一、对禽逆转录病毒特别是J亚群白血病病毒感染的回顾（论文文献综述）
王呈呈[1]（2021）在《K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用》文中研究说明K亚群禽白血病病毒（ALV-K）是近些年新发现的一种外源性禽白血病病毒亚群,该亚群主要存在于中国地方鸡群,病毒增殖慢,感染范围广,是我国地方鸡群主要防控对象之一。相对其它亚群禽白血病病毒,该亚群病毒研究起步晚、感染特性和致病机制所知少、缺乏特异性诊断试剂和方法,极大限制了对该病毒深入研究和临床防控检测。本研究旨在根据ALV-K毒株的囊膜表面蛋白基因特性,利用分子生物学、细胞生物学和兽医免疫学等技术方法获得针对该病毒亚群的特异性蛋白抗原和抗体,并建立基于这些抗原抗体介导的特异性检测方法,为该亚群病毒深入研究和临床防控检测提供物质基础和方法依据。本研究首先根据Gen Bank上发表的ALV-K囊膜表面蛋白gp85基因序列,利用生物信息软件筛选出与其他亚群同源性较低的特异性抗原基因片段,设计引物,以ALV-K-JS11C1毒株的基因为模板扩增该基因片段,利用原核表达技术,获得特异性蛋白抗原;其次,对该蛋白抗原进行纯化、鉴定、包被,优化反应条件,建立检测该亚群病毒抗体的ELISA方法,对该方法的特异性、灵敏度、重复性、符合率、保存期等进行评价;第三,利用该蛋白抗原免疫接种兔,制备多克隆抗体,检测其抗体效价和对病毒或抗原的识别特性;第四,利用该蛋白抗原免疫接种Bal b/c小鼠,制备分泌抗体的脾细胞,与SP2/0细胞杂交融合,获得分泌抗体的杂交瘤细胞,对杂交瘤细胞的染色体数目、分泌抗体类型和识别特性进行检测。结果显示,获得特异性的抗原基因片段大小为310bp,与目前发表的ALV-K亚群同源性为92.9%～100%,而与其他亚群同源性为37%～79.7%;系统进化树显示该基因片段与ALV-K亚群毒株基因亲缘关系很近,与其他亚群较远;蛋白结构抗原性较高。经基因克隆、诱导表达,获得大小为30k Da的目的蛋白条带。对该蛋白进行纯化和包被建立ELISA,并对抗原包被浓度、抗体稀释度、反应条件等进行优化,确定抗原包被浓度为0.75μg/m L、血清抗体稀释度为1:800、二抗稀释浓度为1:5000、一抗孵育时间为45min、二抗孵育时间为60min、显色时间10min为最佳条件;ELISA检测阴性血清临界值为0.705,能区分ALV-K与其它ALV-A/B/J亚群的鸡血清抗体;该方法灵敏度较全长蛋白提高近20倍;板内重复性变异系数在0.90%～7.33%之间,板间重复性显示变异系数在0.84%～5.44%;与商品化ALV p27抗体检测试剂盒符合率可达93.48%;试剂盒至少在5个月内有效。利用该重组蛋白免疫兔可获得效价为8.1×105～5.12×107的血清抗体,所获得的抗体可用于免疫印迹分析（Western blotting）识别ALV-K gp85蛋白和间接免疫荧光分析（IFA）识别细胞中的ALV-K病毒。通过细胞融合和多次亚克隆筛选获得两株分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为ALV-K30B、ALV-K23H,其分泌的抗体亚类分别为Ig G2b、Ig G1,制备的腹水抗体效价可达214和212,所产生的抗体可用于Western blotting特异性识别ALV-K gp85蛋白和IFA识别细胞中的ALV-K亚群毒株,而不识别ALV-A/J亚群毒株。以上结果表明,获取的ALV-K gp85特异性基因片段经诱导表达,可获得成功用于特异性检测鸡血清ALV-K抗体的ELISA包被抗原,也可成功用于制备高效价的多克隆抗体和单克隆抗体。所建立的血清抗体检测ELISA具有良好的特异性、敏感性、稳定性和符合率;所制备的特异性抗体可用于ALV-K病毒及其gp85蛋白的特异性检测。
闫彩虹[2]（2020）在《江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用》文中认为免疫抑制病病原既可引起家禽发生原发性感染甚至死亡,也可损伤其免疫系统,导致机体抵抗力下降,并发或继发感染其他病原,造成家禽生产能力下降和较高的病死率。鸡传染性贫血病毒（CIAV）、马立克病病毒（MDV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）和禽白血病病毒（ALV）是4种常见的可导致家禽免疫抑制的病毒,在我国养鸡场中检出率较高,且常以亚临床感染的形式出现。目前关于这几种免疫抑制病的流行病学调查研究主要集中在广西、安徽、山东、河南等地区,而关于江苏地区家禽这方面的流行病学研究资料较少。由MDV、REV和J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染引起的肿瘤疾病在临床诊断过程中因症状相似而较难确诊,而且这3种病原的实验室检测还是以常规PCR为主,因此建立一种特异、灵敏、快速的检测方法,用于病原检测和临床诊断,同时为疾病的防控和净化提供帮助是非常有必要的。本研究应用PCR方法对来自江苏地区的病禽进行4种免疫抑制病病原的检测,建立了同时检测3种致瘤病毒MDV、REV和ALV-J的三重TaqMan荧光定量PCR方法,并应用于临床检测中,以期了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的感染情况,并为临床上家禽肿瘤疾病的诊断提供一种快速、特异、敏感的新型技术手段。1 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测为了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的流行情况及其感染间相互作用的关系,应用PCR方法对2016-2019年来自江苏地区不同养殖群体的507只病鸡、80只病鸭、129只病鹅和42只病鸽进行CIAV、MDV、REV和ALV的核酸检测,结果显示病鸡样品总阳性检出率为66.07%,CIAV、MDV、REV和ALV的检出率分别为36.09%、25.84%、10.85%和32.94%,CIAV、MDV、REV和ALV的单一感染检出率分别为13.61%、8.88%、1.18%和12.03%,二重感染以CIAV+ALV最为常见,检出率为7.69%,三重感染以CIAV+MDV+ALV最为常见,检出率为3.94%,四重感染检出率为0.99%。不同日龄鸡检测结果显示,6月龄以上鸡CIAV的检出率显着降低,3～6月龄鸡MDV和ALV的检出率较高;不同品种鸡检测结果显示,蛋鸡MDV、REV检出率显着高于肉鸡、草鸡和三黄鸡;2016-2019年检测结果显示,江苏地区鸡群中免疫抑制病病毒仍呈现不同程度的流行,且部分病原的每年检出率存在差异性。4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较经统计学分析表明,CIAV和REV、CIAV和ALV感染间存在相互促进的趋势（P<0.01）。209份水禽样品均未检测出CIAV核酸,MDV、REV和ALV的检出率分别为0.96%、1.44%和3.35%,个别样品还存在REV和ALV的混合感染。病鸽样品中均未检测出这四种免疫抑制病病原。结果表明,鸡群中免疫抑制病病原的感染非常普遍,且存在多种病原的混合感染;水禽中免疫抑制病病原的检出率显着低于鸡群;鸽子感染这4种免疫抑制病病原的机率较低。2鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立为建立同时检测MDV、REV和ALV-J的方法,本研究根据MDV meq基因、REV gp90基因和ALV-J env基因,合成特异性引物和TaqMan探针,建立和优化反应体系和条件,建立了鸡3种致瘤病毒的单个和三重TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的3种病毒的单个荧光定量PCR方法具有相同的反应体系和条件,操作方便,检测快速;单个和多重荧光定量PCR方法均仅特异性扩增MDV、REV和ALV-J,与鸡其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;3种病毒的单个荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×101拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,敏感性较高,三重荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×100拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,与单个敏感性相似;三重荧光定量PCR方法组内与组间重复性试验的Ct值变异系数均小于5%,重复性良好。应用三重荧光定量PCR方法和普通PCR方法分别对来自江苏各地具有免疫抑制病表现的120份临床病鸡样品同时进行MDV、REV和ALV-J核酸的检测,两者的符合率为94.17%。本研究建立的鸡致瘤病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法为临床样品中MDV、REV和ALV-J核酸的检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感的新型技术手段。3两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究为进一步检验三重荧光定量PCR方法的临床应用性,应用建立的三重荧光定量PCR方法对江苏两个鸡场送检的疑似感染肿瘤性病毒的病鸡组织样品进行了检测,并同时进行病毒分离,然后对分离出的MDV野毒株进行meq和pp38两个主要致病基因的序列分析。三重荧光定量PCR结果显示送检病鸡样品MDV核酸均呈阳性,REV和ALV-J核酸均呈阴性,病毒分离鉴定结果显示从两个鸡场的病鸡抗凝全血中各分离到了 1株MDV Ⅰ型毒株,未分离到REV和ALV毒株。核苷酸同源性和遗传进化分析结果显示,JS0316毒株与江苏分离株Js201801关系最近,而JS0424毒株则与近年国内流行毒株亲缘相近。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征（A71S,P194-）,具有MDV强毒分离株的分子特征（D80Y,V115A,T139A,P176R）,JS0316分离株meq基因除了具有以上强毒分离株的分子特征外,还与Js201801存在相同的突变（Q93R）,该突变其余参考毒株均未发生,这可能是MDV江苏分离株新的分子生物学特征。除此之外,JS0316和JS0424分离株meq基因分别出现了其他参考毒株均未发生的氨基酸突变（V123A）和（A/P217T）,JS0316和JS0424分离株pp38基因推导的氨基酸序列也分别出现了特有的氨基酸突变（L981,F240S）和（W67G,V210A）。结果表明三重荧光定量PCR检测结果和病毒分离结果一致,发病鸡均感染了马立克病毒,且分离毒株均具有强毒的分子特征。因此,所建三重荧光定量PCR方法可用于临床检测。
栾秀敏[3]（2020）在《2017-2019年我国部分省份白羽肉鸡ALV-J的分离鉴定及env序列分析》文中研究说明禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）感染引发的多种肿瘤病的统称,临床症状主要表现为多种脏器肿瘤、免疫抑制和严重的生长迟缓。该病在19世纪末出现以来,已在世界范围内广泛流行。该病于20世纪末在我国开始流行并在2008年达到高峰,严重影响了我国商品肉鸡和蛋鸡的养殖,造成了巨大的经济损失。为控制禽白血病的流行与传播,我国对禽白血病实施了严格的净化工作,力求从种源净化做起,在全国范围内逐步净化禽白血病。目前,禽白血病净化工作已经取得了巨大成功,尤其是J亚群禽白血病病毒（subgroup J ALV,ALV-J）在我国商品肉鸡和蛋鸡养殖业中得到一定控制,经济效益得到了明显提升。然而,2017年以来,我国多个省份肉种鸡场再次出现禽白血病,临床症状较之前出现变化,发病率和死亡率显着提高。为了解引发此次禽白血病发生的病原学特征,本研究从我国辽宁、吉林、天津、山东、河北和江苏六个省份21家发生禽白血病症状的养殖场进行了系统的流行病学分析。生产数据显示上述养殖场患病鸡临床症状主要出现于开产前后,发病平均周龄为17.5周,平均日死亡率为6.8/10000。主要症状表现为肝脏肿瘤、脾脏肿瘤、肾脏肿瘤以及最新出现的脊骨肿瘤,且脊骨肿瘤出现的养殖场死亡率显着高于其他养殖场。随后,病毒分离和间接免疫荧光实验显示上述21家养殖场均存在ALV-J的感染,阳性率在20%-100%之间,总体阳性率约为60%,且发生脊骨肿瘤的山东养殖场阳性率均为100%。随后,本研究对所分离到的21株代表毒株进行了env基因测序与分析。同源性比较显示:本研究分离的病毒株核酸序列同源性为97.0%-99.9%,氨基酸序列同源性为94.7%-99.8%,说明这些病毒株高度相似,可能有共同的祖先。同时,本研究证实,此次我国多个省份肉种鸡养殖场中出现的ALV-J毒株与分离自黄羽肉鸡的GD14J2毒株（Genbank登录号:KU500032）的同源性最高,在95.77%～97.16%之间,明显高于其他参考毒株,说明这些新毒株与GD14J2的亲缘关系更为密切,但是否这些毒株具有相同的起源目前仍无定论。另一方面,遗传进化分析显示本研究在相同省份分离到的毒株不具有明显的地域性,且不同来源的毒株在env基因区段拥有一致的基因插入或缺失突变,这表明可能引发此次禽白血病爆发的ALV-J毒株可能存在多个传染源,并非直接来自同一毒株。同时,本研究也探讨分析了疫苗污染可能在此次ALV-J再次爆发中发挥的作用,但结果显示发生禽白血病的养殖场并未使用含有ALV-J外源病毒污染的疫苗,表明病毒可能来自其他途径。上述研究证实了引发此次禽白血病爆发的毒株属于ALV-J,探明了其分子特征和基因组变异情况,为临床防治该病提供了坚实的理论依据。
崔真毓[4]（2020）在《广西不同黄羽肉鸡品系种公鸡中禽白血病病毒分离鉴定及一株重组毒株基因组解析》文中研究表明禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起的,以免疫抑制、生长迟缓和多器官组织肿瘤为主要特征的病毒性传染病,近年来我国黄羽肉鸡和纯地方品系鸡群中ALV相关报道已有多。目前尚无有效的商品化疫苗和药物可用于控制禽白血病,对种鸡群实施严格的禽白血病净化被认为是控制禽白血病最有力的措施。在实施禽白血病净化过程中,公鸡及其精液在ALV传播中的作用不仅是一个重要的理论问题,也是关乎净化效果的实际技术问题,了解公鸡及其精液中ALV的感染和带毒状况、精液和血液中ALV感染状态的相关性对于实施禽白血病净化具有重要意义。本研究分别采用血浆和精液实施病毒分离对广西地区12个黄羽肉鸡品系的种公鸡开展了ALV的分离鉴定和调查,并对其中一株重组ALV开展了基因组测序和分析,以期为相应鸡群实施净化提供必要的基础数据。为了解拟开展禽白血病净化的12个黄羽肉鸡品系种公鸡中ALV感染状况,本研究分别采用血浆病毒分离鉴定和精液病毒分离鉴定并一一对应的方式对12个黄羽肉鸡品系的种公鸡开展了ALV的分离鉴定和流行病学调查。结果显示,12个品系种公鸡经血浆病毒分离阳性率分别为0.74%（1/135）、3.46%（8/231）、1.37%（1/73）、3.78%（9/238）、8.12%（38/468）、5.33%（73/1370）、5.45%（9/165）、2.13%（1/47）、0（0/29）、2.5%（1/40）、1.72%（3/174）、2.5%（5/200）,精液病毒分离阳性率分别为0.74%（1/135）、1.73%（4/231）、1.37%（1/73）、1.26%（3/238）、1.71%（8/468）、6.64%（91/1370）、4.24%（7/165）、0（0/47）、0（0/29）、0（0/40）、5.17%（9/174）、1.50%（3/200）,通过大量数据对比发现在多个品系中同一只公鸡血液病毒分离和精液病毒分离结果并不完全一致,多数鸡群血液病毒分离阳性率高于精液病毒分离阳性率,部分鸡群精液病毒分离阳性率高于血液病毒分离阳性率,分别对其中4个鸡场的6株ALV分离株gp85基因测序分析显示其均为J亚群ALV（ALV-J）。本研究结果表明在广西地区多个黄羽肉鸡品系种公鸡中仍存在ALV的流行,需要实施进一步的净化措施加以控制。在测序过程中初步发现野毒株GXRJ01株疑似为一株天然重组野毒株,为深入了解其分子特征,本探究通过多对相互重叠的引物对其不同基因区域分段扩增后测序,经拼接获得了GXRJ01株的全基因组,该分离株env基因与ALV-J代表株BR119的同源性高达98.7%,但其长末端重复序列（LTR）与E亚群ALV（ALV-E）的代表株同源性介于94.9%-98.4%,推测GXRJ01株很有可能是ALV-J gp85基因和ALV-E的LTR部分发生自然重组产生的野毒株。上述研究进一步显示了广西地区黄羽肉鸡品系中ALV基因的复杂性和多样性,推测黄羽肉鸡鸡群中可能存在多种亚群毒株的混合感染继而提升了重组毒株产生的几率,提示应尽快开展严格的净化措施以避免ALV在上述鸡群中的持续流行与重组几率。本研究采用血浆病毒分离鉴定和精液病毒分离鉴定两种方式同步实施完成了12种不同黄羽肉鸡品系种公鸡中ALV感染状况的调查,摸清了在上述品系种公鸡中ALV带毒状况并通过比较发现了血浆和精液病毒分离鉴定结果的不对应性。此外还发现并解析了一株ALV天然重组野毒株的基因组序列,相关研究结果对推动黄羽肉鸡品系禽白血病净化提供了新的理论数据支撑。
赵震东[5]（2020）在《南通地区禽白血病的流行病学调查及其净化的初步研究》文中研究指明禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）是可引起禽类多种肿瘤及免疫抑制性疾病的反转录病毒。根据其囊膜蛋白特征,该病毒可分为A-K共11个亚群。其中A,B,J亚群较为常见,且J亚群目前在国内最为常见。ALV-J感染主要造成鸡造血细胞恶性增生,引起髓细胞瘤、血管瘤及严重的免疫抑制,对国内外养禽业造成巨大经济损失。随着国内ALV净化工作的推进,鸡群ALV-J的感染及其发病率显着下降。ALV-K是近年来在国内地方品种鸡中分离鉴定出的新型禽白血病病毒。由于ALV-K病毒复制能力较弱,鸡群中ALV-K感染往往不易被检测出来,正挑战目前ALV通用检测及净化技术。本研究对南通地区送检的疑似ALV感染病料进行检测,分离鉴定到一株K亚群禽白血病病毒,并利用ALV-A/B抗体、ALV-J抗体及ALV抗原（p27）检测试剂盒对南通地区8个规模化地方品系祖代种鸡场开展了 ALV流行病学检测,且对两个品系的种鸡鸡群三个世代进行了禽白血病检测净化跟踪研究。1.南通地区禽白血病流行病学调查为了解南通地区ALV感染状态,本研究在对南通地区送检的疑似ALV感染病料进行PCR检测、病毒分离鉴定的基础上,利用商品化的ALV-A/B抗体和ALV-J抗体检测试剂盒以及本实验室研制的ALV抗原检测试剂盒对南通地区8个规模化地方品系祖代鸡鸡场开展了 ALV流行病学检测。研究结果表明,从疑似病料中分离到一株ALV-K,命名为NT181121。8个鸡场A/B亚型抗体阳性检出率为87.5%（7/8）,各鸡场阳性率分别为 4%（2/50）、4%（2/50）、0%（0/50）、4%（2/50）、2%（1/50）、6%（3/50）、12%（6/50）以及 4%（2/50）,总体个体阳性率为 4.5%（18/400）;J亚型抗体阳性检出率为100%（8/8）,各鸡场阳性率分别为20%（10/50）、36%（18/50）、14%（7/50）、6%（3/50）、50%（25/50）、6%（3/50）、22%（11/50）以及 26%（13/50）,总体个体阳性率为22.5%（90/400）;血样ALV抗原阳性检出率为100%（8/8）,各鸡场阳性率分别为 14%（7/50）、22%（11/50）、8%（4/50）、24%（12/50）、26%（13/50）、10%（5/50）、24%（12/50）以及 18%（9/50）,总体个体阳性率为18.25%（73/400）。以上对南通地区8个规模化鸡场外源性ALV感染现状调查结果显示ALV感染在南通地区已非常普遍。2.两个品系种鸡群禽白血病净化的初步研究针对南通地区ALV感染普遍性问题,在采用ALV净化的金标准方案基础上,本研究结合本实验室研制的禽白血病病毒p27抗原夹心ELISA检测试剂盒,对南通地区两个地方品系种鸡群（代号分别为3号和6号）进行了三个代次的ALV检测与净化研究。研究结果表明,通过三个代次的ALV检测、净化淘汰,3号和6号品系种鸡群泄殖腔棉拭样品和全血样品病毒检测阳性率均显着下降。3号品系种鸡群ALVp27抗原阳性率由净化前38.4%下降到4.7%,抗凝血的病毒分离由净化前11.2%降为1.46%;6号品系种鸡群ALVp27抗原阳性率由净化前19.8%降为6.3%,抗凝血的病毒分离由净化前6.3%降为0.8%。以上结果表明这两个地方品系种鸡群经过三个代次的净化,取得了初步的净化成效。
仇玲玲[6]（2020）在《鸡circRNA2420-Bcl11b介导细胞凋亡调控ALV-J感染的作用机制》文中研究表明J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）是一种反转录病毒,引起家禽免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤,给养殖业带来严重的经济损失。相对于其他亚型,ALV-J拥有更强的致病性和传染性,也是目前我国鸡群中发病率最高、感染较为严重、影响深远的一种亚群。目前还没有发现有效的商业化药物或疫苗可供使用,其感染致病致瘤机制有待进一步研究。本研究基于前期ALV-J感染与正常脾脏组织的转录组数据,结合小RNA测序数据,通过生物信息学联合分析筛选出与ALV-J感染致瘤相关的转录本（包括mRNAs、circRNAs、lncRNAs或miRNAs）、转录本间可能的网络互作关系以及病毒感染的关键信号通路。然后从上游和下游两个角度揭示鸡Bcl11b（B-cell lymphoma/leukemia 11B）在ALV-J病毒感染过程中的作用及分子调控机制,并以期进一步完善ALV-J感染致瘤机制的基础研究,也为寻找有效的生物标记以提高抗病育种工作提供理论基础。主要研究内容如下:1.为了探索家禽中ALV-J感染过程中关键基因、circRNAs、lncRNAs以及ceNRA互作网络关系,同时为解析鸡J亚群禽白血病病毒感染分子调控机理提供基础资料,本研究利用已有的ALV-J自然感染发病与正常脾脏组织的转录组数据,结合同样本的小RNA测序数据,获得全面系统的ALV-J感染与非感染鸡脾脏组织的转录组数据,并且通过差异表达转录本韦恩图联合分析、功能富集分析以及ceRNA互作网络等生物信息学手段共筛选出与ALV-J感染致病致瘤相关的15个候选基因（包括Bbx、Bcl11b、Foxk1、Pag1、Tyro3、Brat1、Ctsb、Scube3、Ulk3、Dock4、Zfhx3、Fmr1、Aoc3、Ralb 以及 Mll）、多个相关转录本及转录本间可能的网络互作关系以及病毒感染的关键信号通路,通过在其他感染组织中验证发现Bcl11b表达水平差异最为显着,达80倍,且Bcl11b信号通路复杂,可能是ALV-J感染致病致瘤的关键因子。因此,首先将鸡Bcl11b基因作为研究ALV-J感染致病致瘤的机制切入点。2.为探讨鸡Bcl11b基因的功能,首先克隆获得了鸡Bcl11b的CDS序列,发现存在可变剪接体,并且发现一种新的剪接形式,蛋白结构预测分析发现3号外显子缺失会影响蛋白质三级结构的锌离子结合位点;qRT-PCR检测结果发现鸡Bcl11b在肝、脾、肺、淋巴和肾等组织中均有表达,且在脾、肺和淋巴中高表达,在鸡胚成纤维细胞中高表达;进一步在Bcl11b基因低表达的细胞DF-1中过表达Bcl11b同时检测细胞增殖活力、凋亡及周期变化,发现Bcl11b的过表达显着降低了细胞活力、提高了细胞凋亡水平（P<0.05）,促凋亡基因表达量也显着升高（P<0.05）,对细胞周期影响不显着（P>0.05）,在CEF细胞中干扰Bcl11b表达后细胞凋亡水平显着降低（P<0.05）,对细胞周期影响不显着（P>0.05）。这说明了鸡Bcl11b通过促进细胞的凋亡从而抑制细胞活力和存活,而非阻滞细胞周期。3.为了进一步探索鸡Bcl11b基因在ALV-J感染过程中的作用,首先构建了 ALV-J体外感染CEF细胞产生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的模型,检测体外感染过程中Bcl11b基因表达水平变化趋势与细胞凋亡水平一致,同时检测多个凋亡相关蛋白发现p53蛋白水平在感染后0～2 dpi高表达,其下游蛋白Bax表达水平在在感染后0～3dpi表达水平较高,下游作用因子细胞色素C（CytC）在2-4dpi高表达,符合p53调控的线粒体介导的细胞凋亡模式;Bcl11b基因和凋亡相关基因的表达与凋亡变化吻合。这也说明在体外,鸡Bcl11b基因参与线粒体介导的细胞凋亡。4.进一步探讨了 miRNA靶向Bcl11b参与ALV-J感染的分子机制,本研究首先克隆获得鸡Bcl11b 3’UTR序列1755 nt;通过miRDB、Targetscan、PicTar等在线预测软件并与测序分析数据结合预测靶向鸡 Bcl11b基因的miRNAs并结合双荧光素酶报告系统验证gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p可以靶向鸡Bcl11b;通过分别对miRNAs的过表达和抑制同时检测对鸡Bcl11b的表达水平以及细胞凋亡、周期的影响,结果发现gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p可以通过靶向Bcl11b影响Bcl11b基因的转录和翻译,进而影响了被转染细胞的凋亡水平;通过对ALV-J体外感染CEF细胞过程中Bcl11b基因表达水平、细胞凋亡水平出现拐点的时候（3～5dpi）抑制内源性gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p的表达,发现靶基因Bcl11b表达水平显着上调,细胞凋亡水平也显着上调（P<0.05）。这表明gga-miR-1612、gga-miR-6701-3p通过靶向Bcl11b基因介导细胞凋亡。5.为了探究circRNA2420-miRNA-Bcl11b的调控机制,首先通过qRT-PCR、分子克隆等方法对circRNA2420特征进行分析,发现其是高稳定闭合环状转录本,且其成环并不依赖侧翼内含子上的重复序列;接着对circRNA<sub>2420进行过表达和干扰表达,检测鸡Bcl11b的表达以及细胞的凋亡水平变化,发现过表达circRNA2420后Bcl11b表达量显着上调（P<0.05）,细胞凋亡水平也随之上调（P<0.05）;反之干扰circRNA2420表达后Bcl11b表达量显着下调（P<0.05）,细胞凋亡水平也相应下降（P<0.05）,但是细胞周期没有变化（P>0.05）;通过双荧光素酶报告系统验证靶向Bcl11b基因的两个miRNA（gga-miR-1612 和 gga-miR-6701-3p）与 circRNA2420 的作用方式以及鸡Bcl11b与circRNA2420的互作,发现gga-miR-1612可以靶向结合鸡circRNA2420影响荧光素酶活性,circRNA2420也间接影响了Bcl11b基因的活性。说明circRNA2420可以通过吸附miRNAs（包括gga-miR-1612）调控鸡Bcl11b的表达,进而影响细胞的凋亡。6.为了探究Bcl11b介导细胞凋亡的机制,通过ChIP-seq实验发现Bcl11b作为一种锌指蛋白转录因子可以靶向多个细胞凋亡相关的基因进而参与细胞凋亡及信号通路等多种生物学过程,为揭示Bcl11b的功能及作用机制提供了线索。综上所述,本研究发现ALV-J感染过程中circRNA<sub>2420可以通过吸附miR-1612间接促进鸡Bcl11b基因的表达,而Bcl11b作为一种锌指蛋白转录因子调控凋亡相关基因的转录,进而介导细胞的凋亡调控ALV-J感染。研究结果进一步完善ALV-J感染致瘤机制的基础研究,也为寻找有效的生物标记以提高抗病育种工作提供新的靶点和思路。
何书海[7]（2019）在《J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受的致病机制研究》文中进行了进一步梳理J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是一种致瘤性逆转录病毒,在临床上主要诱发肉鸡和蛋鸡发生髓系细胞白血病和其它各种类型的肿瘤性疾病。自1991年该病毒被发现以来,ALV-J在全世界范围内的各种鸡群中广泛流行并呈现间歇性爆发之势,曾对世界范围内的养鸡业造成了毁灭性打击。目前,ALV-J在我国各品系鸡群中的感染相当普遍,给家禽养殖业带来了巨大的经济损失。除了造成鸡的生产性能下降和诱发肿瘤外,一个更为严重但也容易被忽视的问题是ALV-J感染会造成被感染鸡出现严重的免疫耐受,且免疫耐受是肿瘤形成和机会性感染的必要条件。遗憾的是,迄今为止人们对ALV-J诱导免疫耐受的根本原因和机制知之甚少,所以阐明ALV-J诱导宿主免疫耐受的发病机制对防控该病具有现实而重要的意义。本研究通过建立ALV-J免疫耐受感染实验模型,从发育学、细胞学、免疫学及分子生物学角度明确ALV-J感染鸡的免疫状况及其与免疫耐受形成之间的内在联系;利用现代生命科学前沿技术,检测和分析了ALV-J感染细胞内相关蛋白的表达差异,明确其在B细胞发育和功能相关信号通路中的作用,并对ALV-J的分子致病机制进行理论概括。为研究先天性感染与后天感染诱导免疫耐受的差异,本研究分别通过胚内注射ALV-J模拟先天感染和雏鸡注射ALV-J模拟后天感染的方式建立了实验模型。研究发现,ALV-J胚内感染可造成被感染鸡出现持续性病毒血症但没有抗体反应（即免疫耐受）,而雏鸡时感染ALV-J则只有一部分鸡表现为免疫耐受。通过ELISA检测发现免疫耐受鸡血液中总免疫球蛋白（Ig M和Ig G）水平显着降低。进一步运用免疫组织化学法检测了免疫耐受鸡免疫器官中Ig M+和Ig G+B细胞的数量和发育动态,检测和评价了被感染鸡脾脏B细胞应对胸腺非依赖型抗原脂多糖（LPS）刺激后的活化与增殖能力。结果显示,免疫耐受鸡体内的B细胞向Ig M+和Ig G+抗体生成细胞（特别是Ig G型细胞）发育和分化的能力受到严重的抑制;脾脏生发中心B细胞应对有丝分裂原刺激后活化与扩增能力也被抑制。为了解ALV-J先天感染与后天感染鸡对特异性抗原刺激的免疫应答能力的差异,进一步检测了宿主应对绵羊红细胞（SRBC）及马立克氏病病毒（MDV）减毒1型疫苗刺激所产生的Ig M型和Ig G型抗体滴度。结果显示,先天感染鸡所产生的抗原特异性Ig M型和Ig G型抗体滴度显着降低;然而,虽然后天感染鸡体内抗原特异性Ig G型特异性抗体滴度显着降低,但Ig M型抗体滴度基本正常,这些数据提示ALV-J后天感染对鸡体内B细胞的早期发育影响不大。综合以上实验结果可知,ALV-J先天感染抑制了B细胞的发育及成熟,并抑制了B细胞免疫球蛋白的生成和抗体类别转换能力。为了进一步探明ALV-J先天感染诱导免疫耐受的细胞学机制,本研究检测了自鸡胚发育到雏鸡的各时段法氏囊B细胞发育动态。细胞形态学检测结果显示,ALV-J胚内感染鸡法氏囊发育严重不良且大部分淋巴滤泡不能分化为明显的髓质和皮质,提示这些淋巴滤泡处于幼稚状态;然而孵化后感染ALV-J的鸡法氏囊发育虽然也受到抑制,但大部分淋巴滤泡能够形成皮质部。这些结果证实ALV-J先天感染对鸡法氏囊B细胞的发育影响更大。流式细胞分析结果进一步发现ALV-J胚内感染会造成更高的B细胞感染率（约27%）,且免疫组化结果显示这些gp85抗原阳性B细胞体积和核桨比例较大,大多处于发育早期阶段。以上结果说明,ALV-J的先天感染会导致了胚胎B细胞的后期发育抑制,并因此造成B细胞抗体生成障碍。流式细胞分析结果证实ALV-J阻断了法氏囊中CD117+祖B细胞的分化,并且体外实验进一步证实ALV-J抑制了CD117+B细胞体外增殖能力和应答LPS和IL-4刺激所发生的免疫球蛋白基因类别转换重组能力。综合分析以上体内外实验数据,提示ALV-J诱导的免疫耐受与B细胞发育受阻和功能障碍密切相关,而导致B细胞出现这种“无能”状态的关键原因就是ALV-J选择性作用于早期发育的B细胞并抑制它们的进一步发育和成熟。相关ALV-J感染细胞的蛋白质组学检测结果显示,ALV-J感染改变了DF-1细胞中酪氨酸激酶Lyn的蛋白表达水平。Lyn是B细胞BCR信号通路中的核心因子,其参与了B细胞增殖、分化、成熟或耐受等相关生物学过程。因此,为明确ALV-J诱导B细胞无能的分子机制,本研究进一步分析了ALV-J对B细胞中Lyn的表达调控及对BCR信号转导的影响。Western-blot及免疫组织化学检测结果显示,ALV-J胚内感染鸡法氏囊细胞中的Lyn表达水平上升。因体内实验显示ALV-J感染鸡B细胞中Lyn表达异常,本研究进一步在体外实验中研究了ALV-J对Lyn表达的影响。通过激光共聚焦显微镜观察发现,ALV-J感染B细胞后其病毒gp85蛋白主要分布于细胞浆,同时也有一部分B细胞的胞浆和胞核均有病毒gp85的阳性信号。q RT-PCR和Western-blot检测结果与体内实验结果一致,即ALV-J感染导致B细胞内Lyn的m RNA转录水平和蛋白合成水平均被上调。Lyn在BCR信号转导中同时具有正调控和负调控作用,而这种正负调控作用取决于其不同磷酸化位点的活化水平。为明确Lyn在ALV-J感染组B细胞中发挥的主导作用,本研究进一步检测了BCR信号激活后Lyn蛋白的磷酸化水平及其下游直接底物Syk蛋白的磷酸化水平。流式细胞术分析结果显示,当激活BCR信号后,感染组B细胞中Tyr397位点（激活正调控作用）和Tyr507位点（激活负调控作用）的磷酸化水平均不同程度的增强。此时,作为BCR信号转导的核心激酶同时也是Lyn的直接底物Syk的磷酸化水平就显得尤为重要。流式细胞分析结果显示,此时Syk的磷酸化水平显着下降,提示Lyn在感染组B细胞中主要发挥了抑制BCR信号转导的作用。为了确证这种作用,本研究进一步对B细胞中的Lyn进行了sh RNA干扰并检测了相关蛋白的磷酸化水平。检测结果显示,对感染组B细胞实施Lyn的sh RNA干扰后,其下游蛋白Syk的磷酸化水平显着回升。以上实验数据进一步说明Lyn在感染B细胞中发挥了抑制BCR信号转导的作用,从而导致了B细胞BCR信号级联反应受阻。综上所述,ALV-J诱导的免疫耐受与B无能有关,其根本原因在于ALV-J阻滞了CD117+祖B细胞的发育和分化;而导致B细胞发育和分化障碍的分子机制是ALV-J激活了Lyn在BCR信号转导中的抑制性作用。总之,本研究从细胞和分子两个维度全面解析了ALV-J诱导免疫耐受机制,为禽白血病的防控及揭示相关病毒诱导免疫耐受的机制研究提供了理论依据。
沈习[8]（2019）在《抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制与不同试剂盒临床检测差异性分析》文中研究指明禽白血病病毒（Avianleukosisvirus,ALV）属于反转录病毒科禽C型反转录病毒属,与禽类多种肿瘤性疾病及生产性能息息相关。该病毒主要引起禽类产生肿瘤以及慢性消耗性死亡,造成免疫抑制及生长迟缓,产蛋率大幅度下降,给养禽业带来巨大损失。ALV通过垂直和水平两种方式传播,限制本病的主要方法是淘汰阳性鸡,净化种群中的ALV-A、B、C、D、J和K等亚群。不同亚群病毒有不同的生物学特性以及临床症状,临床上选择合适的试剂盒是净化该病毒的关键。本研究通过研制针对A亚群禽白血病病毒gp85的单克隆抗体,并分析不同试剂盒检测禽白血病的差异性,为生产实践中禽白血病的净化提供研究基础。1 抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定Gp85是ALV的囊膜蛋白,由ALV基因组中env基因编码,具有亚群特异性。本研究首先设计出一对针对A亚群禽白血病病毒env基因的特异性引物,PCR扩增本实验室分离保存的ALV-A-AH10毒株的gp85基因,然后构建原核表达载体PET32a-AH10-gp85,通过转化入BL21感受态细胞,筛选阳性转化质粒并经IPTG诱导表达,对表达的菌体进行超声波破碎,取离心后的上清和沉淀分别作SDS-PAGE分析,结果获得大小约53KD的目的蛋白。纯化后的PET32a-AH10-gp85蛋白与适量佐剂乳化后免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,三次免疫后测小鼠血清抗体效价,对免疫效果较好的加强免疫,三天后取脾脏与骨髓瘤细胞进行融合。用感染AH10病毒的DF1细胞板,固定后,对融合成功的杂交瘤细胞进行IFA筛选。阳性孔经过2-3次亚克隆,结果获得五株稳定分泌单克隆抗体,分别命名为ALV-A-1B12、ALV-A-1C12、ALV-A-1E5、ALV-A-1F8 和 ALV-A-3D11。Western-blot 和 IFA试验结果表明,所获单抗3D11只针对ALV-A/B囊膜蛋白gp85抗原,而其余四株可与J亚群病毒发生荧光反应。本次研究成功制备出一株针对ALV-A/B的单克隆抗体（3D11）,为快速筛检田间感染A/B亚群禽白血病病毒的鸡群提供了临床诊断试剂。2不同试剂盒检测禽白血病肛拭阳性率的差异性分析建立快捷准确,成本低,可用于大批量田间试验的诊断技术是防制禽白血病的重要一环。ELISA检测方法因其具有灵敏、快捷、适用于大面积检测等特点,在众多方法中脱颖而出,被广泛应用于禽白血病的种群净化中。为探索不同ELISA试剂盒针对禽白血病p27抗原检测灵敏度的差异性,本研究将60只2周龄黄羽雏鸡（包括30只活鸡、30只死鸡）进行编号并采集肛拭、血样及组织样本。分别用IDEXX公司p27抗原检测试剂盒和sELISA试剂盒检测其肛拭样本。血样及组织样本接种DF1细胞分离病毒,7天后取培养上清进行p27抗原检测及鉴定,分析比较肛拭阳性率差异,并通过PCR、RT-PCR及间接免疫荧光法验证。结果显示,sELISA试剂盒肛拭阳性检出率为68%,IDEXX试剂盒阳性检出率为27%,且IDEXX公司阳性检出样本均存在于sELISA试剂盒阳性检出的样本中。阳性差异样本通过测序分析,进一步确认为感染K亚群禽白血病病毒,这一结果显示,sELISA试剂盒能够更灵敏有效地检测阳性肛拭样本,特别是检测肛拭中的禽白血病K亚群病毒。
吕孙良[9]（2019）在《湖南省养殖禽类主要病毒性流行病初步调查》文中指出湖南省是养殖业大省,每年为省内外输送以鸡肉为主的大量禽类制品,但以禽流感（Avian Influenza,AI）为代表的禽类流行病的存在对禽类养殖业带来巨大的危害,例如AI和鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis,IB）此类急性传染病能导致禽类迅速大批死亡,而禽白血病（Avian Leukosis）和马立克氏病（Marek’s Disease）此类慢性传染病则主要导致免疫功能下降和各类肿瘤的发生。大部分禽类病毒性流行病的防控主要以预防为主。迄今,尚未见有湖南省内养殖禽类主要病毒性流行病的调查报道。本研究自2018年1月至2019年2月,收集了来自湖南省16个地区,22个养殖场总共225份血清或组织样品,利用PCR或逆转录PCR及T-A克隆技术对影响禽类健康的6种主要病毒性流行病的病原,即禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）、禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）、马立克氏病病毒（Marek’s Disease Virus,MDV）、鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）、鸡星状病毒（Chicken Astrovirus,CAstV）和鸡肾炎病毒（Avian Nephritis Virus,ANV）的流行和分布情况进行了检测。结果在5个养殖场的送检样品中检测出5株AIV,场阳性率为22.73%（5/22）,总体样品阳性率为8.44%（19/225）;19个养殖场检测出E亚群ALV（ALV-E）,1个养殖场检测出ALV-J,1个养殖场检测出ALV-F,场阳性率分别为90.47%、4.76%和4.76%。此外,发现了两株很可能是新亚群的ALV;3个养殖场检测出强毒型MDV,场阳性率为14.29%（3/21）,总体样品阳性率为12.18%（19/156）;有2个养殖场检测出肾型IBV,场阳性率为9.52%（2/21）,总体样品阳性率为3.21%（5/156）;2个场检测出CAstV,场阳性率为9.52%（2/21）,总体样品阳性率为6.41%（10/156）,且这两株CAstV有可能是新的亚型;1个场检测出ANV-2,场阳性率为4.76%（1/21）,总体样品阳性率为0.64%（1/156）。本次对湖南省内禽类病毒性流行病的调查发现,省内各地的禽类养殖场普遍存在有ALV-E,需加强对种鸡的筛查;而检测出的5株AIV为H5和H7亚型,说明H5和H7亚型的防控形势依然严峻;肾型IBV的检出说明对IBV的预防应重点放在肾型;强毒型MDV的发现则提示传统MDV疫苗可能不能提供有效的免疫保护,需要开发出新型MDV疫苗;而新型ALV、新型CAstV和ANV-2对于禽类的影响还有待进一步实验的验证,但对养禽业的潜在危害需要引起重视。本研究对6类主要的禽类病毒性流行病的病原在湖南省禽类养殖场的流行情况进行了初步的调查,为今后的省内禽类疾病防治工作提供了基本的参考资料。
范朦朦[10]（2019）在《J亚群禽白血病RT—PGR检测方法的建立与应用及分离毒株序列分析》文中指出禽白血病是一种广泛存在于肉鸡和蛋鸡养殖业中的一种以引起免疫抑制和肿瘤性疾病为主的传染性疾病[1],以J亚型禽白血病（ALV-J）流行最为广泛,致病力最强[2-3],表现为高带毒率,低发病率和低死亡率[4],多引起生长和免疫抑制[5-8],造成生产性能降低[9-10],给我国养殖业带来了巨大的危害。目前对于禽白血病尚无有效的药物和疫苗[11],主要通过检测淘汰带毒鸡来净化种群,从根源上杜绝该病的传播。公鸡可以通过输精将病毒传染给母鸡,对公鸡进行ALV净化是鸡场净化ALV的关键。传统的检测方法应用最为广泛的有ELISA法、病毒分离法、IFA免疫荧光实验等,各有优缺点。本研究建立了一种RT-PCR（逆转录PCR）的检测方法,采样方便,检测快速,可以有效地对公鸡和母鸡进行ALV检测,阳性检出率相比传统检测法更高,该方法经过实践应用取得了良好的效果。试验一:禽白血病病毒在家禽各组织中的表达定量分析为了了解ALV-J在家禽各组织器官中表达的规律,确定检测ALV的采样材料,试验对3只ALV-J患病鸡进行解剖,提取毛囊、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、空回肠、盲肠、胰脏、泄殖腔上皮组织、输卵管、卵巢、气管等十四个组织器官的RNA,反转录成cDNA,再进行ALV-J的定量检测分析,结果显示,ALV-J在家禽各组织器官均有表达,但表达量存在差异,其中以泄殖腔上皮组织、毛囊、输卵管、卵巢、肾脏等代谢旺盛的部位表达量最高。试验二:RT-PCR检测方法的建立与应用鉴于ALV-J在泄殖腔上皮组织中表达量最高,本试验使用鸡的泄殖腔棉拭子作为ALV-J的检测材料,建立了一种RT-PCR的检测方法（逆转录PCR）法:提取样本稀释液中的RNA,再反转录成cDNA,最后使用ALV-J特异性引物H5、H7进行PCR扩增并进行凝胶电泳,最后对试验结果进行判定。本试验对建立的PCR法进行了退火温度和引物浓度的优化,得出最佳退火温度为58℃,最佳引物浓度为2.4μM。反应灵敏性为3.07×102个拷贝数的病毒。应用试验建立的RT-PCR法对某规模化养鸡场内蛋鸡进行检测,结果显示RT-PCR法阳性检出率明显高于ELISA检测法和病毒分离检测法。试验三:不同品系种公鸡ALV-J感染率检测接下来使用试验建立的RT-PCR检测法对某规模化养殖场饲养条件相同的19个不同品系的种公鸡进行ALV-J检测,共检种公鸡1083只,其中阳性共258只,总阳性率为23.82%,而每个品系的阳性率差异很大,从8.33%-58.33%不等。试验四:分离毒株序列分析为了了解鸡场内流行毒株的遗传信息,分析毒株来源及毒株遗传变异情况,本研究对试验二和试验三养殖场进行了ALV-J毐株的致病区env序列分离,和国内外ALV-J参考毒株进行序列比对分析,构建遗传进化树。结果显示,所分离到的两株ALV-J 株和所有ALV-J参考毒株属于同一个大分支,和A、B、C、D亚群以及内源性E亚群不属于同一分支,表明所分离到的毒株为J亚型ALV而非其他亚型;另外两株分离株同属于一个小分支,具有很高的相似性和非常接近的遗传关系,而两个鸡场为引种和供种的关系,由此推测,引种是传播该病的一个重要因素。试验五:ALV-J感染鸡病理剖检为了了解ALV-J感染引起的临床病理变化,探究分离毒株的致病力和致病特性,试验对8只疑似ALV-J病死鸡进行了病理剖检,观察了其临床病理变化,发现感染了ALV-J的鸡分为有明显症状型和无明显症状型。有明显症状型的鸡表现为鸡冠发白、龙骨弯曲、肝脏肿大、心脏瘀血、脾脏坏死、肝脏肿瘤、盲肠肿大、胰脏肿瘤、肠系膜肿瘤、肌胃腺胃肿瘤、胸腺扁桃体肿大等;无明显症状型的鸡仅表现为肝脏肿大、肾脏肿大、脾脏肿大等,几乎没有其他病理变化,也没有肿瘤的发生。
二、对禽逆转录病毒特别是J亚群白血病病毒感染的回顾（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、对禽逆转录病毒特别是J亚群白血病病毒感染的回顾（论文提纲范文）
（1）K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽白血病 |
| 1.1.1 ALV病原学 |
| 1.1.2 ALV流行病学 |
| 1.1.3 ALV致病性 |
| 1.1.4 ALV防控现状与存在问题 |
| 1.2 K亚群禽白血病病毒(ALV-K) |
| 1.2.1 ALV-K的发现 |
| 1.2.2 ALV-K基因结构及特点 |
| 1.2.3 ALV-K致病性及危害 |
| 1.2.4 ALV-K在我国鸡群感染现状 |
| 1.3 ALV抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.1 ALV-A/B/J抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.2 ALV-K抗体检测ELISA研究进展 |
| 1.3.3 ALV-K抗体检测ELISA存在的问题 |
| 1.4 ALV单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.1 ALV-A/B/J单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.2 ALV-K单克隆抗体研究进展 |
| 1.4.3 ALV-K单克隆抗体研究存在的问题 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 病毒、细胞、抗体和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 2.2.2 K亚群gp85 蛋白原核表达体系的建立 |
| 2.2.3 间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 2.2.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 2.2.5 ALV-K gp85 蛋白的单克隆抗体制备 |
| 2.3 数据处理与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 ALV-K gp85 目的基因分析 |
| 3.1.1 基因序列分析 |
| 3.1.2 目的蛋白分析 |
| 3.2 ALV-K gp85 特异基因的原核表达 |
| 3.2.1 ALV-K gp85 特异基因克隆PCR产物的鉴定 |
| 3.2.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 gp85 特异性蛋白的制备及鉴定 |
| 3.3 ALV-K间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 3.3.1 间接ELISA条件的优化 |
| 3.3.2 特异性试验 |
| 3.3.3 敏感性试验 |
| 3.3.4 重复性试验 |
| 3.3.5 符合率试验 |
| 3.3.6 保存期试验 |
| 3.4 ALV-K gp85 蛋白的多克隆抗体制备 |
| 3.4.1 多克隆抗体效价测定 |
| 3.4.2 多克隆抗体的纯化及检测鉴定 |
| 3.4.3 多克隆抗体的识别检测 |
| 3.5 ALV-K gp85 蛋白的单克隆抗体制备 |
| 3.5.1 ALV-K gp85 蛋白免疫小鼠效价测定 |
| 3.5.2 杂交瘤细胞融合观察 |
| 3.5.3 杂交瘤细胞抗体分泌鉴定 |
| 3.5.4 腹水制备鉴定及应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ALV-K gp85 重组蛋白的制备 |
| 4.2 ALV-K间接ELISA检测抗体方法的建立 |
| 4.3 ALV-K多克隆抗体的制备 |
| 4.4 ALV-K单克隆抗体的制备 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得学术成果 |
（2）江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 家禽免疫抑制病概述 |
| 1.1 鸡传染性贫血 |
| 1.2 马立克病 |
| 1.3 网状内皮组织增生症 |
| 1.4 禽白血病 |
| 1.5 我国家禽免疫抑制病病原感染现状 |
| 2 免疫抑制病病原检测方法的研究概况 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 血清学检测技术 |
| 2.3 分子生物学检测技术 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 毒株来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 样品DNA的提取 |
| 2.4 样品RNA的提取和反转录 |
| 2.5 样品PCR检测 |
| 2.6 数据整理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病原的PCR检测结果 |
| 3.2 感染类型分析 |
| 3.3 不同日龄鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.4 不同品种鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.5 江苏地区鸡2016-2019年免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.6 4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株来源 |
| 1.2 临床样品来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2 病毒核酸提取 |
| 2.3 荧光定量PCR质粒标准品的制备与鉴定 |
| 2.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.6 临床样品的检测和验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒测序鉴定结果 |
| 3.3 质粒标准品的制备 |
| 3.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.6 临床样品的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 发病鸡背景资料及流行病学调查 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测 |
| 2.2 MDV分离培养 |
| 2.3 REV和ALV分离培养 |
| 2.4 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.5 致病相关基因的PCR扩增、测序及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 发病鸡的组织病变 |
| 3.2 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3 REV和ALV分离结果 |
| 3.4 MDV分离结果 |
| 3.5 间接免疫荧光试验 |
| 3.6 致病相关基因的PCR扩增及序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 本文第二章120份临床病鸡样品的流行病学背景资料 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）2017-2019年我国部分省份白羽肉鸡ALV-J的分离鉴定及env序列分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 ALV的形态 |
| 1.1.2 ALV的物理化学性质 |
| 1.1.3 ALV基因组结构 |
| 1.1.4 ALV 分类 |
| 1.1.5 ALV的变异与重组 |
| 1.1.6 ALV的致病性 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.2.1 流行史 |
| 1.2.2 临床症状与病理变化 |
| 1.2.3 传染源 |
| 1.2.4 易感动物 |
| 1.2.5 传播途径 |
| 1.3 病毒的检测与诊断 |
| 1.3.1 病毒的分离鉴定 |
| 1.3.2 血清学检测 |
| 1.4 禽白血病的综合防控 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 主要分子生物学试剂与试剂盒 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病鸡剖检 |
| 2.2.2 病理组织学检查 |
| 2.2.3 血浆样品采集 |
| 2.2.4 血浆样品的处理 |
| 2.2.5 DF-1细胞复苏与培养 |
| 2.2.6 血浆样品病毒分离鉴定 |
| 2.2.7 细胞上清ALV-p27 抗原ELISA检测方法 |
| 2.2.8 间接免疫荧光(IFA)试验 |
| 2.2.9 病毒RNA提取 |
| 2.2.10 病毒RNA的 RT-PCR |
| 2.2.11 扩增产物回收与纯化 |
| 2.2.12 PCR产物与T载体连接 |
| 2.2.13 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.14 连接产物转化 |
| 2.2.15 重组克隆细菌的筛选 |
| 2.2.16 质粒的提取 |
| 2.2.17 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.18 阳性克隆的测序与序列分析 |
| 2.2.19 疫苗中外源病毒污染的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 生产数据分析与剖检记录 |
| 3.2 临床症状 |
| 3.3 病理观察 |
| 3.4 病毒分离与P27检测结果 |
| 3.5 IFA实验结果 |
| 3.6 env基因测序 |
| 3.7 本研究分离株之间的同源性分析 |
| 3.8 本研究分离株与参考毒株序列同源性分析 |
| 3.9 遗传进化分析 |
| 3.10 基因序列分析 |
| 3.11 疫苗外源病毒检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 我国部分地区白羽肉鸡群ALV-J的流行病学调查 |
| 4.2 我国白羽肉鸡群中新发ALV-J基因组变异分析 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
（4）广西不同黄羽肉鸡品系种公鸡中禽白血病病毒分离鉴定及一株重组毒株基因组解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 ALV研究进展 |
| 1.1.1 ALV的形态 |
| 1.1.2 ALV的理化特性 |
| 1.1.3 ALV基因组 |
| 1.1.4 ALV的分类 |
| 1.1.5 ALV-J的发现 |
| 1.1.6 ALV致病性 |
| 1.2 ALV流行病学 |
| 1.2.1 ALV传播方式 |
| 1.2.2 ALV-J的流行病学和净化 |
| 1.2.3 ALV临床症状与病理变化 |
| 1.2.4 ALV检测和诊断 |
| 1.3 禽白血病研究现状与展望 |
| 1.4 禽白血病的综合防控 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 第二章 广西地区不同黄羽肉鸡品系种公鸡中禽白血病流行病学调查 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂及配制方法 |
| 2.1.5 鸡群背景及样品采集 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 血液样品采集 |
| 2.2.2 血液样品处理 |
| 2.2.3 DF-1细胞复苏 |
| 2.2.4 血浆样品病毒分离鉴定 |
| 2.2.5 应用ELISA检测细胞培养上清ALV-p27 抗原 |
| 2.2.6 精液样品的采集 |
| 2.2.7 精液样品的处理 |
| 2.2.8 精液样品接种病毒 |
| 2.2.9 ELISA试剂盒检测公鸡精液ALV-p27 抗原 |
| 2.2.10 部分毒株gp85基因的测序 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 以公鸡血液为样品标准的各品系ALV分离鉴定结果 |
| 2.3.2 以公鸡精液为样品标准的各品系ALV分离鉴定结果 |
| 2.3.3 分别以血浆样品和精液样品实施病毒分离的结果对比 |
| 2.3.4 部分分离毒株的gp85序列分析与亚群鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ALV-J天然重组毒GXRJ01 株的分离鉴定与基因组分析 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 血浆样品的采集与处理 |
| 3.2.2 用于基因组测序的引物合成 |
| 3.2.3 病毒RNA提取 |
| 3.2.4 病毒RNA的 RT-PCR |
| 3.2.5 扩增产物的回收及纯化 |
| 3.2.6 PCR产物与T载体连接 |
| 3.2.7 DH5α感受态细胞的制备 |
| 3.2.8 连接产物的转化 |
| 3.2.9 重组克隆细菌的筛选 |
| 3.2.10 质粒的提取 |
| 3.2.11 质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.12 阳性单克隆的测序与序列分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 血浆样品细胞培养病毒分离结果 |
| 3.3.2 用于病毒全基因序列测定的毒株 |
| 3.3.3 全基因组序列与其他亚群的序列比对及遗传进化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（5）南通地区禽白血病的流行病学调查及其净化的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 符号说明 第1章 禽白血病概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 ALV的分类 |
| 1.1.2 禽白血病病毒结构 |
| 1.1.3 禽白血病病毒对理化因素的抵抗力 |
| 1.1.4 禽白血病病毒的致病性及致病机理 |
| 1.2 禽白血病的传播方式与流行情况 |
| 1.3 禽白血病的诊断与检测 |
| 1.3.1 病毒的分离鉴定 |
| 1.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.3.3 免疫荧光技术(IFA) |
| 1.3.4 聚合酶链式反应(PCR)技术 |
| 1.3.5 血清型检测 |
| 1.4 禽白血病的预防与控制 |
| 1.4.1 免疫接种 |
| 1.4.2 禽白血病抗性鸡的培育 |
| 1.4.3 禽白血病净化 第2章 南通地区禽白血病的流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和检测试剂盒 |
| 2.1.2 样品来源 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂耗材 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病鸡样品检测 |
| 2.2.2 规模化鸡场样品的检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 主要病变观察 |
| 2.3.2 病毒分离间接免疫荧光结果 |
| 2.3.3 多重PCR鉴定 |
| 2.3.4 env基因PCR扩增 |
| 2.3.5 gp85基因序列分析 |
| 2.3.6 gp37基因序列分析 |
| 2.3.7 禽白血病抗体检测结果 |
| 2.3.8 禽白血病病毒p27抗原夹心ELISA检测试剂盒检测结果 |
| 2.4 讨论 第3章 两个品系种鸡群禽白血病净化的初步研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 地方种鸡群 |
| 3.1.2 细胞和检测试剂盒 |
| 3.1.3 主要试剂耗材 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 禽白血病净化方案的制定 |
| 3.2.2 待检样品的采集 |
| 3.2.3 禽白血病病毒p27抗原检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 第一代次种鸡群ALV感染情况 |
| 3.3.2 第二代次种鸡群ALV感染情况 |
| 3.3.3 第三代次种鸡群ALV感染情况 |
| 3.3.4 鸡群初步净化效果 |
| 3.4 讨论 全文总结 参考文献 致谢 |
（6）鸡circRNA2420-Bcl11b介导细胞凋亡调控ALV-J感染的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 禽白血病研究进展 |
| 1.1.1 禽白血病概况 |
| 1.1.2 禽白血病病毒研究进展 |
| 1.1.3 禽白血病临床诊断 |
| 1.1.4 J亚群禽白血病病毒致病与致瘤机制 |
| 1.1.5 禽白血病的防控措施 |
| 1.2 Bcl11b的研究进展 |
| 1.2.1 BCL(B-cell lymphoma/leukemia)家族 |
| 1.2.2 BCL11B的结构与功能 |
| 1.2.3 BCL11B在血液系统肿瘤中的功能 |
| 1.2.4 BCL11B与其他恶性肿瘤的关系 |
| 1.2.5 家禽中BCL11基因研究进展 |
| 1.3 CircRNA研究进展 |
| 1.3.1 CircRNA形成机制 |
| 1.3.2 CircRNA的生物学功能 |
| 1.3.3 CircRNA与肿瘤的关系 |
| 1.3.4 CircRNA在家禽上的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第2章 ALV-J感染相关转录本及互作关系筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 鸡转录本特征分析 |
| 2.2.2 感染组与非感染组差异表达分析 |
| 2.2.3 ALV-J感染相关差异表达转录本功能注释与富集 |
| 2.2.4 ALV-J感染相关互作网络分析与构建 |
| 2.2.5 ALV-J感染关键转录本验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 鸡转录本特征比较 |
| 2.3.2 ALV-J感染相关差异表达转录本联合分析 |
| 2.3.3 功能富集分析 |
| 2.3.4 ceRNA互作及共表达网络的构建 |
| 2.3.5 ALV-J感染致病致瘤候选转录本鉴定 |
| 第3章 鸡Bcl11b基因克隆、表达及功能初步分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 鸡Bcl11b基因CDS克隆与序列分析 |
| 3.2.2 鸡Bcl11b基因表达规律分析 |
| 3.2.3 鸡Bcl11b基因过表达对细胞活力、凋亡及周期的影响 |
| 3.2.4 鸡Bcl11b基因干扰对细胞凋亡及周期的影响 |
| 3.2.5 Bcl11b在ALV-J感染过程的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 鸡Bcl11b调控ALV-J感染的作用机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 鸡Bcl11b 3'UTR获取 |
| 4.2.2 靶向鸡Bcl11b 3'UTR的miRNAs预测及鉴定 |
| 4.2.3 miRNAs靶向鸡Bcl11b基因参与ALV-J的感染 |
| 4.2.4 circRNA_2420-miRNA-Bcl11b网络关系验证 |
| 4.2.5 鸡Bcl11b在基因组上结合位点分析 |
| 4.2.6 Bcl11b基因调控模式图 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 miRNA靶向Bcl11b调节ALV-J的感染过程 |
| 4.3.2 家禽circRNA成环机制 |
| 4.3.3 circRNA_2420作为ceRNA靶向鸡Bcl11b调节细胞凋亡 |
| 4.3.4 转录因子Bcl11b靶基因分析 |
| 全文结论 |
| 主要创新点 |
| 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受的致病机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 禽白血病病毒概述 |
| 1.1.1 ALVs家族及亚群 |
| 1.1.2 ALVs的结构特征 |
| 1.1.3 ALVs的理化特征 |
| 1.1.4 ALV-J的实验室宿主系统 |
| 1.1.5 ALV-J的致病性 |
| 1.2 禽白血病病毒对免疫系统的损伤及其诱导的免疫耐受 |
| 1.2.1 ALVs对免疫系统损伤的研究进展 |
| 1.2.2 ALV-J诱导的免疫耐受 |
| 1.2.3 与免疫耐受相关的几个概念 |
| 1.3 鸡免疫器官特点及B细胞免疫应答的分子机制 |
| 1.3.1 鸡免疫器官的组成及发育特点 |
| 1.3.1.1 鸡T细胞的发育及分化 |
| 1.3.1.2 鸡B细胞的发育及分化 |
| 1.3.2 B细胞介导的体液免疫及免疫球蛋白产生的分子机制 |
| 1.3.2.1 B细胞介导的体液免疫 |
| 1.3.2.2 免疫球蛋白的结构特点 |
| 1.3.2.3 免疫球蛋产生的分子机制 |
| 1.4 BCR信号转导及Lyn介导B细胞无能和耐受的分子机制 |
| 1.4.1 B细胞抗原受体及BCR信号通路 |
| 1.4.2 Lyn在 BCR信号转导中的正调控及负调控作用 |
| 1.4.3 Lyn介导B细胞无能和免疫耐受的机制 |
| 1.4.3.1 无能B细胞的生物学特征 |
| 1.4.3.2 Lyn介导B细胞无能和免疫耐受的分子机制 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 主要检测试剂及耗材 |
| 2.2 主要缓冲液 |
| 2.3 抗体 |
| 2.4 细胞及病毒 |
| 2.4.1 DF-1 细胞的培养传代与冻存 |
| 2.4.2 DT40 细胞的培养传代与冻存 |
| 2.4.3 鸡B淋巴细胞祖细胞的分选与培养 |
| 2.4.4 细胞的病毒感染 |
| 2.4.5 病毒TCID50的检测 |
| 2.5 主要仪器与设备 |
| 2.6 ALV-J先天感染免疫耐受鸡实验模型的建立 |
| 2.6.1 先天感染模型 |
| 2.6.2 后天感染模型 |
| 2.6.3 ALV-J p27 抗原的检测 |
| 2.6.4 抗ALV-J抗体的检测 |
| 2.7 鸡免疫器官病理组织学观察 |
| 2.8 免疫组化检测 |
| 2.9 免疫球蛋白及相关抗体水平ELISA检测 |
| 2.9.1 鸡血液总免疫球蛋白水平的ELISA检测 |
| 2.9.2 鸡血液抗SRBC抗体及抗MDV抗体水平的ELISA检测 |
| 2.10 B细胞中Lyn的 shRNA干扰 |
| 2.11 流式细胞术检测 |
| 2.11.1 法氏囊内B细胞祖细胞发育和分化的检测 |
| 2.11.2 IgM及IgG细胞比例及B细胞内Ig基因CSR的流式细胞术检测 |
| 2.11.3 B细胞中Lyn及 Syk的磷酸化蛋白的流式细胞术检测 |
| 2.11.4 B细胞Ca2+流的流式细胞术检测 |
| 2.12 细胞增殖的CCK-8 检测 |
| 2.13 荧光定量PCR |
| 2.13.1 RNA的提取及反转录 |
| 2.13.2 荧光定量PCR |
| 2.14 蛋白质免疫印迹 |
| 2.15 统计分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 ALV-J免疫耐受鸡实验模型的建立 |
| 3.2 ALV-J感染鸡免疫器官病变特点 |
| 3.3 ALV-J胚内感染对早期B细胞发育的影响 |
| 3.4 ALV-J胚内感染对鸡体内Ig M型和IgG型 B细胞的影响 |
| 3.5 ALV-J感染对鸡特异性体液免疫应答能力的影响 |
| 3.6 ALV-J胚内感染对生发中心B细胞活化及扩增的影响 |
| 3.7 ALV-J对不同发育阶段B细胞的嗜性 |
| 3.8 ALV-J胚内感染对CD117~+祖 B细胞分化的影响 |
| 3.9 ALV-J对CD117~+祖 B细胞体外增殖的影响 |
| 3.10 ALV-J对CD117~+祖 B细胞体外分化与成熟的影响 |
| 3.11 ALV-J对CD117~+祖 B细胞Ig基因类别转换重组的影响 |
| 3.12 感染型DF-1 细胞中Lyn的蛋白质组学检测结果验证 |
| 3.13 ALV-J感染对法氏囊细胞中Lyn表达水平的影响 |
| 3.14 ALV-J对 B细胞中Lyn的表达水平的影响 |
| 3.15 ALV-J对 B细胞中Lyn磷酸化水平的影响 |
| 3.16 ALV-J感染对鸡法氏囊细胞Lyn及 Syk磷酸化水平的影响 |
| 3.17 Lyn shRNA干扰B细胞中Lyn蛋白表达水平 |
| 3.18 Lyn shRNA干扰B细胞中Lyn及 Syk的磷酸化水平 |
| 3.19 ALV-J感染对B细胞Ca2+流的影响 |
| 4.讨论 |
| 4.1 ALV-J先天感染诱导免疫耐受的细胞生物学机制 |
| 4.1.1 B细胞发育障碍与ALV-J感染诱导的免疫耐受直接相关 |
| 4.1.2 祖B细胞克隆无能是ALV-J诱导免疫耐受的重要因素 |
| 4.2 ALV-J诱导B细胞无能的分子机制 |
| 4.2.1 ALV-J感染导致BCR信号转导关键蛋白Lyn异常表达 |
| 4.2.2 ALV-J激活了Lyn在 BCR信号转导中的负调控作用 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 7.致谢 |
| 8.攻读学位期间发表论文情况 |
（8）抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制与不同试剂盒临床检测差异性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 计量单位 |
| 禽白血病概述 |
| 1 禽白血病病毒的基本形态及特性 |
| 1.1 病毒的分类 |
| 1.2 病毒的基因组结构 |
| 1.3 病毒的理化特性 |
| 1.4 病毒的细胞受体 |
| 1.5 病毒的致病性及致病机理 |
| 2 禽白血病的流行状况 |
| 2.1 传播方式 |
| 2.2 流行现状 |
| 3 禽白血病的诊断与检测 |
| 3.1 病毒的分离鉴定 |
| 3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.3 免疫荧光技术 |
| 3.4 聚合酶链式反应(PCR)技术 |
| 3.5 血清型诊断 |
| 4 禽白血病的预防与控制 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 研究内容一 抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制与鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病毒与细胞来源 |
| 1.2 菌株与载体 |
| 1.3 主要试剂及材料 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 目的片段的扩增 |
| 2.1.1 病毒扩增与TCID_(50)测定 |
| 2.1.2 细胞基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 引物的设计与合成 |
| 2.1.4 目的片段的扩增 |
| 2.2 目的片段的克隆 |
| 2.2.1 目的片段的回收 |
| 2.2.2 回收产物与pGEM-T-easy的连接 |
| 2.2.3 连接产物转化感受态细胞DH5a |
| 2.2.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.3 原核表达载体PET32a-AH10-gp85的构建 |
| 2.3.1 目的基因和表达载体PET-32a的酶切及回收 |
| 2.3.2 目的片段和表达载体PET-32a的连接 |
| 2.3.3 连接产物转化至BL21感受态细胞 |
| 2.3.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.4.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.4.2 菌体的超声波裂解 |
| 2.4.3 重组蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.4.4 IPTG诱导浓度的优化 |
| 2.4.5 重组蛋白的大量表达 |
| 2.5 重组蛋白的纯化和鉴定 |
| 2.5.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.5.2 包涵体的复性 |
| 2.5.3 重组蛋白western-blot分析 |
| 2.6 单克隆抗体的制备 |
| 2.6.1 实验动物、细胞及病毒 |
| 2.6.2 主要试剂耗材及仪器 |
| 2.6.3 免疫原的准备 |
| 2.6.4 实验动物的免疫 |
| 2.6.5 骨髓瘤细胞的准备 |
| 2.6.6 小鼠脾淋巴细胞的准备 |
| 2.6.7 细胞融合 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆 |
| 2.8 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 2.9 单克隆抗体腹水的制备 |
| 2.10 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.11 Western blot鉴定单抗的反应性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 目的基因的扩增 |
| 3.2 重组质粒PET32a-AH10-gp85的双酶切鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.4 诱导表达条件的优化 |
| 3.5 纯化蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.6 重组蛋白的western-blot分析 |
| 3.7 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.8 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 3.8.1 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 3.8.2 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 3.8.3 单克隆抗体的生物活性鉴定 |
| 4 讨论与小结 |
| 研究内容二 不同试剂盒检测禽白血病效果差异性分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样品采集与病毒分离 |
| 2.2 ELISA检测处理后样本 |
| 2.3 病毒基因组提取及PCR检测 |
| 2.4 RT-PCR检测活鸡差异样本 |
| 2.5 间接免疫荧光检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ELISA检测结果 |
| 3.2 PCR检测结果 |
| 3.3 RT-PCR检测结果 |
| 3.4 IFA检测结果 |
| 4 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）湖南省养殖禽类主要病毒性流行病初步调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒概述 |
| 1.1.1 禽流感病毒的病原学 |
| 1.1.2 禽流感病毒的流行趋势 |
| 1.1.3 禽流感病毒的感染途径及传播方式 |
| 1.1.4 禽流感病毒的检测方法 |
| 1.2 禽白血病病毒概述 |
| 1.2.1 禽白血病病毒的病原学 |
| 1.2.2 禽白血病病毒在养殖鸡群中的流行趋势 |
| 1.2.3 禽白血病病毒的传播方式 |
| 1.2.4 禽白血病病毒的致病机理 |
| 1.2.5 禽白血病病毒的检测方法 |
| 1.3 其余常见禽类病毒 |
| 1.3.1 马立克氏病病毒 |
| 1.3.2 鸡传染性支气管炎病毒 |
| 1.3.3 鸡星状病毒与鸡肾炎病毒 |
| 1.4 本课题研究目的及方案 |
| 第2章 湖南省禽流感病毒的流行病学调查及遗传进化分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验仪器及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品采集与处理 |
| 2.2.2 病毒核酸提取 |
| 2.2.3 病毒RNA反转录 |
| 2.2.4 聚合酶链式反应扩增及引物 |
| 2.2.5 目的片段胶回收 |
| 2.2.6 目的片段T-A克隆测序 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 禽流感病毒检测结果 |
| 2.3.2 YY1801 株全基因组分析 |
| 2.3.3 4株H5 亚型AIV全基因组分析 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 第3章 湖南省禽白血病病毒的流行病学调查及基因组遗传进化分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 病毒核酸提取 |
| 3.2.2 病毒RNA反转录 |
| 3.2.3 聚合酶链式反应扩增及引物 |
| 3.2.4 目的片段胶回收 |
| 3.2.5 目的片段T-A克隆测序 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 样品PCR检测结果 |
| 3.3.2 env基因扩增与序列分析 |
| 3.3.3 XXYI181104株env基因氨基酸序列分析 |
| 3.3.4 XTLI18100110/209/214 三株env基因氨基酸序列分析 |
| 3.3.5 XTLI18100110/209/214株env基因的重组分析 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 第4章 IBV、MDV和禽星状病毒的流行病学调查 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 病毒核酸提取 |
| 4.2.2 病毒RNA反转录 |
| 4.2.3 聚合酶链式反应扩增及引物 |
| 4.2.4 目的片段胶回收 |
| 4.2.5 目的片段T-A克隆测序 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 MDV检测结果及分析 |
| 4.3.2 IBV检测结果及分析 |
| 4.3.3 鸡星状病毒与鸡肾炎病毒检测结果及分析 |
| 4.4 总结与讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士学位期间参与发表论文 |
| 致谢 |
（10）J亚群禽白血病RT—PGR检测方法的建立与应用及分离毒株序列分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 禽白血病概述 |
| 1.2 禽白血病的发展史 |
| 1.3 禽白血病病原分类 |
| 1.4 J亚群禽白血病简介 |
| 1.5 病原学 |
| 1.5.1 病毒形态 |
| 1.5.2 生物学特性 |
| 1.5.3 基因组结构 |
| 1.5.4 外源性和内源性ALV |
| 1.6 禽白血病流行病学特点 |
| 1.6.1 传染源 |
| 1.6.2 宿主范围 |
| 1.6.3 传播途径 |
| 1.7 禽白血病的危害 |
| 1.8 临床症状及病理变化 |
| 1.9 ALV的诊断与检测技术 |
| 1.9.1 ELISA检测法 |
| 1.9.2 病毒分离法 |
| 1.9.3 PCR检测法 |
| 1.9.4 RT-PCR检测法 |
| 1.9.5 荧光定量PCR检测法 |
| 1.9.6 IFA法 |
| 1.9.7 琼脂扩散实验 |
| 1.10 禽白血病的防治 |
| 1.11 本研究的目的及意义 |
| 2 试验一：禽白血病病毒在家禽各组织中的表达定量分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 引物 |
| 2.2.4 试验仪器与设备 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 样本cDNA的制备 |
| 2.3.2 阳性标准品的制备 |
| 2.3.3 标准曲线的建立 |
| 2.3.4 定量分析 |
| 2.4 试验结果 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 2.5.1 讨论 |
| 2.5.2 小结 |
| 3 试验二：RT-PCR检测方法的建立与应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 样本采集与保存 |
| 3.2.3 实验仪器与设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 RT-PCR检测法试验步骤 |
| 3.3.2 ELISA检测法 |
| 3.3.3 病毒分离检测法 |
| 3.4 试验结果 |
| 3.4.1 PCR反应条件的优化 |
| 3.4.2 不同样本PT-PCR检测结果比较 |
| 3.4.3 RT-PCR灵敏性试验 |
| 3.4.4 PCR法重复性验证 |
| 3.4.5 PCR法与ELISA法检测结果比较 |
| 3.4.6 ALV-J不同检测方法结果比较 |
| 3.4.7 RT-PCR法准确率评估 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 3.5.1 讨论 |
| 3.5.2 小结 |
| 4 实验三：不同品系种公鸡ALV-J感染率检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 4.3.1 讨论 |
| 4.3.2 小结 |
| 5 实验四 分离毒株序列分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验试剂 |
| 5.2.3 实验仪器与设备 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 DF-1细胞病毒增殖 |
| 5.3.2 ELISA检测 |
| 5.3.3 目的片段的扩增 |
| 5.3.4 引物 |
| 5.3.5 参考毒株 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 HNlk-01毒株序列分析 |
| 5.4.2 HNzz-01毒株序列分析 |
| 5.4.3 HNlk-01与HNzz-01遗传进化树分析 |
| 5.5 讨论与小结 |
| 5.5.1 讨论 |
| 5.5.2 小结 |
| 6 实验五：ALV感染鸡病理剖检 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 引物 |
| 6.2.3 方法 |
| 6.2.4 试验仪器与设备 |
| 6.3 试验结果 |
| 6.3.1 病理变化剖检结果 |
| 6.3.2 ALV-J PCR 扩增结果 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 6.4.1 讨论 |
| 6.4.2 小结 |
| 7 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附录 |
四、对禽逆转录病毒特别是J亚群白血病病毒感染的回顾（论文参考文献）
- [1]K亚群禽白血病病毒gp85表面蛋白的特异基因表达及应用[D]. 王呈呈. 山东农业大学, 2021
- [2]江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用[D]. 闫彩虹. 扬州大学, 2020(04)
- [3]2017-2019年我国部分省份白羽肉鸡ALV-J的分离鉴定及env序列分析[D]. 栾秀敏. 山东农业大学, 2020(02)
- [4]广西不同黄羽肉鸡品系种公鸡中禽白血病病毒分离鉴定及一株重组毒株基因组解析[D]. 崔真毓. 广西大学, 2020(02)
- [5]南通地区禽白血病的流行病学调查及其净化的初步研究[D]. 赵震东. 扬州大学, 2020
- [6]鸡circRNA2420-Bcl11b介导细胞凋亡调控ALV-J感染的作用机制[D]. 仇玲玲. 扬州大学, 2020(01)
- [7]J亚群禽白血病病毒诱导鸡免疫耐受的致病机制研究[D]. 何书海. 山东农业大学, 2019(01)
- [8]抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制与不同试剂盒临床检测差异性分析[D]. 沈习. 扬州大学, 2019
- [9]湖南省养殖禽类主要病毒性流行病初步调查[D]. 吕孙良. 湖南大学, 2019(01)
- [10]J亚群禽白血病RT—PGR检测方法的建立与应用及分离毒株序列分析[D]. 范朦朦. 河南农业大学, 2019(04)