活后0-30 min注射的囊胚率显着低于60-90 min注射组,但阳性率和囊胚阳性率均显着高于60-90 min注射组。对ICSI后不同时间合子内的GSH含量分析显示,激活后0-30 min注射组的6 h合子GSH含量显着低于60-90 min注射组和孤雌激活组（3.22±0.06 vs 5.02±0.09和4.73±0.14,P<0.05）,而60-90 min注射组的6 h和12 h合子GSH含量与孤雌组均无显着差异。进一步原核分析发现,0-30 min注射组的雌雄双原核形成率显着高于60-90 min（56.9±3.7% vs 36.3±2.0%,P<0.05）,且0-30min注射组精子解聚率显着高于60-90min,表明延长激活以后的注射时间会造成更高的孤雌胚胎产生。采用不同外源基因载体（EGFP-N1、Anti-FMDV. PRL-EGFP和IFN-EGFP）的ICSI-MGT囊胚率差异不显着,但显着影响胚胎阳性率,其中EGFP-N1线性化载体阳性率显着高于环状载体（35.9±0.2%vs20.9±0.9%,P<0.05）,而Anti-FMDV RNAi载体阳性率和囊胚阳性率均显着低于其它载体（P<0.05）。将Cas-GDF8、Anti-FMDV和EGFP-N1的ICSI-MGT胚胎移植入6头自然发情受体内,4头未见返情,其中7557号受体流产获得3头胎猪,7645号受体妊娠到期得到4头仔猪,对仔猪耳朵皮肤EGFP和Neo双基因进行PCR鉴定均显示阳性,表明应用优化的ICSI-MGT技术可以获得转基因猪后代。
刘帅,吕玲燕,孙俊铭,刘庆友,石德顺,崔奎青[3]（2012）在《猪卵母细胞电激活方法初探》文中认为本实验比较了已报道的4组常用的猪卵母细胞电激活方法,并对电激活参数进行系统探索。结果表明:电激活参数（125 V/mm,80μs,1 DC）,激活液0.3 mol/L甘露醇+0.1 mmol/L MgSO4+0.1 mmmol/L CaCl2+0.01%PVA的激活方案,囊胚发育率显着优于其他3组方案（25.6%vs 12.6%vs 21.5%vs 15.2,P<0.05）;脉冲电压100 V/mm时3次脉冲激活组囊胚发育率优于2次和1次脉冲组（27.3%vs 16.2%vs 21.7%,P<0.05）;激活液中Ca2+浓度（0.1%,0.05%）对激活效果无显着影响,囊胚发育率分别为36.5%和40.9%;本实验结果中电激活效果明显优于化学激活（46.3%vs 29.4%,P<0.05）。通过上述实验本研究建立了一种优化的猪卵母细胞电激活方法,为生产单精子显微注射与体细胞核移植猪奠定了基础。
石俊松,罗绿花,周荣,周秀,麦然标,李紫聪,吴珍芳[4]（2012）在《不同电激活参数及CB处理对猪卵母细胞孤雌发育的影响》文中研究表明从猪卵巢上获取的卵母细胞经体外培养成熟42～44 h后去除颗粒细胞,选取成熟的卵母细胞进行孤雌激活培养.试验采用不同的场强、脉冲时程和脉冲次数进行对照试验,并比较了细胞松弛素B（CB）辅助激活对孤雌胚胎发育的影响.结果显示:1)当场强为0.8 kV.cm-1,选取4个脉冲时程（80、100、120、140μs）参数分别进行1次、2次脉冲激活时,100μs、1次脉冲囊胚率最高,为（42.22±5.38）%,但同其他组无显着差异（P>0.05）.2)脉冲时程为100μs,选取4个场强（0.8、1.0、1.2、1.4 kV.cm-1）参数分别进行1次、2次脉冲激活时,1.4 kV.cm-1、1次脉冲囊胚率最高,为（44.04±0.68）%,但同其他组无显着差异（P>0.05）.3)场强为0.8 kV.cm-1和1.4 kV.cm-1,选取4个脉冲时程（80、100、120、140μs）进行1次脉冲激活时,1.4 kV.cm-1+80μs组囊胚率（54.60±2.86）%均高于其他组,且极显着高于1.4 kV.cm-1+140μs、0.8 kV.cm-1+80μs和0.8 kV.cm-1+140μs组（P<0.01）.4)用1.4 kV.cm-1、80μs、1次脉冲激活卵母细胞后,使用CB辅助激活4 h的囊胚率为（54.07±3.12）%,极显着（P<0.01）高于不使用CB组.以上结果说明,电激活中脉冲次数对猪孤雌胚胎发育无显着影响,且在本试验条件下,采用1.4 kV.cm-1的场强、80μs的脉冲时程,并使用CB辅助激活4 h,能够得到较高囊胚率的猪孤雌激活效率.
潘伟荣,魏太云,信吉阁,张崇义,卿玉波,魏红江[5]（2011）在《电激活参数和培养基对猪卵母细胞孤雌发育的影响》文中研究说明为优化电激活和胚胎培养的相关技术体系,研究电激活参数和培养液对猪卵母细胞孤雌胚胎发育的影响。结果表明:在脉冲电压为150 V（以每1 mm电激槽宽计,下同）、脉冲持续时间为100μs、脉冲1次的电激活条件下,猪卵母细胞孤雌激活的效果较好;在脉冲持续时间和脉冲次数恒定的条件下,脉冲电压150 V组的囊胚率显着高于100 V组和125 V组（P<0.05）,达46.3%;在脉冲电压和脉冲次数恒定的条件下,脉冲持续时间100μs的囊胚率显着高于75、125μs组（P<0.05）,达50.5%;在脉冲电压和脉冲持续时间恒定的条件下,1次脉冲的卵裂率和囊胚率显着高于2次脉冲组（P<0.05）,分别达82.7%、50.3%;PZM3和NCSU23培养液对猪孤雌激活胚胎发育的影响差异不显着（P>0.05）,但PZM3培养液组的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数均略高于NCSU23组。
张文昌,王秀爱,刘凤军,庄益芬,陈曦,谢旭东,洪志勇,陈梅芳,叶屹峰,余翠月[6]（2010）在《猪成熟卵母细胞的孤雌激活及体外胚胎培养的研究》文中指出为优化并提高卵母细胞的孤雌激活效率,研究了不同浓度离子霉素作用不同时间并联合6-DMAP对猪卵母细胞孤雌激活的影响。结果表明5μM的离子霉素作用4min的卵裂/囊胚率最高（66.7%,13.6%）,比较了不同电激活参数激活对孤雌胚发育的影响,经多次孤雌激活试验表明激活参数120v/mm,60μs,1DC的激活效果最佳。探讨了不同培养基对孤雌胚体外发育的影响,结果表明:NCSU-2 3和PZM-3培养孤雌胚胎卵裂率无明显差异（55.2%,56.1%）,但在囊胚率上,PZM-3显着高于NCSU-23（13.8%vs 7.84%,P<0.05）。
赵金凤[7]（2010）在《猪卵母细胞孤雌激活方法的研究》文中研究表明本研究以猪体外成熟卵母细胞为实验材料,分别采用了单次电激活,二次电激活,化学激活以及物理化学联合激活方法,对猪体外成熟卵母细胞进行孤雌激活,并比较分析了各方法的激活效果。旨在选择出较好的孤雌激活方法,以提高猪体外成熟卵母细胞的孤雌激活率和孤雌胚的囊胚发育率,为提高核移植的成功率,以及进一步研究奠定基础。本研究包括以下主要内容:1.选择不同的电场强度和脉冲时程,做单次电激活,比较不同组合对激活效率的影响。2.固定脉冲时程及脉冲次数,分别选择不同的电场强度,做二次电激活,比较不同组合对孤雌激活胚早期发育的影响。3.不同浓度Ionomycin作用不同时间;Ionomycin分别与6-DMAP、CB及CHX组合;9% Ethanol作用不同时间,对每一组合的激活效率进行比较,旨在研究较好的化学激活方法。4.电激活处理结合化学试剂（6-DMAP、CB及CHX）,比较不同组合对体外成熟卵母细胞孤雌激活后孤雌胚早期发育的影响。研究结果表明:1.对于单次电刺激对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活参数的确定,电场强度为2.0kV/cm,脉冲次数为1次,脉冲时程分别为10、20和30μs的条件对孤雌胚早期发育的影响无显着差异,且均为较优条件,其中以脉冲时程为30μs最为理想;2.对于二次电刺激对猪体外成熟卵母细胞的孤雌激活参数选择,二次电场强度分别2.0kV/cm和1.4kV/cm,脉冲时程均为30μs,脉冲次数均为1次的条件为最优;3.不同浓度Ionomycin作用不同时间对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活效果的影响,Ionomycin浓度为20mmol/L,作用时间为10min、15min的条件较好,10min最为理想;4. Ionomycin分别与6-DMAP、CB组合对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活后,孤雌胚的卵裂率和囊胚率高于Ionomycin与CHX组;5. 9% Ethanol作用10min、20min组合对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活后,孤雌胚的卵裂率和囊胚率均显着高于作用30min、40min,前二者之间差异不显着;6.电刺激处理后应用6-DMAP或CB处理对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活效率显着优于电处理后应用CHX。
王秀爱[8]（2010）在《莆田黑猪体细胞核移植的研究》文中研究说明体细胞克隆猪在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大的优势和应用潜力,已成为当今体细胞克隆领域研究的热点。本研究以莆田黑猪耳成纤维细胞为供体细胞,猪卵母细胞作为受体细胞,以建立高效的猪体细胞核移植体系为目的,主要优化了卵母细胞体外成熟培养条件,研究了成熟卵母细胞的孤雌激活方法,以及微电极融合法对重构胚融合率的影响,应用开放式拉长细管（OPS）对重构胚胎进行了玻璃化冷冻,结果表明:1、本试验采用出生3～5d的莆田黑猪,采用组织块法培养猪耳成纤维细胞,传代、纯化及冷冻后,得到了大量稳定的供体细胞系。2、对影响卵母细胞体外成熟培养（IVM）的几项因素即卵母细胞的培养方式,石蜡油的添加,不同外源激素的组合及ITS的添加进行研究分析,结果显示（1）凹槽皿组猪卵母细胞成熟率高于四孔板和30mm塑料皿,但差异不显着（P>0.05）。（2）石蜡油的添加对卵丘细胞扩展和卵母细胞体外成熟率均有显着提高（P<0.05）。（3）激素PMSG+HCG+FSH组高于FSH+LH和HMG组（80.1%vs68.3%vs53.3%）,相互之间差异显着（P<0.05）。（4）在猪卵母细胞成熟培养液中添加1%ITS（v/v）,结果,卵母细胞成熟率没有明显提高,但显着提高了孤雌激活后胚胎的卵裂率和囊胚率（63.3%vs55.1%,18.7%vs12.1%）（P<0.05）,说明在卵母细胞成熟培养液中添加1%ITS能够显着提高猪卵母细胞激活后孤雌胚胎发育力。3、为优化并提高卵母细胞的孤雌激活效率,研究了不同浓度离子霉素作用不同时间并联合6-DMAP对猪卵母细胞孤雌激活的影响。结果表明5μM的离子霉素作用4min的卵裂/囊胚率最高（66.7%,13.6%）,比较了不同电激活参数对孤雌胚发育的影响,经多次孤雌激活试验表明激活参数120v/mm,60μs,1DC的激活效果最佳。探讨了不同培养基对孤雌胚体外发育的影响,结果表明NCSU-23和PZM-3培养孤雌胚胎卵裂率无明显差异（55.2%,56.1%）,但在囊胚率上,PZM-3显着高于NCSU-23（13.8%vs7.84%,P<0.05）。4、为了提高重构胚的融合效率,试验采用微电极融合法,与传统的槽式融合法相比,显着提高了重构胚的融合效率（84.8%vs64.4%,P<0.05）,卵裂率和囊胚率无统计学差异（P>0.05）。多次融合激活试验摸索了微电极融合激活的最佳参数为16v,20μs,1DC。5、采用开放式拉长麦管（OPS）玻璃化冷冻克隆胚的桑葚胚和囊胚,结果:解冻后得到了72.3%的胚胎正常形态率。
侯文文[9]（2009）在《猪卵母细胞体外成熟及胚胎培养的相关研究》文中研究指明为了进一步探索建立稳定、有效、经济的猪胚胎体外生产方案,为猪克隆平台的优化提供依据。本研究针对影响猪胚胎体外生产效率的部分关键环节,重点了研究如何提高猪卵母细胞体外成熟质量、优化猪胚胎体外培养条件。研究了不同电击活参数,必需氨基酸和非必需氨基酸对猪卵母细胞体外成熟与成熟后孤雌发育的影响;探索了Leptin对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎体外发育的影响;比较了在体外培养过程中添加丙戊酸对猪克隆胚的影响。（1）将经过体外成熟的卵母细胞随机分别以1.56 kv/cm、100μs、2DC;1.56 kv/cm、100μs、1DC;1.00 kv/cm、80μs、2DC三组参数进行电激活,发现经1.00 kv/cm、80μs、2DC电激活的卵母细胞,无论是胚胎的卵裂率还是囊胚率都低于1.56 kv/cm、100μs、2DC和1.56 kv/cm、100μs、1DC电激活的组（卵裂率65.77±0.31% vs. 78.90±0.19%、77.78±0.18%, P<0.05;囊胚率27.71±0.39% vs. 39.98±0.38%、36.55±0.25%, P<0.05）。（2）为了探讨瘦素（Leptin）对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后胚胎早期发育的影响,本研究选择在Earle’s盐缓冲的TCM199中添加10 IU/mL PMSG,10 IU/mL hCG,10 ng/mL EGF配制成化学限定的基础液,添加不同浓度Leptin对猪卵母细胞进行体外成熟培养为各试验组,以未添加Leptin的基础液为对照组1,而添加5%的胎牛血清（FBS）,10%猪卵泡液为对照组2。比较分析各组卵母细胞核成熟效率,孤雌激活后胚胎的卵裂率,囊胚发育率,结果表明,各添加组卵母细胞成熟率与对照组之间无显着差异（P>0.05）;孤雌激活后,各组间的卵裂率和囊胚发育率也无明显差异。（ 3 ）以不同浓度必需氨基酸和非必需氨基酸（ 1%EAA+1%NEAA ,2%EAA+1%NEAA）添加到猪卵母细胞IVM培养液,发现无论是成熟率还是孤雌激活后的卵裂率,实验组与对照组都没有显着差异（P>0.05）;而胚胎的后期培养上,发现添加组（1%EAA+1%NEAA,2%EAA+1%NEAA）的囊胚率要显着低于对照组1和2（19.07±3.15% ,16.89±2.41% vs.26.53±2.00% ,27.55±1.64%,P<0.05）。（4）在胚胎培养液PZM-3和PZM-4中分别添加不同浓度的瘦素（10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）发现处理组胚胎发育情况均优于对照组,尽管在卵裂率和囊胚细胞总数上没有显着差异,但在囊胚率方面,发现无论是PZM-3还是PZM-4添加组都比对照组要高,且差异显着（P<0.05）,而且相对于对照组,添加50ng/mL的组囊胚率最高（PZM-3,51.23±3.48% vs. 34.37±4.03%,P<0.05;PZM-4,31.76±5.07% vs. 12.14±1.89%,P<0.05）。（5）在胚胎培养液PZM-3中添加不同浓度的VPA,发现添加组的卵裂率与对照组没有显着差别（P>0.05）;而添加组胚胎的后期均不能发育到囊胚。结果表明:①用1.56 kv/cm、100μs、2DC作为孤雌激活的电击活参数效果最好。②在成熟液中添加Leptin对卵母细胞成熟作用不明显,也没有显着提高后期胚胎发育的能力。③在成熟液中添加必需氨基酸和非必需氨基酸对于卵母细胞的成熟并不影响,但对孤雌激活胚的后期发育不利,囊胚率显着降低。④在胚胎培养液中添加Leptin对胚胎发育有促进作用,添加50ng/mL和100ng/mL能显着提高囊胚率,且添加50ng/mL囊胚率最高。⑤在胚胎培养液中添加全程VPA对重构胚胎的发育不利,不能发育到达囊胚期。综上所述,在猪卵母细胞的体外培养过程中,利用1.56 kv/cm、100μs、2DC的电击活参数,激活后在PZM-3胚胎培养液中添加50ng/mL Leptin,使得猪的胚胎在体外培养过程中可以获得较好的发育能力。
张玲,黄友防,何若钢,卢晟盛,许惠艳,兰宗宝,房慧伶,潘天彪,蓝海恩,黄敏瑞,卢克焕[10]（2009）在《利用电极盘进行猪卵母细胞电激活》文中指出[目的]研究不同电激活参数以及电脉冲联合6-DMAP对猪卵母细胞孤雌激活效果的影响。[方法]使用电极盘,测定不同场强（1.1、1.3、1.5、1.71、.9 kV/cm）,不同脉冲时程（305、07、09、0、110μs）,1次脉冲下猪卵母细胞囊胚率的变化。[结果]结果表明,脉冲强度以1.5和1.7 kV/cm效果最好,在80μs时其猪卵母细胞囊胚率分别达到（22.35±5.16）%和（20.59±9.41）%;脉冲强度1.5 kV/cm,1次电脉冲后4 h联合6-DMAP激活卵母细胞,当脉冲时程达到70和90μs时,囊胚率分别达到（21.65±9.95）%和（23.10±16.27）%。[结论]在试验条件下,使用电极盘的最适电激活参数为脉冲强度1.51.7 kV/cm,脉冲时长80μs,1次脉冲电激活。
二、猪卵母细胞电激活参数的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪卵母细胞电激活参数的研究（论文提纲范文）
（1）钙敏感受体参与猪卵母细胞成熟、激活及胚胎发育的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 钙敏感受体的生理功能及其研究进展 |
| 1.1.1 CASR的表达 |
| 1.1.2 CASR的结构 |
| 1.1.3 CASR信号通路 |
| 1.1.4 CASR的生理功能 |
| 1.2 卵母细胞成熟调控机制 |
| 1.2.1 卵母细胞的核成熟 |
| 1.2.2 卵母细胞的胞质成熟 |
| 1.3 卵母细胞激活调控机制 |
| 1.3.1 卵母细胞的MII阻滞 |
| 1.3.2 卵母细胞MII阻滞的退出 |
| 1.4 卵母细胞受精和胚胎发育 |
| 1.4.1 受精过程及调控机制 |
| 1.4.2 早期胚胎发育 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器设备及试剂 |
| 2.2.1 主要仪器设备 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 溶液配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 卵母细胞收集与成熟培养 |
| 2.4.2 RNA提取、反转录PCR与实时荧光定量PCR |
| 2.4.3 免疫荧光染色 |
| 2.4.4 Western Blot检测 |
| 2.4.5 核成熟的检测 |
| 2.4.6 卵母细胞孤雌激活和早期胚胎体外培养 |
| 2.4.7 卵母细胞电激活及体外培养 |
| 2.4.8 原核形成的检测 |
| 2.4.9 体外受精 |
| 2.4.10 受精率的检测 |
| 2.4.11 囊胚细胞数检测 |
| 2.4.12 卵母细胞ROS和GSH水平检测 |
| 2.4.13 数据分析 |
| 第三章 CASR在猪卵母细胞体外成熟中作用的研究 |
| 3.1 CASR在猪的卵母细胞和颗粒细胞上的表达 |
| 3.2 在不同成分成熟液对卵母细胞的CASR表达和分布的影响 |
| 3.3 CASR的激动剂NPS R-568和抑制剂NPS2390对于猪卵母细胞核成熟的影响 |
| 3.4 CASR的激动剂NPS R-568和抑制剂NPS2390对于猪卵母细胞胞质成熟的影响 |
| 3.5 CASR的激动剂NPS R-568和抑制剂NPS2390对于猪卵母细胞孤雌激活早期胚胎发育的影响 |
| 3.6 CASR的激动剂NPS R-568和抑制剂NPS2390对猪卵母细胞成熟过程中MAPK3/1磷酸化水平的影响 |
| 3.7 小结与讨论 |
| 3.7.1 小结 |
| 3.7.2 讨论 |
| 第四章 CASR在猪卵母细胞激活中作用的研究 |
| 4.1 CASR在猪的激活的卵母细胞上的表达和分布 |
| 4.2 CASR在猪卵母细胞激活过程中的表达变化 |
| 4.3 CASR的激动剂NPS R-568和抑制剂NPS2390对猪卵母细胞激活的影响 |
| 4.4 猪卵母细胞激活过程中胞内钙离子对CASR功能的影响 |
| 4.5 在猪卵母细胞激活中CaMKⅡ活性对于CASR功能的影响 |
| 4.6 在猪卵母细胞激活过程中CaMKⅡ调控CASR的表达 |
| 4.7 在猪卵母细胞激活过程中CASR对CaMKⅡ磷酸化水平的影响 |
| 4.8 小结与讨论 |
| 4.8.1 小结 |
| 4.8.2 讨论 |
| 第五章 CASR在猪体外受精和早期胚胎发育中作用的研究 |
| 5.1 CASR在猪配子和IVF胚胎上的表达 |
| 5.2 CASR对猪体外受精胚胎体外生产的影响 |
| 5.3 CASR对猪孤雌激活早期胚胎发育的影响 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 5.4.1 小结 |
| 5.4.2 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 博士期间参与的文章 |
（2）猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 卵母细胞成熟、激活与胚胎培养 |
| 1.1 卵母细胞成熟 |
| 1.2 卵母细胞激活 |
| 1.3 早期胚胎发育 |
| 2 卵胞质注射转基因 |
| 2.1 卵胞质注射研究进展 |
| 2.2 卵胞质注射转基因机理 |
| 2.3 卵胞质注射影响因素 |
| 3 单精子胞质内注射转基因 |
| 3.1 精子载体法 |
| 3.2 单精子胞质内注射 |
| 4 本论文的研究意义 |
| 第二章 猪卵母细胞体外成熟与胚胎培养影响因素研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 猪卵母细胞体外成熟影响因素研究 |
| 2.2 猪胚胎培养影响因素研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 猪卵母细胞体外成熟影响因素研究 |
| 3.2 猪胚胎培养影响因素研究 |
| 4 结论 |
| 第三章 猪卵母细胞孤雌激活方法研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 猪卵母细胞化学激活方法的初步研究 |
| 2.2 猪卵母细胞电激活方法的初步研究 |
| 2.3 猪卵母细胞电激活联合化学激活方法的初步研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 猪卵母细胞化学激活方法的初步研究 |
| 3.2 猪卵母细胞电激活方法的初步研究 |
| 3.3 猪卵母细胞电激活联合化学激活方法的初步研究 |
| 4 结论 |
| 第四章 猪卵胞质注射转基因影响因素研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 孤雌激活和IVF方法的完善 |
| 2.2 孤雌卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 2.3 受精卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 孤雌激活和IVF方法的完善 |
| 3.2 孤雌卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 3.3 受精卵胞质注射转基因方法的初步研究 |
| 4 结论 |
| 第五章 猪单精子胞质内注射转基因影响因素研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 试验设计 |
| 1.6 数据统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 不同激活方法对猪ICSI胚胎发育的影响 |
| 2.2 不同外源基因浓度对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.3 精子与外源基因孵育时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.4 不同精子冷冻液和孵育液对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.5 不同精子处理方法和激活方法对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.6 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.7 激活后精子注射时间对不同发育时间合子内谷胱甘肽含量的影响 |
| 2.8 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎原核形成的影响 |
| 2.9 不同外源基因载体对ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 2.10 单精子卵胞质注射胚胎的体内发育 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 不同激活方法对猪ICSI胚胎发育的影响 |
| 3.2 不同外源基因浓度对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.3 精子与外源基因孵育时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.4 不同精子冷冻液和孵育液对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.5 精子处理和激活对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.6 激活后精子注射时间对猪ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.7 不同外源基因载体对ICSI胚胎发育能力及转基因效率的影响 |
| 3.8 单精子卵胞质注射胚胎的体内发育 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）猪卵母细胞电激活方法初探（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 卵母细胞收集与成熟 |
| 1.3 卵母细胞激活及胚胎培养 |
| 1.4 实验方案 |
| 1.4.1 不同激活方案对猪卵母细胞激活效果的影响 |
| 1.4.2 脉冲次数对猪卵母细胞激活效果的影响 |
| 1.4.3 脉冲电压对猪卵母细胞激活效果的影响 |
| 1.4.4 激活液中Ca2+浓度对猪卵母细胞电激活效果的影响 |
| 1.4.5 不同激活模式对猪卵母细胞电激活效果的影响 |
| 1.5 胚胎细胞计数 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同激活方案对猪卵母细胞激活效果的影响 |
| 2.2 脉冲次数对猪卵母细胞激活效果的影响 |
| 2.3 脉冲电压对猪卵母细胞激活效果的影响 |
| 2.4 激活液中Ca2+浓度对猪卵母细胞电激活效果的影响 |
| 2.5 不同激活模式对猪卵母细胞电激活效果的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 激活模式的选择 |
| 3.2 电激活参数的选择 |
| 3.3 电激活液选择 |
| 3.4 激活方法选择 |
| 4 结论 |
（4）不同电激活参数及CB处理对猪卵母细胞孤雌发育的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与培养液 |
| 1.2 猪卵母细胞的收集及体外成熟培养 |
| 1.3 成熟卵的孤雌激活及体外培养处理 |
| 1.4 试验设计 |
| 1.4.1 脉冲时程和脉冲次数对孤雌胚胎发育的影响 |
| 1.4.2 场强和脉冲次数对孤雌胚胎发育的影响 |
| 1.4.3 场强和脉冲时程对孤雌胚胎发育的影响 |
| 1.4.4 CB对孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 脉冲时程和脉冲次数对孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.2 场强和脉冲次数对孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.3 场强和脉冲时程对孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.4 CB处理对孤雌胚胎发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 脉冲次数对孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.2 场强和脉冲时程对孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.3 CB处理对猪孤雌胚胎的影响 |
（5）电激活参数和培养基对猪卵母细胞孤雌发育的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵母细胞的来源及采集 |
| 1.2 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 脉冲电压对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 2.2 脉冲持续时间对猪卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 2.3 脉冲次数对猪卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 2.4 培养液对猪孤雌激活胚胎发育的影响 |
| 3 结论与讨论 |
（7）猪卵母细胞孤雌激活方法的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 卵母细胞的生长和成熟 |
| 1.2 卵母细胞体外成熟的研究 |
| 1.2.1 卵母细胞体外成熟的影响因素 |
| 1.2.2 卵母细胞体外成熟的调节机制 |
| 1.3 卵母细胞孤雌激活的研究 |
| 1.3.1 卵母细胞孤雌激活的机制 |
| 1.3.2 卵母细胞孤雌激活的方法及研究进展 |
| 1.3.3 卵母细胞孤雌激活的影响因素 |
| 1.4 体细胞核移植概述 |
| 1.4.1 体细胞核移植的研究进展 |
| 1.4.2 核移植研究中存在的问题 |
| 1.4.3 体细胞核移植的应用前景 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器设备及耗材 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 卵母细胞的成熟培养 |
| 2.2.2 卵母细胞的激活处理 |
| 2.2.3 实验数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 卵母细胞的单次电激活 |
| 3.2 卵母细胞的二次电激活 |
| 3.3 卵母细胞的化学激活 |
| 3.3.1 不同浓度Ionomycin 作用不同时间 |
| 3.3.2 Ionomycin 分别与6-DMAP、CB 及CHX 组合 |
| 3.3.3 9% Ethanol 作用不同时间 |
| 3.4 卵母细胞的物理化学联合激活 |
| 4 讨论 |
| 4.1 卵母细胞体外成熟对猪孤雌胚胎早期发育的影响 |
| 4.2 电刺激对猪孤雌胚胎早期发育的影响 |
| 4.3 化学试剂对猪孤雌胚胎早期发育的影响 |
| 4.4 电刺激结合化学试剂对猪孤雌胚胎早期发育的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 图版 |
| 图版说明 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）莆田黑猪体细胞核移植的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 体细胞核移植 |
| 2 猪体细胞核移植的研究进展 |
| 3 影响猪体细胞核移植的几个因素 |
| 3.1 供体细胞 |
| 3.2 胞质受体 |
| 3.3 胚胎重构 |
| 3.4 克隆胚的激活 |
| 3.5 克隆胚的培养 |
| 4 猪胚胎冷冻的研究进展 |
| 5 核移植的应用价值 |
| 6 存在的问题 |
| 7 本试验研究的目的和意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 供体细胞的准备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器和耗材 |
| 1.3 试验试剂 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 溶液配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 成纤维细胞组织块培养法 |
| 1.4.2 成纤维细胞传代培养 |
| 1.4.3 成纤维细胞的纯化 |
| 1.4.4 成纤维细胞液氮冷冻保存 |
| 1.4.5 成纤维细胞的解冻复苏 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 核移植供体细胞的选择 |
| 3.2 成纤维细胞生长特性 |
| 3.3 成纤维细胞培养方法 |
| 3.4 成纤维细胞分离纯化 |
| 3.5 成纤维细胞的冷冻与解冻 |
| 第二章 猪卵母细胞体外成熟培养 |
| 1 材料与方 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要仪器和耗材 |
| 1.3 试验试剂 |
| 1.3.1 主要试剂 |
| 1.3.2 溶液的配制 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的回收 |
| 1.4.2 IVM 的培养 |
| 1.4.3 IVM 后颗粒细胞的去除 |
| 1.4.4 成熟卵母细胞孤雌激活 |
| 1.4.5 胚胎培养 |
| 1.4.6 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 不同培养方式对IVM 的影响 |
| 2.2 石蜡油的添加对IVM 培养的影响 |
| 2.3 不同外源激素组合对IVM 的影响 |
| 2.4 ITS 对IVM 及孤雌胚体外发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同培养方法对IVM 的影响 |
| 3.2 石蜡油的添加对IVM 的影响 |
| 3.3 外源激素对IVM 的影响 |
| 3.4 ITS 对IVM 及孤雌胚体外发育的影响 |
| 第三章 猪卵母细胞的孤雌激活及体外胚胎培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器和耗材 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 溶液的配制 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 卵母细胞的采集和体外成熟培养 |
| 1.4.2 卵母细胞孤雌激活 |
| 1.4.3 孤雌胚胎的体外培养 |
| 1.4.4 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Ion 联合6-DMAP 对卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 2.2 不同电激活参数激活对孤雌胚发育的影响 |
| 2.3 激活后不同培养基对孤雌胚体外发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 Ion 联合6-DMAP 对卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 3.2 不同电激活参数激活对孤雌胚发育的影响 |
| 3.3 激活后不同培养基对孤雌胚体外发育的影响 |
| 第四章 微电极融合法对猪体细胞克隆胚胎融合激活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 1.3 微电极的制作与连接 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.4.1 供体细胞的准备 |
| 1.4.2 卵母细胞的体外成熟培养 |
| 1.4.3 受体卵母细胞去核 |
| 1.4.4 去核后卵母细胞的注核 |
| 1.4.5 重构胚的电融合和激活 |
| 1.4.6 融合率的观察 |
| 1.4.7 重构胚胎的培养 |
| 1.4.8 微电极融合激活试验设计 |
| 1.4.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 电场强度对电融合效果的影响 |
| 2.2 电脉冲时间对电融合效果的影响 |
| 2.3 电脉冲次数对电融合效果的影响 |
| 2.4 电场强度对电融合效果的影响 |
| 2.5 微电极融合法与槽式融合法对电融合效果的影响 |
| 3 讨论 |
| 第五章 重构胚的冷冻与解冻 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要仪器和耗材 |
| 1.3 OPS 的制备 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 1.6.1 供体细胞（成纤维细胞）的培养 |
| 1.6.2 卵母细胞的体外成熟培养及核移植 |
| 1.6.3 重构胚的体外培养 |
| 1.6.4 重构胚的冷冻 |
| 1.7 重构胚胎的解冻 |
| 1.8 形态学观察法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）猪卵母细胞体外成熟及胚胎培养的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 猪卵母细胞体外成熟 |
| 1.1 卵母细胞体外成熟 |
| 1.2 卵母细胞体外成熟的影响因素 |
| 2 猪胚胎的体外培养 |
| 2.1 猪胚胎体外培养的影响因素 |
| 3 猪的体细胞核移植及其影响因素 |
| 3.1 供核细胞的影响 |
| 3.2 核移植方法的影响 |
| 3.3 表观修饰剂干预的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂与溶液 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂与溶液配制 |
| 1.5 方法 |
| 1.6 试验设计 |
| 1.7 统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同电激活参数对卵母细胞孤雌发育的影响 |
| 2.2 Leptin 对卵母细胞体外成熟及后期发育的影响 |
| 2.3 NEAA 和 EAA 对卵母细胞体外成熟培养及后期胚胎发育的影响 |
| 2.4 Leptin 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.5 VPA 处理对重构胚胎体外发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同电激活参数对卵母细胞孤雌发育的影响 |
| 3.2 不同 Leptin 对卵母细胞体外成熟及后期发育的影响 |
| 3.3 NEAA 和 EAA 对卵母细胞体外成熟培养及后期胚胎发育的影响 |
| 3.4 Leptin 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.5 VPA 对重构胚胎体外发育的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）利用电极盘进行猪卵母细胞电激活（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 培养液 |
| 1.2 卵母细胞的准备 |
| 1.3 卵母细胞的电激活 |
| 1.4 卵母细胞电激活后的体外培养 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同电场强度对猪卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 2.2 不同脉冲时程联合6-DMAP对猪卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 3 结论与讨论 |
四、猪卵母细胞电激活参数的研究（论文参考文献）
- [1]钙敏感受体参与猪卵母细胞成熟、激活及胚胎发育的研究[D]. 刘聪. 中国农业大学, 2017(05)
- [2]猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究[D]. 刘帅. 广西大学, 2015(01)
- [3]猪卵母细胞电激活方法初探[J]. 刘帅,吕玲燕,孙俊铭,刘庆友,石德顺,崔奎青. 中国畜牧杂志, 2012(23)
- [4]不同电激活参数及CB处理对猪卵母细胞孤雌发育的影响[J]. 石俊松,罗绿花,周荣,周秀,麦然标,李紫聪,吴珍芳. 华南农业大学学报, 2012(03)
- [5]电激活参数和培养基对猪卵母细胞孤雌发育的影响[J]. 潘伟荣,魏太云,信吉阁,张崇义,卿玉波,魏红江. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2011(04)
- [6]猪成熟卵母细胞的孤雌激活及体外胚胎培养的研究[A]. 张文昌,王秀爱,刘凤军,庄益芬,陈曦,谢旭东,洪志勇,陈梅芳,叶屹峰,余翠月. 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（上册）, 2010
- [7]猪卵母细胞孤雌激活方法的研究[D]. 赵金凤. 东北农业大学, 2010(05)
- [8]莆田黑猪体细胞核移植的研究[D]. 王秀爱. 福建农林大学, 2010(04)
- [9]猪卵母细胞体外成熟及胚胎培养的相关研究[D]. 侯文文. 安徽农业大学, 2009(07)
- [10]利用电极盘进行猪卵母细胞电激活[J]. 张玲,黄友防,何若钢,卢晟盛,许惠艳,兰宗宝,房慧伶,潘天彪,蓝海恩,黄敏瑞,卢克焕. 安徽农业科学, 2009(15)