一、荧光定量PCR技术测定HBV-DNA与乙肝血清学标志分析比较（论文文献综述）
李茂仕[1]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用》文中提出背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题,肝细胞内的共价闭合环状DNA（ccc DNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因,但因检测需依赖肝活检而难以临床普及;虽然外周血中无法直接检测ccc DNA,但可通过其他血清指标来反映ccc DNA的变化。目前,核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段,但并不能直接清除ccc DNA,绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少,但因HBV突变的必然性和复杂性,耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA仅由ccc DNA转录产生且不受NAs治疗的影响,可较为真实反映肝内ccc DNA的表达情况。然而,HBV RNA检测尚无公认的标准化检测方法,其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。我们首先使用微滴数字PCR（dd PCR）技术建立了定量检测血清HBV RNA的方法,并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBV RNA水平,并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药（GR）和部分病毒学应答（PVR）患者血清HBV RNA的动力学特征以及耐药突变情况,以期为血清HBV RNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。方法:1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法检测血清HBV RNA水平,使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性;以1例高浓度的HBV RNA样本进行梯度稀释,两种检测方法平行进行测定,每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性,敏感性。2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBe Ag阳性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag阴性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用q PCR法检测血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBe Ag阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。3.以31例HBe Ag阴性、HBV DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2倍正常参考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象,检测其血清HBV RNA水平,肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显着性肝炎,以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBV RNA水平在鉴别显着性肝炎中的价值。4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBV DNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本,以dd PCR方法检测血清HBV RNA水平,观察其与HBs Ag、HBV DNA动态变化的特征,并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBV RNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。结果1.两种血清HBV RNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874,95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L时检出率均为100%,CV值分别介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L时,随着梯度稀释倍数的增加,检出率逐渐下降,最低检测下限（LLo D）分别约为61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可测结果和稀释倍数之间存在显着性线性相关,R2分别为0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型为主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA与血清HBV DNA显着正相关,相关系数（r）分别为0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,两者没有显着性相关关系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA与HBs Ag呈现显着正相关,相关系数分别为0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag阴性表型中则无此显着相关性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是与HBe Ag阴性患者ALT升高相关的独立危险因素,比值比（OR）分别为2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平则处于接近于显着性的状态（P=0.053）。7例血清HBV DNA阴性,但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鉴别HBe Ag阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2×ULN）患者显着性肝炎的能力,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBV RNA用于鉴别肝脏显着性炎症的最佳截断值为2.81 log10 copies/m L,此时敏感度73.7%,特异度66.7%,准确度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变,在这时间点之前,3例患者血清HBV RNA持续>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBV RNA持续>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平则分别从4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag则几乎没有变化(分别上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT区耐药位点突变结果与HBV DNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBV RNA RT区长期监测发现,患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变,而GR2患者则从初治开始就具备rt L180M+M204I突变。结论:1.我们使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量检测方法,低浓度血清样本的检出是困难的,但可以增加重复检测次数来改善;2.血清HBV RNA在不同临床表型中的水平存在差异,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBV RNA与血清HBV DNA均是未治HBe Ag阴性患者ALT升高的独立危险因素,因此在血清HBV DNA阴性患者中检测HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可补充HBV DNA用于反映肝脏炎症;3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT<2×ULN）的HBe Ag阴性患者中,血清HBV RNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBV DNA不具备这样的能力,因此这部分患者可通过血清HBV RNA水平作为启动抗病毒治疗的依据;4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。总之,血清HBV RNA作为一个病毒学指标,可在血清HBV DNA阴性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag阴性患者中用于肝脏炎症的评估;血清HBV RNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测,进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。
王睿君[2]（2021）在《乙肝疫苗免疫对隐匿性HBV感染持久保护性的人群分析及HBV早期暴露影响乙肝疫苗抗原特异性滤泡辅助性T淋巴细胞产生的作用研究》文中研究表明人群中的研究已证明:在新生儿期接种乙肝疫苗,能有效预防慢性乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染,儿童的乙肝表面抗原（hepatitis B Surface Antigen,HBsAg）流行率已显着下降,HBV感染所导致的青少年人群的肝细胞癌发病及死亡风险也明显降低。但疫苗免疫后10-15年,由乙肝疫苗免疫所诱导产生的抗乙肝表面抗原的保护性抗体（Antibodies against hepatitis B surface antigen,anti-HBs）消失。尽管国内外学者在人群中已开展了多项乙肝疫苗的试验性加强免疫测试,结果发现在anti-HBs阴性的乙肝疫苗接种者中,加强免疫能促进anti-HBs产生,但这仅表示机体存在针对HBsAg的回忆性抗体应答,而非抗病毒免疫力存在的直接证据。与很多肿瘤一样,肝细胞癌通常高发于成人,多种因素可促进HBV感染者的肝癌发生,已有分析发现,肝细胞癌的发病风险在隐匿性HBV感染（occulthepatitis B virus infection,OBI）者中也显着增加。国内外已有的研究发现:疫苗接种人群中存在OBI状态。部分出生于HBsAg（+）母亲的儿童,在新生儿期已接种乙肝疫苗且在儿童期获得完全保护后,在成年后出现HBV感染状态,包括OBI状态。因此,有必要分析新生儿乙肝疫苗免疫后所诱导的保护作用的持久性,及影响保护性抗体生成的可能原因。本研究工作包括两个部分:第一部分:新生儿期接种乙肝疫苗后对隐匿性HBV感染保护作用持久性的人群分析（论着已发表）背景与目的:乙肝病毒核心抗体（Antibodies against hepatitis B core antigen,anti-HBc）阳性状态提示既往可能接触过HBV,但在anti-HBc（+）者的外周血中可检测到HBV DNA片段,提示存在可能的OBI状态。国内外已有的研究发现,在乙肝疫苗免疫者HBsAg（-）/anti-HBc（+）体内能检测到HBVDNA,表明部分疫苗免疫者可能有OBI的发生。由于OBI与多种慢性肝脏疾病包括肝细胞肝癌相关,因此,确定新生儿乙肝疫苗对成年人群的OBI预防效果至关重要。江苏启东县曾是我国HBV高流行地区,为研究新生儿期接种乙肝疫苗对HBV相关的肝脏疾病及肝癌的保护作用,本团队于1983-1990年在启东县开展了启东乙肝干预研究,当时我国农村地区尚无乙肝疫苗的供应。该研究采用整群抽样方法,以农村公社为基础单位,用单纯随机法将入组人群分为新生儿乙肝疫苗免疫组（简称疫苗组）和新生儿未免疫对照组（简称对照组）。其中疫苗组共纳入41 182名儿童,有40 211（97.64%）在出生后24h内、1月龄、6月龄注射了 3剂血源性乙肝疫苗（5μg/剂）。对照组共纳入41 730名儿童,在10岁前未接种乙肝疫苗,当地疾病预防控制中心于2000年对该地区1986年后出生者进行了乙肝疫苗补种,已确认其中的23 368名对照组参与者按0-1-6程序补种了 3针10μg的重组乙肝疫苗。本团队于2008-2012年（研究对象到达19-28岁时）对启东乙肝干预研究的参加者进行了血清学和疾病发生结局随访。本次分析于2018年（研究对象到达28-35岁）开展,是在2008-2012年血清学随访基础上进行,以确定新生儿乙肝疫苗免疫后对隐匿性HBV感染保护作用的持久性。方法与结果:1.研究对象。从2008-2012年随访队列中抽取约10%作为研究对象,通过检测HBV感染血清学标志物、HBV DNA及感染性HBV的基因组,即不完全双链松弛环状DNA（relaxedcircular DNA,rcDNA）,分析该人群的OBI状态。本研究共收集到6 715例血样,其中疫苗组3 615例,对照组3 100例。2.新生儿期接种乙肝疫苗能诱导有效的抵抗HBV感染的免疫保护作用。在成年期（28-35 岁）,疫苗组的 HBsAg 阳性率为 1.58%（57/3 615）,HBsAg（-）/anti-HBc（+）阳性率为 4.70%（170/3 615）,均低于对照组的 7.45%（231/3 100）和 19.48%,（604/3100）（p 均<0.001）。3.新生儿期接种乙肝疫苗者的HBsAg（-）/anti-HBc（+）阳性率,未呈现具有统计学意义的随年龄增加而升高趋势。疫苗组HBsAg（-）/anti-HBc（+）阳性率在28-29岁时为 4.31%（55/1 276）,30-31 岁时为 4.66%（59/1 266）,32-33 岁时为 5.74%（49/853）,但在34-35岁为4.29%（7/163）,未呈现具有统计学意义的增高趋势（P for trend=0.261）。但在对照组,该阳性率由28-29时的17.16%稳定升高到34-35岁的25.67%,具有统计学意义（P for trend<0.001）。4.出生于母亲HBsAg（+）的疫苗接种者HBV感染风险增加。在新生儿乙肝疫苗免疫组中,出生于HBsAg（+）母亲的成年人HBsAg阳性率为8.5%（32/378）,HBsAg（-）/anti-HBc（+）阳性率为10%（38/378）;而出生于HBsAg（-）母亲的成年人HBsAg 阳性率仅为 0.8%（25/3 237）,HBsAg（-）/anti-HBc（+）的阳性率为 4.1%（132/3237）。5.新生儿期接种乙肝疫苗的成年人群中存在OBI状态。在HBsAg（-）/anti-HBc（+）者中,新生儿乙肝疫苗免疫组的HBV DNA阳性率13.08%（17/130）,对照组阳性率4.18%（12/287）。通过检测感染性HBV的基因组（HBV rcDNA）存在状态,在29例HBsAg（-）/anti-HBc（+）/HBVDNA（+）者中检测到 26 例（90%）血浆中存在 HBV rcDNA,由此确认了 HBV的隐匿性感染状态。6.新生儿期接种乙肝疫苗未增加疫苗中和抗体作用位点的HBV S区突变频率。对HBV PreS-S基因进行扩增测序,并分析该区的突变情况,发现在疫苗组所分离到的HBV中,中和抗体作用位点的S区基因“a”决定簇的氨基酸突变频率的并未增加,但Pre S2区R48K存在高频突变,与该地区的OBI感染者的突变情况一致。小结:新生儿期接种乙肝疫苗所诱导的保护作用可持续到至少三十年;但部分疫苗接种的成年人中存在隐匿性HBV感染状态;出生于母亲HBsAg（+）携带者成年后HBV感染风险增加。第二部分:胚胎期HBV暴露对乙肝疫苗抗原滤泡辅助性T细胞产生及抗体应答的影响背景与目的:乙肝疫苗的抗原成分是HBV的包膜蛋白HBsAg,其诱导产生保护性抗体anti-HBs依赖于CD4+T淋巴细胞的辅助。滤泡辅助性T淋巴细胞（T follicular helper cells,Tfh cells）是一类持续表达CXCR5的CD4+T淋巴细胞,其自分泌的白介素21（Interleukin,IL21）能促进自身发育分化。除Tfh细胞外,NKT也是IL-21的重要来源。而发育成熟的Tfh细胞可通过IL21-IL21R,ICOS-ICOSL,CD40L-CD40等促进B淋巴细胞增殖分化,及浆细胞和记忆性B淋巴细胞形成。过去已有的研究已证实,母体内的HBsAg能通过胎盘屏障进入到胎儿羊水和脐带血中,出生于HBV（+）母亲者对多种微生物产物的免疫应答不同于出生于HBV（-）母亲者。因此,我们推测胚胎期暴露于母亲HBsAg,有可能通过影响子代体内针对HBsAg的Tfh细胞的分化产生,进而影响其辅助抗HBs的抗体应答,影响乙肝疫苗的免疫保护效果。方法与结果:1.母亲HBsAg（+）携带状态阻碍新生儿针对HBsAg应答的特异性干扰素γ（Interferon Gamma,IFNy）,IL4和IL21产生型T淋巴细胞的形成。共收集到11例出生于HBV不同状态母亲的新生儿脐带血,根据分娩前2周孕妇外周血的HBV DNA和HBV血清学标志物,将其分为HBsAg（+）/HBV DNA>105 IU/mL组（n=2）,HBsAg（+）/HBV DNA≤105 IU/mL 组（n=5）,和 HBsAg（-）/HBV DNA（-）组（n=4）。分别分离3组脐带血淋巴细胞后,采用5μg/mL的HBsAg刺激培养5天,利用ELISPOT检测HBsAg特性的细胞因子产生型细胞数量。发现出生于HBsAg（+）母亲的新生儿脐带血中HBsAg特异性IFNγ、IL4和IL21产生型T淋巴细胞数目均低于出生于HBsAg（-）母亲者。在母亲HBV DNA>105 IU/mL时,新生儿脐带血中难以检测到IL21产生型T淋巴细胞。2.建立胚胎期暴露于HBsAg的小鼠模型。我们选择与C57BL/6J遗传背景相同,并能持续表达并分泌HBsAg的HBV转基因雌鼠（HBV-mother,HBV-M）,与C57BL/6J野生雄鼠交配。待孕期19-20天时,分离胎肝,收集胎血及羊水并检测HBsAg含量。来自HBV-M的所有F1代（HBV-M/F1）胎鼠的羊水中均可检测到HBsAg,提示该模型在某种程度上可模拟人的胚胎期暴露于HBsAg状态。将从胎肝、胎血及羊水中均检测到HBsAg的F1代小鼠命名为HBV-M/F1+,其HBsAg编码基因片段整合在肝细胞内;将仅在羊水中检测到HBsAg的F1代小鼠命名为HBV-M/F1-,其肝细胞不存在HBV片段,仅在胚胎期的羊水中暴露于HBsAg。3.胚胎期暴露于HBsAg阻碍F1代小鼠Tfh细胞的形成。在HBV-M/F1+和HBV-M/F1-及C57BL/6J野生小鼠4周龄时,每只注射5μg重组乙肝疫苗,通过流式细胞染色分析发现,所有HBV-M/F1代小鼠,特别是HBV-M/F1+的HBsAg特异性CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞数目以及HBsAg特异性CD4+T淋巴细胞分泌的IL21均低于C57BL/6J野生小鼠（p<0.05）。分离淋巴细胞进行共培养过程中,在加入IL21后,HBV-M F1-小鼠的HBsAg特异性CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例升高,但HBV-M/F1+小鼠的Tfh细胞无明显改变。4.胚胎期暴露于HBsAg能降低F1代小鼠分泌anti-HBs的浆细胞数目。注射一剂5μg乙肝疫苗后,HBV-M/F1组小鼠体内CD4+T淋巴细胞辅助的anti-HBs分泌细胞数目明显低于C57BL/6J组（p<0.01）。然而,分离HBV-M F1-小鼠和HBV-M/F1+小鼠的T细胞和B淋巴细胞与C57BL/6J野生的小鼠的B细胞和T淋巴细胞分别进行共培养,在加入IL21后,来自HBV-M/F1-小鼠的CD4+CXCR5+Tfh细胞可促进野生小鼠的B细胞形成CD138+IgD-浆细胞,而来自HBV-M/F1+小鼠的Tfh细胞对野生小鼠CD138+IgD-形成无明显改变。5.乙肝疫苗的加强免疫增强了 HBV-M/F1-小鼠的anti-HBs应答。每间隔2周对HBV-M/F1小鼠进行乙肝疫苗免疫,以观察加强免疫对小鼠抗体应答影响,尽管在HBV-M/F1+小鼠中检测不到anti-HBs的产生,但HBV-M/F1-小鼠体内anti-HBs 阳性率从第二次免疫后58%（7/12）增加到第三次免疫后92%（11/12）,与C57BL/6J组小鼠的阳性率无统计学差异,分别为58%和100%,但是,HBV-M/F1-小鼠的IgG2a/IgG1比值明显低于C57BL/6J野生小鼠（p<0.01）。小结:胚胎期暴露于HBsAg可阻碍HBsAg特异性的Tfh产生,降低Tfh细胞分泌的IL21而影响浆细胞产生anti-HBs的能力。然而,加强免疫通过一定方式增加IL-21产生,从而改善B细胞针对HBsAg的抗体产生能力,由此增强胚胎期暴露于母亲HBsAg但未感染HBV者的anti-HBs应答。
刘晓红[3]（2021）在《血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究》文中研究表明目的探讨乙肝表面抗原（HBs Ag）及乙型肝炎e抗原（HBe Ag）阴性,伴表面抗体（HBs Ab）、e抗体（HBe Ab）、核心抗体（HBc Ab）至少一项阳性的血清中,检测HBV DNA含量对隐匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）的检出价值,及探讨OBI的发生机制。方法采用化学发光免疫分析法（CLIA）检测乙肝五项病毒血清标志物（HBV-M）,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）进行HBV-DNA含量复筛,对OBI检出情况进行分析。采用湿化学法检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（BILT3）,分析受检患者肝损伤情况。采用CLIA方法检测丙型肝炎病毒抗体（HCV-Ab）、梅毒抗体（TP-Ab）、人类获得性免疫缺陷病毒抗体（HIV-Ab）,分析是否合并其他病毒感染及宿主免疫应答有无明显差异。测序法进一步检测HBV病毒是否存在基因突变,分析OBI发生机制。结果本次论文实验期间收集HBsAg及HBeAg阴性,伴HBs Ab、HBe Ab、HBc Ab至少一项阳性的血清共计1138份,PCR共检出35份HBV-DNA阳性,OBI检出率3.08%,其中HBc Ab、HBs Ab阳性和HBc Ab阳性HBV-M模式的检出率最高,分别为4.11%、4.04%。HBc Ab随着样本吸光度/临界值（S/Co值）升高,HBV-DNA阳性检出率依次显着升高（P<0.05）。596例患者接受肝功能检查,肝损伤占22.99%,肝损伤组HBV-DNA阳性率、HBc Ab高反应性（S/Co值≥10.0）均显着高于肝正常组（P<0.05）。35例HBV-DNA阳性标本接受HCV、TP、HIV检测,HCV阳性占11.43%,TP阳性占2.86%,HIV阳性为0,合并HCV病毒感染组与合并TP或HIV病毒感染组存在明显差异（P<0.05）。乙型肝炎病毒基因变异检测S区145位点、S区127位点、C区,未发现基因突变。结论常规检测HBsAg及HBeAg阴性伴HBcAb阳性提示存在OBI可能,且OBI发生风险随HBc Ab反应性S/Co值升高而明显升高。同时参考肝损伤指标,提示应当进一步行HBV DNA含量检测,为临床诊断OBI和降低OBI所致乙肝病毒传播风险提供参考。
丁文斌[4]（2020）在《乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究》文中研究说明乙型肝炎病毒前基因组RNA（pregenomic RNA,pg RNA）作为乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）的反转录模板以及HBV聚合酶蛋白（polymerase,Pol）和核心抗原（HBV core antigen,HBc Ag）的翻译模板,在HBV的生命周期中发挥了重要作用[1-3]。近年来相关研究发现慢性乙肝（Chronic Hepatitis B,CHB）患者的外周循环血中可以稳定的检测到HBV RNA,且血清HBV RNA主要以pg RNA的形式存在于CHB的外周循环中;在长期服用核苷类似物（Nucleoside analogs,NAs）抗病毒治疗,血清HBV DNA水平在临床上为阴性（即未检出）的CHB患者中,其血清pg RNA表达水平不但与肝内pg RNA水平呈正相关关系,还可以反映出CHB患者肝脏的炎症和纤维化程度[4,5]。此外,还有许多研究提出血清pg RNA可以作为一种潜在的生物学标志物,用于评价NAs抗病毒治疗效果,检测NAs治疗中的病毒突变以及指导NAs治疗的安全停药[6-10]。然而,pg RNA在HBV相关肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发生及进展过程中发挥了何种作用尚不明确。此外,相关研究报道α干扰素2a（Interferon-α-2a,IFN-α-2a）可以抑制pg RNA的转录,且在HBV相关HCC行根治性手术的患者中,术后IFN-α-2a辅助治疗能够降低他们HCC的复发率并提高总体生存率,但具体作用机制仍不明确[11-13]。在本研究中,我们首先探索了pg RNA在HBV相关HCC发生和进展中的作用及机制。其次,我们探索了干扰IFN-α-2a除了直接抗肿瘤作用外,能否通过抑制pg RNA发挥预防HBV相关HCC发生和进展的作用。本研究分为以下两个部分。本研究的第一部分中,我们首先从本中心临床样本库中选取了136例术前服用NAs药物抗病毒治疗至少48周,血清HBV DNA阴性的慢乙肝肝癌患者,对其术前的血清,术中切除的肝癌及癌旁组织中pg RNA的表达量进行检测。结果显示癌旁组织中pg RNA的表达高于癌组织,且血清pg RNA表达与癌旁组织pg RNA表达呈正相关关系（r=0.63,p<0.001）。接下来我们根据患者血清pg RNA的表达水平,使用中位数法把患者分为血清pg RNA高表达组和血清pg RNA低表达组,然后对其基本临床病理学信息进行分析和比较。结果显示血清pg RNA高表达不但与更低的肿瘤分化程度（p=0.014）,更严重的肝脏炎症程度（p=0.006）,纤维化程度（p=0.013）及肝硬化（p=0.040）相关,而且还与HBV e抗原（HBV e antigen,HBe Ag）阳性（p=0.004）和HBV表面抗原（HBV surface antigen,HBs Ag）滴度（p=0.007）密切相关。此外,血清pg RNA高表达在患者的总生存期（Overall survival,OS）更短（p=0.0166）,肝癌的累计复发率（Cumulative recurrence rate,CRR）更高（p=0.0157）。多因素分析表明血清pg RNA高表达是肝癌患者手术后死亡（OS:95%CI=1.197-3.356,p=0.008）和肝癌复发的独立危险因素（CRR:95%CI=1.167-3.058,p=0.010）。对临床数据的分析提示pg RNA可能在HCC发生和进展中发挥了重要作用。接下来我们通过体内体外等功能实验进一步探索pg RNA在肝癌发生和进展中的作用。我们使用pg RNA特异性短发卡RNA（sh-RNA）成功构建了稳定干扰pg RNA的Hep G2.2.15肝癌细胞系。同时,我们使用pg RNA全长过表达质粒成功在肝癌细胞Hep G2.2.15和Huh7中过表达了pg RNA并挑取了稳定过表达单克隆。Cell Counting Kit-8（CCK-8）,克隆形成,Ed U,细胞流式,成球及体内和体外绝对稀释等实验表明敲低pg RNA的表达能够抑制细胞的增殖能力,克隆形成能力,抑制肝癌细胞的抗细胞凋亡能力,同时抑制肝癌细胞的干细胞特性（简称干性）和成瘤能力;而在肝癌细胞中过表达pg RNA后,肝癌细胞的增殖能力,克隆形成能力,抗凋亡能力,干性及成瘤能力进一步增强。体内外功能实验结果进一步证明了pg RNA与HCC的发生及进展密切相关。在探索pg RNA促进HBV相关HCC发生和进展的机制研究过程中,通过RNA pull-down实验[14],银染实验和蛋白质谱分析,我们发现pg RNA可与一个经典的促癌分子胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白3（Insulin-like growth factor 2 m RNA binding protein 3,IGF2BP3）直接结合并相互调节。接下来,我们又通过RNA pull-down和蛋白免疫印迹（Western blot）,RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和RNA原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）共聚焦等实验进一步验证了pg RNA与IGF2BP3的直接相互结合作用,且两者结合后pg RNA的稳定性得到增强。接下来,通过一系列的实验和生物信息学预测分析,我们发现pg RNA通过海绵样吸附mi RNA-let-7e-5p,在转录后修饰水平上调IGF2BP3的表达。此外,通过细胞功能的加减法实验,我们发现过表达pg RNA对肝癌增殖能力和干性的促进作用可以被进一步干扰IGF2BP3所阻断。总之,我们的研究发现在CHB患者体内,pg RNA与IGF2BP3之间存在相互调节作用。一方面,pg RNA与IGF2BP3直接结合,且两者结合后pg RNA的稳定性会升高;另一方面,pg RNA可通过海绵样吸附作用,隔离IGF2BP3抑制性的mi R-let-7e-5p,增加IGF2BP3 m RNA的稳定性,从而在转录后修饰水平上调IGF2BP3蛋白的表达。综上所述,我们第一部分部分的研究发现pg RNA-IGF2BP3信号轴在HBV相关HCC发生和进展过程中发挥了重要作用。本研究的第二部分中,我们探索IFN-α-2a能否通过抑制HBV-pg RNA,进而抑制HBV相关HCC的发生和进展。我们使用IFN-α-2a处理Hep G2.2.15肝癌细胞不同的时间段后,对pg RNA和IGF2BP3的表达变化进行检测。结果显示,当我们使用IFN-α-2a处理细胞0-24 h时,pg RNA和IGF2BP3 m RNA的表达从处理4 h后开始明显下降,但IGF2BP3蛋白水平未明显变化。接下来,我们使用IFN-α-2a处理细胞更长的时间（0-7天）,结果显示pg RNA和IGF2BP3的m RNA的表达水平从处理4 h起开始明显下降,IGF2BP3蛋白水平从处理24 h后开始明显下降。此外,当我们用IFN-α-2a处理不表达pg RNA但遗传背景与Hep G2.2.15相同的Hep G2细胞相同时间后,IGF2BP3无论在m RNA还是蛋白水平均未发生明显变化。这些结果提示IFN-α-2a无法直接下调IGF2BP3的表达,而是通过抑制pg RNA进而下调IGF2BP3的表达,发挥抑制HCC进展的作用。接下来,我们通过体内体外细胞功能加减法实验进一步验证IFN-α-2a是否通过抑制pg RNA发挥抑制HCC发生和复发的作用。首先,我们使用IFN-α-2a和等体积生理盐水分别处理pg RNA过表达单克隆和对应的阴性对照单克隆细胞。结果显示pg RNA的过表达可以在一定程度上逆转IFN-α-2a对肝癌细胞增殖能力和干性的抑制作用。接下来,我们使用pg RNA过表达单克隆和对应阴性对照单克隆细胞构建裸鼠皮下荷瘤模型,并使用IFN-α-2a或等体积生理盐水分别处理相应的裸鼠。结果显示过表达pg RNA后可以部分逆转IFN-α-2a对皮下荷瘤生长的抑制作用。综上,这些结果提示IFN-α-2a除了直接抗肿瘤生长作用外,在HBV相关HCC中还可以通过阻断pg RNA-IGF2BP3轴从而抑制肝癌细胞的增殖能力和干性,最终发挥抑制HCC进展的作用。相关研究已发现IFN-α-2a可以抑制pg RNA的转录[15]。此外,最近的研究也发现在HBV pg RNA的5’和3’末端茎环结构上存在N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰位点,且m6A修饰程度增强后,HBV的所有转录本（包括pg RNA）的稳定性及相应的翻译产物会被下调[16]。因此,我们接下来探索IFN-α-2a处理对pg RNA稳定性及其m6A修饰的影响。通过放线菌素D（Actinomycin D）转录抑制实验并进一步计算pg RNA半衰期,我们发现经IFN-α-2a处理48 h后,pg RNA的稳定性明显下调。接下来我们通过基因特异性m6A q PCR,进一步验证IFN-α-2a处理对pg RNA的m6A修饰的影响。结果显示,IFN-α-2a处理能够明显增加pg RNA的m6A修饰水平。同时我们也检测了经IFN-α-2a处理后,m6A修饰过程中三个重要蛋白甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）,甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）以及脂肪和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）的表达变化[17]。结果显示,经IFN-α-2a处理的Hep G2.2.15细胞中METTL3和METTL14的表达明显升高,而FTO的表达明显下降。提示IFN-α-2a可能通过上调肝癌细胞中甲基转移酶METTL3和METTL14的表达同时下调去甲基酶FTO的表达,进而增加pg RNA的m6A修饰水平。综上所述,我们该部分的研究发现IFN-α-2a除了直接的抗肿瘤作用外,在HBV相关HCC中还可以通过增加HBV-pg RNA的m6A修饰水平,促进pg RNA的降解,从而抑制pg RNA-IGF2BP3信号轴,发挥预防HCC发展的作用。
徐博文[5]（2020）在《用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA》文中指出现有的抗病毒药物比如核苷类似物（nucleotide analogues,NAs）、聚乙二醇化的干扰素α（PEGylated interferon alpha,PEG-IFNα）等可以有效抑制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的复制,但是难以清除肝细胞内的HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）。残余的cccDNA容易导致停药后慢性乙型病毒性肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）的复发甚至进展。因此肝内cccDNA的水平是判断乙肝是否被治愈的重要参考指标。然而直接肝脏穿刺活检检测肝内cccDNA的水平属于有创检查,无法作为常规临床检查手段,需要寻找无创的替代手段,比如血清学检查反映肝内cccDNA的水平等。乙型肝炎病毒cccDNA可以生成0.7kb、2.1kb、2.4kb、3.5kb等多种不同长度的转录本,其中3.5kb的前基因组RNA（pregenomic RNA,pgRNA）是唯一能够反转录生成松弛环状DNA（relaxed circular DNA,rc DNA）负链的转录本。rc DNA是完整HBV颗粒的必要组成,因此pgRNA是HBV复制周期中的关键分子。血清中的pgRNA水平被证明和肝脏内cccDNA的转录活性具有较好的相关性,尤其在经过NAs治疗的病人,血清pgRNA比血清HBV DNA更能反映肝内cccDNA的转录活性,并且能够帮助判断停用抗病毒药物后乙肝在病毒学水平复发的几率,对于指导停药时机具有重要意义。因此血清pgRNA有望成为新的临床检验指标。尽管血清HBV RNA有独特的临床意义,但是其仍然无法替代HBV DNA成为更好的临床检测指标:HBV DNA水平不仅是决定患者是否进行抗病毒治疗的重要依据,同时也是评价患者病毒学应答的重要指标。另外有研究显示,HBV RNA与DNA的比值在不同自然感染史的CHB患者之间存在显着差异,因此HBV DNA和RNA的综合水平对于判断HBV感染阶段、疾病预后具有重要意义。但是目前临床上只有标准化的HBV DNA检测试剂盒,而无HBV RNA的标准检测方法。如果将来HBV RNA成为新的临床检验指标,也往往需要同时检测HBV DNA和RNA,如果分别检测必定带来耗费更多人力、时间、试剂、耗材和检测样品等问题。另一方面,目前检测HBV RNA尚无公认的常规方法,既往文献中的检测手段均存在一定局限。例如本课题的研究证明了直接抽提RNA并用oligo d T或基因特异性引物（gene specific primer,GSP）反转录的定量PCR可能因为难以消除的HBV DNA污染而存在定量不准,并且即使用DNase消化RNA提取物中的DNA也无法完全排除HBV DNA的干扰。还有其它文献报道了利用Quantigene核酸定量、微滴式数字PCR（droplet digital PCR,dd PCRds）等新技术进行HBV RNA的检测,虽然具有高灵敏度、特异性等优点,但是由于需要先进且昂贵的配套设备,目前只适用于实验室研究,尚难以在临床得到普及和推广。本课题开发了一种新的利用双重荧光定量PCR同时检测核酸提取物中pgRNA和DNA的方法,在克服了以往检测HBV RNA方法容易受到HBV DNA污染局限的同时,实现了两项指标的双检,相较于分别检测HBV DNA和RNA,可节省一半以上时间,以及减少一半的样本量需求,并且我们证明了该检测体系具有较高的特异性、准确性。本课题共设计有两种检测策略,第一种是反转录后拷贝数相减法的定量策略,适用于检测细胞培养上清标本,理论上也适合用于血清的检测;第二种策略是针对第一种的改良,方法是特异性扩增带锚定序列的c DNA然后定量,该改良检测策略对于检测细胞培养上清和细胞标本都能够胜任。综上,本课题设计的检测方法可以同时定量检测核酸提取物中HBV DNA和HBV RNA且具有定量准确、特异性好等优点,另外操作简单,节约了时间和人力物力成本,需要的检测样本量较少,因此能够较好地满足临床检验需求,具有潜在的转化价值。
刘贺[6]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究》文中研究表明目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重组体的遗传变异情况;探寻藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗体（HBsAb）双阳性发生率及原因;分析HBV/CD重组体的时空动态传播过程和进化遗传学特征（包括基因序列起源、核苷酸替换率和居群动力学等）。方法:利用多阶段随机抽样的方法,在西藏自治区和青海省海南州进行社区藏族人群血清样本采集,西藏七个地市中共收集HBsAg阳性血清样本852例,青海省收集HBsAg 阳性血清样本411例。按照采样地区藏族人群人口分布情况,选取具有代表性的血清样本进行DNA提取,分别对HBV全长和BCP区采用巢式PCR方法进行扩增、测序和拼接,以获得HBV全序列。对获得的全序列进行重组分析,对不同重组型的基线情况、遗传变异、血清型进行比较;对重组体内不同基因型片段进行系统发育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb双阳性血清样本做为观察组,并以1:4配比选择年龄、性别、病毒DNA水平和HBeAg状态同质的HBsAg 阳性/HBsAb阴性血清样本作为对照组,对两组间基因序列S区、PreS区氨基酸突变率、缺失和全基因组核苷酸突变位点分布情况进行比较。使用自NCBI中检索、收集的HBV C2亚基因型、D基因型和CD重组体全长序列,合并本研究中获得的185株全长序列,构建数据库。使用BEAST软件包对CD重组体中的D基因型片段和D1-5亚基因型;CD重组体中的C基因型片段和C2亚基因型分别进行系统发生生物地理学分析。同时,对CD1和CD2全长序列单独进行溯祖分析,并使用贝叶斯skyline重建方法推断种群数量的历史变化。结果:共获得185条HBV全长序列,其基因分型主要为CD重组基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799为D基因型,其余部分为C基因型;49株CD2型,其nt10-1499为D基因型,其余部分为C基因型;除CD重组型,还获得了 4株C2亚基因型序列。185株测序样本中,HBeAg阳性组的病毒DNA水平高于HBeAg阴性组（P=0.001）;HBeAg阴性组年龄高于HBeAg阳性组（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型区域均与C2亚基因型最为接近;CD重组体的D基因型段（nt10-799）与D4亚基因型最为接近,而CD2型nt800-1499序列在系统发育树中与D1-D3更为接近。CD2型重组体主要分布于与印度接壤的山南地区和日喀则市（P=0）。CD重组体在S区氨基酸aa76、aa120和aa129与D基因型存在差异。HBV/CD重组体的主要血清学型为ayw2型（175/181,96.7%）。与CD1型相比,CD2型存在较多的S207N突变。HBV/CD重组体的T1762/A1764双突变发生率低于C基因型,与D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突变频率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突变水平与C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg阳性样本的双阳性率为2.14%（27/1263）。在S蛋白全长、N端,MHR（aa100-169）,“a”决定簇（aa124-147）,茎环结构第一环（aa124-137）,第二环（aa139-147）和C端的氨基酸突变率,双阳性组均显着高于对照组;双阳性组中PreS区缺失显着高于对照组（以上结果中,均为P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突变率在两组间无显着性差异（P=0.19;P=0.89）。PreC/C区C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在两组间的分布均存在显着差异。双阳性组和对照组的核苷酸点突变比较,PreS/S区C3189A和T825C、P区C930A在两组间分布存在显着性差异。其中,PreS区C129T（S155L）仅存在于对照组;PreS区C3189A（D103E）和S区T825C（V224A）突变仅存在于双阳性组。HBVD基因型和CD重组体中的D型区域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亚洲南部,其平均进化速率约为1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位点/年。D4亚基因型是CD1和CD2中最为接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）进入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化为CD1和CD2内相应片段。CD1型较CD2型出现更早,表明先形成D基因型区段为nt10-799的CD1,后续形成D基因型区段为10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重组体分别形成三个独立的进化群。HBV/CD1重组体自1980年代开始至2000年,其种群大小保持稳定;HBV/CD2重组体自1997年首次报道以来,其种群大小经过短暂上升之后,随即出现了明显的下降趋势。全球C2亚型片段的传播最先起源于亚洲东部,首先传播到中国西北和亚洲北部,随后东亚分离株又进一步播散到美洲。结论:HBV/CD重组体是高原地区流行的主要基因型。HBeAg阴性组患者体内重组体DNA水平更高,病毒复制速度较快,病情处于进展期。年龄增长是导致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中发生转阴的主要原因。HBV/CD1重组来源为D4和C2亚基因型;HBV/CD2可能经过重组来源为D1-3、D4和C2亚基因型的多次重组。基于各基因型的地理分布,形成CD重组体的主要重组来源可能为中国（C2亚基因型）和印度（D4亚基因型）。与D基因型相比,HBV/CD重组体的主要血清型无明显变化。HBV/CD重组体感染者均在高海拔地区生活,造成这种现象的可能原因是高原居民具有相近的遗传背景特征或长期的高海拔生活导致其具有相同或相似的生活习惯。青藏高原HBV表面抗原阳性人群中HBsAg和HBsAb双阳性的发生率接近大多数不同基因型的既往研究结果。与对照组相比,双阳性组的氨基酸突变率在S区全长及其内的各个区段均显着增加。S区高突并不是血清双阳性病的充分必要条件,并不能完全解释HBsAg/HBsAb共存现象,PreS区的改变可能是导致HBsAg/HBsAb双阳性的因素之一。S区T825C（V224A）、PreS区C3189A（D103E）仅存在于双阳性组中,这些氨基酸变异导致蛋白结构发生变化,可能是双阳性发生的重要条件。HBVD基因型最可能的起源地是南亚地区。D基因型原型株在18世纪中叶逐步从印度传播到中亚进而传播到欧洲、地中海地区和非洲。在此过程中,19世纪中叶先后分化出D1、D3和D2亚基因型。同时19世纪中叶自印度向东北方向传播,逐步形成D4亚基因型并在1910年左右进入青藏高原及周边地区与C2型发生重组,这与英军两次入侵西藏时间相吻合。欧洲主要HBV D亚型的传播可追溯到二十世纪早期,包括第一次世界大战特别是第二次世界大战在内的一段时期。此过程可能与战争中产生的创伤、输血和疫苗注射,以及有组织的大规模人口迁移导致HBV的快速传播和演化有关。C2基因型向美洲等地的播散则与亚洲在二十世纪八九十年代的欧美移民潮有关,随着大量东亚地区亚裔人口向欧美等发达国家移民导致C2亚基因型的世界范围传播。
杨宇婷[7]（2020）在《儿童隐匿性乙肝病毒感染风险及检测方法的研究》文中进行了进一步梳理背景:虽然乙肝疫苗免疫接种计划在中国已实行近30年,我国仍然是乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）中高度流行国家。本次研究主要通过对乙肝疫苗接种后中国儿童HBV相关血清标志物的变化情况进行分析,从而对儿童隐匿性HBV感染（occult HBV infection,OBI）风险进行评估,并对OBI检测方法进行研究。方法:对215,624名0-16岁于2012年8月-2017年12月在重医附属儿童医院住院的儿童乙肝血清标志物检测结果进行分析,探究儿童OBI风险。在HBV的不同基因区段进行引物探针的设计,病毒核酸的提取,PCR扩增反应,探索OBI检测的新思路。结果:1-16岁儿童中HBV核心抗体（HBcAb）阳性率约为5.99%。HBV表面抗原（HBsAg）,0岁组为0.3%,1-9岁组为0.55%,当年龄>9岁时显着升高,为1.40%。并已初步建立一种多重荧光定量PCR技术用于OBI的检测,该方法检测灵敏度高、特异性好、操作简便。结论:此研究是首次通过分析中国儿童在乙肝疫苗免疫接种后的HBV血清标志物的变化情况,从而探究隐匿性HBV感染风险,并尝试建立一种新型OBI检测技术。在1-16岁儿童中可能存在有较高比例的隐匿性HBV感染,并且有突破性感染发生的风险。因此,建立一种准确、高效、临床适用性的OBI检测方法,对OBI进行及时准确的检测将尤为重要。
董冲[8]（2020）在《应用HBcAb阳性供肝的儿童肝移植受者术后新发乙肝风险及预防方案的研究》文中进行了进一步梳理目的:研究乙肝病毒核心抗体（HBcAb）阳性供肝应用于儿童肝移植受者的危险因素及探讨乙肝疫苗主动免疫预防术后新发乙肝（HBV）的疗效及影响因素。方法:1、对天津市第一中心医院自2012年8月至2014年11月150例儿童亲体肝移植的供受者资料进行回顾性分析,依据供者血清HBcAb检测结果分为HBcAb阳性组和HBcAb阴性组,对两组儿童受者的新发HBV感染情况以及临床资料进行比较分析。根据肝移植术后是否有新发HBV感染分为新发HBV组及非新发HBV组,统计分析两组供者性别、血清HBcAb检测结果、供肝组织共价闭合环状脱氧核糖核酸（HBV cccDNA）检测结果、受者手术时间、术中失血量、术中输注红细胞量、术中输注血浆量、术中输液总量、供者年龄、供者体重、移植物重量方面的差异。2、对天津市第一中心医院自2016年9月至2018年9月139例接受强化乙肝疫苗免疫方案预防HBcAb阳性供肝术后新发HBV感染的儿童肝移植受者进行前瞻性研究,根据肝移植术后是否有新发HBV分为新发HBV组及非新发HBV组,比较两组间供者和受者的特征、手术信息以及移植物和受者的情况,应用单变量和多变量分析确定乙肝疫苗预防治疗后新发HBV感染的危险因素,并根据术后3个月内乙肝表面抗体滴度变化进行分组,分为:A组HBs Ab滴度>1000IU/L;B组HBs Ab滴度200-1000IU/L;C组HBs Ab滴度<200IU/L,观察影响抗体滴度变化的因素。3、儿童受者疫苗反应的强度根据受者术前使用乙肝疫苗支数分为强反应组（≤3支）,中反应组（4～6支）,弱反应组（>6支）,分别在应用疫苗前、疫苗后1周和疫苗后2周,利用流式细胞术检测外周血各淋巴细胞比例及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测NK细胞分泌穿孔素和颗粒酶B的差异;酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测外周血细胞因子γ干扰素（IFN-γ）和白介素2（IL-2）分泌动态变化;免疫印迹试验（Western blot）和RT-PCR法检测NK细胞Toll样受体3（TLR3）、Toll样受体9（TLR9）和视黄酸诱导基因蛋白I（RIG-I）蛋白表达及信使核糖核酸（mRNA）转录水平,明确其与乙肝疫苗反应性的差异。结果:1.符合入组条件的儿童受者共125例,中位随访时间为8个月（3～31个月）,包括供者血清HBcAb阳性组47例和供者血清HBcAb阴性组78例,两组的新发HBV感染例数分别为8例（17.02%）和1例（1.28%）,差异有统计意义（P<0.05）;余临床资料差异均无统计学意义。所有供肝组织中共检出HBV cccDNA阳性者11例,检出率为8.8%,其中供者血清HBcAb阳性组供肝组织中HBV cccDNA阳性者10例,占比21.3%,供者血清HBcAb阴性组检出1例,占比1.3%,差异有统计学意义（P<0.05）;11例接受HBV cccDNA阳性供肝的儿童移植术后新发HBV感染者4例,感染率36.4%,其余114例接受HBV cccDNA阴性供肝的儿童移植术后新发HBV感染者5例,感染率4.4%,差异有统计学意义（P<0.05）。新发HBV组供者血清HBcAb（+）和供肝组织HBV cccDNA（+）例数高于非新发HBV组,差异有统计学意义（P<0.001）。供者血清HBcAb（+）与供肝组织HBV cccDNA（+）两者之间具有相关性。2.受者中位随访时间为23.5±15.7月,有5例（3.6%）出现新发HBV感染,肝移植术后新发HBV感染的平均时间为11.6个月（6～18个月）。随访期间,与新发HBV感染的受者相比,新发HBV感染的移植物和受者均存活。多因素逻辑回归分析受者术前抗体滴度<1000 IU/L,移植物HBV-DNA>1000copies、术后3个月HBs Ab下降速度和术中血浆用量大于400 ml是影响乙肝疫苗主动免疫方案效果的主要因素;术后3个月内乙肝表面抗体滴度变化与术中血浆的用量相关。3.研究发现在应用乙肝疫苗一周后,强反应组外周血NK细胞的比例及NK细胞分泌穿孔素和颗粒酶B的能力、血清中细胞因子IL-2和IFN-γ含量、NK细胞中TLR3、TLR9和RIG-I蛋白及mRNA的表达均较中反应组和弱反应组明显增高（P<0.05）;应用乙肝疫苗两周后,与中反应组和强反应组相比,弱反应组外周血NK细胞的比例及NK细胞分泌穿孔素和颗粒酶B的能力、血清中细胞因子IL-2和IFN-γ含量、NK细胞中TLR3、TLR9和RIG-I蛋白及mRNA的表达仍然明显偏低（P<0.05）。结论:1.供者血清HBcAb（+）是儿童肝移植术后新发HBV感染的危险因素,与供肝组织HBV cccDNA（+）相关,故应用HBcAb（+）供肝需要给予合适的预防治疗;2.乙肝疫苗主动免疫治疗方案能够有效地预防HBcAb阳性供肝儿童肝移植术后新发HBV感染,术前快速使HBs Ab滴度达到1000 IU/L以上是降低术后新发HBV的关键因素;3.影响儿童受者乙肝疫苗反应强度的因素与受者NK细胞的比例和功能密切相关,其机制可能是TLR3、TLR9及RIG-I相关的天然免疫模式识别受体信号通路。
王同同[9]（2020）在《超敏HBV DNA检测在慢性HBV感染者中的动态监测价值》文中指出目的HBV DNA的检测对于确定乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染者病毒复制水平具有重要意义。本文利用超敏检测技术,探讨低病毒载量（≤500IU/m L）背景下,HBV DNA水平与乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e antigen,HBe Ag）、肝功能各指标的相关性,以及HBV DNA、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）随着抗病毒时间的趋势变化。方法筛选370例传统荧光定量法检测HBV DNA病毒载量≤500IU/m L的慢性HBV感染者的血清标本,对应的超敏HBV DNA水平也同时被检测,将抗病毒治疗的221例患者按照DNA水平分为超敏阴性（-）组和超敏阳性（+）组,并分析两组中肝功能各指标,HBe Ag统计学差异;治疗组患者按照治疗时间进一步分为抗病毒治疗半年,一年,两年和三年,149例未治疗慢性HBV感染者设为对照组,分析HBV DNA阳性率,ALT异常率随着抗病毒时间的变化趋势;分析ALT血清水平显示异常的情况下,HBV DNA阳性率随治疗时间的趋势关系。结果ALT异常率在超敏阴性（-）组和超敏阳性（+）组中比较差异有统计学意义（P=0.048）;谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）异常率两组比较差异无统计学意义（P=0.773>0.05）;另外,肝功能各指标血清学水平在两组中均没有差异（P>0.05）而HBe Ag阳性率在两组中比较差异有统计学意义（P<0.05）。超敏HBV DNA阳性率随抗病毒治疗时间不同,其趋势检验显示负相关（χ2=39.823,P<0.001）;而ALT异常率也具有趋势相关性（χ2=4.029,P=0.045）。ALT显示异常的患者中随抗病毒治疗时间的增加,超敏HBV DNA阳性率逐渐降低,未治疗组与治疗组之间差异有统计学意义（χ2=18.922,P=0.001）;组间比较,采用Bonferroni法调整α水平后,治疗两年、三年与对照组比较差异有统计学意义（P=0.002,P=0.001）。结论超敏定量检测在低病毒载量HBV感染者中具有重要价值,较传统荧光定量检测有更高的HBV DNA阳性检出率,准确了解病毒复制水平,减少假阴性造成的病情误判;结合低病毒载量背景下的ALT和HBe Ag等指标,动态监测患者的实际情况,有助于选择最佳治疗方案。
巫智勇[10]（2020）在《国产试剂与Roche试剂HBV DNA荧光定量PCR检测方法的精度比较》文中进行了进一步梳理目的:了解Roche公司Cobas PCR试剂与国产HBV荧光定量PCR试剂对HBV DNA检测的差异性,以更好地指导抗病毒治疗。方法:收集安医大一附院2019年3月至2019年6月期间门诊和住院的未经和已经进行核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化患者的血清70份,采用相关性分析来评价Cobas检测和国产检测对不同HBV DNA载量标本的精确性。HBV DNA定量检测:HBV DNA分别用Cobas定量试剂（Roche）和上海之江生物科技股份有限公司试剂（ZJ）进行检测。扩增反应分别在Cobas Taq Man 48 PCR仪和美国Applied Biosystem公司生产的ABI 7500基因扩增仪进行。同一份标本采用2种试剂进行平行检测,具体操作和结果判定参照试剂盒说明进行。结果:1.上海之江生物科技股份有限公司生产的试剂ZJ试剂检测结果与Roche检测结果的总体相关系数r=0.612,P=0.004,说明两者之间存在显着的线性相关。2.国产试剂对于病毒载量低于106 copy/ml的标本检测结果的问题突出体现在三个方面:1)检测结果准确性差;2)相当比例的标本国产试剂出现检测值≤1000copy/ml,病毒载量越低,出现检测值低于下限的比例越高。3)病毒载量低于106 copy/ml的标本,国产试剂检测结果的重复性差,同一标本不同批次的检测结果可以相差1个数量级。在103<HBV DNA≤106范围内,P值大于0.05,提示两种检验方法间不存在显着相关性,在HBV DNA>107copy/ml范围以上,两种检验方法间存在显着的线性相关。3.ZJ试剂检测结果≤1000copy/ml而Roche检测结果>1000copy/ml的,即ZJ试剂检测结果呈假阴性的标本有16例,占37.2%。结论:1.国产试剂与Roche试剂具有较好的相关性,表明国产试剂总体来说反映了标本中的病毒载量水平,可以用于常规检测。国产试剂与Roche试剂在病毒载量高于107 copy/ml以上时具有较好的相关性,在病毒载量低于≤106 copy/ml范围内的检测精度相关性差。2.血清HBV DNA高滴度或低滴度持续存在是乙型肝炎病情进展和肝癌发生的危险因素,血清HBV DNA的高精度检测至关重要,建议对于HBV DNA低于106 copy/ml的标本,尤其是经过抗病毒治疗后国产检测低于检测下限的,应当使用用Cobas高精度病毒载量检测系统进行检测或复测,尽量避免假阴性结果而延误患者病情。
二、荧光定量PCR技术测定HBV-DNA与乙肝血清学标志分析比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、荧光定量PCR技术测定HBV-DNA与乙肝血清学标志分析比较（论文提纲范文）
（1）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴数字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及与实时荧光定量PCR方法的对比评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特点及其临床意义 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 恩替卡韦耐药及部分病毒学应答患者血清HBV RNA动力学特征以及用于长期监测耐药突变的初步研究 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（2）乙肝疫苗免疫对隐匿性HBV感染持久保护性的人群分析及HBV早期暴露影响乙肝疫苗抗原特异性滤泡辅助性T淋巴细胞产生的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写与注解 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分: 新生儿期接种乙肝疫苗后对隐匿性HBV感染保护作用持久性的人群分析 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料和方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| (五) 小结 |
| 第二部分: 胚胎期HBV暴露对乙肝疫苗抗原滤泡辅助性T细胞产生及抗体应答的影响 |
| (一) 前言 |
| (二) 材料与方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| (五) 小结 |
| 综述 滤泡辅助性T淋巴细胞的发育分化及其与B淋巴细胞相互作用 |
| 参考文献 |
| 基金资助情况 |
| 发表文章 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究现状 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 HBV-pgRNA通过与IGF2BP3相互调控,促进HBV相关HCC的发生和进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 第二部分 IFN-α-2a通过增加pgRNA的m6A修饰降低其稳定性,阻断pg RNA-IGF2BP3 信号轴,抑制HCC的进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 乙型肝炎病毒前基因组 RNA 在乙肝相关疾病发病机制及临床应用中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（5）用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 用于检测培养上清中 HBV DNA 和 RNA 的双重定量PCR 体系的建立 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 用拷贝数相减法检测 hep G2.2.15 细胞内和培养上清中的 HBV DNA 和 RNA |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 双重定量 PCR 检测 HBV DNA 和 RNA 的方法的改良 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 工作小结 |
| （一）主要研究内容 |
| （二）下一步需要解决的问题 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV RNA 的检测方法和临床意义研究进展 |
| 一、病毒复制周期中的血清HBV RNA |
| 二、血清HBV RNA的种类和检测方法 |
| 三、血清HBV RNA与其他HBV标记物的相关性 |
| 四、血清HBV RNA的临床意义 |
| 五、血清HBV RNA的研究展望 |
| 六、总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.引物及扩增条件 |
| 3.主要试剂、耗材及生产厂家 |
| 4.主要仪器设备及生产厂家 |
| 5.HBV生物信息学分析主要软件 |
| 6.实验方法 |
| 7.HBV荧光定量PCR检测 |
| 8.生物信息学分析方法 |
| 9.统计分析 |
| 10.质量控制 |
| 二、结果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列扩增结果 |
| 2.HBV DNA全长序列分型分析 |
| 3.青藏地区HBV/CD重组体不同区段系统发育分析结果 |
| 4.青藏高原藏族人群全长序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重组体全序列基因变异分析结果 |
| 6.HBV血清型分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HBV/CD重组型表面抗原抗体双阳性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.DNA序列拼接与分析 |
| 3.HBV荧光定量PCR检测 |
| 4.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBsAg和HBsAb双阳性的发生率 |
| 2.双阳性组和对照组的基本信息 |
| 3.PreS/S区氨基酸突变率分析结果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突变位点分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 HBV/CD重组体时空动力学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建 |
| 2.数据库内序列的基因型和重组分析 |
| 3.用于时空动态分析的主要工具和软件 |
| 4.时空动态分析方法 |
| 5.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建情况 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析结果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析结果 |
| 4.HBV/CD1重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 5.HBV/CD2重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型时空动态分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb双阳性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（7）儿童隐匿性乙肝病毒感染风险及检测方法的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 儿童乙肝疫苗接种后隐匿性HBV感染的情况分析 |
| 1 研究对象与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 隐匿性乙肝病毒感染检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（8）应用HBcAb阳性供肝的儿童肝移植受者术后新发乙肝风险及预防方案的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、乙肝病毒核心抗体阳性供肝应用于儿童亲体肝移植受者的危险因素分析 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 供受者资料 |
| 1.1.2 实验材料 |
| 1.1.3 血清学及病毒学测 |
| 1.1.4 肝脏组织HBV-DNA及HBV cccDNA的检测 |
| 1.1.5 肝脏组织活检及HBsAg检测 |
| 1.1.6 HBV-YMDD测序分析 |
| 1.1.7 新发HBV感染标准 |
| 1.1.8 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 一般资料 |
| 1.2.2 根据供者HBcAb检测结果进行分组 |
| 1.2.3 供者HBcAb阳性组及阴性组术后新发HBV感染情况 |
| 1.2.4 HBV cccDNA与受者新发HBV感染的关系 |
| 1.2.5 新发HBV感染的危险因素分析 |
| 1.2.6 供者血清HBcAb(+)与供肝组织HBV cccDNA(+)相关性分析 |
| 1.2.7 儿童受者新发HBV感染的诊断、治疗及结局 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 应用HBcAb阳性供肝对儿童肝移植的必要性 |
| 1.3.2 应用HBcAb阳性供肝的受者新发HBV感染的风险性 |
| 1.3.3 应用HBcAb阳性供肝受者新发HBV感染的机制 |
| 1.3.4 应用HBcAb阳性供肝儿童受体术后新发HBV感染的预防治疗 |
| 1.4 小结 |
| 二、乙肝疫苗主动免疫治疗方案预防HBcAb阳性供肝儿童肝移植术后新发HBV感染的研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 乙肝疫苗主动免疫预防方案的一般情况 |
| 2.2.2 供受者特征对乙肝疫苗主动免疫预防术后新发HBV的影响 |
| 2.2.3 受者手术情况对乙肝疫苗主动免疫预防术后新发HBV的影响 |
| 2.2.4 受者术后HBsAb滴度下降速度对乙肝疫苗预防术后新发HBV的影响 |
| 2.2.5 术后并发症对乙肝疫苗主动免疫预防术后新发HBV的影响 |
| 2.2.6 影响乙肝疫苗主动免疫预防儿童肝移植术后新发HBV的因素 |
| 2.2.7 新发HBV感染案例的特点及诊断、治疗 |
| 2.2.8 儿童肝移植受者术后HBsAb滴度变化的影响因素 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 应用乙肝疫苗主动免疫预防儿童肝移植术后新发HBV的意义 |
| 2.3.2 乙肝疫苗主动免疫的方案及效果 |
| 2.3.3 肝移植术后HBsAb滴度变化速度的影响 |
| 2.3.4 影响乙肝疫苗主动免疫预防儿童肝移植术后新发HBV的因素 |
| 2.4 小结 |
| 三、儿童受者强化乙肝疫苗方案反应差异性分析 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 乙肝疫苗反应强度分组情况及各组受者的特征 |
| 3.2.2 受者NK细胞比例对乙肝疫苗反应强度的影响 |
| 3.2.3 受者NK细胞的功能对乙肝疫苗反应强度的影响 |
| 3.2.4 NK细胞中模式识别受体信号通路对乙肝疫苗反应强度的影响 |
| 3.2.5 受者血清中细胞因子IL-2和IFN-γ含量对乙肝疫苗反应速度的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 研究影响乙肝疫苗反应强度因素的必要性 |
| 3.3.2 影响强化乙肝疫苗方案反应强度的机制 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）超敏HBV DNA检测在慢性HBV感染者中的动态监测价值（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 本人简历 |
| 研究生期间获奖情况 |
| 学术论文 |
| 在读期间参加的科研工作 |
| 致谢 |
| 综述 低载量HBV DNA在慢性乙型肝炎中的研究进展 |
| 参考文献 |
（10）国产试剂与Roche试剂HBV DNA荧光定量PCR检测方法的精度比较（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 慢性乙型肝炎的病毒学检测及预后 |
| 参考文献 |
四、荧光定量PCR技术测定HBV-DNA与乙肝血清学标志分析比较（论文参考文献）
- [1]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用[D]. 李茂仕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]乙肝疫苗免疫对隐匿性HBV感染持久保护性的人群分析及HBV早期暴露影响乙肝疫苗抗原特异性滤泡辅助性T淋巴细胞产生的作用研究[D]. 王睿君. 北京协和医学院, 2021
- [3]血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究[D]. 刘晓红. 锦州医科大学, 2021(01)
- [4]乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究[D]. 丁文斌. 中国人民解放军海军军医大学, 2020
- [5]用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA[D]. 徐博文. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [6]青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究[D]. 刘贺. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [7]儿童隐匿性乙肝病毒感染风险及检测方法的研究[D]. 杨宇婷. 重庆医科大学, 2020(12)
- [8]应用HBcAb阳性供肝的儿童肝移植受者术后新发乙肝风险及预防方案的研究[D]. 董冲. 天津医科大学, 2020(06)
- [9]超敏HBV DNA检测在慢性HBV感染者中的动态监测价值[D]. 王同同. 安徽医科大学, 2020(02)
- [10]国产试剂与Roche试剂HBV DNA荧光定量PCR检测方法的精度比较[D]. 巫智勇. 安徽医科大学, 2020(02)
标签：基因型论文; 乙肝表面抗原阳性论文; 乙肝阴性论文; 两对半论文; 乙肝核心抗体论文;