一、兔抗M13噬菌体酶标抗体的制备（论文文献综述）
王丽娟[1]（2021）在《抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库的构建及抗体的筛选》文中研究指明单链抗体（ScFv）是通过一段柔性多肽（Linker）将抗体重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）连接起来所形成的一种新型基因工程抗体,与单克隆抗体（MAb）相比,ScFv不仅保留了完整单克隆抗体的特异性,还有分子量小、异源性低等特点,使其在靶向治疗与诊断检测方面具备广泛的应用前景。本研究以非洲猪瘟病毒（ASFV）为研究对象,构建了抗ASFV的猪源噬菌体单链抗体文库,并从中筛选出可以稳定表达的具有ASFV反应活性的猪源ScFv,为ASFV的诊断提供一种新型原材料。首先,根据IMGT数据库中公布的猪源抗体基因序列设计重叠PCR（SOE-PCR）引物,分离自然感染ASFV的抗体阳性猪外周血淋巴细胞,提取其总RNA作为扩增模板,在上述引物作用下经过两轮巢式PCR获得猪源抗体VH及VL基因,再通过一轮SOE-PCR,利用一段Linker序列将VH与VL连接形成VH-Linker-VL,获得ScFv基因,测序发现,ScFv的基因多样性良好,达到90%以上,符合建库要求。随后,将ScFv与pHEN-2噬菌粒载体进行双酶切连接,连接产物转化至TG1宿主菌,获得一个库容量为1.13×108的原始文库,经辅助噬菌体M13K07拯救后,获得初始猪源ScFv噬菌体文库,经测定,文库滴度为8.0×1013cfu/m L。包被ASFV抗原检测板,对噬菌体文库进行亲和富集,经3轮筛选后,获得显着富集的抗ASFV ScFv噬菌体文库,同时筛选出4株特异性抗ASFV的ScFv,其中VH-VLλ6和VH-VLλ11与ASFV的反应活性较好,PCR扩增VH-VLλ6和VH-VLλ11序列,测序后进行NCBI Ig Blast序列比对分析,结果证实VH-VLλ6和VH-VLλ11为猪源ScFv。最后,将VH-VLλ6和VH-VLλ11分别构建至pET30a表达载体,转化BL21（DE3）感受态细胞进行原核表达,在IPTG的诱导下,对表达产物进行SDS-PAGE分析,分别在约27 KDa处发现目的条带,且主要以包涵体形式存在,经镍柱纯化后纯度达到90%以上。进一步以酶联免疫吸附实验（ELISA）、间接免疫荧光实验（IFA）鉴定VH-VLλ6和VH-VLλ11与ASFV之间的反应性,结果证实,获得的两株经原核表达系统表达的单链抗体与ASFV具有较好的反应活性。综上所述,本研究以SOE-PCR技术为依托,以自然感染ASFV的抗体阳性猪外周血淋巴细胞总RNA为模板,成功构建了一个猪源单链抗体噬菌体文库,从文库中筛选得到两株特异性抗ASFV的ScFv,进一步实验证明筛选得到的两株ScFv确实具有ASFV反应活性。该抗体的成功制备填补了目前市场上ASFV ScFv的空白,为ASFV诊断与防控的原材料来源提供了新渠道。
王博[2]（2021）在《我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选》文中进行了进一步梳理第一部分我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析海蛇属蛇目眼镜蛇科海蛇亚科,全球共70余种,我国分布有17种,优势种为平颏海蛇（Hydrophis curtus,H.curtus）和青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus,H.cyanocinctus）,在北部湾及海南、福建近海最为多见。海蛇毒是由多种蛋白、多肽和小分子物质共同组成的混合物,其主要组分为神经毒素和多种酶类,致死性极强。由于海蛇种类、地域分布及猎食对象的不同,海蛇毒中所含的蛋白种类和占比也有一定差异。为了更好地研究我国海域平颏海蛇毒（H.curtus venom,Hcu V）和青环海蛇毒（H.cyanocinctus venom,Hcy V）的组成,比较分析两者差异情况,本部分以平颏海蛇和青环海蛇为研究对象,首先构建了海蛇毒腺转录组数据库;其次利用液相色谱-质谱联用技术,通过蛋白组学方法对两种海蛇毒的蛋白组成进行了比较分析;在组学基础之上,我们又进一步对海蛇毒相关的生物学性质进行了测定与分析。主要结果如下:1.首先应用Illumina Hi Seq?平台对我国两种海蛇毒腺进行了转录组测序,成功构建了高质量的毒腺转录组数据库,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别获得38,710和35,716条unigenes序列。我们将毒腺的转录组数据在公共数据库（NR、KEGG、GO、KOG、Swiss Prot）中进行了功能注释,在NR数据库中,两种海蛇毒腺注释序列来源最多的3个物种均为Notechis scutatus,Pseudonaja textilis,Ophiophagus hannah;在KEGG注释中,平颏海蛇和青环海蛇毒腺分别注释了10,949和10,683条unigenes,主要集中在信号转导和疾病发生相关的路径中;对简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）位点检测,平颏海蛇和青环海蛇毒腺转录组中分别发现了15,171和12,908个SSR位点,其中以单核苷酸为重复单元的类型占比最高,均超过了50%。通过与Uni Prot动物毒素库（Uni Prot animal toxin and venom database）Blast比对,在两种海蛇毒腺中总共筛选到了17种蛇毒蛋白,充分挖掘了海蛇毒腺中蛇毒蛋白功能基因的资源。2.通过液相色谱-质谱联用技术,获得Hcu V和Hcy V蛋白组分的原始肽段,匹配检索Uni Prot动物毒素数据库,在Hcu V和Hcy V中分别鉴定到47和38种毒素相关蛋白。根据功能分类,鉴定到的毒素相关蛋白可归为15个家族,主要包括:三指毒素、蛋白酶类、磷脂酶类、富含半胱氨酸毒素蛋白类、毒素因子、离子通道抑制剂等。这些毒素多见于蛇类,但也有少数见于其它有毒生物,包括蜘蛛（Lycosa singoriensis）、蝎子（Lychas mucronatus）、芋螺（Conus textile）等。3.通过毒素蛋白组比较分析发现,不同毒素家族在Hcu V和Hcy V中所占比例不同,具体的蛋白组成也有一定差异。Hcu V和Hcy V中比例最高的两类毒素均为三指毒素（主要包括短链和长链神经毒素）和磷脂酶A2,在Hcu V中所占比例分别为54%和38%,在Hcy V中分别为69%和22%,与文献报道的不同海域海蛇毒的组成及占比有明显差异。两种海蛇毒的生物学活性测定结果表明,Hcu V和Hcy V的小鼠半数致死量(LD50)分别为0.34 mg/kg和0.24 mg/kg,都有很强的致死性;两种海蛇毒均检测到明显的神经毒性、磷脂酶A2活性,以及微弱的蛋白酶活性和间接溶血毒性,但无明显的促凝与抗凝活性,这些活性检测结果与组学分析结果相一致。本部分通过对Hcu V和Hcy V进行多组学分析,并结合蛇毒生物学活性检测,揭示了我国两种优势种海蛇毒组成的分子多样性,也提示毒素蛋白组成比例的不同与其咬伤症状表现和致死效应之间可能存在的关系,为后续研制针对我国海域海蛇咬伤中毒的抗毒血清提供了重要基础。第二部分抗平颏海蛇毒血清的制备及其抗毒效果评价海蛇毒主要组分为神经毒素,能阻断神经突触传递,从而产生一系列中毒症状。海蛇毒的毒性极强,可诱发严重的呼吸衰竭,死亡率高,目前针对海蛇咬伤最有效的急救方式是尽快注射抗毒血清,但我国仅生产几种抗陆地蛇毒血清,对海蛇咬伤救治效果不佳。第一部分研究结果提示,不同海域、不同种类的海蛇,其毒素组成存在一定差异,因此有必要研制特异性针对我国海域优势种海蛇毒的抗毒血清,本论文第二部分即以我国海域优势种平颏海蛇毒为抗原,经过抗原处理、免疫马匹、抗体纯化等步骤,制备了高效价的抗毒血清;并进一步对抗海蛇毒血清的体内外抗毒效果进行了评价,明确了抗毒血清的有效用量和使用时机,为今后临床应用提供了参考。主要结果如下:1.采用0.6%甲醛浓度灭活毒素再添加弗氏不完全佐剂进行乳化,使毒素抗原获得最大的免疫原性,免疫马匹后50天采血可获得最高效价的马血清;经过酶消化、硫酸铵沉淀、超滤、柱层析等抗体纯化步骤后,抗海蛇毒血清中抗体F（ab’）2蛋白纯度达到91.6%,杂质大量减少,同时具备较好的毒素中和能力。2.抗平颏海蛇毒血清（H.curtus antivenom,Hcu AV）体外抗毒实验结果显示,Hcu AV对平颏海蛇毒和青环海蛇毒均有良好中和效果:1 m L Hcu AV能够对抗1.2 mg平颏海蛇毒或0.9 mg青环海蛇毒,使半数实验动物存活,提示Hcu AV能交叉中和多种海蛇毒,并为体内实验的抗毒血清用量提供了依据。3.Hcu AV体内抗毒实验结果显示,海蛇咬伤中毒后注射Hcu AV能显着提高实验动物的存活率,但需在短时间内（出现中毒症状前）尽早注射足量抗毒血清才能达到较好的救治效果,预防用药和延迟用药均无法降低中毒死亡率。同时,Hcu AV能有效减轻海蛇毒造成的多器官病理学变化。本部分以平颏海蛇毒为抗原,制备了高效价、高纯度的抗平颏海蛇毒马血清,能有效中和Hcu V和Hcy V,覆盖我国海域优势种海蛇毒。海蛇咬伤后尽快注射足量抗毒血清,能显着地降低中毒死亡率,保护机体脏器免受损伤,为今后抗海蛇毒血清的临床应用提供了实验依据。第三部分平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析海蛇毒由多种酶类、非酶类蛋白和多肽、小分子物质组成,是一类重要的海洋生物毒素。海蛇毒除了剧烈的毒性之外,也含有多种结构特异、功能新颖的活性物质,具有多样的药理学效应如:镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗血栓等。海蛇毒中的活性物质是海洋生物资源开发研究的热点之一。本部分以我国南海海域平颏海蛇为研究对象,分离其毒腺组织,利用M13噬菌体展示技术构建了平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库。然后以内毒素LPS为靶标分子,经过多轮淘选,筛选出一个高亲和力的噬菌体克隆,通过基因测序、氨基酸序列预测与性质分析等,最终通过化学合成法获得了一段功能性多肽,并通过体内、体外实验评价其对内毒素的拮抗效果。本部分主要结果如下:1.构建了高质量的平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示文库,文库库容达到2.2×109,随机测序验证外源插入片段准确无误;c-Myc标签检测结果表明,外源插入片段在噬菌体外壳表面得到了高效的展示。2.以LPS为靶标分子,经过4轮固相淘选、阳性克隆测序、氨基酸序列预测等过程,获得了一段平颏海蛇毒腺来源的21肽。多肽性质分析结果表明,该多肽富含碱性氨基酸,理论分子量为2523.15,理论等电点为10.76,在中性溶液中携带正电荷;该多肽的二级结构主要为α-螺旋,氨基与羧基端呈现出双亲性结构,能够与带负电荷疏水性的LPS特异性结合。3.通过化学合成方式成功合成并纯化了该21肽,纯度超过95%,质谱测定实际分子量与软件预测的理论值相符,证明合成的多肽无误,可用于进一步实验。利用生物膜干涉技术（BLI）对该多肽与LPS的结合力进行测定,结果表明,该多肽与LPS具有较强的结合能力,结合方式为“快结合-慢解离”。内毒素中和实验表明,该海蛇毒腺来源的21肽具有明确的内毒素中和效果,因而将其命名为H.curtus Endotoxin-neutralizing Peptide,简称Hc-ENP。4.体外实验结果表明,Hc-ENP具有明确的LPS拮抗效果,在5-10μg/m L浓度下,能够有效抑制LPS与RAW264.7细胞的结合。Western-blot、ELISA、细胞免疫荧光等结果显示,Hc-ENP能通过抑制MAPK、NF-κB炎性信号通路的激活,从而有效抑制LPS刺激细胞产生的一系列炎性反应,包括:炎性因子释放、炎性相关酶表达量升高、活性氧含量增加等,进而发挥抗炎活性。5.体内实验结果表明,Hc-ENP能够有效抑制LPS刺激机体引发的全身性炎性反应,包括:靶器官炎性细胞浸润、血清炎性因子水平升高、器官组织中炎性相关酶表达量升高、组织病理改变等。本部分通过构建高质量海蛇毒腺M13噬菌体展示库来进行淘选,从而获得平颏海蛇毒腺中的特定活性分子。本实验中我们获得了一个平颏海蛇毒腺来源的内毒素中和肽—Hc-ENP,其在体内外均有明确的LPS拮抗效果,本研究为进一步开发利用海蛇基因资源,探索其开发应用价值提供了新的途径。
陈文静[3]（2020）在《鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白3特异亲和肽抑制虫体入侵宿主细胞研究》文中研究说明鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白3（E.tenella microneme protein 3,Et MIC3）是E.tenella的微线体在球虫入侵宿主细胞早期阶段中分泌于子孢子表面的重要蛋白质,且能够与鸡盲肠上皮细胞表面的特定受体分子结合从而介导整个入侵过程。由E.tenella引起的球虫病对养禽业的危害非常大。由于当前主要的治疗（抗球虫药）和预防（球虫活苗）球虫疾病的方法存在易产生耐药性以及花费成本高等缺点,因此有研究基于其入侵机制进行抗球虫疾病的研究,并发现Et MIC3可作为候选疫苗有效降低球虫的入侵程度。Et MIC3由七个串联重复结构域组成（A、B、C1、C2、C3、C4、D）,包括两端三个不完全重复结构域和中间四个完全重复结构域（C1、C2、C3、C4段）,在对各个区域进行保守性及抗原性分析之后,本研究主要探讨了B段和C1段（Et MIC3-BC1）两个片段在虫体入侵宿主细胞过程中所起到的作用。噬菌体展示技术是一种新的技术,可以用来鉴别抗原表位及研究抗原和抗体的结构,并且能够筛选出抗原和抗体的模拟肽,在寄生虫病研究及防治中具有重要作用。本实验通过采用噬菌体展示技术获得了能与Et MIC3-BC1蛋白特异结合的亲和肽,并研究了目的亲和肽在体内、外抑制虫体入侵宿主细胞的作用。1、原核表达Et MIC3-BC1蛋白并制备相应多克隆抗体。本实验首先进行了重组表达质粒的构建（p ET-30a-Et MIC3-BC1）,并通过异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂的诱导将目的蛋白表达于E.coli（BL21）中。该重组蛋白在经SDS-PAGE验证之后,大量纯化回收,并且进行蛋白质复性。以复性之后的蛋白作为免疫原对新西兰大白兔进行免疫,从而制备多克隆抗体,通过Western blot（WB）和ELISA方法对抗体进行检测。琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE的实验结果显示了在本实验中p ET-30a-Et MIC3-BC1重组表达质粒被成功构建以及重组蛋白的成功表达;WB和ELISA结果说明了以Et MIC3-BC1蛋白作为抗原能够制备生物学活性（BA）良好的多克隆抗体。2、Et MIC3-BC1重组蛋白亲和肽的筛选。按照试剂盒说明,通过噬菌体展示技术,以纯化并且复性之后的重组Et MIC3-BC1蛋白为靶分子于噬菌体十二肽库中进行四轮生物筛选,并在第四轮生物筛选结束后随机地选择三十个状态良好的噬菌斑进行噬菌体扩增、提DNA、测序并推导出其氨基酸序列。结果显示,30个独立的噬菌斑共得到8种亲和力较高的十二肽序列,合成了其中出现频率及亲和力较高的A肽（AGRLLTPTMSLV）、D肽（DYHDPSLPTLGK）、W肽（WKDVHKAWLLEP）进行进一步研究。并且通过ELISA、间接ELISA和竞争ELISA法表明这三种多肽对应的噬菌体能够与Et MIC3-BC1和子孢子蛋白发生特异性结合以及抗Et MIC3-BC1多抗可以抑制噬菌体与重组蛋白之间的结合。3、测定A肽、D肽、W肽体外抵抗E.tenella子孢子入侵MDBK细胞的水平。采用MTT法测得这三种亲和肽作用于MDBK细胞的最大无毒浓度是125μg/ml。通过Percoll密度梯度离心法进行E.tenella子孢子的纯化,并且采用CFDA-SE荧光探针对子孢子进行标记。通过流式细胞仪检测当三种多肽浓度分别为25μg/m L,50μg/m L,75μg/m L,100μg/m L,125μg/m L时抑制子孢子（30万/孔）入侵MDBK细胞（1万/孔）的效率。结果显示这三种多肽都能够抑制子孢子的入侵,并且A肽、D肽的抑制效果都极显着高于W肽（P<0.01）,A肽的抑制效果极显着高于D肽（P<0.01）。4、检测A肽、D肽、W肽相应噬菌体在机体内的抗球虫作用。75只21日龄蛋鸡随机分成五组（15只/组）:PBS组、A组、D组、W组、E.tenella感染对照组。21日龄时,PBS组的鸡口服无菌PBS,A组、D组、W组、E.tenella感染对照组的鸡口服E.tenella孢子化卵囊（1万/只）。于攻虫后的第0-2天,给PBS组与E.tenella感染对照组口服无菌PBS,A组每天口服1×1012pfu A肽所对应的阳性噬菌体、D组每天口服1×1012pfu D肽所对应的阳性噬菌体、W组每天口服1×1012pfu W肽所对应的阳性噬菌体。感染后第七天取各组粪便,观察克粪便卵囊排出减少率。于感染后的第八天对各组鸡进行剖杀,测定各组鸡的体重变化、盲肠病变评分、大体病理学和组织病理学变化、OPG和ACI等指标。结果表明,A组、D组、W组都能够抵抗一定程度的球虫感染,其中A组和D组的各项指标与攻虫对照组相比差异极显着（P<0.01）且A组优于D组,W组与E.tenella感染对照组相比较差异显着（P<0.05）。各组的抗球虫指数分别为:200（PBS组）、168.74（A组）、161.27（D组）、137.36（W组）、118.21（E.tenella感染对照组）。5、Atodock分子对接软件评估Et MIC3-BC1蛋白和三种多肽的结合方式。通过Swiss-model对Et MIC3-BC1蛋白建立三维模型,用Atodock分析A肽、D肽、W肽分别和Et MIC3-BC1蛋白在空间上的结合情况。结果显示A肽、D肽、W肽与Et MIC3-BC1蛋白之间均存在疏水作用力和氢键,且A肽的结合作用最佳,D肽次之,W肽较弱,表明三种多肽在空间上均能够与Et MIC3-BC1蛋白结合。综上,本实验用Et MIC3-BC1蛋白所筛选出的亲和配体（A肽、D肽、W肽）体内、外能够有效的抑制E.tenella子孢子对宿主细胞的入侵,具备一定的抵抗球虫感染保护作用。本研究丰富了研制基于Et MIC3的鸡球虫病相关多肽疫苗的依据。
杨雷[4]（2020）在《TIM-3单克隆抗体制备及人源化小鼠构建》文中指出免疫治疗作为继肿瘤手术治疗、放化疗后的一种新的治疗方法,主要是通过活化淋巴细胞激活自身免疫系统,促使淋巴细胞能够识别并杀伤肿瘤细胞。近些年的肿瘤治疗中,通过激活T细胞免疫治疗受到强烈的关注,免疫检查点蛋白PD-1特异性单克隆抗体通过阻断肿瘤免疫逃逸,改善免疫应答显示出较好的肿瘤治疗效果,这表明免疫检查点抑制剂的癌症免疫疗法是有效的治疗方法之一。随着PD-1单抗出现耐药性,越来越多研究转向联合用药,TIM-3同样作为T细胞表面抑制分子之一,通过与其配体Galectin-9结合抑制Thl细胞的功能并使其最终凋亡,同时也调控Th1和Thl7细胞的细胞因子如干扰素（IFN）、白介素（IL2）等分泌,抑制TIM3蛋白活性可增强阻断PD-1的抗肿瘤作用效果,因此制备TIM3单克隆抗体为进一步进行针对性的抗体药物开发有重要意义。本研究首先利用昆虫蛋白表达系统制备了高纯度人TIM3（aa 22-202）胞外结构域蛋白,经过对兔子的三次免疫后,分离兔PBMC细胞,利用多种抗体标记,通过流式分选获得识别人源TIM-3蛋白的记忆B细胞。其次,B细胞与表达CD40L的EL4-B5饲养层细胞在加入IL2、IL21细胞因子的条件下共培养,使B细胞在体外增殖并获得足够检测的单克隆抗体,利用巢式PCR获得轻重链基因序列片段,真核表达系统表达兔抗人TIM-3单克隆抗体,并通过ELISA、Western blot、流式细胞分析等方法鉴定该抗体亲和性以及在蛋白和细胞层面的特异性。最后,利用CRISPR基因编辑技术构建了TIM-3人源化小鼠,为探究TIM3单克隆抗体的治疗效果以及功能性研究提供基础。本研究使用单个B细胞抗体制备技术获得高效价的人源TIM3单克隆抗体,对于研发的单克隆抗体疗效评估同时构建了人源化TIM3胞外区的模型小鼠与B16黑色素瘤细胞,用于研究其生物学活性以及临床试验研究。对继PD-1/PD-L1抗体药物之后的新免疫检查点治疗药物的研发奠定了坚实的基础并提供科学依据。
郭瑞峰[5]（2021）在《人源化半合成纳米抗体文库的构建及CD47纳米抗体的研制》文中研究指明纳米抗体源自驼类和鲨鱼等软骨鱼类动物体内天然缺失轻链的重链抗体,由其可变区VHH克隆而来。作为结合抗原最小的功能性片段,纳米抗体比完整的传统抗体分子结构简单、稳定性高,分子量仅为其十分之一,具有很强的组织穿透能力,且易于进行基因工程改造,因此在各类生物技术以及医学疾病的诊断和治疗等领域应用前景广阔。而CD47分子作为免疫球蛋白（Ig）超家族的成员在针对肿瘤分子的免疫识别中代表着“别吃我”的信号,即,肿瘤等细胞表面的CD 47分子与巨噬细胞上的蛋白配体SIRP α结合后可抑制后者吞噬功能的发挥,进而逃避了免疫监视作用;而解除此抑制则可重新唤醒“沉睡中的”巨噬细胞,对其进行免疫清除。因此,CD47分子也被赋予免疫检查点的使命,成为肿瘤免疫治疗领域的又一个潜在靶点;而能够阻断CD47-SIRP α通路的靶向药物则有望成为继PD-1、PD-L1阻断药后肿瘤免疫治疗领域的又一热点。本研究立足于纳米抗体的噬菌体展示技术,首先在人源化半合成纳米抗体文库的构建方法方面进行探讨,尝试了一种绕过酶切环节,仅需一步PCR反应即可完成VHH抗体库基因构建的策略;随后以真核表达的CD47抗原分子为靶标,经过对抗体库的若干轮生物淘选来得到VHH噬菌体抗体克隆;再利用大肠杆菌表达系统对VHH片段进行原核分泌表达,并在毕赤酵母中进行了初步的表达尝试;最后通过流式细胞术对VHH的免疫阻断活性进行了检测。第一部分在人源化半合成纳米抗体文库的构建方法方面进行了探讨。本章节采用报道中性质优良的cAbBCII10纳米抗体序列作为基础框架,并将其中FR2区域外的相关氨基酸残基在设计时通过替换处理来实现人源化操作。然后在此框架的基础上通过长引物PCR法引入CD3区随机序列,并对此种策略构建抗体文库的效率及可行性进行了印证。研究中发现,此法仅需通过一步PCR反应即可完成人源化半合成VHH抗体库基因的拼接构建,回收产物连接后即可用于转化,库容多样性良好,每批电转操作后平均可达1.21×108,减少了基因拼接环节的工作强度以及回收步骤过多所造成的损失,提高了工作效率。本章节的研究为纳米抗体文库的构建提供了新的思路和技术路线。第二部分利用真核表达系统对生物淘选过程及后继检验阶段所需的相关抗原进行了制备。本章节用扩增抽提的含有CD47Fc、SIRP α-Fc及CD47his基因的高纯度无菌、无内毒素真核表达质粒对293Fv悬浮细胞株进行转染,成功实现了三种抗原蛋白的真核表达,亲和层析纯化后进行检测,所获得的每种抗原均达到了毫克级别,为后继的淘选及检测实验做好铺垫工作。第三部分进行了针对CD47抗原的生物淘选、单克隆鉴定及亲和力测定等方面的研究。本章节利用VHH纳米抗体库对CD47固相包被抗原进行了4轮的淘选,富集效应明显,第三轮即进入到平台期。随后挑选单克隆进行检验,阳性克隆测序后通过序列比对分析得到了五个针对CD47胞外区抗原的VHH纳米抗体序列。其中四个序列高度相似,仅在框架区有个别氨基酸残基上的差异,而第五个序列则与前四个差异较大。经亲和力实验测得这两类VHH的Kd值分别为1.5×1010 mol-1和7.5×109 mol-1。本章研究结果为后继的VHH纳米抗体的表达做好铺垫工作。第四部分对获得的VHH纳米抗体进行了表达、纯化及免疫阻断活性等方面的研究。本章节通过突变PCR将淘选到的阳性噬菌体展示克隆一步改造成分泌型原核表达载体,随后对VHH纳米抗体的可溶性分泌表达进行了分析。研究过程中对培养基类型、培养温度、VHH分泌表达的分布空间等方面进行了探讨,发现大部分VHH以可溶形式表达,表达空间分布在两类VHH间差异较大,渗透休克法进行周质提取或破菌后取上清是较为优选的策略。另外,本章节还采用了毕赤酵母分泌型表达载体对VHH的分泌表达进行了初步的尝试,见证了在信号肽的导引下,VHH抗体分子可被分泌至培养基中,表达量可观且培养基中杂蛋白背景很少,体现了酵母表达系统在VHH表达方面的优势。本章节最后对大肠杆菌分泌表达的VHH纳米抗体进行了针对CD47-SIRP α通路的免疫阻断实验,显示出其中一个VHH序列具有一定的免疫阻断活性。本章节的研究为实现VHH纳米抗体在大肠杆菌中的可溶性分泌表达提供了新的可行的方法和思路。综上所述,本论文探索了一种较为便捷、高效的人源化半合成VHH纳米抗体文库的构建方法,绕开了传统的动物使用环节,所建库容多样性良好,每个电转批次库容均可达到108以上;在制备真核表达的靶点抗原基础上,本论文通过噬菌体纳米抗体展示库技术经生物淘选得到了 5个针对CD47抗原的的VHH纳米抗体序列,经亲和力分析属于高亲和力抗体;随后采用大肠杆菌表达系统对VHH片段进行原核分泌表达,对培养条件及纯化策略进行了探讨并在毕赤酵母中进行了初步表达尝试;最后通过流式细胞术对VHH的免疫阻断活性进行了检测,确定了一株具有阻断活性的VHH纳米抗体,为后继进一步的应用开发打下基础。
刘欣[6]（2019）在《B细胞成熟抗原特异性单域抗体的筛选制备和鉴定》文中认为B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen,BCMA）是在多发性骨髓瘤（Multiple myeloma,MM）细胞和浆细胞表面上特异性表达的蛋白。研究靶向BCMA的单域抗体（Single domain antibody,sdAb）,可以特异性MM细胞表面的结合BCMA蛋白;sdAb又有高水溶性、低免疫原性、较强的组织渗透力和强稳定性的特点,将在MM的特异性免疫分析和治疗中发挥作用。本试验中使用BCMA蛋白免疫双峰驼,获得重链可变区（VHH）基因库,将基因库转化到大肠杆菌TG1中,构建噬菌体抗体库进行三轮富集、淘筛,选取了 Phage ELISA鉴定出的与BCMA蛋白高结合活性的重组噬菌体。将VHH基因克隆到原核表达载体pET-25b-SBP,采用低温诱导工程菌进行可溶性表达,用镍柱对破碎菌上清进行纯化。进行ELISA鉴定,鉴定其亲和活性,试验研究结果如下:（1）免疫后测得血清抗体效价为1:16000,建立BCMA特异性噬菌体抗体库库容3.15×106,富集筛选后经Phage ELISA检测阳性重组噬菌体共有52株。（2）将VHH基因克隆入原核表达载体pET-25b-SBP,菌落PCR及表达鉴定进行高表达筛选,诱导表达得到可溶的BCMA特异性sdAb;经ELISA试验鉴定,筛选表达得到的sdAb与BCMA蛋白结合,并具有一定的亲和活性。
魏世娟[7]（2019）在《重组噬菌体对沙眼衣原体作用及机制的探索》文中研究说明研究背景沙眼衣原体引起的细菌性性传播疾病目前是国内外重要的公共卫生问题,在其他性传播疾病渐渐得到的控制的情况下,生殖道沙眼衣原体感染的发病率却持续走高。鉴于目前因沙眼衣原体耐药导致治疗失败的案例越来越多,抗生素已经无法控制它的发展,我们迫切的需要一个强有的治疗措施以改善沙眼衣原体感染和流行的现况。衣原体噬菌体被公认为最有希望解决这一难题的有效措施。研究目的1.拟获得对沙眼衣原体有高效抑制或破坏作用的、特异的、安全的重组噬菌体。为临床上沙眼衣原体感染的精准治疗方法奠定基础。2.初步探究重组噬菌体对沙眼衣原体的可能作用机制。研究方法1.重组M13-RGD-IN5噬菌体对沙眼衣原体作用及机制:（1）利用基因工程构建重组噬菌体M13-RGD-IN5、M13-RGD、M13-IN5,即将整合素RGD和衣原体噬菌体PhiCPG1的IN5分别插入到M13噬菌体的主要外壳蛋白pVIII和次要外壳蛋白pIII中;（2）纯化重组M13噬菌体并用噬菌斑法测试各重组M13噬菌体的滴度;（3）CCK-8实验检测重组M13噬菌体对Hela细胞的细胞毒性并筛选出重组噬菌体最适干预浓度;（4）将不同的重组M13噬菌体作用与沙眼衣原体（CT）和豚鼠结膜炎衣原体（GPIC）,通过免疫荧光检测观察重组噬菌体对Hela细胞、沙眼衣原体及豚鼠结膜炎衣原体的作用;（5）通过共聚焦显微镜观察重组M13-RGD-IN5噬菌体在感染有沙眼衣原体的hela细胞中的定位;（6）探究透射电子显微镜观察重组M13-RGD-IN5噬菌体感染沙眼衣原体36小时后,沙眼衣原体在你超微结构上的变化;（7）利用针对IN5的多克隆抗体检测重组M13-RGD-IN5对沙眼衣原体作用的特异性;（8）通过QPCR验证重组噬菌体是否可在沙眼衣原体中增殖。2.重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对沙眼衣原体作用及机制:（1）利用基因工程构建重组pGFP-PhiCPG1质粒;（2）利用CaCl2法将重组质粒转化进入豚鼠结膜炎衣原体的原体（EB）中;（3）通过传代扩增重组pGFP-PhiCPG1噬菌体,并通过QPCR对每代重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的拷贝数进行定量;（4）纯化重组pGFP-PhiCPG1噬菌体,并用QPCR定量;（5）CCK-8实验检测重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对Hela细胞的细胞毒性;（6）将不同浓度的重组pGFP-PhiCPG1噬菌体作用沙眼衣原体和豚鼠结膜炎衣原体,用免疫荧光检测观察重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对衣原体的作用并筛选出最佳干预浓度;（7）将最适干预浓度的重组pGFP-PhiCPG1噬菌体作用于沙眼衣原体和豚鼠结膜炎衣原体后,利用免疫荧光观察感染后不同时间段重组噬菌体对衣原体的作用;（8）透射电子显微镜观察重组噬菌体感染衣原体36小时后,沙眼衣原体和豚鼠结膜炎衣原体在超微结构上的变化。研究结果1.重组M13-RGD-IN5噬菌体:（1）成功构建了重组M13-RGD-IN5噬菌体、重组M13-RGD噬菌体、重组M13-IN5噬菌体;（2）根据CCK-8实验检测结果,证明重组M13噬菌体的滴度在小于等于10100 pfu/mL时对HeLa细胞没有明显的细胞毒性;（3）RGD的加入使得细胞的内吞作用增强具有剂量依赖性;IN5的加入不影响Hela细胞对重组M13-RGD-IN5噬菌体的摄取;（4）重组M13-RGD-IN5噬菌体对沙眼衣原体的抑制作用具有剂量依赖性并选取109 pfu/ml为最佳干预浓度;（5）重组噬菌体显着降低沙眼衣原体和豚鼠结膜炎衣原体的感染,抑制率分别为69.05%和77.06%;（6）重组M13-RGD-IN5噬菌体,能穿透细胞粘膜屏障及包涵体膜进入到沙眼衣原体在宿主细胞形成的包涵体中,而这种现象未出现在重组M13-RGD噬菌体干预沙眼衣原体的过程中;（7）若重组噬菌体在感染沙眼衣原体之前,将其与抗IN5的多克隆抗体共同孵育,则不会改变沙眼衣原体的感染进程;（8）透射电镜观察结果显示重组M13-RGD-IN5噬菌体影响沙眼衣原体网状体（RB）向原体（EB）的正常转化,产生异常增大的网状体从而抑制EB的产生;（9）QPCR结果显示,重组M13-RGD-IN5噬菌体在沙眼衣原体及Hela细胞中是不增殖的,遵守严格的宿主限定。2.重组pGFP-PhiCPG1噬菌体:（1）成功构建出重组pGFP-PhiCPG1噬菌体;（2）pGFP的加入并不影响PhiCPG1在豚鼠结膜炎衣原体中的自我包装,感染与增殖过程;（3）重组噬菌体pGFP-PhiCPG1可以感染沙眼衣原体;（4）CCK-8实验检测结果,证明重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的滴度在小于1016v.g/mL时对HeLa细胞没有明显的细胞毒性;（5）重组噬菌体pGFP-PhiCPG1对沙眼衣原体及GPIC有显着地抑制作用且有剂量依赖性;（6）重组噬菌体pGFP-PhiCPG1对沙眼衣原体及GPIC在感染早期无明显影响,抑制作用主要发生在衣原体生长周期的中后期,影响RB向EB的正常转化,产生异常增大的网状体从而抑制EB的产生。研究结论1.通过基因工程合成的能稳定表达整合素结合蛋白RGD和衣原体噬菌体衣壳蛋白IN5的重组M13-RGD-IN5噬菌体克服了细胞膜及所作用粘膜的阻碍,对沙眼衣原体的生长具有明显的抑制作用,且不影响其自身的蛋白折叠。2.通过基因工程构建的重组噬菌体pGFP-PhiCPG1生物学特性与衣原体噬菌体PhiCPG1极为相似,适用于在实验研究衣原体噬菌体PhiCPG1;能感染沙眼衣原体并能明显抑制其生长繁殖。3.重组噬菌体M13-RGD-IN5抑制沙眼衣原体的感染的机制可能是信号通路触发的破坏作用。重组噬菌体pGFP-PhiCPG1抑制沙眼衣原体的感染的机制除了噬菌体大量增殖造成的机械破坏外,可能还存在信号通路触发的某种破坏作用。4.综合整个结果,暗示沙眼衣原体有可能是衣原体噬菌体PhiCPG1的宿主菌之一或者沙眼衣原体可能存在自己的噬菌体而且与噬菌体PhiCPG1的亲缘关系很近,为寻找沙眼衣原体特异性噬菌体提供了方向。
练婷婷[8]（2019）在《M13重组噬菌体的鉴定及其对沙眼衣原体和豚鼠嗜衣原体的作用》文中研究表明【背景】沙眼衣原体泌尿生殖道感染是国内外常见的性传播疾病,且发病率逐年上升,近年来已居于性传播疾病的首位。据WHO统计,全世界每年大约新发沙眼衣原体感染约9200万。大约2/3的沙眼衣原体感染者没有临床症状,易被忽视,无法得到及时的诊治,引起一系列严重的并发症和后遗症。衣原体是一种区别于普通细菌的,具有特殊生物学特性的病原体,而临床上将其作为普通细菌,给予抗生素治疗,效果欠佳。衣原体噬菌体是一种以衣原体为宿主的噬菌体,部分衣原体噬菌体能引起宿主衣原体始体裂解性感染,并依靠简单的粘附作用传给下一代原体。利用衣原体噬菌体引起衣原体病变并使之裂解的特点,可将其作为生物制剂用于衣原体感染的治疗,但目前尚未发现沙眼衣原体的噬菌体。我们课题组前期研究发现将纯化的豚鼠嗜衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1作用于沙眼衣原体,能明显抑制体外沙眼衣原体感染,对Vp1蛋白结构进行分析发现,其含有七个插入环,其中一个较大的插入环-IN5环暴露在噬菌体衣壳蛋白表面形成蘑菇样的突起,推测Vp1蛋白的IN5环结构可能为最重要的功能区。【目的】探索M13-IN5重组噬菌体对E型沙眼衣原体和豚鼠嗜衣原体的作用。【内容】鉴定M13-IN5重组噬菌体IN5环目的片段;检测M13-IN5重组噬菌体的效价;研究M13-IN5重组噬菌体IN5环蛋白的表达;将构建成功的M13-IN5重组噬菌体对沙眼衣原体E型标准株（CtE）和豚鼠嗜衣原体（Chlamydiadophila caviae）进行干预,利用光镜观察CtE在感染36h、48h、60h、72h的变化并检测各干预时间点噬菌体活性,利用免疫荧光显微镜观察豚鼠嗜衣原体在感染20h、24h、28h、32h的变化;利用激光扫描共聚焦显微镜精确定位M13-IN5重组噬菌体在Hela细胞内的位置。【方法】利用双层平板法检测重组噬菌体的效价。DNA提取试剂盒提取噬菌体DNA,进行PCR、酶切、测序,验证重组噬菌体。提取噬菌体蛋白,Western Blot检测重组噬菌体IN5环蛋白的表达。利用成功重组的噬菌体干预CtE,在CtE的培养过程中,加入效价均为1011PFU/ml的M13噬菌体、M13-IN5重组噬菌体进行干预,并设置CtE对照组和空白对照组,在干预36h、48h、60h、72h,普通光学显微镜下观察M13-IN5重组噬菌体对CtE作用;在干预36h,利用激光扫描共聚焦显微镜,观察M13-IN5重组噬菌体在Hela细胞内的位置;收集噬菌体干预实验各时段的培养基,用双层平板法检测噬菌体的效价,判断重组噬菌体的活力和重组噬菌体在干预各时段的存活情况。在豚鼠嗜衣原体的培养过程中,加入效价均为1011PFU/ml的M13噬菌体、M13-IN5重组噬菌体进行干预,并设置豚鼠嗜衣原体对照组和空白对照组,在干预20h、24h、28h、32h,通过免疫荧光显微镜观察M13-IN5重组噬菌体对豚鼠嗜衣原体的作用。【结果】利用DNA重组技术获得M13-IN5重组噬菌体,挑取单克隆扩增M13-IN5重组噬菌体,通过噬菌斑计数得到M13-IN5重组噬菌体滴度,LB平板培养显示,M13-IN5重组噬菌体噬斑形成单位PFU=3.05×1011/ml,提示M13-IN5重组噬菌体具有生物活力。M13-IN5重组噬菌体在大小约55kDa处有一较浓的蛋白带,其大小正好与IN5环和M13噬菌体pIII外壳蛋白的融合蛋白（58.2kDa）大小相当,M13噬菌体组和大肠杆菌ER2738组在相应位置无条带,这说明重组噬菌体IN5基因能够正常表达。激光扫描共聚焦定位显示,M13-IN5重组噬菌体荧光与CtE包涵体荧光存在重叠。M13-IN5重组噬菌体对CtE及豚鼠嗜衣原体均有抑制作用;CtE感染36、72 h时,M13-IN5重组噬菌体组和M13噬菌体组的包涵体数目较CtE对照组降低（P<0.05）,而且M13-IN5重组噬菌体组包涵体数目较M13噬菌体组有明显降低（P<0.05）,而感染48 h、60h时,M13-IN5重组噬菌体组、M13噬菌体组、CtE对照组包涵体数目无明显区别（P>0.05）;在豚鼠嗜衣原体感染中也出现沙眼衣原体干预实验类似的结果,豚鼠嗜衣原体感染28h、32h,M13-IN5重组噬菌体组和M13噬菌体组的包涵体数目较豚鼠嗜衣原体对照组降低（P<0.05）,而且M13-IN5重组噬菌体组包涵体数目较M13噬菌体组明显降低（P<0.05）,豚鼠嗜衣原体感染20h、24h,M13-IN5重组噬菌体组、M13噬菌体组、豚鼠嗜衣原体对照组包涵体数目无明显区别（P>0.05）。【结论】M13-IN5重组噬菌体具有生物活性,且能够成功表达IN5环蛋白;在体外实验中,M13-IN5重组噬菌体能进入衣原体包涵体内,且能明显抑制增殖期的沙眼衣原体E型标准株和生长周期晚期的豚鼠嗜衣原体感染。
刘媛[9]（2018）在《基于抗体的拟除虫菊酯农药代谢物分析和Cry2Aa毒素分子模拟研究》文中研究指明抗体是由脊椎动物产生的一种能高亲和力、特异性识别抗原的多功能分子。在植物保护领域,抗体即可作为农药残留免疫分析的生物识别分子,又可用于农药的分子模拟,替代其与靶标昆虫受体结合,甚至引发生物学效应。本研究从抗体的生物识别和分子模拟两大功能着手,开展了多种拟除虫菊酯农药共性代谢产物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）免疫分析技术研究。同时采用抗独特型抗体技术对苏云金芽孢杆菌（Bt）Cry2Aa毒素进行分子模拟,并对其生物活性与原毒素进行比较研究,具体取得的结果如下:（1）3-PBA胶体金免疫层析法的建立试验采用体内诱生腹水法制备了 3-PBA单克隆抗体,并用Protein G柱进行亲和纯化。用间接竞争ELISA法测定的3-PBA对纯化抗体的抑制中浓度（I50）为0.63 μg/mL,最低检测限（110）为0.13μg/mL,线性检测范围（I20-I80）在0.19-2.04μg/mL之间。用柠檬酸三钠还原法制备了 15nm的胶体金颗粒用于纯化抗体标记,测定的最佳抗体标记浓度为48μg/mL。试验以硝酸纤维素膜为载体,组装了免疫层析试纸,优化的检测线浓度和金标抗体喷膜量分别为2 mg/mL和5μL/cm。以检测线完全抑制为标准,免疫层析试纸对3-PBA的检测阈值为1μg/mL,检测时间为10min。采用免疫层析试纸对40个添加了不同浓度3-PBA的水样进行测试,结果表明假阴性率为2.5%,未观察到假阳性结果。该方法有潜力用于水体等环境样本中3-PBA的现场快速检测。（2）3-PBA单链抗体的构建及生物信息学分析本研究以实验室保存的一株能识别3-PBA的鼠杂交瘤细胞株为模板,提取其总RNA,反转录为cDNA第一链。采用简并引物,PCR法扩增鼠抗体重链可变区（VH）和κ轻链可变区（Vκ）基因。再用重叠延伸PCR法,将VH、Vκ基因与一个45 bp的linker进行连接。克隆至pET26b（+）载体后,化转E.coli BL21（DE3）。单链抗体株小量诱导表达后,用ELISA法和Western blot验证了对3-PBA的结合活性。试验随后通过ExPASy和IMGT生物信息学网站对单链抗体的理化性质、二级结构、等位基因及功能区进行预测与分析。结果表明3-PBA单链抗体计算分子量为29905.61 Da,理论等电点为8.95,为亲水性、不稳定蛋白。单链抗体基因全长840bp,VH和Vκ分别为370bp和319bp。与编码VH和Vκ的可变区基因片段一致性最高的等位基因分别为Musmus IGHV1-18*01 F或Musmus IGHV1-22*01 F 和 Musmus IGKV4-72*01 F。VH 和 Vκ 的 3 个互补决定区（CDR区）长度分别为8-8-16和5-3-9。相比于胚系基因,单链抗体CDR区的总氨基酸突变率为20%。试验通过SWISS-MODEL软件对单链抗体同源建模,用Autodock Vina软件对单链抗体和3-PBA进行分子对接,发现单链抗体与3-PBA之间存在氢键、疏水作用、CH-π作用和阳离子-π作用。参与抗原识别的关键氨基酸位点包括 GLY-74,ASN-76,GLU-81,VAL-123,LEU-130,TRP-252 和ARG-83,这些氨基酸均位于IMGT标注的抗体CDR区及其邻近区域。本试验首次成功构建了能识别3-PBA的单链抗体,为后期表达和检测应用奠定了基础。另外试验分析和预测了参与3-PBA识别的抗体关键氨基酸位点及其相互作用力,合理的解释了单链抗体与3-PBA的结合模式,为抗体的进一步优化和生产提供了重要的参考信息。（3）3-PBA单链抗体的表达、功能分析与检测应用试验考察了温度、诱导剂浓度和诱导时间,对3-PBA单链抗体表达的影响。结果表明,16℃的诱导温度,终浓度0.25 mM IPTG和8h诱导时间为优化的单链抗体表达条件。单链抗体大量表达后,包涵体用镍离子亲和柱进行纯化,用200 mM的咪唑进行洗脱,获得了电泳纯的蛋白,得率为2.68 mg/L,并进行尿素溶解和透析复性。试验对包被原及抗体工作浓度和甲醇浓度进行优化后,建立了基于单链抗体的3-PBA间接竞争ELISA检测方法,计算得到的抗体抑制中浓度（I50）为0.55 μg/mL,方法的线性检测范围（I20-I80）在0.15-2.64 μg/mL之间,最低检测限（110）为0.05μg/mL,3-PBA单链抗体的灵敏度比其母本单克隆抗体有所提高。单链抗体对甲氰菊酯、高效氯氰菊酯和氰戊菊酯仅有0.56%-1.15%的交叉反应,但对3-苯氧基苯甲醛和3-苯氧基苯甲醇的交叉反应率高达93.22%和87.30%,单链抗体也可用于这两种菊酯代谢物的快速筛查检测。单链抗体在4℃保存的半衰期在14-21天之间,-20℃和-80℃下保存3个月未发现结合信号下降,具有较好的稳定性。通过对自来水样的添加回收试验,ELISA法的平均回收率在83%-96%之间,平均批内和批间变异系数分别在1.78%-8.54%和4.65%-10.56%之间,与HPLC法的相关性R2为0.9892。该方法有潜力替代色谱法用于水体等环境样品中3-PBA的快速筛查检测。（4）基于链替换技术的Cry2Aa抗独特型单链抗体的构建与筛选通常从非免疫抗体库中直接筛选抗独特型抗体,得到的阳性克隆数量较少甚至无法获得。实验室前期从人源半合成抗体库（Tomlinson Ⅰ库）中筛选得到两株苏云金芽孢杆菌（Bt）Cry2Aa毒素的抗独特型单链抗体（B10和F2）。为了获得更多的抗独特型单链抗体,本研究以B10、F2为模板,采用链替换技术,分别构建了库容为1.4×106和1.2×106的Cry2Aa抗独特型单链抗体的重链和轻链替换库。通过多克隆噬菌体ELISA分析发现,轻链替换库的整体亲和力是重链替换库的4.2倍。试验用Cry2Aa多抗为筛选抗原,分别对重、轻链替换库进行了 1轮筛选,筛选阳性率分别为13.6%和57.4%,经过测序最终获得1个重链替换突变体和6个轻链替换突变体。试验采用竞争性噬菌体ELISA测定了突变体与筛选抗原的表观亲和力,其中最佳克隆MUT10的表观亲和力为1.42×106 M-1。竞争抑制试验表明,100 μg/mL的Cry2Aa对MUT10和Cry2Aa多克隆抗体的结合最高可产生30.1%抑制,50 μL的MUT10培养上清对Cry2Aa与其多抗产生了46.7%的抑制。MUT10为部分抑制型抗独特型抗体,模拟了 Cry2Aa毒素的部分结构特征。本研究为Cry2Aa抗独特型单链抗体的生物活性测定提供了基础材料。（5）Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对小菜蛾生物活性的初步分析本研究在前期获得Cry2Aa抗独特型单链抗体的基础上,测试和比较了Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对常见鳞翅目靶标害虫小菜蛾的生物活性。试验首先采用ELISA法测定了 Cry2Aa与小菜蛾刷状缘膜囊泡（BBMV）的结合曲线,通过Scatchard模型回归分析,计算得到的表观结合亲和力为266.6nmol/L。同时用ELISA法测定了 9种Cry2Aa抗独特型单链抗体与小菜蛾BBMV的结合活性,结果表明抗独特型单链抗体MUT10与BBMV存在最高的特异性结合。试验利用浸叶法测定了 Cry2Aa对小菜蛾的半数致死浓度（LC50）为27.90 μg/mL,而107cfu/mLMUT10对小菜蛾的矫正死亡率为12.8%。试验用Ligand blot分析了 Cry2Aa、MUT10与小菜蛾BBMV的结合蛋白,并对245 kDa上方的一条共同结合条带进行了 LC-MS/MS分析。结果表明,该条带酶解后得到ATYSEGPNGSVR片段,通过数据库比对分析,匹配到一个分子量为332kDa的小菜蛾未鉴定蛋白,其功能注释为脂质运载蛋白。本研究为Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对小菜蛾作用机理的阐明提供了有益数据。本研究构建了多种拟除虫菊酯农药共性代谢产物3-苯氧基苯甲酸的新型抗体识别分子,建立了其免疫学分析方法,获得了抗体信息学数据,阐明了其结合模式。另外,试验构建并筛选了能模拟Cry2Aa毒素部分结构特征的抗独特型单链抗体,开展了 Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对小菜蛾生物活性的比较研究,探索了杀虫蛋白资源创制的新思路。
祝婧雯[10]（2018）在《基于噬菌体展示技术筛选高亲和力兔源HER2单链抗体》文中提出研究目的:获得兔源HER2抗体的重链与轻链基因,合成单链抗体ScFv,通过噬菌体侵染构建完整的噬菌体单链抗体库。分别使用酶标板包被抗原与HER2阳性乳腺癌组织切片免疫组化两种方法筛选高亲和力HER2抗体,从特异性抗体库的富集倍数与阳性率两个方面比较两种方法筛选效果,探究以组织切片作为固相载体在噬菌体文库筛选方面的应用。研究方法:使用HER2蛋白免疫新西兰大白兔,提取脾脏总RNA,逆转录合成cDNA。设计兔源简并引物,以cDNA为模板PCR扩增出HER2抗体重链和轻链可变区基因序列,引入Linker随机拼接二者获得ScFv片段。通过双酶切及定向克隆技术获得pCANTAB5e-ScFv重组质粒,将其转化TG1感受态细胞;以辅助噬菌体M13K07侵染转化后的宿主菌TG1,从而构建兔抗HER2单链抗体噬菌体文库。分别使用酶标板包被抗原与HER2阳性乳腺癌组织切片免疫组化两种方法,依照“吸附-洗脱-扩增”流程进行筛选,经过5轮筛选获得终极抗体库,菌液PCR鉴定阳性克隆,Phage-Elisa鉴定重组抗体亲和力。通过Immunoglobulin（IG）及Nucleotide BLAST分析软件对所获得重链、轻链基因序列进行同源性比对。实验结果:1、成功提取脾脏总RNA,VH、VL拼接获得完整ScFv基因。2、构建的兔源HER2单链抗体库库容为1.68×106,重组率为83.3%。3、使用两种方法,经过5轮淘筛,产率逐渐升高,特异性噬菌体得到了有效富集,酶标板作为固相载体筛选的抗体库特异性增长了约105倍,HER2阳性乳腺癌组织切片作为固相载体筛选的抗体库特异性增长了 4180倍。4、HER2组织切片筛选出的特异性抗体库阳性率为60%,也高于酶标板筛选出的特异性抗体库25%的阳性率。对比富集倍数及阳性率,组织切片作为固相载体淘筛噬菌体库效果更好。5、选取两株反应较好的阳性克隆测序,所获得重链可变区基因与兔源抗体基因同源性为95.4%,轻链可变区基因同源性为91.4%,二者皆属于V1基因家族,序列结构完整。结论:成功构建大容量的兔源HER2单链抗体库,筛选出亲和力较高的特异性抗体,组织切片作为噬菌体展示文库的固相载体、免疫组化筛选方法可行,且筛选效果比酶标板筛选更好。
二、兔抗M13噬菌体酶标抗体的制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、兔抗M13噬菌体酶标抗体的制备（论文提纲范文）
（1）抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库的构建及抗体的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 非洲猪瘟病毒研究进展 |
| 1.1.1 非洲猪瘟疫情 |
| 1.1.2 基因组特征及主要蛋白 |
| 1.1.3 诊断与防控 |
| 1.2 单链抗体研究进展 |
| 1.2.1 抗体的结构和功能 |
| 1.2.2 抗体制备技术的发展 |
| 1.2.3 单链抗体的研发优势 |
| 1.2.4 单链抗体表达系统 |
| 1.3 噬菌体库展示技术 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术原理 |
| 1.3.2 噬菌体展示系统分类 |
| 1.4 目的及意义 |
| 第二章 猪源单链抗体噬菌体文库的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒与菌株 |
| 2.2.2 引物 |
| 2.2.3 常用试剂 |
| 2.2.4 实验溶液配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 猪外周血淋巴细胞分离 |
| 2.3.2 淋巴细胞总RNA提取 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 PCR扩增目的基因 |
| 2.3.5 PCR产物的纯化与回收 |
| 2.3.6 “T-A”克隆鉴定 |
| 2.3.7 质粒提取 |
| 2.3.8 重组载体p HEN-2-ScFv的制备 |
| 2.3.9 感受态细胞的制备 |
| 2.3.10 ScFv噬菌体文库的构建 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 RNA提取及c DNA合成 |
| 2.4.2 VH、VL基因扩增 |
| 2.4.3 VH-linker、linker-VL基因扩增 |
| 2.4.4 ScFv基因扩增拼接 |
| 2.4.5 ScFv的“T-A”克隆鉴定 |
| 2.4.6 噬菌体文库的构建 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 抗ASFV单链抗体的筛选及鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 质粒、菌株、细胞 |
| 3.2.2 常用试剂 |
| 3.2.3 实验溶液配制 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 抗ASFV特异性文库的筛选 |
| 3.3.2 蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.3 酶联免疫吸附实验 |
| 3.3.4 间接免疫荧光实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 噬菌体文库的筛选 |
| 3.4.2 筛选单克隆初步ELISA检测 |
| 3.4.3 ScFv抗体蛋白的表达与优化 |
| 3.4.4 ScFv抗体蛋白的纯化 |
| 3.4.5 ELISA分析ScFv蛋白反应活性 |
| 3.4.6 IFA验证ScFv蛋白反应活性 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 我国两种优势种海蛇毒多组学比较分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗平颏海蛇毒血清的制备及抗毒效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 平颏海蛇毒腺中活性组分的淘选与效应分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 蛇毒中活性组分的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（3）鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白3特异亲和肽抑制虫体入侵宿主细胞研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 鸡球虫概述 |
| 1.1.1 鸡球虫的种类 |
| 1.1.2 鸡球虫的生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病的临床危害及入侵机制 |
| 1.2 鸡球虫抗原蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 表面抗原 |
| 1.2.2 鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白的研究 |
| 1.3 噬菌体展示技术的研究进展 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术的基本原理 |
| 1.3.2 噬菌体展示技术的应用 |
| 1.4 计算机分子模拟技术的原理和相关应用 |
| 1.4.1 同源建模 |
| 1.4.2 分子对接 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物和虫种 |
| 2.1.2 菌种、载体与细胞株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 标准参照物 |
| 2.1.5 主要实验试剂的配制方法 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 p ET-30a-Et MIC3-BC1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 重组质粒p ET-30a-Et MIC3-BC1 在大肠杆菌表达系统中的诱导表达 |
| 2.2.3 Et MIC3-BC1 重组蛋白的纯化回收及复性 |
| 2.2.4 多克隆抗血清的制备及其鉴定 |
| 2.2.5 噬菌体随机十二肽库对Et MIC3-BC1 蛋白亲和配体的生物淘选 |
| 2.2.6 结合克隆的特征鉴定 |
| 2.2.7 亲和噬菌体氨基酸序列的推导及合成 |
| 2.2.8 ELISA检测亲和噬菌体与重组Et MIC3-BC1 蛋白及虫体Et MIC3 蛋白结合情况 |
| 2.2.9 体外检测合成多肽抑制E.tenella子孢子入侵细胞的能力 |
| 2.2.10 体内检测多肽对应阳性噬菌体抗球虫保护作用 |
| 2.2.11 利用同源模建和分子对接分析Et MIC3-BC1与A肽、D肽、W肽的结合 |
| 2.2.12 数据统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒p ET30a-Et MIC3-BC1 的构建 |
| 3.1.1 Et MIC3-BC1 基因的PCR鉴定 |
| 3.1.2 重组质粒p ET30a-Et MIC3-BC1 PCR鉴定 |
| 3.1.3 Et MIC3-BC1 重组蛋白的原核表达与纯化 |
| 3.2 Et MIC3-BC1 多克隆抗血清的效价和特异性测定 |
| 3.3 Et MIC3-BC1 重组蛋白亲和配体的生物筛选 |
| 3.3.1 Et MIC3-BC1 重组蛋白对噬菌体十二肽库的四轮筛选和滴度测定 |
| 3.3.2 亲和噬菌体的ELISA鉴定 |
| 3.3.3 测定亲和噬菌体的序列 |
| 3.4 多肽亲和力的检测 |
| 3.4.1 ELISA法检测亲和噬菌体与Et MIC3-BC1 的结合情况 |
| 3.4.2 Et MIC3-BC1 多抗竞争抑制亲和噬菌体与Et MIC3-BC1 重组蛋白的结合 |
| 3.4.3 ELISA检测虫体Et MIC3 蛋白与亲和噬菌体的结合 |
| 3.5 所筛选多肽对E.tenella子孢子入侵的体外抑制作用 |
| 3.5.1 E.tenella子孢子的纯化及其荧光标记 |
| 3.5.2 多肽浓度的确定 |
| 3.5.3 Et MC3-BC1 多克隆抗体抑制E.tenella子孢子入侵MDBK细胞 |
| 3.5.4 多肽对E.tenella子孢子入侵MDBK细胞的抑制 |
| 3.6 A、D、W肽体内抑制E.tenella子孢子入侵分析 |
| 3.6.1 体重增重变化 |
| 3.6.2 球虫感染后盲肠病变计分 |
| 3.6.3 卵囊排出减少率 |
| 3.6.4 抗球虫指数(ACI) |
| 3.6.5 盲肠病理学变化 |
| 3.7 同源建模和分子对接展示 A、D、W 肽和 Et MIC3-BC1 的结合 |
| 3.7.1 同源建模 |
| 3.7.2 分子对接 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Et MIC3-BC1 蛋白表达 |
| 4.2 抗 EtMIC3-BC1 多克隆抗体的制备及其活性检测 |
| 4.3 Et MIC3-BC1 亲和肽的筛选与鉴定 |
| 4.4 体外评价所选亲和肽抑制E.tenella子孢子入侵细胞的能力 |
| 4.5 体内评价亲和噬菌体抑制E.tenella子孢子入侵细胞的能力 |
| 4.6 利用同源建模以及分子对接分析 A、D、W 肽与 Et MIC3-BC1 的结合 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）TIM-3单克隆抗体制备及人源化小鼠构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一节 肿瘤治疗研究现状 |
| 1.1 肿瘤免疫治疗 |
| 1.2 免疫检查点 |
| 1.3 T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3) |
| 第二节 单克隆抗体的发展及应用 |
| 2.1 杂交瘤技术与噬菌体展示技术 |
| 2.2 单个B细胞抗体技术 |
| 第三节 CRISPR基因编辑技术 |
| 第一章 人源TIM-3(aa22-202)蛋白表达 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.1 H-TIM3(aa22-202)Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达载体构建 |
| 2.2 Bacmid转染及病毒收获 |
| 2.3 H-TIM3(aa22-202)蛋白表达及检测 |
| 第三节 实验结果与分析 |
| 3.1 Bacmid载体构建 |
| 3.2 H-TIM3(aa22-202)蛋白蛋白印迹鉴定结果 |
| 第二章 兔抗人TIM3 单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 实验兔蛋白免疫及鉴定 |
| 2.2.2 阳性B细胞流式分选及培养鉴定 |
| 2.2.3 H-TIM3 单抗表达载体构建及初步筛选 |
| 2.2.4 H-TIM3 单抗初步筛选及纯化 |
| 2.2.5 H-TIM3 单抗蛋白层面特异性鉴定 |
| 2.2.6 流式检测H-TIM3 单抗细胞表面特异性识别 |
| 第三节 实验结果与分析 |
| 2.3.1 动物免疫后血清抗体效价鉴定 |
| 2.3.2 流式分选阳性B细胞 |
| 2.3.3 B细胞培养抗体检测 |
| 2.3.4 单克隆抗体轻重链可变区调取 |
| 2.3.5 单克隆抗体蛋白层面特异性鉴定 |
| 2.3.6 H-TIM3 单克隆抗体亲和性鉴定 |
| 2.3.7 H-TIM3 单克隆抗体细胞表面特异识别 |
| 第三章 人源化TIM3 细胞/小鼠模型构建 |
| 第一节 实验材料 |
| 第二节 实验方法 |
| 第三节 实验结果及分析 |
| 第四章 总结 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
（5）人源化半合成纳米抗体文库的构建及CD47纳米抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 噬菌体与噬菌体抗体库展示技术 |
| 1.2 纳米抗体 |
| 1.3 CD47分子与配体SIRPα的结构特征及免疫调节功能 |
| 1.4 立题依据与研究内容 |
| 第2章 人源化半合成纳米抗体文库的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试剂、酶及仪器 |
| 2.2.2 载体、菌种、培养基及溶液 |
| 2.2.3 VHH全长模板及引物设计 |
| 2.2.4 人源化VHH噬菌体展示库全长载体的构建 |
| 2.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 PCR产物的胶回收 |
| 2.2.7 回收产物的磷酸化处理 |
| 2.2.8 磷酸化产物的连接 |
| 2.2.9 TG1电转感受态细胞的制备 |
| 2.2.10 TG1感受态细胞的电转化 |
| 2.2.11 单克隆的挑取及菌落PCR检验 |
| 2.2.12 测序结果分析及库容计算 |
| 2.2.13 纳米抗体文库的保存 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 VHH噬菌体展示库全长DNA的线性PCR产物及回收后连接结果的鉴定 |
| 2.3.2 VHH噬菌体展示库随机克隆测序及氨基酸序列比对分析 |
| 2.3.3 VHH噬菌体展示库库容量的计算 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 CD47及SIRP α抗原的制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试剂、酶及仪器 |
| 3.2.2 载体、菌种、细胞、培养基及溶液 |
| 3.2.3 真核表达质粒的大抽制备 |
| 3.2.4 CD47Fc、CD47his及SIRPα-Fc抗原蛋白在293F细胞中的瞬转表达 |
| 3.2.5 抗原蛋白的亲和层析 |
| 3.2.6 抗原蛋白SDS-PAGE电泳 |
| 3.2.7 抗原蛋白溶液的超滤浓缩 |
| 3.2.8 抗原蛋白浓度测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 大抽质粒浓度的测定 |
| 3.3.2 CD47Fc、SIRPα-Fc及CD47his抗原蛋白的真核表达及亲和纯化 |
| 3.3.3 抗原蛋白浓度测定 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 CD47纳米抗体的淘选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试剂、酶及仪器 |
| 4.2.2 载体、菌种、细胞、培养基及溶液 |
| 4.2.3 M13K07辅助噬菌体的扩增制备 |
| 4.2.4 噬菌体纳米抗体库的包装制备 |
| 4.2.5 纳米抗体的淘选 |
| 4.2.6 抗体库富集程度的ELISA检测 |
| 4.2.7 单克隆的ELISA筛选 |
| 4.2.8 阳性克隆测序及序列分析 |
| 4.2.9 阳性克隆噬菌体抗体的包装 |
| 4.2.10 阳性克隆的亲和力测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 M13K07辅助噬菌体的制备及滴度测定 |
| 4.3.2 噬菌体纳米抗体库的包装制备 |
| 4.3.3 CD47纳米抗体的淘选 |
| 4.3.4 阳性单克隆的筛选 |
| 4.3.5 阳性克隆序列分析 |
| 4.3.6 阳性克隆亲和力的测定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 CD47纳米抗体的表达及免疫阻断活性检测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 试剂、酶及仪器 |
| 5.2.2 载体、菌种、细胞、培养基及溶液 |
| 5.2.3 大肠杆菌CD47VHH阳性克隆表达载体的构建 |
| 5.2.4 大肠杆菌DH5α与BL21超级感受态细胞的制备及转化 |
| 5.2.5 大肠杆菌系统的原核分泌表达及周质蛋白的渗透休克法提取 |
| 5.2.6 VHH蛋白的镍柱亲和纯化 |
| 5.2.7 同源重组法构建pPIC9K-CD47VHH-3-5表达质粒 |
| 5.2.8 毕赤酵母重组表达载体的线性化及回收 |
| 5.2.9 毕赤酵母感受态细胞的制备 |
| 5.2.10 线性载体质粒的电转化 |
| 5.2.11 G418筛选高表达菌株 |
| 5.2.12 阳性酵母菌的诱导表达 |
| 5.2.13 流式细胞仪检测VHH纳米抗体的免疫阻断活性 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 大肠杆菌CD47VHH阳性克隆表达载体的构建及BL21表达菌的转化 |
| 5.3.2 CD47VHH-3-5his在使用不同培养基时周质的表达及提取情况。 |
| 5.3.3 CD47VHH-3-5his与CD47VHH-3-91his在BL21宿主菌周质中的表达 |
| 5.3.4 CD47VHH-3-5his于不同温度以及培养基中葡萄糖含量时在BL21中的表达情况 |
| 5.3.5 CD47VHH-3-5his于不同温度及培养基葡萄糖含量时在TG1中的表达情况 |
| 5.3.6 CD47VHH-3-91his在不同温度下的表达情况 |
| 5.3.7 VHH蛋白的亲和纯化 |
| 5.3.8 毕赤酵母pPIC9K-CD47VHH-3-5质粒和空载体的线性化酶切 |
| 5.3.9 转化的GS115-pPIC9K-CD47VHH-3-5在MD和G418平板上的生长情况 |
| 5.3.10 纳米抗体CD47VHH-3-5在毕赤酵母GS115中的表达情况 |
| 5.3.11 流式细胞仪检测CD47VHH的免疫阻断活性 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表的学术成果 |
（6）B细胞成熟抗原特异性单域抗体的筛选制备和鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 B细胞成熟抗原概述 |
| 1.1.1 B细胞成熟抗原 |
| 1.1.2 B细胞成熟抗原的配体 |
| 1.1.3 B细胞成熟抗原与B细胞 |
| 1.1.4 B细胞成熟抗原与多发性骨髓瘤 |
| 1.2 噬菌体展示技术 |
| 1.2.1 噬菌体 |
| 1.2.2 噬菌体库的发展 |
| 1.2.3 噬菌体和噬菌体库 |
| 1.2.4 噬菌体库与辅助噬菌体 |
| 1.2.5 阳性克隆筛选 |
| 1.2.6 噬菌体抗体库 |
| 1.3 单域抗体 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 2 试验一 BCMA蛋白特异性噬菌体抗体库的构建及sdAb的富集与筛选 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验试剂 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要培养基及缓冲液配制方法 |
| 2.1.4 试验仪器和设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 噬菌体抗体库的构建 |
| 2.2.2 BCMA蛋白特异性sdAb的富集和筛选 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BCMA免疫后血清抗体效价测定结果 |
| 2.3.2 前导肽至CH2区PCR 一轮扩增 |
| 2.3.3 VHH PCR二轮扩增结果 |
| 2.3.4 VHH酶切试验结果 |
| 2.3.5 BCMA噬菌体抗体库库容、多样性测定结果 |
| 2.3.6 噬菌体抗体库筛选结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 试验二 BCMA特异性单域抗体的诱导表达、纯化及鉴定 |
| 3.1 试验材料及仪器 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器和设备 |
| 3.1.3 主要培养基及缓冲液配制方法 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 表达质粒的构建 |
| 3.2.2 重组VHH-pET-25b-SBP蛋白的表达及纯化 |
| 3.2.3 BCMA蛋白特异性sdAb的鉴定 |
| 3.2.4 BCMA蛋白特异性sdAb抗原结合特性鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 VHH-pCANTAB5E酶切和pET-25b-SBP质粒酶切结果 |
| 3.3.2 重组质粒菌落鉴定结果 |
| 3.3.3 SDS-PAGE |
| 3.3.4 Western-blot |
| 3.3.5 BCMA蛋白特异性sdAb抗原结合活性的ELISA鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）重组噬菌体对沙眼衣原体作用及机制的探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状与成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、重组M13噬菌体对沙眼衣原体作用及机制的初探 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 载体、菌株,细胞株,衣原体株 |
| 1.1.2 试剂耗材 |
| 1.1.3 主要培养基的配制 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.1.5 仪器与耗材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 大肠杆菌ER2738的扩增储备 |
| 1.2.2 感受态细胞ER2738的制备 |
| 1.2.3 重组M13噬菌体的构建与纯化 |
| 1.2.4 Hela细胞的培养 |
| 1.2.5 沙眼衣原体E型标准株的培养 |
| 1.2.6 衣原体GPIC株的培养 |
| 1.2.7 CCK-8 实验检测重组M13噬菌体对细胞毒性 |
| 1.2.8 Hela细胞对携带有RGD的重组M13噬菌体的摄取 |
| 1.2.9 重组M13噬菌体对沙眼衣原体及Hela细胞的作用 |
| 1.2.10 重组M13-RGD-IN5噬菌体感染沙眼衣原体后的实时定量PCR(QPCR) |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 重组M13噬菌体的构建 |
| 1.3.2 衣原体的增量培养和EB的粗略纯化 |
| 1.3.3 重组M13-RGD-IN5噬菌体对沙眼衣原体和GPIC的作用 |
| 1.3.4 重组M13-RGD-IN5噬菌体在Hela细胞中是不增殖的 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 实验小结 |
| 二、重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对沙眼衣原体作用及机制的初探 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 载体、菌株,细胞株,衣原体株 |
| 2.1.2 试剂耗材 |
| 2.1.3 主要培养基的配制 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.1.5 仪器与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PUC-Phi CPG1-Kna质粒的扩增 |
| 2.2.2 重组pGFP-PhiCPG1衣原体噬菌体的构建 |
| 2.2.3 Infusion产物的转化 |
| 2.2.4 pGFP-PhiCPG1单克隆菌落的挑取、扩增与质粒提取 |
| 2.2.5 重组pGFP-PhiCPG1质粒的验证 |
| 2.2.6 Hela细胞和McCoy细胞细胞的培养 |
| 2.2.7 沙眼衣原体E型标准株的培养与纯化 |
| 2.2.8 衣原体GPIC株的培养与纯化 |
| 2.2.9 CaCl2法进行重组pGFP-PhiCPG1质粒的转化 |
| 2.2.10 重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的纯化 |
| 2.2.11 重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的DNA提取 |
| 2.2.12 重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的验证 |
| 2.2.13 转化的重组pGFP-PhiCPG1噬菌体随传代次数增加的增殖情况 |
| 2.2.14 纯化的重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的定量 |
| 2.2.15 CCK-8实验检测重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对细胞的毒性 |
| 2.2.16 重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对沙眼衣原体的作用及机制的初探 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组质粒pGFP-PhiCPG1的构建 |
| 2.3.2 衣原体GPIC增量培养和EB的纯化 |
| 2.3.3 重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的验证 |
| 2.3.4 重组pGFP-PhiCPG1噬菌体的增殖 |
| 2.3.5 不同浓度的重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对沙眼衣原体及GPIC的作用 |
| 2.3.6 CCK-8 检测重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对Hela的毒性 |
| 2.3.7 重组pGFP-PhiCPG1噬菌体在衣原体发育周期的不同阶段对衣原体感染的作用 |
| 2.3.8 透射电子显微镜观察重组pGFP-PhiCPG1噬菌体对沙眼衣原体的作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）M13重组噬菌体的鉴定及其对沙眼衣原体和豚鼠嗜衣原体的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、重组噬菌体鉴定及其效价检测 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 噬菌体、细菌、细胞 |
| 1.1.2 试剂及液体配置 |
| 1.1.3 仪器及耗材 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 噬菌体滴度测定 |
| 1.2.2 重组噬菌体的鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 重组噬菌体展示系统的挑选 |
| 1.3.2 重组噬菌体插入片段的选择 |
| 1.3.3 重组噬菌体的筛选、扩增 |
| 1.4 小结 |
| 二、重组噬菌体对E型沙眼衣原体和豚鼠嗜衣原体的抑制作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 菌株、细胞株、沙眼衣原体、噬菌体 |
| 2.1.2 试剂及液体配置 |
| 2.1.3 仪器与耗材 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 沙眼衣原体的纯化与定量 |
| 2.2.2 豚鼠嗜衣原体的纯化与定量 |
| 2.2.3 豚鼠嗜衣原体EB多克隆抗体效价和特异性检测 |
| 2.2.4 噬菌体对Hela细胞的毒性作用 |
| 2.2.5 重组噬菌体对衣原体的作用 |
| 2.2.6 激光共聚焦荧光显微镜观察重组噬菌体的定位情况 |
| 2.2.7 在干预不同时段噬菌体效价测定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 细胞增殖-毒性检测 |
| 2.3.2 衣原体EB多克隆抗体制备 |
| 2.3.3 M13-IN5 重组噬菌体在细胞中的定位 |
| 2.3.4 M13-IN5 重组噬菌体对沙眼衣原体和豚鼠嗜衣原体作用检测 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 沙眼衣原体持续感染 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）基于抗体的拟除虫菊酯农药代谢物分析和Cry2Aa毒素分子模拟研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 天然抗体的结构、类型与多样性的产生 |
| 1.1 天然抗体的结构与类型 |
| 1.2 天然抗体多样性的产生 |
| 2 抗体的制备 |
| 2.1 多克隆抗体技术 |
| 2.2 单克隆抗体技术 |
| 2.3 重组抗体技术 |
| 3 抗体在农药残留免疫分析领域的应用 |
| 3.1 农药抗体 |
| 3.2 抗体标记物与检测形式 |
| 4 抗体在抗原分子模拟中的应用 |
| 4.1 抗独特型抗体的原理与类型 |
| 4.2 抗独特型抗体与生物受体 |
| 4.3 抗独特型抗体模拟抗原结合活性及生物活性 |
| 5 选题依据及研究内容 |
| 5.1 3-苯氧基苯甲酸免疫分析技术研究 |
| 5.2 Cry2Aa抗独特型单链抗体的构建、筛选及其生物活性研究 |
| 5.3 研究内容 |
| 第二章 3-苯氧基苯甲酸胶体金免疫层析法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1试验材料、试剂及仪器 |
| 1.2 腹水的制备与纯化 |
| 1.3 纯化单抗效价和抑制中浓度的测定 |
| 1.4 胶体金的制备 |
| 1.5 金标抗体的制备 |
| 1.6 检测线浓度和胶体金喷膜量的优化 |
| 1.7 试纸的组装 |
| 1.8 免疫层析试纸检测流程、检测的结果判断标准和检测阈值确定 |
| 1.9 水样检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 腹水的制备、纯化与性能分析 |
| 2.2 胶体金的鉴定与最佳抗体标记浓度的确定 |
| 2.3 检测线浓度和金标抗体喷膜量的优化 |
| 2.4 免疫层析试纸检测阈值的确定及水样的检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 免疫层析法的主要优势 |
| 3.2 免疫层析法的灵敏度与适用性 |
| 3.3 免疫层析法的选择性 |
| 4 结论 |
| 第三章 3-苯氧基苯甲酸单链抗体的构建及生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 1.2 总RNA的提取 |
| 1.3 cDNA第一链的合成 |
| 1.4 抗体VH和Vκ基因扩增及拼接 |
| 1.5 表达载体的构建与化转 |
| 1.6 单链抗体的小量表达与活性验证 |
| 1.7 ELISA |
| 1.8 Western blot |
| 1.9 单链抗体的理化性质预测 |
| 1.10 IMGT数据库对单链抗体的序列分析 |
| 1.11 单链抗体同源建模与分子对接 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA提取 |
| 2.2 VH和Vκ基因的扩增、拼接和表达载体构建 |
| 2.3 单链抗体在宿主菌中的初步表达定位和活性验证 |
| 2.4 单链抗体的理化性质预测 |
| 2.5 IMGT数据库对单链抗体基因序列分析 |
| 2.6 单链抗体同源建模、分子对接与结合模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 单链抗体的构建方法 |
| 3.2 抗体信息学数据及结合模式分析 |
| 4 结论 |
| 第四章 3-苯氧基苯甲酸单链抗体的表达、功能分析与检测应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 1.2 单链抗体表达温度的优化 |
| 1.3 单链抗体表达时间的优化 |
| 1.4 诱导剂浓度的优化 |
| 1.5 ELISA和Western blot |
| 1.6 单链抗体的纯化与复性 |
| 1.7 包被原和工作浓度的优化 |
| 1.8 甲醇对ELISA体系的影响 |
| 1.9 3-PBA间接竞争ELISA检测方法的建立 |
| 1.10 交叉反应率试验 |
| 1.11 添加回收试验 |
| 1.12 HPLC法比对 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单链抗体的诱导温度的优化 |
| 2.2 诱导表达时间和IPTG浓度的优化 |
| 2.3 单链抗体大量表达与纯化 |
| 2.4 包被原和抗体工作浓度的优化 |
| 2.5 甲醇对抗体性能的影响 |
| 2.6 间接竞争ELISA法的建立 |
| 2.7 交叉反应率的测定 |
| 2.8 单链抗体的稳定性研究 |
| 2.9 添加回收试验、HPLC法的比对 |
| 3 讨论 |
| 3.1 单链抗体表达参数的优化 |
| 3.2 单链抗体的功能性分析 |
| 3.3 单链抗体的检测应用 |
| 4 结论 |
| 第五章 基于链替换技术的Cry2Aa抗独特型单链抗体的构建与筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 1.2 抗体重、轻链基因扩增 |
| 1.3 单链抗体基因的拼接 |
| 1.4 重组质粒构建 |
| 1.5 重、轻链替换库的构建 |
| 1.6 多克隆噬菌体ELISA分析 |
| 1.7 重、轻链替换库的筛选 |
| 1.8 阳性克隆鉴定 |
| 1.9 抗独特型单链抗体可溶性表达与纯化 |
| 1.10 抗独特型单链抗体的功能性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 抗体重、轻链基因扩增及拼接 |
| 2.2 双酶切与重组质粒构建 |
| 2.3 重轻链替换库的筛选与鉴定 |
| 2.4 抗独特型单链抗体的可溶性表达与活性验证 |
| 2.5 Cry2Aa抗独特型单链抗体的表观亲和力分析 |
| 2.6 Cry2Aa与抗独特型单链抗体MUT10的竞争抑制试验 |
| 3 讨论 |
| 3.1 链替换技术效率分析 |
| 3.2 抗独特型单链抗体与Cry2Aa毒素的竞争替代作用分析 |
| 4 结论 |
| 第六章 Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对小菜蛾生物活性的初步分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 1.2 Cry2Aa抗独特型单链抗体的制备 |
| 1.3 小菜蛾BBMV的提取 |
| 1.4 BBMV结合分析 |
| 1.5 生物测定 |
| 1.6 SDS-PAGE与Ligand blot分析 |
| 1.7 LC-MS/MS |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Cry2Aa及其抗独特型单链抗体与小菜蛾BBMV的结合能力分析 |
| 2.2 Cry2Aa及其抗独特型单链抗体对小菜蛾的生物测定 |
| 2.3 Cry2Aa及其抗独特型单链抗体与小菜蛾BBMV的Ligand blot分析 |
| 2.4 Cry2Aa及其抗独特型单链抗体与小菜蛾BBMV共同结合蛋白条带的LC-MS/MS分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BBMV结合能力及杀虫活性分析 |
| 3.2 中肠结合蛋白分析 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间取得研究成果 |
（10）基于噬菌体展示技术筛选高亲和力兔源HER2单链抗体（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体研究进展 |
| 1.1.1 抗体介绍 |
| 1.1.2 抗体结构特点 |
| 1.1.3 抗体技术发展 |
| 1.1.4 单链抗体 |
| 1.2 噬菌体展示技术 |
| 1.2.1 噬菌体展示技术原理 |
| 1.2.2 噬菌体展示系统类型 |
| 1.2.3 噬菌体展示技术筛选方法 |
| 1.3 HER2研究进展 |
| 1.3.1 HER2介绍 |
| 1.3.2 HER2与乳腺癌 |
| 1.3.3 HER2抗体研究现状 |
| 1.4 本课题研究内容及创新之处 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 课题特色与创新之处 |
| 第二章 噬菌体展示文库的构建及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物与菌种 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要溶液及试剂配方 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 HER2蛋白的合成 |
| 2.2.1.1 HER2蛋白的诱导表达 |
| 2.2.1.2 HER2蛋白的分离纯化 |
| 2.2.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达 |
| 2.2.1.4 蛋白复性与乳化 |
| 2.2.2 免疫实验用兔 |
| 2.2.2.1 免疫注射 |
| 2.2.2.2 间接竞争Elisa法检测 |
| 2.2.2.3 免疫组化检测 |
| 2.2.3 脾脏总RNA提取 |
| 2.2.3.1 脾脏细胞分离 |
| 2.2.3.2 脾脏总RNA的提取 |
| 2.2.4 逆转录合成cDNA |
| 2.2.5 引物设计 |
| 2.2.6 抗体V_H、V_L基因的获取 |
| 2.2.7 ScFv基因的拼接 |
| 2.2.8 pCANTAB5e质粒载体与ScFv基因双酶切 |
| 2.2.9 pCANTAB5e-ScFv重组质粒构建 |
| 2.2.10 TG1超级感受态细胞的制备 |
| 2.2.11 初级抗体库的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 HER2蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.2 免疫血清鉴定 |
| 2.3.3 脾脏总RNA的提取 |
| 2.3.4 抗体重链、轻链可变区基因的PCR扩增 |
| 2.3.5 pCANTAB5e-ScFv重组质粒的构建 |
| 2.3.6 初级抗体库的鉴定 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 噬菌体单链抗体库的富集筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验菌种 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要溶液及配方 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 淘筛前准备 |
| 3.2.1.1 辅助噬菌体毒种制备 |
| 3.2.1.2 辅助噬菌体滴度测定 |
| 3.2.1.3 噬菌体增殖培养 |
| 3.2.1.4 噬菌体沉析 |
| 3.2.2 酶标板淘筛 |
| 3.2.3 HER2组织切片免疫组化淘筛 |
| 3.2.4 Phage-ELISA检测重组抗体 |
| 3.2.5 特异性抗体测序 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 辅助噬菌体滴度的测定 |
| 3.3.2 噬菌体ScFv抗体库的淘筛 |
| 3.3.2.1 噬菌体ScFv抗体库的富集筛选 |
| 3.3.2.2 噬菌体ScFv终极抗体库的阳性率 |
| 3.3.3 Phage-ELISA检测抗体亲和力 |
| 3.3.4 抗体可变区序列分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
四、兔抗M13噬菌体酶标抗体的制备（论文参考文献）
- [1]抗非洲猪瘟病毒猪源单链抗体噬菌体文库的构建及抗体的筛选[D]. 王丽娟. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]我国优势种海蛇毒多组学分析、抗毒血清制备以及毒腺中活性组分淘选[D]. 王博. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白3特异亲和肽抑制虫体入侵宿主细胞研究[D]. 陈文静. 东北农业大学, 2020(04)
- [4]TIM-3单克隆抗体制备及人源化小鼠构建[D]. 杨雷. 福建师范大学, 2020(12)
- [5]人源化半合成纳米抗体文库的构建及CD47纳米抗体的研制[D]. 郭瑞峰. 华东理工大学, 2021(08)
- [6]B细胞成熟抗原特异性单域抗体的筛选制备和鉴定[D]. 刘欣. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [7]重组噬菌体对沙眼衣原体作用及机制的探索[D]. 魏世娟. 天津医科大学, 2019(02)
- [8]M13重组噬菌体的鉴定及其对沙眼衣原体和豚鼠嗜衣原体的作用[D]. 练婷婷. 天津医科大学, 2019(02)
- [9]基于抗体的拟除虫菊酯农药代谢物分析和Cry2Aa毒素分子模拟研究[D]. 刘媛. 南京农业大学, 2018
- [10]基于噬菌体展示技术筛选高亲和力兔源HER2单链抗体[D]. 祝婧雯. 福州大学, 2018(03)