一、反义核酸对体外培养A型精原细胞端粒酶活性的影响（论文文献综述）
于敏莉[1]（2012）在《维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究》文中研究说明家禽的胚胎发育有独特的规律,通过对家禽原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）的体外研究,可以更深入地了解其胚胎发育过程及影响因素,并可对其基因进行遗传操作,制作各种研究模型,从而为生殖生物学和发育生物学等研究提供了一个优良的动物模型。为了更深层次揭示禽类生殖细胞增殖和分化的细胞内部和外源性调控机理、性腺发育和配子形成的分子机理,本实验以海兰鸡鸡胚为材料,分离了不同时期的PGC,进行体外培养并优化培养模型,研究了维甲酸（RA）对PGC粘附和增殖的作用及其胞内信号传导机制,同时还研究了RA对胚胎期卵巢生殖细胞减数分裂启动过程中的调控作用,探索基于LV-siRNA的慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立Raldh2基因敲除的转基因鸡模型,为进一步研究胚胎早期发育的机理、转基因家禽的制备奠定了基础。1.鸡胚PGC的分离、培养及鉴定在体视显微镜下用玻璃针分离19期3.5d鸡胚生殖嵴部位或28期5.5d鸡胚性腺,胰蛋白酶+EDTA消化分散组织,用KO-DMEM添加7.5%胎牛血清和10ng/ml白血病抑制因子（LIF）、10ng/ml碱性成纤维生长因子（bFGF）、10ng/ml干细胞生长因子（SCF）、0.1mMMEM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺（Glu）、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养液,通过PGC和体细胞体外共培养的方式建立原代培养模型。然后传代于鸡胚成纤维细胞饲养层上进行继代培养。同时我们从13-15期鸡胚血液中分离提取PGC,在饲养层上进行原代和传代培养。传至3-5代后,用碱性磷酸酶（AKP）、过碘酸雪夫氏（PAS）化学反应及c-kit、SSEA-1,3,4、EMA-1等免疫细胞化学鉴定PGC,用PCNA和BrdU掺入法检测细胞的增殖活性。并收集PGC集落,采用RT-PCR方法检测干细胞多能性相关基因（Pou5fl,Sox2和Nanog）的表达。上述结果表明我们建立的PGC-体细胞共培养模型较好的维持了PGC的生物特性及未分化状态,且具有较强的增殖活性。因此,该模型是可用于PGC体外增殖和分化调控的研究。2.RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其机理的研究本实验研究了RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其相关的信号传导途径。结果表明：经过RA（0.1-10μM）处理后,PGC的集落数目和面积呈时间和剂量依赖性增加。同时RA能够促进细胞间的粘附,提高粘附蛋白E-钙粘蛋白、α-连锁蛋白和β-连锁蛋白的mRNA水平,增强PGC的粘附性,并存在一定的剂量效应关系。流式分析结果显示,PGC经过RA处理4天后,S/G2期（4N）的PGC数量显着增加,说明此部分细胞已经进入有丝分裂期。此外,RA能激活PGC中PKC和Akt活性,促进NF-κB的核转移,提高钙粘蛋白和β-catenin的磷酸化水平,然而这些刺激作用分别被LY294002（P13K抑制剂）,KP372-1（Akt抑制剂）,SN50（NF-κB抑制剂）和H7（PKC抑制剂）所阻断。RA显着上调PGC中细胞周期蛋白cyclin D1/E, CDK2/6和原癌基因c-fos, c-myc（?）勺表达,但是这种上调作用被H7、LY294002、KP372-1和SN50所抑制：综上所述,在体外培养条件下,RA通过PI3K/Akt/NF-κB信号级联反应及与PKC/β-catenin之间的交联反应促进鸡胚PGC的增殖,揭示RA在调控鸡胚胎生殖细胞发育中起着重要的作用。3.RA对鸡胚生殖细胞减数分裂的调控机理的研究在本实验中,我们结合胚胎期卵巢的体外培养和RNA干扰等手段,探索RA对鸡胚胎期生殖细胞减数分裂的调控及作用机制。SCP3和γH2AX免疫荧光染色结果表明,鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂,比例逐渐增加,到18.5天,进入减数分裂的细胞几乎遍布整个卵巢。减数分裂早期标志基因Strs8mRNA的表达在12.5天开始显着上调,早于减数分裂启动的时间：而减数分裂标志基因Scp3和Dmcl mRNA（?）内表达则在15.5天显着上调,再次验证鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂；RA合成酶基因Raldh2在15.5天显着上调而降解酶Cyp26bl却逐渐下降,表明Raldh2在RA聚集并维持减数分裂中的重要作用；RA受体RARβ则略微升高,表明其在RA启动减数分裂中的介导作用。而在雄性睾丸中,这些基因的表达变化很小,一直保持较低水平。10.5天和12.5天鸡胚卵巢在无血清的体外培养体系中分别培养5天和3天,生殖细胞能白发启动减数分裂：在培养体系中添加RA能明显增加进入减数分裂的细胞比例,显着上调了减数分裂相关基因Stra8,Scp3和Dmcl（?）的mRNA表达水平。Raldh2shRNA干扰后显着抑制了RA诱导减数分裂启动的作用。综上所述,我们的研究表明,RA及其信号通路对减数分裂启动中的重要调控作用,并首次报道了Raldh2基因敲减能够显着抑制生殖细胞进入减数分裂。4.利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型研究生殖细胞的发育本实验采用RNA干涉（RNAi）的方法,成功设计了三对针对Raldh2基因序列的保守区域的shRNA （short hairpin）分子,并构建质粒干涉载体。转染鸡胚15.5天卵巢生殖细胞后,转染效率达到80%-90%。通过qRT-PCR及SCP3免疫荧光染色检测,结果表明Raldh2-gallus-1224很好的抑制了Raldh2的表达,成功筛选出能高效抑制Raldh2复制的靶位点。针对有效位点构建了携带有能高效抑制Raldh2的shRNA慢病毒载体,将包装后的病毒注射到X期鸡胚胚盘内进行转基因操作,建立Raldh2基因敲减的转基因鸡模型。结果发现Raldh2基因敲减的转基因鸡胚外观与对照组的鸡胚相比无明显差异,卵巢形态大致正常,应用PCR检测GFP在胚体内的表达,进一步证实我们成功制备了转基因鸡模型,且qRT-PCR检测到Raldh2的表达显着下降。本实验为探索基于LV-siRNA慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立基因敲减的转基因鸡模型,为研究卵泡发育的分子机制奠定基础。以上实验结果表明：鸡胚PGC的体外共培养模型可用于PGC增殖和分化调控的研究,经AKP、PAS及c-kit、SSEA-1、3、4和EMA-1免疫细胞化学染色和干细胞多能性相关基因（Pou5fl,Sox2和Nanog）表达的RT-PCR检测等多种方法证实了PGC的原始性。利用此模型我们研究了维甲酸在PGC体外培养中的促增殖和粘附作用及其分子机理：我们还描述了鸡胚卵巢生殖细胞体内减数分裂启动中的形态学和分子变化,通过组织培养和RNA干扰等手段研究了RA对减数分裂启动的调控作用。这些发现将为禽类干细胞系的建立和转基因模型的制备奠定基础,同时也为进一步研究生殖细胞的发育提供理论指导和实验平台。
王大虎[2]（2011）在《端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义》文中研究指明目的:食管癌（esophageal carcinoma, EC）是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一,我国的食管癌发病率较高,河北省磁县更是食管癌的高发区,严重影响着人们的生活质量和生命健康。端粒、端粒酶在肿瘤细胞的永生化和演进中扮演重要角色。端粒酶的激活可以导致细胞无限制地增殖和肿瘤的发生。端粒（telomere）作为分子钟控制着人类细胞的复制与衰老,与细胞的寿命密切相关。正常细胞每次分裂,端粒DNA长度会缩短55～200 bp,经历多次分裂后缩短至其下限时,细胞最终凋亡或死亡。端粒酶（telomerase）是一种以自身RNA为模板的逆转录酶,其核心组分之一端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase , hTERT）是端粒酶发挥活化作用的重要途径,它的表达调控在端粒酶活性调节中起关键作用,是细胞呈现端粒酶活性的决定因素。已有大量研究发现,在恶性肿瘤的发生中存在有端粒DNA长度的缩短,并且端粒酶的激活维持了大多数组织的端粒长度,抵消了细胞分裂导致的端粒DNA消耗。说明端粒缩短在恶性肿瘤的演变中起重要作用。已有大量研究表明,人体正常细胞除少量细胞如精原细胞、胚胎细胞、干细胞外,大多数细胞的端粒酶几乎都是无活性的,而与之相反在绝大多数恶性肿瘤中端粒酶活性高表达,表达率高达90%以上。因此端粒酶的活化可能是恶性肿瘤发生发展的多种基因改变中起到了至关重要的作用,并且可以作为最具普遍性和特异性的肿瘤分子标记物,在肿瘤的诊断和治疗中具有重要的地位。而抑制端粒酶的活性,将有可能阻止肿瘤细胞恶性增殖,这种特性使端粒酶成为当今肿瘤诊治研究的热点。本实验利用了多项实验方法检测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,探讨与食管癌发生及生物学行为的关系,试图为食管癌的早期诊断提供客观参考指标,并为揭示食管癌的发生、发展的机制提供理论依据。采用端粒重复序列扩增反应（TRAP）-ELISA和TRAP -银染法半定量技术,检测食管癌及异型增生组织中端粒酶活性的表达,探讨端粒酶活性与食管癌发生发展及其与临床病理因素的关系。PinX1基因作为端粒酶的内源性抑制基因,近年来被认为是一种潜在的抑癌基因,其表达可能与多种肿瘤的发生发展有关。有实验证实在胃癌、大肠癌及白血病患者中PinX1表达明显下降,端粒酶活性增强。但是也有研究显示PinX1在肝癌细胞中的表达与正常组织无显着差异,而与之相应的是此类肿瘤中大部分端粒酶活性也增强。目前PinX1基因在肿瘤细胞中的作用和对端粒酶活性的调控及在细胞癌变中的机制尚不十分清楚。有关PinX1基因在食管癌中的研究国内外也鲜有报道。PinX1基因的作用越来越引起人们的重视,但到目前为止,PinX1基因在食管癌中生物学意义、作用机理国内外的报道很少,并且没有适合研究PinX1基因的食管癌细胞模型。由于基因转染已经成为治疗肿瘤等基因表达异常的有效手段,那么,通过外源性过表达PinX1基因能否抑制食管癌细胞的增殖?是否可以抑制端粒酶活性?本实验中利用多项技术,应用细胞模型研究PinX1在人食管癌、异型增生组织及正常食管组织中的表达,探讨PinX1与食管癌发生发展及与食管癌临床分期、病理分型及预后的相关性,并分析与端粒酶活性表达的相关性。研究转染PinX1基因前后细胞增殖凋亡等的变化,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。同时我们应用TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测转染前后Eca109细胞端粒酶活性的变化,进一步探讨PinX1基因与端粒酶的关系。方法:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义收集采集自河北省磁县食管癌高发区现场的咬检组织1000例,所有患者未接受过化疗和放疗。从中选取130例,根据病情分为3组,第1组为正常食管组织36例,第2组为异型增生组织50例,第3组为食管鳞癌组织44例。经病理组织学诊断,50例异型增生食管粘膜组织中,22例为轻度增生组织,28例为重度增生组织;44例食管鳞状细胞癌中,20例为高分化鳞癌、11例为中分化鳞癌,13例为低分化鳞癌,25例侵及纤维膜及周围软组织,19例未侵及纤维膜;20例为淋巴结转移,24例为无淋巴结转移。采用流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）和免疫组织化学方法（immunohistochemistry, IHC）检测测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,分析与食管癌发生及与临床病理特征的关系。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义收集食管鳞状细胞癌手术切除标本130例,每例标本分别取癌组织、癌旁组织（距癌边缘2-5cm）及手术切缘正常食管粘膜（距癌边缘5cm以上）。从中选取50例食管鳞状细胞癌、异型增生及正常食管粘膜组织。经病理组织学诊断,50例食管鳞状细胞癌,39例为高中分化鳞癌,11例为低分化鳞癌,34例侵及纤维膜,16例未达到纤维膜,17例淋巴结转移,33例未转移。采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）、流式细胞术方法（flow cytometry, FCM）、TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测食管癌组织、异型增生、正常粘膜组织中端粒酶活性和PinX1基因和蛋白的表达,分析端粒酶活性和PinX1表达与食管癌临床病理特征的关系。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响利用分子生物学技术构建pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒。采用脂质体转染方法将pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒转染Eca109细胞,同时也设置空载体pCDNA3.1转染组。转染72小时后用G418进行稳定转染细胞的筛选,筛选出来的阳性细胞分别命名为Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。应用激光共聚焦方法测定转染效率,MTS方法检测过表达PinX1对Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞生长抑制作用。FCM方法检测细胞生长周期和细胞凋亡。RT-PCR、FCM、Western-blot方法检测Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞中PinX1基因及蛋白的表达,TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测端粒酶活性在细胞中表达。结果:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义FCM检测端粒长度结果显示,端粒DNA长度在食管癌组织中表达量与正常食管组织相比明显缩短,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织的表达量呈现逐渐降低趋势（P<0.01）;端粒DNA长度在食管轻度增生、重度增生之间呈逐渐降低趋势,重度增生组与轻度增生组相比明显缩短（P<0.01）,轻度增生组与正常组比较无显着性差异（P>0.05）。随着细胞学分级增高,端粒DNA长度Q-FISH值逐渐降低,端粒DNA长度与细胞学分级呈负相关（r=-0.79, P <0.01）。FCM检测端粒酶hTERT基因蛋白含量,在癌、重度增生、轻度增生和正常食管的FI值分别为1.84±0.21、1.39±0.24、1.13±0.19和0.87±0.18,癌组hTERT含量高于重度增生组（P <0.01）、重度增生组高于轻度增生组（P<0.01）,轻度增生组与正常组相比无显着性差别。随着细胞学分级增高, hTERT的FI值随之升高, hTERT蛋白含量与细胞学分级呈正相关关系（r=0.83, P<0.01）。根据FI值>1.0为阳性表达的判断标准,轻度增生组、重度增生组和癌组hTERT蛋白阳性表达率分别为68.18%、92.86%和95.45%,重度增生组和癌组的表达率都高于轻度增生组（P<0.01）。FCM检测正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组细胞DNA含量,DI值分别为1.03±0.34、1.06±0.28、1.17±0.25和1.54±0.37,正常组、轻度增生组和重度增生组的DI值呈上升趋势（P>0.05）,癌组的DI值明显高于重度增生组。DI值与细胞学分级正相关（r=0.62, P<0.01）;正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组DNA异倍体率分别为11.11（4/36）、9.09（2/22）、28.57（8/28）和81.82（36/44）,癌组异倍体率高于重度增生组（P<0.01）,重度增生组高于轻度增生组（P<0.05）;从正常组到癌组PI值分别为10.98±4.11、14.15±4.76、18.97±5.27和28.79±5.47,随着细胞学分级的升高,PI值增大,癌组显着高于重度增生组（P<0.01）,重度增生组高于轻度增生组（P<0.05）。PI值与细胞学分级正相关（r=0.64, P<0.01）。130例食管样本的DI值与PI值高度正相关（r=0.76, P<0.01）;端粒长度Q-FISH值与端粒酶hTERT蛋白FI值负相关（r=-7.49, P<0.01）;端粒Q-FISH值与DI值负相关（r=-0.41, P<0.01）。IHC结果显示:端粒酶hTERT蛋白阳性颗粒呈棕黄色,阳性物质全部位于上皮细胞和癌细胞的核内。在异型增生组织,端粒酶hTERT蛋白的阳性表达部位主要集中在基底细胞层及其上方的细胞核内,随着食管黏膜上皮增生程度的加重,hTERT阳性细胞逐渐增多,阳性细胞带上移。正常食管粘膜组织中阳性表达率为11.1%（4/36）,异型增生组织和癌组织hTERT蛋白阳性表达率分别为44.0%（22/50）和86.37%（38/44）。三者阳性率比较,癌组织显着高于异型增生组织（P<0.01）,异型增生组织高于正常上皮组织（P<0.01）。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义端粒酶活性检查结果显示,在食管癌、异型增生和正常食管组织中,阳性表达率分别为84.0%、62.0%及6.0%,食管癌及异型增生组织与正常食管粘膜比较具有显着统计学差异（P<0.05）。端粒酶活性的平均A值分别为食管癌组织1.457±0.838、食管异型增生组织0.429±0.346和正常食管粘膜组织0.073±0.039。三组间两两比较端粒酶活性的平均A值均存在高度显着统计学差异（P<0.05）。按正常食管粘膜组织、食管异型增生组织和食管鳞癌组织的序列,端粒酶阳性表达率和平均A值依次明显增高。食管癌组织中端粒酶阳性表达率与组织学分级和淋巴结转移无关,而端粒酶活性的平均A值与组织学分级和淋巴结转移有关;食管癌组织中端粒酶阳性表达率及端粒酶活性的平均A值与其他临床病例因素如年龄、性别和浸润深度等无关。RT-PCR及FCM检测PinX1结果显示,PinX1 mRNA及蛋白在食管癌组织中表达均显着低于食管正常粘膜（P <0.01）,在食管正常粘膜、异型增生、癌组织之间呈现逐渐降低趋势（P <0.05）。食管癌组织中,PinX1 mRNA和蛋白与分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移密切相关（P <0.05）,与性别和年龄无明显相关（P >0.05）。食管癌组织中端粒酶活性表达与PinX1蛋白表达呈负相关性（rs =-0.883,P=0.000）。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响应用脂质体转染方法,将pCDNA3.1（+）-PinX1重组质粒及空载体pCDNA3.1成功转染入Eca109细胞中,并应用G418成功筛选出稳定转染细胞,转染pCDNA3.1- PinX1重组质粒与空载体pCDNA3.1的阳性克隆细胞分别记为Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。MTS法测定增殖情况结果显示,转染PinX1基因后,Eca109细胞生长明显减慢（P<0.05）;而Eca109细胞与仅转染入空载体的Eca109细胞生长比较,两者无明显差异（P>0.05）。FCM测定细胞生长周期实验结果显示,转染PinX1基因的Eca109细胞的G0/G1期细胞数（%）为70.58±5.26,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的G0/G1期细胞数（%）（分别为53.14±4.83及47.27±3.73）（P<0.05）。说明转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G0/G1期（Fig. 3-9）。FCM测定细胞凋亡实验结果显示,流式细胞仪检测细胞凋亡表明:转染PinX1基因的Eca109细胞的凋亡率（%）为23.28±5.73,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的凋亡率（%）（分别为0.27±0.18及3.40±1.09）（P<0.05）。说明转染入PinX1基因后,细胞发生早期凋亡改变。RT-PCR、Western-blot和FCM检测结果显示,Eca109/ PinX1细胞中PinX1 mRNA和蛋白表达水平较Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞显着升高（P <0.05）。细胞端粒酶活性的检测结果显示,转染PinX1基因后,细胞端粒酶活性明显降低（P<0.05）。转染前后Eca109中端粒酶活性表达与细胞增殖指数（PI）表达呈正相关性（rs=0.451,P=0.000）。结论:1端粒DNA长度在食管癌前细胞及癌细胞中明显缩短,并且随病变程度加重而递减。端粒酶hTERT、细胞内DNA含量和PI值在食管上皮癌变发生中明显递增,提示食管癌变与三者密切相关。端粒DNA长度、端粒酶hTERT在食管癌前病变早期即出现变化,可以做为监测食管癌发生发展的参考指标。端粒酶hTERT与食管癌的临床病理特征无关,不能做为食管癌病人预后的指标。端粒缩短、端粒酶hTERT高表达都与食管癌变密切相关,有望以上述二者为靶点指导抗肿瘤的基因治疗。2食管癌及异型增生组织中存在端粒酶活性表达,并存在量的差异。端粒酶活性在异型增生即呈现高表达,随着病变的加重,端粒酶活性依次显着增高,提示端粒酶参与了食管癌的发生与发展,端粒酶的激活是食管癌的早期事件。端粒酶可望成为食管癌的病情监测及早期诊断的生物学指标。端粒酶活性A值与食管癌的组织学分级和淋结转移有关,提示食管癌端粒酶活性A值可作为判断疗效和评价预后的指标。PinX1在食管癌组织中表达显着低于食管正常组织,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织之间呈现逐渐降低趋势。PinX1在食管癌中表达和病理分级呈负相关,分级越高,PinX1表达越低。浸润深度达到纤维膜者、有淋巴结转移者的PinX1表达要低于浸润深度未达到纤维膜者、无淋巴结转移者。认为PinX1是一种潜在的食管癌相关基因,检测PinX1的表达水平可能对评价食管癌恶性程度、转移潜能和预后评估有重要的临床价值。食管癌组织中端粒酶活性与PinX1表达呈显着负相关性,证实PinX1抑制端粒酶活性。3首次应用脂质体转染方法建立食管癌细胞株Eca109/PinX1,目前国内外文献尚未见相关报道。Eca109细胞转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G0/G1期,细胞发生早期凋亡改变。Eca109细胞转染PinX1基因后,端粒酶活性明显降低,并且端粒活性与细胞增殖指数呈显着正相关,考虑在食管癌细胞中PinX1基因通过降低端粒的活性,减弱细胞的增殖,有望成为食管癌治疗的分子靶点。
郑小波[3]（2010）在《c-jun对仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌影响的机理研究》文中进行了进一步梳理两性配子的生成是动物繁衍的前提和基础,睾酮在精子生成过程中具有十分重要的作用。睾酮不仅在精子生成过程中具有十分重要的作用,而且睾酮还参与维持雄性动物的第二性征,对精子的活力、授精的成功率也有重要的影响。间质细胞是雄性动物体内产生睾酮最主要的细胞,研究间质细胞睾酮合成的调控机制对于深入认识精子生成的分子机制,预防和治疗雄性不育均有十分重要的意义。关于睾酮合成机制的研究以往多集中在下丘脑-垂体-睾丸轴内分泌调节和促性腺激素对睾酮合成的影响上,但近年来的研究表明,原癌基因的表达在睾酮合成中起着十分重要的作用。本研究以荣昌猪为实验动物,利用体内体外模型探讨原癌基因c-jun对睾酮合成的调节机制,为进一步认识原癌基因在精子生成中的作用提供基础数据。大量的研究表明,睾丸间质细胞的睾酮分泌也伴有某些原癌基因的表达变化,特别是即时早期基因的表达变化。这些即时早期基因主要包括fos成员和jun家族。我们以c-jun为目的基因,以1、3、5周龄的荣昌仔猪睾丸为研究对象,采用实时荧光定量RT-PCR方法和放射免疫法研究了c-jun mRNA在仔猪睾丸中的表达及表达与血浆睾酮水平的关系,并切片观察睾丸组织结构的变化。实验结果表明：c-jun mRNA在1、3、5周龄仔猪睾丸组织中均有表达。其中3周龄表达较高,5周龄次之,1周龄较低,3周龄与5周龄和1周龄相比存在显着差异（P<0.05）。血浆睾酮水平在第3周最高,在其他时期较低,3周龄与1周龄、5周龄比较差异显着（P<0.01）,3周龄仔猪睾丸间质细胞结构逐渐完整,5周龄数量有所下降。c-jun mRNA的表达与血浆睾酮水平及间质细胞结构变化可能存在一致性。3周龄荣昌仔猪睾丸作为研究睾酮分泌机制的材料是适宜的。通过不同时间仔猪睾丸组织c-jun mRNA表达分析发现,其表达水平与血浆睾酮浓度检测结果有一致性。为了进一步了解c-jun mRNA表达和睾酮分泌的关系,采用了体外培养的间质细胞进行研究,目的是排除其他细胞（如支持细胞、生精细胞）的干扰。通过锥虫蓝试验和3β-HSD酶活性检测,用酶解法结合差速离心分离的荣昌仔猪间质细胞数量较多,纯度较高,其活力为（93.0±4.9）%,纯化后的细胞百分率为（85.1±3.6）%。睾酮基础分泌量随培养的时间延长而增高,两者呈线性关系（r=0.826,P<0.01）,培养至4h后增长峰趋于平缓。随着hCG刺激浓度的增加,睾酮分泌量增加,两者呈明显线性关系（r=0.893,P<0.01）。当hCG浓度达到50IU/mL时,诱导睾丸间质细胞睾酮分泌量最高。本实验中均采用50IU/mL为hCG诱导浓度。为了进一步准确了解c-jun mRNA表达与睾酮分泌的关系,我们采用了反义核酸技术,即将c-jun基因制备成反义c-junASODNs与体外培养的3周龄睾丸间质细胞共育,了解c-jun表达与睾酮分泌的量效关系。同时,通过MTT和TUNEL法了解睾丸间质细胞睾酮分泌过程中细胞增殖和凋亡的作用。结果显示,c-jun ASODNs以剂量依赖性方式抑制基础状态下睾酮分泌（P<0.01）及睾丸间质细胞增殖（P<0.01）,当加入1μmol/L c-junASODNs时,显着抑制睾丸间质细胞的凋亡（P<0.05）。这表明c-jun可促进基础状态下仔猪睾丸间质细胞睾酮的分泌,这种作用与c-jun促进睾丸间质细胞增殖和凋亡有关。睾丸间质细胞的分泌有基础性分泌和促性腺激素诱导的分泌,后者受下丘脑—垂体—性腺轴调节。绒毛膜促性腺激素hCG可与间质细胞表面受体结合,使ATP（?）→cAMP,而cAMP可动员胆固醇经过一系列中间步骤,最终生成睾酮。本试验通过c-jun ASODNs诱导观察c-jun在调节hCG诱导的仔猪睾丸间质细胞分泌的作用,采用c-jun ASODNs拮抗c-jun,维拉帕米阻断钙通道,添加cAMP观察其对体外培养睾丸间质细胞睾酮分泌的影响。结果发现hCG可刺激荣昌仔猪睾丸间质细胞的睾酮分泌,c-jun ASODNs（0.125-2μmol/L）呈剂量依赖性抑制hCG诱导离体睾丸间质细胞的分泌（P<0.01）,加用cAMP后睾酮分泌增加,可逆转c-jun ASODNs抑制hCG诱导离体睾丸间质细胞的睾酮分泌。维拉帕米（10-5mol/L）可增加c-jun ASODNs抑制睾酮分泌作用。因此,推测c-jun在促进hCG诱导间质细胞分泌睾酮过程中,主要通过以下信号途径传递信息：（1）hCG作用于仔猪睾丸间质细胞膜特异性受体,通过G蛋白介导,激活腺苷酸环化酶,从而使cAMP生成增多,然后以cAMP作为第二信使,通过cAMP-PKA途径导致核内原癌基因c-jun转录和翻译,其表达产物间或产物与c-fos蛋白在亮氨酸拉链区（1eucne zipper）形成同源或异源二聚体复合物,与靶基因的AP-1 （activator protein 1）位点结合,直接调节转录活性,激活一些晚期基因转录,如P450c17mRNA,后经过一系列酶作用,促进睾酮的合成和分泌。（2）hCG作用于睾丸间质细胞膜上特异性受体,使细胞内Ca2+浓度增高,然后以Ca2+作为第二信使,通过IP3-DAG-钙调蛋白激酶途径继而使核内原癌基因c-jun转录激活。其表达产物间或产物与c-fos蛋白在亮氨酸拉链区形成同源或异源二聚体复合物,与靶基因的AP-1位点结合,直接调节转录活性,激活一些晚期基因转录,如P450c17 mRNA,然后经过一系列酶作用,促进睾酮的合成和分泌。综上所述,我们可以得到以下结论：1、c-jun mRNA在1、3、5周龄荣昌仔猪睾丸中均有表达,3周龄较高,其变化趋势与血浆中睾酮水平变化有一致性。2、酶解法结合差速离心分离的荣昌仔猪间质细胞活力强,纯度较高,数量较多。随着培养时间延长,睾酮分泌量增加,4h达峰值。随着hCG的浓度增加,睾酮分泌增加,50IU/mL的hCG刺激的睾酮分泌达峰值。3、c-jun能剂量依赖性促进基础状态下的睾酮分泌,可能与促进间质细胞增殖和凋亡有关。4、c-jun能剂量依赖性影响hCG诱导的睾酮分泌。5、c-jun在调节hCG诱导睾酮的分泌过程中,可能的机制是通过hCG→激活受体→激活第二信使（cAMP,Ca2+）→诱导c-jun基因转录mRNA→在胞浆内表达产物c-Jun进入核内其表达产物间或产物与c-fos蛋白在亮氨酸拉链区（1eucine zipper）形成同源或异源二聚体复合物,与靶基因的AP-1 （activator protein-1）位点结合→激活一些晚期基因转录,如P450c17mRNA,后经过一系列酶促作用→促进睾酮的合成和分泌。
刘成武[4]（2008）在《病毒载体介导的微型核酶对犬贾第虫端粒酶活性的影响》文中提出本研究在对犬贾第虫（G. canis）病毒研究的基础上,构建了犬贾第虫病毒（GCV）通用型转染载体,在载体中引入了抗性盒、多克隆酶切位点和内源性启动子,并在G. canis体内持续稳定表达了绿色荧光蛋白基因;根据国外报到的蓝氏贾第虫的端粒重复序列设计了寡聚核苷酸探针[5′-TAGGG-3′]5与Bal31-EcoRI不同消化时间的G. canis基因组DNA进行杂交鉴定,确定了我国G. canis端粒重复序列为（TAGGG）n;在此基础上,采用改进的端粒重复序列扩增法（TRAP）首次对G. canis滋养体时期和包囊时期的端粒酶活性进行了检测,并在滋养体时期检测到很强的端粒酶活性,而包囊时期未检测到端粒酶活性;将两端携带反义GcTERT基因的微型核酶插入到犬贾第虫病毒载体pNEO/GDH/MCS中,构建两个核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体TRzS和TRzL,其体外转录体对GcTERT基因体外转录RNA切割效率分别为76.14%和83.42%,同时构建一个反义RNA载体,切割效率为31.56%;体内试验表明TRzS和TRzL对GcTERT基因表达抑制效果显着,最高可分别达84%和72%,端粒酶活性明显降低的同时,转染组虫体细胞数量显着低于正常对照组（P<0.01）。本试验成功的构建和应用了犬贾第虫病毒通用型载体,为进行贾第虫细胞生物学和分子生物学等方面的研究奠定了基础,同时对G. canis端粒酶活性的研究,也为将来以端粒酶作为化疗的靶位点,进行贾第虫病的预防和治疗提供新思路。
闫登科[5]（2007）在《c-raf在精原干细胞中的表达及作用的研究》文中进行了进一步梳理目的:完善大鼠精原干细胞的分离和体外培养技术;研究c-raf对精原干细胞体外培养的存活作用及机制。方法:非连续密度梯度离心及差速贴壁法分离精原干细胞;c-kit细胞免疫组织化学鉴定精原干细胞;基因测序和SeqMan、检验精原干细胞扩增DNA和c-raf的同源性;MTT比色法检测体外培养精原干细胞的存活及增殖情况,观察c-raf AON对精原干细胞体外培养存活的量效关系及c-raf AON对精原干细胞体外培养存活的时效关系;RT-PCR检测c-raf mRNA和caspase-3 mRNA的表达情况;TUNEL检测c-raf AON对精原干细胞凋亡的影响。结果:非连续密度梯度离心及差速贴壁法分离的精原干细胞,经台盼蓝染色计数其存活率分别为92.3%和91.5%;分离后的精原干细胞经c-kit鉴定其纯度为90.1%;精原干细胞在含10%NBS的DMEM中培养120h时增殖达高峰,在无10%NBS的DMEM中培养其存活率持续下降;精原干细胞扩增DNA和c-raf的同源性为98%;15μmol/L c-raf AON作用12h后精原干细胞存活率下降（P<0.05）,于18h后存活率持续下降（P<0.05）;与对照组相比c-raf AON组的c-raf mRNA水平明显下调（P<0.05）,而caspase-3 mRNA表达水平明显上调（P<0.05）;c-raf AON组凋亡指数（40.5%）明显大于对照组（30.2%）和错义组（29.4%）的凋亡指数（P<0.05）。结论:非连续密度梯度离心结合差速贴壁法是分离精原干细胞的有效方法;c-kit可作为鉴定精原干细胞的分子标志物;精原干细胞在含10%NBS的DMEM培养基中短期增殖;c-raf在九天的雄性SD大鼠的精原干细胞上表达;c-raf可能通过抑制凋亡而促进精原干细胞存活;c-raf可能通过下调capspase-3的表达而抑制精原干细胞凋亡。
高岭[6]（2007）在《丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡及端粒酶活性影响的体内外实验研究》文中提出喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，位居头颈部上皮源性恶性肿瘤的第2位，占全身肿瘤的1.2％～1.6％。近年来，世界多数地区喉癌的发病率及死亡率均有明显增高趋势，严重威胁着人类的健康与生命。虽然近几十年来传统的治疗方式如手术、放疗、化疗等已有很大改进，提高了患者的5年生存率，但手术治疗往往严重破坏患者的喉功能而致残；放疗仅对早期喉癌疗效好，对于大多数就诊时即为中、晚期或治疗后又出现复发、转移的患者往往效果不佳；而化疗又由于其严重的毒、副作用常使得患者不能耐受治疗，从而使这些治疗方式仍受到极大限制。因此，积极寻求治疗喉癌的新途径成为广大耳鼻咽喉科研究者面临的新课题。近年来，随着对肿瘤发生机理研究的不断深入，针对肿瘤发生机制多环节而起作用的新型抗肿瘤药物不断发展，新的抗癌药物不断应用于临床，但因存在不少急需解决的问题，其临床应用前景仍受到很大限制。而以在维持肿瘤的生长中起重要作用的端粒酶为靶点的端粒酶抑制剂和促进肿瘤细胞凋亡的凋亡诱导剂等，因其作用机制广泛，潜在的毒性反应较轻，已引起肿瘤研究者的广泛关注。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDIs）是近年来发现的一类新的靶向抗肿瘤药物，它主要通过调节组蛋白的乙酰化状态来改变染色质结构，进而引起相关基因转录，使肿瘤细胞的形态和功能发生改变，最终导致细胞增殖抑制、诱导分化、凋亡以及端粒酶活性抑制等一系列结果而达到治疗肿瘤的目的。丁酸钠（sodium butyrate，SB）是食物纤维在结肠内发酵过程中产生的一种无毒的四碳短链脂肪酸，是HDIs中的一类小分子化合物。体外实验证实，丁酸钠能抑制多种肿瘤细胞增殖，诱导细胞分化和凋亡，并且在诱导凋亡过程中，还能有效地抑制细胞端粒酶活性表达，具有广泛的抗肿瘤效应。进一步研究表明，丁酸钠对人前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌裸鼠移植瘤均有明显的生长抑制及诱导凋亡作用，且对机体无明显毒副作用。这些研究结果提示丁酸钠有望成为一种高效、低毒的凋亡诱导剂和端粒酶抑制剂在肿瘤治疗中发挥作用。目前对丁酸钠抗肿瘤作用的研究已涉及消化系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、神经系统及骨肿瘤等相关系统肿瘤，但丁酸钠对头颈部肿瘤影响的报道较少，有关其对喉癌作用的研究，迄今国内、外尚无文献报道。随着细胞培养方法的发展与普及，应用体外培养的癌细胞寻找新抗癌药物的研究已逐渐成为最重要的初筛手段之一。Hep-2为人喉上皮样癌细胞系，因其保留了大部分人喉鳞癌的生物学特性，已被广泛用于喉癌诊断、治疗的体外研究。为探讨丁酸钠在喉癌治疗中的作用，本研究在体外培养Hep-2细胞的基础上，采用免疫组化技术、流式细胞术及多种分子生物学技术观察了丁酸钠对Hep-2细胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影响并探讨其发生机制，为药物治疗喉癌拓展新的思路和方法。机体内部环境与体外环境有着很大的差异，体外实验结果并不能确切反映药物在体内对肿瘤的杀伤情况。为进一步明确丁酸钠经体内代谢后对肿瘤的影响，本研究在体外实验的基础上，以Hep-2细胞株建立人喉癌裸鼠皮下移植瘤模型，应用适当浓度的丁酸钠进行分组治疗实验，观察丁酸钠的抑瘤作用以及荷瘤裸鼠的毒性反应，并探讨其发生机制，为药物的开发、应用提供有价值的实验依据。本研究分为以下三部分。第一部分丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞增殖及凋亡的影响方法1．采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl terazolium，MTT）比色法测定经0.625、1.25、2.5、5、10mmol／L丁酸钠分别作用12、24、36、48、60、72h后Hep-2细胞增殖活性的改变，并于倒置显微镜下观察细胞形态变化。2．应用透射电镜观察经2.5mmol／L丁酸钠作用48h的细胞超微结构变化。3．采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucl-eotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling，TUNEL）技术分别检测经2.5mmol／L丁酸钠作用0（对照）、24、48、72h的细胞凋亡情况，统计细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）。4．分别提取经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h的细胞DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，显示凋亡细胞DNA片段化。5．采用流式细胞术分别检测经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h的细胞凋亡率及细胞周期分布。6．分别制备经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h的细胞爬片，采用免疫细胞化学技术检测细胞Ki-67抗原和Survivin蛋白表达情况。7．统计学处理：应用SPSS13.0统计软件作统计学处理。MTT法采用两因素方差分析加LSD法两两比较，TUNEL法、流式细胞术和免疫细胞化学检测均采用单因素方差分析加LSD法两两比较。以α=0.05作为检验水准。结果1．丁酸钠作用后细胞的增殖活性受到明显抑制，不同浓度组间（P＜0.01）、不同时间组间（P＜0.05）均存在显着性差异。10mmol／L丁酸钠作用72h后细胞生长抑制率达70.43％。丁酸钠作用后细胞的形态发生改变，且随药物浓度增加、作用时间延长而更显着。2．2.5mmol／L丁酸钠作用48h，透射电镜下显示核染色质浓缩、边集及凋亡小体等典型的凋亡细胞超微结构改变。3．2.5mmol／L丁酸钠作用48、72h，琼脂糖凝胶电泳均可见清晰的DNA梯状条带。4．TUNEL法显示，2.5mmol／L丁酸钠作用24、48、72h后细胞AI由作用前的2.27±1.18分别增加至13.63±1.90、22.25±3.56和33.50±2.75，不同时间组间差异有显着性（P＜0.01）。5．流式细胞术显示，随丁酸钠作用时间延长，细胞凋亡率逐渐增加（不同时间组间有显着性差异，P＜0.01），G0／G1期细胞比例逐渐升高（P＜0.01），S期细胞比例逐渐降低（P＜0.01），而G2／M期细胞比例无明显变化（P＞0.05）；细胞增殖指数（proliferation index，PI）降低趋势明显（P＜0.01）。6．丁酸钠作用后，细胞Ki-67抗原和Survivin蛋白表达均受到抑制，随丁酸钠作用时间延长，Ki-67和Survivin阳性细胞平均光密度（mean optical density，MOD）值均逐渐降低，不同时间组间均有显着性差异（P＜0.01）。第二部分丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞端粒酶活性及端粒酶三组分mRNA表达的影响方法1．采用端粒重复序列扩增（telomeric repeat amplification protocal，TRAP）-银染法检测经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h的Hep-2细胞端粒酶活性，并应用凝胶图象分析系统对检测结果进行半定量分析，研究丁酸钠对Hep-2细胞端粒酶活性的影响。2．采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术检测经2.5mmol／L丁酸钠作用0、24、48、72h后细胞端粒酶三组分的mRNA表达情况，并对检测结果进行半定量分析，研究丁酸钠对Hep-2细胞端粒酶三组分表达的影响，以期了解丁酸钠影响细胞端粒酶活性的作用部位。3．统计学处理：应用SPSS13.0统计软件作统计学处理。采用单因素方差分析加LSD法两两比较。以α=0.05作为检验水准。结果1．丁酸钠作用后Hep-2细胞端粒酶活性降低。经2.5mmol／L丁酸钠作用24、48、72h后细胞端粒酶活性分别比药物作用前下降了25.36％、61.11％、86.68％，不同时间组间有显着性差异（P＜0.01）。2．经2.5mmol／L丁酸钠作用24、48、72h后细胞端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）mRNA表达水平分别比药物作用前下降了20.92％、55.09％、75.80％，不同时间组间有显着性差异（P＜0.01）；而端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）和端粒酶相关蛋白（human telomerase associated protein 1，hTP1）mRNA表达水平在各时间点无明显改变（P＞0.05）。第三部分丁酸钠对人喉癌裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究方法1．选用4-6w龄BALB／C-nu／nu雌性裸小鼠12只，于裸鼠右腋部皮下接种Hep-2细胞，建立人喉癌裸鼠移植瘤模型。成瘤后随机分为对照组和实验组，每组6只，治疗组每d向肿瘤组织局部注射丁酸钠，剂量为2.2mg／g体质量；对照组注射同体积PBS（0.01M，pH7.4）。共治疗4w。2．每d观察裸鼠的精神、饮食及活动状况。每w测量瘤体大小及裸鼠体质量，绘制肿瘤生长变化曲线，进行药物毒性评价。治疗结束时处死小鼠，剥除肿瘤称重，计算抑瘤率。光学显微镜下观察肿瘤及心、肝、肺、脾、肾等重要脏器变化。3．应用透射电镜观察移植瘤超微结构变化。4．采用TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况，统计细胞凋亡指数。5．采用免疫组化技术检测移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白表达情况，并对染色结果进行定量分析。6．采用TRAP-银染法检测移植瘤端粒酶活性，并对检测结果进行半定量分析。7．采用RT-PCR技术检测移植瘤端粒酶三组分mRNA表达情况，并对检测结果进行半定量分析。8．统计学处理：应用SPSS13.0统计软件作统计学处理。采用独立样本的t检验。以α=0.05作为检验水准。结果1．与对照组相比，实验组肿瘤生长较慢，肿瘤体积小于对照组，且随治疗时间延长，这种抑制效果更加明显。治疗结束时，两组瘤体积、瘤质量均存在显着性差异（P＜0.05），体积抑瘤率和质量抑瘤率分别达58.81％和60.33％。2．光镜下，实验组肿瘤组织内坏死面积明显大于对照组，细胞异形性较对照组小，分化程度稍高于对照组，可见核固缩等凋亡表现。3．透射电镜下，实验组可见染色质浓缩、边集等典型的凋亡细胞超微结构改变。4．与对照组相比，实验组肿瘤组织中凋亡细胞明显增多，两组AI分别为：3.10±0.37、29.70±1.84，组间有显着性差异（P＜0.01）。5．实验组Ki-67抗原和Survivin蛋白表达均低于对照组。两组Ki-67阳性细胞MOD值分别为：0.278±0.012、0.186±0.100；两组Survivin阳性细胞MOD值分别为：0.149±0.007、0.098±0.009，组间均有显着性差异（P＜0.01）。6．实验组端粒酶活性明显低于对照组。两组端粒酶活性灰度值分别为：3858.00±412.67、2018.83±269.84，组间有显着性差异（P＜0.01）。7．与对照组比较，实验组hTERT mRNA表达明显减弱，两组hTERT mRNA表达相对光密度（relative optical density，ROD）值分别为：0.60±0.05、0.26±0.03，组间有显着性差异（P＜0.01）；而两组hTR mRNA和hTP1 mRNA表达水平无显着差异（P值均＞0.05）。8．治疗过程中，裸鼠未见明显不良反应，各组末体质量（final body weight，FBW）／初体质量（initial body weight，IBW）均＞0.8，无毒性反应。各组心、肝、肺、脾、肾等重要脏器均无肿瘤转移及器质性改变。结论本文采用免疫组化技术、流式细胞术以及多种分子生物学技术首次检测了丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞及人喉癌裸鼠移植瘤的增殖、凋亡、细胞周期、Ki-67抗原、Survivin蛋白表达、端粒酶活性及端粒酶三组分mRNA表达的影响，得出如下结论：1．丁酸钠对Hep-2细胞具有增殖抑制作用，这种抑制作用呈时间剂量依赖性。2．丁酸钠对Hep-2细胞具有诱导凋亡作用，这种作用存在时间依赖性。3．丁酸钠能下调Hep-2细胞Ki-67抗原表达，且呈时间依赖性。此作用可能是其抑制细胞增殖的机制之一。4．丁酸钠能下调Hep-2细胞Survivin蛋白表达，且呈时间依赖性。其对细胞的诱导凋亡作用可能是通过下调Survivin表达而实现。5．丁酸钠参与Hep-2细胞周期调控，使细胞阻滞于G0／G1期。丁酸钠对细胞的增殖抑制、诱导凋亡及端粒酶抑制作用可能均与其G0／G1期阻滞有关。6．丁酸钠能抑制Hep-2细胞hTERT mRNA表达，并下调其端粒酶活性，二者均呈时间依赖性；而对hTR mRNA和hTP1 mRNA表达无影响。提示丁酸钠对Hep-2细胞端粒酶活性的抑制作用可能是通过下调hTERT基因表达而实现。7．成功构建了人喉癌Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型，证实丁酸钠能抑制喉癌移植瘤生长，且对机体无明显毒、副作用。8．与体外实验结果相似，丁酸钠能下调喉癌裸鼠移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白表达；并诱导细胞凋亡；同时下调hTERT mRNA表达而抑制端粒酶活性。9．本研究首次从体内外证实了丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞及人喉癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用，其机制可能与阻滞细胞周期于G0／G1期、下调Ki-67抗原及Survivin蛋白表达、诱导细胞凋亡、下调hTERT mRNA表达而抑制端粒酶活性、进而抑制细胞增殖有关。为丁酸钠的临床研究提供了有价值的实验资料。
高晓东[7]（2007）在《端粒酶hTERT基因反义核酸对TNF-α诱导的膀胱癌细胞（T24）凋亡的影响》文中研究说明目的端粒是真核细胞染色体末端特殊的DNA-蛋白质结构，人类端粒含有TAGGG重复序列，具有重要的生物学功能。端粒可稳定染色体，防止染色体末端融合，保护染色体结构基因。有关文献报道，85％-90％以上的肿瘤细胞表达端粒酶活性。因而抑制端粒酶活性具有潜在的肿瘤防治的前景。人类端粒酶主要由三部分组成：人类端粒酶RNA成分（hTR），人类端粒酶相关蛋白（TEP1），人类端粒酶反转录酶催化亚单位（hTERT）。hTR的功能是为染色体端粒延伸起模板作用，人类端粒酶反转录酶催化亚单位hTERT是端粒酶活性表达的关键组分和限速因子。hTERT基因mRNA在膀胱癌细胞中同时表现出高水平的表达，与端粒酶活性的表达一致。端粒酶RNA的反义核酸可以抑制端粒酶活性和肿瘤细胞的生长。本实验探讨hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN）对膀胱癌细胞T24端粒酶活性抑制作用及hTERT基因的反义寡核苷酸对细胞因子TNF-α诱导膀胱癌T24细胞凋亡的影响。方法采用TRAP-银染法及TRAP-PCR-ELISA法检测膀胱癌细胞的端粒酶活性；采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化；采用台盼蓝排斥试验观察hTERT AS PS-ODN与TNF-α共同作用对膀胱癌细胞T24生长活力的影响；倒置显微镜观察凋亡细胞的形态学变化；通过流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率。结果hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN）作用于膀胱癌细胞T24 48h，其端粒酶活性下降，作用72h，其端粒酶活性受到抑制，与正义寡核苷酸组，空白对照组相比有显着性差异（P＜0.05）；hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸（AS PS-ODN）作用于膀胱癌细胞T24后，hTERT基因mRNA表达水平及蛋白表达水平均明显下降，与正义寡核苷酸组，空白对照组相比有显着性差异（P＜0.05）；hTERT AS PS-ODN作用于膀胱癌细胞T24后加入TNF-α作用48小时，膀胱癌细胞T24的抑制率与对照组，S PS-ODN组，AS PS-ODN组，TNF-α组及S PS-ODN+TNF-α组相比有统计学差异（P＜0.01）；hTERT AS PS-ODN作用于膀胱癌细胞T24后加入TNF-α作用48小时，细胞出现典型的凋亡形态变化：hTERT AS PS-ODN作用于膀胱癌细胞T24后加入TNF-α作48小时，凋亡细胞的百分率分别同对照组，S PS-ODN组，AS PS-ODN组，TNF-α组及S PS-ODN+TNF-α组相比有显着差异（P＜0.05）。结论通过hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸（ASPS-ODN）能特异性抑制hTERT基因的表达降低膀胱癌细胞T24端粒酶活性：hTERT基因反义核酸对TNF-α诱导膀胱癌细胞T24凋亡有增敏作用。
曹波[8]（2006）在《嘉陵江重庆主城区水源水中有机污染物雄性生殖毒性的研究》文中研究表明水体有机物污染严重威胁人们饮用水安全和环境保护,地面水被各种各样的有机物污染,如多环芳烃、多氯联苯和农药等。我国经济快速增长工业化发展以及城市化的进程加剧了我国江河湖泊的水污染,目前水环境污染状况是主要河流有机物污染严重,流经城市河段普遍受到污染。我国规定的优先控制污染物68种中有59种是有机污染物,从对人体健康的危害和生态平衡的破坏性来看,有毒有机污染物在环境中往往具有长效性,不易降解,可通过生物链蓄集,且对环境的破坏和人体健康的危害多具不可逆性,对人类健康构成严重威胁。我国松花江、珠江、黄浦江和太湖等主要河流与湖泊均检测到了多种有机污染物,其中包括了多种优先控制污染物;嘉陵江位于三峡水库的上游,是重庆居民主要饮用水水源,同时也是重庆大量工业和生活污水的最后排放口,三峡成库后由于流速减慢,水体自净能力降低,水体有机物污染可能会加重。已有大量研究指出环境污染是引起人类男性生殖能力下降的重要原因,有机污染物是可能的因素,例如增塑剂污染、农药的使用等。其中邻苯二甲酸酯类物质是典型的睾丸毒剂,可引起睾丸萎缩,精子数目与活力下降,造成动物的不育。外来化学物的睾丸毒性往往表现为对生精过程的破坏,生精过程受许多因素影响,细胞凋亡是外来化学物质睾丸损伤的主要分子机理,有研究认为生精细胞凋亡的发生可能是由于生精细胞促分化因子受到抑制,或者促生精细胞凋亡因子受到激发引起的,两种因子在正常生理过程中保持均衡,维持着正常生精过程的平衡。其中fas与其受体结合启动生精细胞凋亡,而干细胞生长因子（stem cell factor, scf）促进生精细胞分化发育成为成熟精子,同时具有抑制生精细胞凋亡的作用。有人认为生精细胞与精子细胞凋亡是外来化学物睾丸损伤的最终反应,外来化合物有可能通过影响scf/c-kit系统与fas/fasL系统平衡而造成生精过程损伤。大量实验室证据表明在较高剂量条件下有机污染物可对雄性睾丸造成损害,但实际暴露过程中机体是与多种化学物接触。目前对于环境中化学物混合作用的具体机制缺乏深入的研究,混合物作用机制,一般认为有相乘作用,拮抗作用与相加作用。研究混合物作用的模式主要有两类,一类是人为采用不同的化合物组合,观察混合物对机体的效应,根据效应的强度判断是否有联合作用;另一种是直接观察自然界有机提取物,多以水中有机提取物作为受试物,观察其对机体的效应。我室前期研究发现嘉陵江水中可检出邻苯二甲酸酯类和多环芳烃等有机污染物,并通过体内外实验证实水中有机提取物具有类雌激素类活性。本研究中我们采用XAD-2树脂提取嘉陵江重庆市段某自来水厂取水点水样,提取水中有机污染物,对有机污染物进行GC/MS分析,采用经济合作与发展组织动物发育/生殖筛选实验程序421,评价水中有机污染物对实验大鼠的雄性生殖毒性,确定生殖毒作用的靶器官,并对毒作用的分子机制进行研究。本研究分为以下三个部分:一、采用固相萃取技术提取水中有机污染物,并进行气相色谱-质谱分析,初步确定水源水中有机污染物种类。二、采用经济合作与发展组织生殖/发育毒性筛选试验,用水源水中有机提取物染毒实验大鼠,进行生殖毒性评价,确定生殖毒性的靶器官。三、根据前面实验结果确定生殖靶器官或靶作用位点,重点对其诱导生精细胞凋亡的分子机制进行研究。主要研究结果与结论一、于2004年7月（丰水期）采集嘉陵江重庆市主城区段水样,应用GCMS分析技术,共定性出有机污染物8种。有2种邻苯二甲酸酯类物质,6种多环芳烃类物质。在已检出的有机污染物中,有2种属于我国水环境优先控制污染物,分别是邻苯二甲酸二正辛酯、荧葸,说明嘉陵江重庆市主城区段水源水中存在有机物污染,本次实验结果与本室之前的结果相近。二、本研究中动物染毒剂量分别为2L/kg.bw/day,16L/kg.bw/day,80L/kg.bw/day,玉米油作为溶剂对照。实验期间染毒动物体重无明显改变,孕鼠在怀孕第三周食物消耗量明显下降,高剂量组明显低于对照组。睾丸、卵巢脏器系数比值各剂量组与对照组相比无明显改变,高剂量组附睾脏器系数比值明显高于对照组。低剂量组可观察到睾丸间质细胞增生,中高剂量组可观察到间质细胞减少。各个剂量组均可观察到生精上皮空泡变性,初级精母细胞减少。附睾尾精子计数与附睾重量比值,随染毒剂量增加而下降,其中高剂量组明显低于对照组,高剂量组精子头部畸形率明显高于对照组。低剂量组雄性大鼠血清睾酮含量明显高于高剂量组,提示水中有机提取物对染毒动物睾酮分泌有影响。中高剂量组雄性大鼠血清卵泡刺激素含量明显低于对照组。染毒动物交配率,受孕率各染毒组间无明显差异,仔鼠个数体重各染毒组间均无明显差异,高剂量组活产指数明显低于对照组,染毒组观察到孕鼠分娩时有死胎出现以及部分仔鼠出生后被母鼠咬死,提示水中有机提取物对仔鼠的发育以及孕鼠的神经行为有一定影响。上述资料提示本项目条件下水中有机提取物对人群的生殖健康有潜在的危害,水中有机污染物引起的生殖损伤应引起高度重视。三、已有研究证实环境污染物可以诱导睾丸生精细胞凋亡增加。我们的研究发现实验大鼠精原细胞有凋亡发生,但染毒组与对照组相比无明显差异（P>0.05）,同时观察到精子细胞凋亡发生,高剂量组明显高于对照组（P<0.05）。Fas及Fas配体介导细胞凋亡是环境污染物睾丸毒性的重要发生机制,我们发现水中有机污染物可引起高剂量组精原细胞与减数分裂前生精细胞Fas与FasL蛋白明显增加,但是精原细胞与生精细胞凋亡并未增加,说明在本研究条件下,Fas与FasL表达增加并不引起细胞凋亡增加。我们未观察到精子细胞有Fas与FasL蛋白表达,精子细胞凋亡的机制可能有其它的原因,有待进一步研究。c-kit蛋白是生精过程中生精细胞发育分化的重要指标,主要在精原细胞上表达。我们的结果显示,高剂量组c-kit表达阳性细胞增加,提示精原细胞明显增加,生精过程受到阻滞。综上所述,嘉陵江重庆主城区段水中有机提取物具有睾丸毒性,对仔鼠发育可能有不利影响,睾丸生精细胞是可能的靶作用位点。水中有机物的睾丸毒性分子机制需要进一步采用体外实验深入研究,也需要获得人群流行病学资料阐明人群生殖损伤与水中有机污染物之间的关系。为了早期发现和诊断人群生殖损伤,还应寻找敏感的生物标志物。
王白燕[9]（2006）在《纳米载体介导的hTERT反义寡核苷酸对EC9706细胞的抑制作用研究》文中研究表明食管癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，治疗效果尚不理想，随着分子生物技术的发展，找到一种新的治疗食管癌的方法成为可能。 端粒（telomere）是位于真核细胞线性染色体末端，由高度保守的简单重复的DNA序列和蛋白质组成的特殊结构，对于保护染色体、防止染色体融合、降解是非常重要的。端粒酶（telomerase）是一种核蛋白，由3种亚单位成分：即人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）、端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和端粒酶相关蛋白Ⅰ（telomerase associated protein，TPI）组成，近年来大量研究发现端粒酶是细胞永生化和肿瘤发生必不可少的，是人体内最具肿瘤特异性和高表达的生物学标志。其中hTERT是端粒酶活性的表达亚基，它几乎存在于所有的恶性肿瘤中，hTERT的表达与端粒酶活性相一致，是端粒酶活性的决定性因素。因此，hTERT成为靶向端粒酶抗癌策略的理想靶点。据报道，91％的食管癌组织中可检测到端粒酶活性及其逆转录酶的表达。 反义核酸技术是一门全新的基因工程技术，近年来发展迅速。利用反义核酸技术，人工合成靶向hTERT的反义寡核苷酸（Antisense oligodeoxynucleotides，ASODN），抑制hTERT mRNA表达和端粒酶活性，诱导肿瘤细胞凋亡，是目前进行肿瘤基因治疗的方向之一。未经修饰的寡核苷酸（Oligonucleotides，ODNs）易被胞内核酸酶降解，作用效果较差。研究者们利用各种不同的病毒或非病毒基因
杨俊玲[10]（2006）在《原癌基因c-src在精原干细胞中表达及作用的研究》文中研究说明目的：探索及完善精原干细胞的分离、鉴定和体外培养技术；研究原癌基因c-src对体外培养的精原干细胞存活及与凋亡密切相关的caspase-3表达的影响。 方法：非连续密度梯度离心及差速贴壁法分离精原干细胞；c-Kit和TERT细胞免疫组织化学鉴定精原干细胞；用MTT比色法检测精原干细胞的存活及增殖情况，观察AS-src对精原干细胞存活的剂量性影响及AS-src对精原干细胞存活的时间性影响；用RT-PCR检测c-src mRNA和caspase-3 mRNA的表达情况。 结果：非连续密度梯度及差速贴壁法分离精原干细胞，台盼蓝染色计数细胞存活率分别为92.5％和92.1％；分离后所获取的细胞c-Kit和TERT免疫组织化学阳性细胞数平均值分别为90.8±1.0％和91.7±1.2％；精原干细胞在含10％NBS的DMEM中培养96h时增殖达高峰；10μmol／l AS-src作用12h后精原干细胞存活率下降（P＜0.05），于24h，48h，72h持续下降（P＜0.01）；与S-src和空白对照组相比，AS-src组c-src mRNA水平明显下调，而caspase-3 mRNA表达水平明显上调。 结论：非连续密度梯度结合差速贴壁法是分离精原干细胞的有效方法；以c-Kit及TERT作为marker分子通过免疫组织化学检测为精原干细胞的鉴定提供较为充分的依据；精原干细胞可以在含10％NBS的DMEM培养基中短期增殖；c-Src可以促进精原干细胞的存活；c-Src可能通过PI-3K／PKB途径，导致Caspase-3磷酸化从而抑制精原干细胞的凋亡。
二、反义核酸对体外培养A型精原细胞端粒酶活性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反义核酸对体外培养A型精原细胞端粒酶活性的影响（论文提纲范文）
（1）维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 禽类原始生殖细胞的研究进展 |
| 1.1 干细胞的起源 |
| 1.2 干细胞的生物学特性 |
| 1.3 禽类PGC的特性 |
| 1.4 PGC的起源 |
| 1.5 禽类PGC的迁移 |
| 1.6 原始生殖细胞的应用 |
| 1.6.1 PGC作为研究胚胎发育的体外模型 |
| 1.6.2 PGC在种质资源保护中的应用 |
| 1.6.3 转基因家禽的制备 |
| 1.6.4 药物生产 |
| 1.7 小结 |
| 第二节 细胞外基质对PGC迁移的影响及调控 |
| 2.1 粘附蛋白的结构和影响因素 |
| 2.2 E-钙粘蛋白的结构和功能调节 |
| 2.2.1 E-钙粘蛋白生物学特性 |
| 2.2.2 E-钙粘蛋白/连锁蛋白复合体的生物学特性 |
| 2.2.3 E-钙粘蛋白的调控 |
| 2.3 粘附分子在细胞信号传导中的作用 |
| 2.4 粘附分子在生殖细胞发育中的作用 |
| 2.5 ECM在PGC迁移中的作用 |
| 第三节 禽类原始生殖细胞增殖的调控 |
| 3.1 PGC的增殖 |
| 3.2 生长因子对PGC增殖的调控 |
| 3.2.1 白血病抑制因子 |
| 3.2.2 干细胞生长因子 |
| 3.2.3 碱性成纤维生长因子 |
| 3.2.4 肿瘤坏死因子TNF-α和cAMP |
| 3.2.5 维甲酸(RA) |
| 3.2.6 其它细胞因子 |
| 3.2.7 负调控因子 |
| 3.3 细胞信号通路对PGC增殖的调控 |
| 3.3.1 LIF信号通路 |
| 3.3.2 BMP信号通路 |
| 3.3.3 Wnt途径 |
| 3.3.4 Oct4 |
| 3.3.5 Nanog |
| 3.3.6 Sox2 |
| 3.3.7 NF-κB信号 |
| 3.4 细胞周期相关基因控制PGC的增殖 |
| 第四节 禽类原始生殖细胞分化的调控 |
| 4.1 禽类性腺发育 |
| 4.1.1 胚胎性腺的基本过程 |
| 4.1.2 PGC与性腺发生和发育的关系 |
| 4.2 禽类性腺发育的调控及其机理 |
| 4.2.1 减数分裂 |
| 4.2.2 维甲酸在PGC分化中的调控 |
| 4.2.3 Nanos2和PGC分化 |
| 4.2.4 FGF9在PGC分化中的调控 |
| 4.3 卵母细胞发生的分子调控 |
| 4.3.1 卵母细胞的发生 |
| 4.3.2 禽类卵巢的发育 |
| 第五节 利用转基因技术研究生殖细胞发育的调控机理 |
| 5.1 转基因鸡的研究现状 |
| 5.2 RNA干扰的研究进展 |
| 5.2.1 小RNAs的分类 |
| 5.2.2 RNAi作用机制 |
| 5.2.3 RNAi作用的特点 |
| 5.2.4 siRNA与shRNA的比较 |
| 5.2.5 RNA干扰的应用 |
| 5.3 转基因鸡的制备方法 |
| 5.3.1 慢病毒感染法 |
| 5.3.2 原始生殖细胞介导法 |
| 5.3.3 精子载体法 |
| 5.3.4 显微注射法 |
| 5.4 RNAi转基因动物的研究 |
| 5.4.1 RNAi转基因动物的研究现状 |
| 5.4.2 RNAi制备转基因动物的优势 |
| 5.4.3 RNAi转基因动物存在的问题与应用前景 |
| 第六节 本研究的目的和内容 |
| 6.1 本研究的目的和意义 |
| 6.2 研究目标及内容 |
| 第二章 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞粘附调控机理的研究 |
| 第一节 鸡胚原始生殖细胞体外培养模型的建立及优化 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 饲养层的制备 |
| 1.2.5 生殖嵴和性腺PGC的分离、纯化和培养 |
| 1.2.6 血液中PGC的分离、纯化和培养 |
| 1.2.7 鸡胚PGC的染色鉴定 |
| 1.2.8 RT-PCR检测PGC特异基因的表达 |
| 1.2.9 性腺切片免疫组织化学染色 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 生殖嵴、性腺PGC体外分离培养及鉴定 |
| 1.3.2 血液PGC体外分离培养及鉴定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 PGC的分离及培养 |
| 1.4.2 鸡胚PGC的培养条件 |
| 1.4.3 鸡胚PGC的鉴定 |
| 1.5 小结 |
| 第二节 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞粘附的影响及其机理的研究 |
| 摘要 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 主要试剂及配制 |
| 2.2.4 PGC培养及药物处理 |
| 2.2.5 PGC集落粘附性的检测 |
| 2.2.6 SSEA-1和β-catenin双标免疫荧光染色 |
| 2.2.7 细胞周期流式分析 |
| 2.2.8 RNA提取和常规RT-PCR |
| 2.2.9 Real-Time RT-PCR |
| 2.2.10 蛋白质的提取和Western Blot分析 |
| 2.2.11 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 RARs和RA合成酶在PGC及性腺中的表达情况 |
| 2.3.2 RA对PGC粘附性的作用 |
| 2.3.3 PKC在RA对增强PGC问粘附性中的介导作用 |
| 2.3.4 β-catenin在RA增强PGC粘附性中的介导作用 |
| 2.3.5 RA在体外对PGC增殖的影响 |
| 2.3.6 PKC在RA对PGC促增殖中的作用 |
| 2.3.7 RA对细胞周期蛋白mRNA表达水平的影响 |
| 2.3.8 RA在体外对PGC细胞周期的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞增殖调控的研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 PGC培养及药物处理 |
| 1.2.5 BrdU掺入鉴定PGC的增殖 |
| 1.2.6 细胞周期流式分析 |
| 1.2.7 RNA提取和常规RT-PCR |
| 1.2.8 Real-Time RT-PCR |
| 1.2.9 蛋白质的提取和Western Blot分析 |
| 1.2.10 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 RA在体外对PGC增殖的影响 |
| 1.3.2 PI3K/Akt在RA对PGC促增殖中的介导作用 |
| 1.3.3 NF-κB在RA对PGC促增殖中的介导作用 |
| 1.3.4 RA及抑制剂对细胞周期蛋白mRNA表达水平的影响 |
| 1.3.5 RA及抑制剂对PGC细胞周期的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第四章 维甲酸对鸡胚生殖细胞减数分裂调控机理的研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 样品采集 |
| 1.2.5 鸡胚性腺组织培养和处理 |
| 1.2.6 鸡胚卵巢生殖细胞的分离培养和处理 |
| 1.2.7 Raldh2 siRNA转染 |
| 1.2.8 鸡胚性腺组织的冰冻切片 |
| 1.2.9 鸡胚性腺组织石蜡切片制作 |
| 1.2.10 胚胎期卵巢形态学观察 |
| 1.2.11 性腺冰冻切片免疫荧光染色 |
| 1.2.12 RNA提取和Real-Time RT-PCR |
| 1.2.13 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 胚胎期鸡胚卵巢发育的形态学特征 |
| 1.3.2 胚胎期鸡卵巢减数分裂阶段的变化 |
| 1.3.3 减数分裂相关基因表达的在不同时期鸡胚性腺中的表达情况 |
| 1.3.4 RA合成和降解酶在不同时期鸡胚性腺中的表达情况 |
| 1.3.5 AO染色观察体外培养卵巢的内部结构 |
| 1.3.6 RA在体外对减数分裂的影响 |
| 1.3.7 Raldh2 shRNA干扰 |
| 1.3.8 Raldh2基因敲减对减数分裂的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第五章 利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 玻璃针的制备 |
| 1.2.5 siRNA的设计 |
| 1.2.6 病毒滴度的复核(有限稀释法测定) |
| 1.2.7 靶细胞感染预实验 |
| 1.2.8 293FT细胞的培养 |
| 1.2.9 病毒的生产 |
| 1.2.10 病毒滴度分析 |
| 1.2.11 鸡胚病毒注射 |
| 1.2.12 PCR检测目的基因的表达 |
| 1.2.13 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 慢病毒滴度测定结果 |
| 1.3.2 不同转染时间绿色荧光蛋白的表达分析 |
| 1.3.3 shRNA高效抑制Raldh2复制靶位点的筛选 |
| 1.3.4 转基因个体的PCR分析 |
| 1.3.5 转基因鸡胚15.5天卵巢形态 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第六章 结论和创新点 |
| 1.1 结论 |
| 1.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表文章 |
（2）端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 端粒DNA 长度及端粒酶hTERT 在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 食管癌中的端粒酶活性和PinX1 的表达及其生物学意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基因转染PinX1 对食管癌Eca109 细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 端粒、端粒酶和PinX1 与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）c-jun对仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌影响的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 原癌基因的研究概况 |
| 1.1.1 原癌基因(proto-onco gene) |
| 1.1.2 即刻早期基因(immediate-early gene,IEG) |
| 1.1.3 编码核内蛋白的原癌基因 |
| 1.1.4 转录因子(transcription factors)与细胞基因调控 |
| 1.1.5 碱性亮氨酸拉链bZIP(basic leucine zipper)家族中的转录因子AP-1(activated protein 1)家族 |
| 1.2 原癌基因c-jun的生物学特性 |
| 1.2.1 原癌基因c-jun的结构与功能 |
| 1.2.2 c-jun表达的活性调控 |
| 1.2.3 c-Jun蛋白的磷酸化 |
| 1.2.4 Jun-Fos异源二聚体的形成 |
| 1.2.5 Jun/Fos与转录因子AP-1 |
| 1.2.6 c-jun家族在细胞致癌中的作用 |
| 1.3 原癌基因c-jun与细胞之间的关系 |
| 1.3.1 原癌基因c-jun与细胞增殖和转化 |
| 1.3.2 原癌基因c-jun与细胞分化 |
| 1.3.3 原癌基因c-jun与细胞凋亡 |
| 1.4 原癌基因c-jun在不同组织器官中的表达及与疾病的关系 |
| 1.4.1 原癌基因c-jun与中枢神经系统 |
| 1.4.2 原癌基因c-jun与心血管系统 |
| 1.4.3 原癌基因c-jun与炎症性疾病 |
| 1.4.4 原癌基因c-jun与肿瘤和癌症 |
| 1.5 原癌基因c-jun与生殖的关系 |
| 1.5.1 c-jun对雄性生殖的影响 |
| 1.5.2 c-jun对雌性生殖的影响 |
| 1.6 一些外部因素影响后的原癌基因c-jun变化 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的背景和意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.2.1 c-jun在荣昌仔猪睾丸组织中的表达及与睾酮分泌的关系 |
| 2.2.2 c-jun对离体培养仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌的影响 |
| 2.2.3 c-jun调节hCG诱导荣昌仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌的作用机制 |
| 2.3 研究的技术路线 |
| 第三章 c-jun在仔猪睾丸组织中的表达及与睾酮分泌的关系 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 数据处理及统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同日龄荣昌仔猪睾丸组织结构的变化 |
| 3.2.2 总RNA的纯度和完整性鉴定 |
| 3.2.3 扩增曲线与溶解曲线 |
| 3.2.4 比较目的基因和参照基因的扩增效率 |
| 3.2.5 仔猪睾丸组织中c-jun mRNA的表达分析 |
| 3.2.6 不同时期荣昌仔猪血浆睾酮水平 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 c-jun对体外培养仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 试验动物 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.1.5 检测方法 |
| 4.1.6 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 体外培养仔猪睾丸间质细胞的功能 |
| 4.2.2 不同浓度c-jun ASODNs对仔猪间质细胞增殖的影响 |
| 4.2.3 不同浓度c-jun ASODNs对仔猪间质细胞凋亡的影响 |
| 4.2.4 不同浓度c-jun ASODNs对基础状态下仔猪间质细胞睾酮分泌的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 体外培养的间质细胞的反应性 |
| 4.3.2 鉴定间质细胞的标志—3β-HSD |
| 4.3.3 c-jun对仔猪睾丸间质细胞增殖的影响 |
| 4.3.4 c-jun对仔猪睾丸问质细胞凋亡的影响 |
| 4.3.5 c-jun对仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌的影响 |
| 第五章 c-jun调节hCG诱导仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌的作用机制 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 试验动物 |
| 5.1.4 试验方法 |
| 5.1.5 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 不同浓度c-jun ASODNs对hCG诱导仔猪睾丸间质细胞的睾酮分泌的影响 |
| 5.2.2 cAMP对c-jun调节睾丸间质细胞分泌睾酮的影响 |
| 5.2.3 维拉帕米对c-jun调节hCG诱导睾丸间质细胞分泌睾酮的影响 |
| 5.3 讨论与结论 |
| 第六章 综合与小结 |
| 论文的创新点 |
| 主要参考文献 |
| 缩略词表 |
| 博士在校期间发表的论文及参加的课题情况 |
| 致谢 |
（4）病毒载体介导的微型核酶对犬贾第虫端粒酶活性的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 贾第虫病毒及载体研究进展 |
| 1 贾第虫病毒的研究进展 |
| 2 贾第虫病毒载体的研究进展 |
| 第二章 端粒、端粒酶的研究进展及与寄生虫的关系 |
| 1 端粒的结构与功能 |
| 2 端粒酶的研究进展 |
| 3 寄生虫端粒酶的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犬贾第虫病毒通用型转染载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 犬贾第虫端粒重复序列的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 犬贾第虫端粒酶活性的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 犬贾第虫病毒转染载体介导的微型核酶对 GcTERT 基因体外转录体切割效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 犬贾第虫病毒转染载体介导的微型核酶对端粒酶活性抑制效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 附录 蓝氏贾第虫和犬贾第虫端粒酶逆转录酶基因(TERT)序列比较 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
（5）c-raf在精原干细胞中的表达及作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 动物 |
| 2.1.2 试剂及其配制方法 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SSCs 的分离、纯化、鉴定及体外培养 |
| 2.2.2 c-raf 扩增DNA 序列测定与分析 |
| 2.2.3 c-raf AON 对SSCs 存活、增殖的检测 |
| 2.2.4 c-raf 及caspase-3 的mRNA 表达的测定 |
| 2.2.5 SSCs 凋亡的检测 |
| 2.3 统计处理 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 SSCs 的分离、纯化 |
| 3.2 SSCs 的鉴定及纯度 |
| 3.3 SSCs 的体外培养 |
| 3.4 SSCs 扩增DNA 与c-raf 的同源性 |
| 3.5 c-raf 对SSCs 存活及增殖的作用 |
| 3.6 c-raf mRNA、caspase-3mRNA 的表达 |
| 3.7 c-raf 在SSCs 凋亡中的作用 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 SSCs 的分离、纯化、鉴定及体外培养 |
| 4.2 c-raf 基因在SSCs 上的表达 |
| 4.3 c-raf 对SSCs 存活的影响 |
| 4.4 c-raf 与SSCs 凋亡的关系 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
（6）丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡及端粒酶活性影响的体内外实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文部分 丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡及端粒酶活性影响的体内外实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞增殖及凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第一部分照片 |
| 第二部分 丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞端粒酶活性及端粒酶三组分mRNA表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分照片 |
| 第三部分 丁酸钠对人喉癌裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分照片 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述部分 组蛋白乙酰化/去乙酰化与肿瘤的关系及组蛋白去乙酰化酶抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词索引 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）端粒酶hTERT基因反义核酸对TNF-α诱导的膀胱癌细胞（T24）凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 一. 前言 |
| 二. 研究对象，材料和方法 |
| 三. 结果 |
| 四. 讨论 |
| 五. 结论 |
| 六. 参考文献 |
| 七. 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 八. 致谢 |
| 九. 附录 |
（8）嘉陵江重庆主城区水源水中有机污染物雄性生殖毒性的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 嘉陵江重庆主城区水源水中有机污染物雄性生殖毒性研究 |
| 前言 |
| 第一部分：嘉陵江重庆主城区水源水中有机提取物定性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分：嘉陵江重庆主城区水源水中有机提取物雄性生殖毒性评价 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分：嘉陵江重庆主城区水源水中有机提取物睾丸毒性分子机制初步研究. |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述 环境因素生殖损伤中的生精细胞凋亡 |
| 参考文献 |
| 博士生阶段已发表论文及会议交流论文 |
（9）纳米载体介导的hTERT反义寡核苷酸对EC9706细胞的抑制作用研究（论文提纲范文）
| 论文部分 |
| 题目：纳米载体介导的hTERT反义寡核苷酸对EC9706细胞的抑制作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述部分 |
| 新型纳米载体、端粒酶与肿瘤在治疗方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写 |
| 致谢 |
（10）原癌基因c-src在精原干细胞中表达及作用的研究（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、前言 |
| 四、材料方法 |
| 五、结果 |
| 六、讨论 |
| 七、结论 |
| 八、参考文献 |
| 九、致谢 |
| 十、附图 |
| 十一、综述 |
四、反义核酸对体外培养A型精原细胞端粒酶活性的影响（论文参考文献）
- [1]维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究[D]. 于敏莉. 浙江大学, 2012(08)
- [2]端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义[D]. 王大虎. 河北医科大学, 2011(10)
- [3]c-jun对仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌影响的机理研究[D]. 郑小波. 西南大学, 2010(05)
- [4]病毒载体介导的微型核酶对犬贾第虫端粒酶活性的影响[D]. 刘成武. 吉林大学, 2008(11)
- [5]c-raf在精原干细胞中的表达及作用的研究[D]. 闫登科. 南昌大学, 2007(03)
- [6]丁酸钠对人喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡及端粒酶活性影响的体内外实验研究[D]. 高岭. 郑州大学, 2007(06)
- [7]端粒酶hTERT基因反义核酸对TNF-α诱导的膀胱癌细胞（T24）凋亡的影响[D]. 高晓东. 兰州大学, 2007(04)
- [8]嘉陵江重庆主城区水源水中有机污染物雄性生殖毒性的研究[D]. 曹波. 第三军医大学, 2006(03)
- [9]纳米载体介导的hTERT反义寡核苷酸对EC9706细胞的抑制作用研究[D]. 王白燕. 郑州大学, 2006(12)
- [10]原癌基因c-src在精原干细胞中表达及作用的研究[D]. 杨俊玲. 南昌大学, 2006(02)