一、马尾松毛虫CPV基因组S7的序列分析及部分序列的原核表达（论文文献综述）
陈威[1]（2020）在《反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜的联合杀虫作用及对其GSTs基因表达的影响》文中提出桃蚜（Myzuspersicae）属半翅目蚜科,为世界性重要害虫。长期使用化学农药使桃蚜产生抗药性,反式茴香脑和球孢白僵菌均具有作为生物杀虫剂的潜力,但两者混用来防治桃蚜鲜有报道。本研究通过将两者混用来探索反式茴香脑对球孢白僵菌是否具有杀蚜增效作用,并在此基础上,进一步探讨反式茴香脑和球孢白僵菌处理桃蚜后谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）基因的表达模式,从分子水平初步研究GSTs是否对反式茴香脑和球孢白僵菌的胁迫具有响应。研究结果总结如下:1反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜的生物测定使用球孢白僵菌Bbr84菌株单独处理桃蚜,结果表明:浓度为108孢子/mL的孢子悬浮液致死效果最好,处理6 d的校正死亡率和LT50分别为82.96%和3.83 d；将浓度分别为0.0375、0.0750、0.1500和0.3000 mg/mL的反式茴香脑与浓度为7×107孢子/mL的球孢白僵菌混用,处理5 d后桃蚜的校正死亡率分别为56.83%、88.64%、64.78%和53.42%,由此可知,0.0750 mg/mL的反式茴香脑和浓度为7×107孢子/mL的球孢白僵菌混合使用后对桃蚜致死效果最好。2桃蚜GSTs基因的鉴定和生物信息学分析通过检索桃蚜的转录组,鉴定出9条GSTs基因的cDNA序列（MperGSTd1、MperGSTd2、MperGSTd3、MperGSTo1、MperGSTs1、MperGSTs2、MperGSTs6、MperGSTt1和MperGSTt2a）。9个cDNA的编码区长度介于132-185bp之间。利用生物信息学工具对序列进行分析,并构建了系统发育树,明确了桃蚜这9个GSTs基因所属的家族,此外还发现这9个基因编码区的蛋白质与半翅目昆虫GSTs亲缘关系较近,而与其它物种GSTs亲缘关系较远。3反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜GST酶活性和GSTs基因表达的影响分别使用0.25 mg/mL的反式茴香脑和孢子悬浮液浓度为108孢子/mL的球孢白僵菌处理桃蚜,在3 h、6 h和12 h后收集试虫测定GST酶活性,结果显示反式茴香脑处理的GST酶活性受到抑制,球孢白僵菌处理的GST活性升高。桃蚜9条GSTs基因在不同发育阶段及分别应对反式茴香脑和球孢白僵菌胁迫表达量均有差异。大部分基因在4龄若蚜期的表达量较高,在反式茴香脑和球孢白僵菌分别胁迫下,不同时间段处理的GSTs基因表达量显着变化,有的表达量上调至对照组10倍以上。
刘世火[2]（2020）在《桔小实蝇发育阶段转变前后转录组分析及几丁质酶基因功能研究》文中研究表明几丁质是昆虫表皮、中肠围食膜及气管的重要组成成分,几丁质酶（Chitinase,Cht,EC 3.2.1.14）是水解几丁质的一类内切酶。昆虫几丁质酶主要参与蜕皮、围食膜降解、细胞增殖、机体免疫防御等重要生理过程。通过调控几丁质的降解,有可能实现对昆虫生长发育,甚至是生命的控制。由于人类和其他高等动物不含几丁质,聚焦几丁质代谢通路发掘害虫防控新靶标相对安全。因此,昆虫几丁质代谢调控成为专一性新型杀虫剂研究的热点。桔小实蝇是一种世界范围内严重危害果蔬的农业害虫,世代发育历经卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。本学位论文以桔小实蝇为研究对象,通过转录组测序和生物信息学分析,在鉴定桔小实蝇不同发育阶段转变前后重要功能基因的基础上,综合运用实时荧光定量PCR、RNAi、异源表达、Western Blot、免疫组化、超景深三维显微成像系统等技术和手段,克隆获得12个几丁质酶基因（包括7个Cht基因和5个IDGF基因）的c DNA序列,解析其时空表达模式;比较分析原核表达和真核表达获得的Bd Cht8重组蛋白的几丁质结合能力和催化活性;探究不同发育阶段特异性表达的几丁质酶基因在桔小实蝇生长发育中的功能。主要研究结果如下:1桔小实蝇发育阶段转变前后转录组分析及Chts基因鉴定基于桔小实蝇卵末、1龄幼虫初、1龄幼虫末、2龄幼虫初、2龄幼虫末、3龄幼虫初、3龄幼虫末、白蛹、蛹末和成虫初共10个发育节点的30个样品,采用二代转录组测序技术,构建桔小实蝇发育阶段转变前后转录组数据库。共获得681.72Gb Clean data,各样品Clean data均不低于16.03 Gb,且Q30碱基百分比在94.32%及以上。各样品Clean data映射到桔小实蝇基因组序列上的比对效率从43.23%到72.67%不等。通过与基因组数据比对,共获得17,656个基因,其中已知基因和新基因分别为12,309和5,347个。将新基因序列与8个蛋白质序列库比对发现,有1,819个新基因获得注释信息。桔小实蝇不同发育阶段转变前后共有11,708个差异表达基因（differently expressed gene,DEG）。其中,在卵孵化、1龄幼虫蜕皮、2龄幼虫蜕皮、化蛹及羽化前后,分别鉴定获得2,132、952、1,062、2,301和1,333个DEGs。采用q RT-PCR技术检测基因表达量确认了转录组表达谱的可靠性。进一步分析发现,激素（20E和JH）和表皮（几丁质和表皮蛋白）相关通路的基因在桔小实蝇发育阶段转变前后呈现周期性表达模式。GO功能富集分析表明,几丁质相关GO功能类在桔小实蝇不同发育阶段转变过程中显着富集。在此基础上,克隆获得桔小实蝇12个Cht基因的c DNA序列,并解析了它们编码的蛋白的结构特征。所有12个Chts均具有几丁质催化结构域,部分蛋白拥有几丁质结合域。系统发育分析表明,桔小实蝇12个Chts聚类于8个Group,并分别与黑腹果蝇对应的Cht聚为一支,各节点自展值介于46%-100%,表明桔小实蝇Chts与黑腹果蝇具有较高的同源性。2桔小实蝇Chts基因的表达模式解析利用q RT-PCR,系统分析12个Chts在桔小实蝇不同发育阶段的表达模式。结果显示,Chts表达谱在不同发育阶段差异较大。在卵发育前期和中期,各有4个基因（前期:Bd Cht1、Bd Cht2、Bd Cht11和Bd IDGF4;中期:Bd Cht7、Bd Cht8、Bd Cht10和Bd IDGF6）高表达;3个基因（Bd Cht5、Bd IDGF2和Bd IDGF3）则从卵发育中期至后期持续高表达;卵发育后期仅Bd IDGF1具有较高表达水平。在幼虫发育过程中,7个基因（Bd Cht1、Bd Cht2和5个Bd IDGFs）持续高表达,2个基因（Bd Cht8和Bd Cht11）持续低表达。在化蛹过程中,3个基因（Bd Cht7、Bd Cht11和Bd IDGF1）的表达量较低,其余9个基因的表达量均较高;在蛹发育过程中,Bd Cht11和Bd IDGF1的m RNA水平较低,其余10个基因的m RNA水平均较高。在成虫发育过程中,9个基因（Bd Cht1、Bd Cht2、Bd Cht8、Bd Cht10及5个Bd IDGFs）持续高表达。系统解析12个Chts在桔小实蝇3龄幼虫不同组织（中肠、脂肪体、气管、体壁、马氏管和中枢神经系统）及5日龄雌、雄成虫不同组织（体壁、气管、中肠、脂肪体、马氏管、卵巢和精巢）的表达模式发现,12个Chts在桔小实蝇幼虫及成虫所测组织中均有表达,且表达水平差异较大。Bd IDGF4和Bd IDGF6在幼虫及成虫所测组织中均有较高m RNA水平,而Bd Cht5在所测组织中的表达量均较低。Bd Cht8在成虫中肠特异性高表达,表明该基因可能参与中肠围食膜形成及消解。Bd Cht1在卵巢中表达量较高,暗示该基因可能参与卵巢发育过程。桔小实蝇Chts响应温度胁迫、激素（20E和JH类似物）及药剂处理的表达模式解析发现,低温和高温胁迫时,Bd Cht7、Bd IDGF1和Bd IDGF4均呈现不同的响应模式;20E处理后,仅Bd Cht1和Bd IDGF6无响应,其余10个基因均有不同程度响应;烯虫酯处理后,仅Bd IDGF3无响应,其余11个基因均有不同程度响应;马拉硫磷处理后,仅Bd Cht5、Bd Cht10和Bd IDGF3无响应,其余9个基因均有不同程度响应。3桔小实蝇Bd Cht8重组蛋白酶学特性解析利用原核表达技术可表达并获得桔小实蝇BdCht8重组蛋白。由于重组蛋白以包涵体形式存在,无法在正常条件下纯化,故采用尿素使蛋白变性后获得可溶且纯度较高的重组蛋白。重组蛋白几丁质结合能力和酶活性检测结果表明,Bd Cht8蛋白能特异性结合固体几丁质,但无几丁质酶催化活性。进一步采用真核表达技术,利用Sf 9细胞系,表达并获得Bd Cht8重组蛋白。体外几丁质酶活性及几丁质结合能力测定结果表明,经真核表达的Bd Cht8重组蛋白具有几丁质内切酶活性和几丁二糖酶活性,对应的酶活力分别为60.38±1.79和200.99±10.41 Unit/m L。同时,经真核表达的Bd Cht8重组蛋白可以特异性结合几丁质。此外,阿洛氨菌素（50μg/m L）能显着抑制Bd Cht8重组蛋白的催化活性,抑制率达16.27%。Gln NAc2-7（100μg/m L和500μg/m L）亦能显着抑制Bd Cht8重组蛋白的催化活性,抑制率分别为14.28%和29.27%。同样的,Psammaplin A在中浓度（5μg/m L）和高浓度（50μg/m L）时均能显着抑制Bd Cht8重组蛋白的催化活性,抑制率分别为19.48%和32.77%。4 Chts基因在桔小实蝇生长发育中的功能研究基于幼虫饲喂法和注射法构建了桔小实蝇RNAi技术体系。探究Bd Cht1、Bd Cht7和Bd Cht10在幼虫生长发育中的功能发现,摄入ds Bd Cht1 12 h和24 h后,与对照相比,1龄幼虫Bd Cht1表达量分别显着下调62.46%和19.93%,幼虫死亡率均显着高于对照,且致死幼虫存在气管断裂的表型。分别摄入ds Bd Cht7和ds Bd Cht10 24 h后,与对照相比,1龄幼虫Bd Cht7和Bd Cht10表达量分别显着下调25.07%和36.81%,幼虫死亡率均显着高于对照。分别饲喂20 mg/m L Gln NAc2-7和100μg/m L Psammaplin A抑制剂24 h后,与对照相比,幼虫死亡率分别显着升高31.66%和20.54%。对2龄幼虫注射ds Bd Cht10,于24 h后检测发现,Bd Cht10表达量显着下调85.38%,幼虫无法正常蜕皮导致死亡。采用注射法RNAi解析Bd Cht5、Bd Cht8和Bd Cht10在桔小实蝇末龄幼虫化蛹过程中的功能发现,注射si RNA-Bd Cht5 24 h后,3龄幼虫Bd Cht5表达量显着降低50.00%,且注射12 h和24 h后化蛹率均显着低于对照。进一步统计羽化率发现,处理组与对照无显着差异。注射ds Bd Cht10 24 h后,Bd Cht10表达量显着下调59.38%,且处理组幼虫在注射12、24、36和48 h后的化蛹率均显着低于对照,但羽化率与对照相比均无显着差异。在化蛹过程中探究Bd Cht8的功能时发现,无论采用ds RNA还是si RNA进行RNAi,均不能有效沉默该基因。利用注射法RNAi研究Bd Cht1和Bd Cht8在成虫器官发育中的功能发现,注射ds Bd Cht1后,Bd Cht1表达量显着下调,且成虫卵巢发育畸形,出现卵巢减小、卵瓣数量减少的表型。干扰Bd Cht8表达则导致雌成虫直肠膨大,出现卵巢几乎停止发育的表型。进一步利用抗体在成虫中肠组织中定位Bd Cht8,发现Bd Cht8分布于肠道细胞内和细胞间。综上所述,本学位论文研究结果不仅丰富了桔小实蝇生物信息学数据库,还明确了生长发育中起重要作用的激素（20E和JH）和表皮（几丁质和表皮蛋白）相关通路基因在桔小实蝇发育阶段转变前后的表达模式,阐明了Bd Cht1、Bd Cht5、Bd Cht7、Bd Cht8和Bd Cht10在桔小实蝇生长发育过程中的功能,为靶向几丁质酶的新型害虫控制剂的研发提供了理论基础。
顾天滋[3]（2019）在《仁扇舟蛾嗅觉相关基因鉴定及GOBP2蛋白功能研究》文中提出仁扇舟蛾（Clostera restitura）是重大杨树食叶害虫之一,具有产卵量大、孵化率高和繁殖快等特点,再加上研究背景较为薄弱,没有针对性的防治策略,一旦爆发成灾,很难有效防控,因此,开发新型防治方法具有重要意义。通过开展仁扇舟蛾昆虫嗅觉识别系统的研究,揭示昆虫生存策略,可为利用化学生态调控手段有效防治仁扇舟蛾奠定坚实的基础。本研究利用Illumina Hiseq TM 2000高通量测序平台对仁扇舟蛾雌、雄虫触角进行转录组测序,通过生物信息学分析和同源比对等方法获得了仁扇舟蛾嗅觉相关蛋白候选基因;通过实时荧光定量方法对气味结合蛋白、化学感受蛋白基因进行了表达模式分析和RACE（Rapid applification of c DNA ends）克隆,筛选出关键基因进行原核表达和蛋白功能分析,采用同源建模和分子对接方法预测气味结合蛋白与气味配体结合情况,进一步明确其结合特性,最后对雌、雄虫进行触角电位分析,探寻对仁扇舟蛾具有刺激作用的植物挥发物成分。主要研究结果如下:1.通过Illumina Hiseq TM 2000高通量测序平台对仁扇舟蛾雌、雄虫触角进行转录组测序,共鉴定出165个嗅觉相关基因,其中包括43个气味结合蛋白（Odrant binding proteins,OBPs）,13个化学感受蛋白（Chemosensory proteins,CSPs）,78个气味受体（Odorant receptors,OR）,15个离子受体（Ionotropic receptor,IRs）,13个味觉受体（Gustatory receptor,GRs）,3个感受神经元膜蛋白（（Sensory neuron membrane proteins,SNMP））;对43个基因进行序列分析发现,其中27个OBP基因具有完整的开放阅读框和15～30不等的氨基酸组成的信号肽;通过Blastx比对、系统发育分析和motif图谱构建,鉴定出仁扇舟蛾普通气味结合蛋白（General odorant binding proteins,GOBPs）和信息素结合蛋白Pheromone binding proteins,PBPs)基因。对13条CSP基因进行序列分析可知,所有基因均符合C1-X6-8-C2-X18-19-C3-X2-C4结构通式;序列比对结果显示,Cres CSP与其它鳞翅目昆虫CSP基因序列相似度不低于55%;motif图谱分析发现,各图谱之间只存在motif数量的区别,位置相对OBP motif图谱更加保守,说明CSP基因在进化过程中的保守性。挖掘出的78个OR基因中,28个有较为完整的编码区,包含5～8个跨膜域,结合Blastx比对和系统发育树分析,鉴定出Cres102169为非典型气味受体Orco,Cres102537、Cres106862和Cres98888为PRs。2.对仁扇舟蛾OBP雌、雄差异基因进行克隆和序列分析,获得8个OBP基因全长序列,分析结果表明8个OBPs N-端均包含17～23个氨基酸构成的信号肽序列,其中Cres OBP10为Minuc-C OBP,其它7个均有6个保守的半胱氨酸位点,满足Classic OBP结构通式,8个OBP基因在雌、雄虫不同日龄和组织中表现出多样的表达模式,均在触角中高表达,说明触角作为主要的嗅觉器官在其嗅觉识别过程中发挥重要作用,Cres OBP10在雌、雄成虫足中有较高表达量,暗示Cres OBP10参与非挥发性或者低挥发性化学信息的探测,不仅如此,Cres OBP10和Cres PBP1在雌虫头部表达量显着高于雄虫,推测其参与雌虫寻找产卵寄主。Cres PBPs在雄虫触角中的表达量极显着高于雌虫,而GOBP尤其是CresGOBP2表现出显着的雌虫触角高表达特征,暗示了PBPs主要参与雄虫识别雌虫释放的信息素,GOBP2不仅参与植物挥发物识别,也可能参与雌虫产卵过程中信息素识别。3.对仁扇舟蛾6个CSP基因进行克隆和序列分析,结果表明6个CSP基因完整序列均含有4个保守的半胱氨酸位点,符合C1-X6-8-C2-X18-19-C3-X2-C4通式,是典型的化学感受蛋白家族;利用q RT-PCR对仁扇舟蛾6个CSP基因进行各虫态表达谱分析,发现CSP4和CSP5在1龄时期高表达,CSP1和CSP2在1～3龄期间高表达,CSP3在3～4龄期间高表达,此阶段仁扇舟蛾开始分散取食且食量突增,因此推测这一阶段高表达的基因参与昆虫的寄主识别;CSP6在卵期显着高表达,推测其参与生长发育等非嗅觉行为;在成虫阶段,除了CSP6以外,其它CSP基因均在羽化后3～4天达到表达量高峰,与交配高峰期相吻合,暗示CSP基因参与求偶或交配过程中的性信息素识别;组织表达谱分析,发现CSP基因主要在触角中大量表达,部分CSP基因在头、翅、足中表达,CSP1、CSP4、CSP5和CSP6在雌虫触角中的表达量显着高于雄虫,CSP2和CSP4在雄虫翅中表达量较高,CSP3则在雄虫足上的表达量高于雌虫,进一步说明了CSP功能多样性。4.原核表达获得重组蛋白CresGOBP2,Western Blot分析表明组织提取总蛋白在15～18 k Da出现清晰的单一条带,说明蛋白纯化质量较高;荧光竞争结合实验发现,CresGOBP2与供试的29种气味物质结合谱很窄,仅与（E）-2-庚烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、苯甲酸、β-紫罗酮、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯6种气味物质具有结合能力,与邻苯二甲酸二丁酯（Ki=10.92μM）和邻苯二甲酸二异丁酯（Ki=9.75μM）结合能力最强。5.通过同源建模和分子对接手段对仁扇舟蛾气味结合蛋白和包含1-NPN在内的6个配体进行互作分析,结果表明2个CresGOBP均与家蚕（Bombyx mori）GOBP2蛋白结构相似度最高（48.57%和79.43%）,对所得模型综合评估发现,2个CresGOBP蛋白结构均合理,对CresGOBP与5种气味物质和荧光探针进行蛋白-配体互作分析,结果显示CresGOBP1和GOBP2都与1-NPN具有一定结合能力（Total score>4.0）,与2个CresGOBP docking得分最高的配体均为邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异丁酯（Total score>6.5）,CresGOBP1与邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、（E）-2-庚烯醛CScore得分最高（Cscore=5）,CresGOBP2与β-紫罗酮CScores得分最高（Cscore=5）。CresGOBP1和CresGOBP2CresGOBP1在与各配体对接过程中,均由第9位苏氨酸（THR 9）和第37位色氨酸（TRP 37）以及第56位丝氨酸（SER 56）于配体形成氢键,初步判断以上三个氨基残基是CresGOBP与气味分子互作的关键氨基酸位点。6.对14种挥发性化学物质进行雌、雄虫触角电位实验,结果表明仁扇舟蛾成虫对（E）-2-庚烯醛、顺-3-己烯醇、己醛、顺-3-己烯酯、2-羟基苯甲醛、反式-2,4-癸二烯醛反应较强;雌、雄虫触角对大多数小分子量的醛、醇和酯类有生理活性,推测这类物质在仁扇舟蛾的寄主定位中起重要作用;雌虫对0.2μg/μL邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯和（E）-2-庚烯醛的触角反应显着高于雄虫,这与荧光竞争结合及分子对接实验结果一致,从电生理水平进一步验证CresGOBP2的结合特性。
高文杰[4]（2019）在《茉莉酸甲酯诱导下神农香菊萜类物质合成相关基因的挖掘及功能分析》文中研究表明神农香菊（Chrysanthemum indicum var.aromaticum）是菊属植物中罕见的具有浓郁香味的种。前期研究发现其叶片、花瓣均被有许多腺毛,而腺毛的胶状分泌物又与植株香气物质产生密切相关,经气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析发现其叶片分泌物主要为单萜和倍半萜及其含氧衍生物。目前,关于神农香菊香味形成的原因及分子调控机理至今未见报道。本研究以茉莉酸甲酯（MeJA）作为一种外源诱导剂,通过对神农香菊进行不同浓度和时间的MeJA处理,优选出MeJA增香的最佳条件,并对MeJA处理下的神农香菊进行转录组测序分析,从分子水平揭示神农香菊萜类物质合成途径的调控机理,挖掘神农香菊萜类物质合成相关基因,分析这些基因在萜类代谢途径上的功能,为进一步采用转基因工程技术创制高萜类芳香材料提供依据,使培育芳香的菊花新材料成为可能。主要研究结果如下:1.随着MeJA处理浓度和处理时间的增加,神农香菊T-形非腺毛和头状腺毛的密度呈先升高后降低的趋势。叶片分泌物中萜烯类的相对含量随着MeJA处理浓度和处理时间的增加而增加,其中,4-亚甲基-1-（1-甲基乙基）双环[3.1.0]2-己烯和石竹烯含量的变化最显着;苯、醇类的相对含量则呈先升高后降低的趋势。在0.5%浓度和48 h处理下,对/间伞花烃、香树烯的含量开始下降,而（-）-,α-人参烯、马榄烯、愈创木烯和cis-桧萜醇则消失。这些结果表明神农香菊叶片表皮毛数量及其分泌物含量能够响应MeJA的诱导,并在浓度为0.25%和处理时间为24h时的诱导效果最显着。2.对MeJA溶液不同诱导时间下的神农香菊叶片进行了转录组测序,共获得176,091个Unigenes,能够至少在一个数据库中被注释的Unigenes占69.94%。在MJ4vsCtrl、MJ24vsCtrl和MJ24vsMJ4比较组中分别获得了 750、650和313个差异表达基因（DEGs）,这些差异基因被富集到33个次生代谢相关途径。对参与茉莉酸（JA）生物合成和信号转导途径、萜类物质合成途径、苯丙烷类代谢途径和脂肪酸类代谢途径的DEGs,以及差异表达的次生代谢相关植物后修饰酶和转录因子进行表达热图分析,发现大多数DEGs受MeJA的诱导上调表达。qRT-PCR试验结果与转录组测序结果基本一致,表明转录组数据测序的基因表达谱数据是可信的。3.参考转录组组装序列分别克隆了长度为1278 bp和1035 bp的神农香菊GPS和FPS基因的开放阅读框（ORF）序列,分别命名为CiGPS和CiFPS。系统进化分析发现,CiGPS和CiFPS基因分别与青蒿和菊花的亲缘关系最近。蛋白质的理化性质分析表明,两个基因编码的蛋白质均为亲水性蛋白。qRT-PCR结果显示,CiGPS和CiFPS基因均在叶中的表达量最高,且MeJA可诱导CiFPS基因的表达。构建植物表达载体pBI121-CiGPS-GFP和pBI121-CiFPS-GFP,农杆菌介导法转入烟草中,经Kana生根筛选及PCR和RT-PCR鉴定转基因阳性苗,对差异表达的3个转基因株系进行后续的功能分析。转CiGPS和CiFPS基因烟草与野生型（WT）及转空载株系（EV）相比,株高变矮,叶色变深,叶绿素和类胡萝卜素含量升高;叶片长柄腺毛数量显着增加,短柄腺毛仅在转CiGPS株系叶片正面显着增加;叶片分泌物中萜烯类物质相对含量显着升高,并且在转基因株系中检测到WT和EV株系中未检测到的单萜类和倍半萜类化合物;转CiGPS基因烟草中GPS酶活性升高,而转CiFPS基因烟草中FPS酶活性,仅F6株系显着高于WT和EV株系;在转CiGPS基因烟草植株中HMGR、DXR、GGPPS和MTS基因的表达量升高,EAS基因的表达量降低;在转CiFPS基因烟草植株中HMGR、DXS、DXR、GGPPS、EAS和CCD基因的表达量升高,MTS基因的表达量降低。4.利用神农香菊转录组数据库克隆了长度为1881 bp的神农香菊MYC2基因的ORF序列,命名为CiMYC2。通过系统进化分析发现,它与青蒿的AaMYC2基因的亲缘关系最近。蛋白质的理化性质分析表明,CiMYC2蛋白质属于亲水性蛋白。CiMYC2基因表达模式分析显示,它在叶中的表达量最高,且受MeJA的诱导。构建植物表达载体pBI121-CiMYC2-GFP,CiMYC2蛋白亚细胞定位在细胞核上。农杆菌介导法转入烟草中,经Kana生根筛选及PCR和RT-PCR鉴定转基因阳性苗,选择差异表达的4个转基因株系进行基因的功能分析。CiMYC2基因在烟草中过表达后,株高变矮,叶色变深,叶绿素和类胡萝卜素含量升高;叶片长柄和短柄腺毛数量均显着增加,叶片分泌物中萜烯类物质相对含量显着升高,并且在转基因株系中检测到WT和EV株系中未检测到的萜烯类化合物;在转CiMYC2基因烟草植株中HMGR、DXR、GGPPS、MTS和CCD基因上调表达,EAS基因下调表达,DXS、GPS、FPS和EAS基因仅在个别转基因株系中上调表达。
张小晴[5]（2019）在《美国白蛾气味结合蛋白与信息素受体的功能研究》文中研究说明美国白蛾Hyphantria cunea（Drury）原生于北美洲,是一种非常猖厥的危险性害虫,为世界性检疫对象。目前美国白蛾已成为我国最重要的外来入侵种之一,防控形势十分严峻。昆虫依靠其高度灵敏的嗅觉感受系统进行生存和繁衍,即便在几公里外,雄性蛾的触角也可以探测到雌性蛾释放的性信息素。蛾类昆虫的性信息素根据化学结构的不同,分为Type Ⅰ的直链脂肪酸衍生物和Type Ⅱ的多烯烃类的环氧化合物两大类。美国白蛾是Type Ⅰ与Type Ⅱ型均有的混合型性信息素体系,因此,利用生物化学与分子生物学技术,深入研究美国白蛾性信息素结合蛋白、普通气味结合蛋白和信息素受体的功能,尤其是与Type Ⅰ和Type Ⅱ性信息素进行特异性结合以及精确识别等问题,有利于解析蛾类信息素结构与嗅觉通讯进化机制。本实验利用原核表达系统获得大量目的蛋白,然后利用荧光竞争性结合实验（Fluorescence competitive binding assays）的方法,测定了 PBP和GOBP对美国白蛾性信息素以及植物挥发物的结合能力。利用爪蟾卵母细胞异源表达系统结合双电极电压钳技术,研究美国白蛾性信息素受体PR3对美国白蛾性信息素的反应谱。1.美国白蛾性信息结合蛋白的鉴定和功能分析利用qPCR技术研究美国白蛾3个PBP在成虫不同组织的相对表达量,结果表明,美国白蛾3个PBP均在雌雄虫触角中高表达,其中HcunPBP1雄虫是雌虫表达量的6.5倍;HcunPBP2雄虫是雌虫表达量的1.7倍;HcunPBP3雄虫是雌虫表达量的4.2倍。利用原核表达系统、组氨酸标签蛋白Ni磁珠纯化技术和荧光竞争性结合实验,测定了美国白蛾3个PBP对四种性信息素组分和24种植物挥发物的结合能力。结果表明,美国白蛾3个PBP与Type Ⅰ性信息素组分均有较强的结合能力（Ki<1.0 μM）,而与Type Ⅱ性信息素组分的结合有着明显的差异。其中HcunPBP2与Type Ⅱ性信息素组分1,Z3,Z6-9S,10R-epoxy-21Hy的结合能力较强,HcunPBP3有中等结合能力,而HcunPBP1没有结合能力;HcunPBP1和HcunPBP3均与Type Ⅱ性信息素组分Z3,Z6-9S,10R-epoxy-21Hy有中等的结合能力,而HcunPBP2没有结合能力。此外,在测试的24种植物挥发性物质中,3个PBP均能选择性与部分植物挥发物结合,且具有较强的结合能力（Ki<10.0 μM）。结合我们的研究结果,我们推测美国白蛾3个PBP具有明显的功能分化,在感受雌蛾释放的性信息素组分有着明显得偏好性,而除了感受雌蛾性信息素外,PBP还能参与一些植物气味的感受。2.美国白蛾普通气味结合蛋白的鉴定和功能分析跟据实验室已有的美国白蛾触角转录组数据,克隆出美国白蛾2个GOBP的基因序列,并对2个GOBP基因的表达谱和气味结合特性进行了系统分析。qPCR结果表明,美国白蛾HcunGOBP1和HcunGOBP2均在雌雄虫触角中高表达,且在雌雄蛾间的表达量水平相当。然而HcunGOBP2在雌虫触角的表达量是HcunGOBP1的4.6倍,在雄虫触角的表达量是HcunGOBP1的5.1倍。另外,在不含触角的组织中仅有极低或没有表达。荧光竞争性结合实验结果表明,HcunGOBP2与Type Ⅰ性信息素组分有较强的结合能力,而与Type Ⅱ性信息素组分没有结合能力;HcunGOBP1对4种信息素组分均没有结合能力。在测试的24种植物挥发物中,美国白蛾2个GOBP均与部分植物挥发物有着不同程度的结合能力（Ki=9-50μM）,而与所选的大部分植物挥发物没有结合能力。综上所述,美国白蛾2个GOBP在气味物质感受方面具有功能分化的特点:HcunGOBP1可能仅用于植物挥发物的识别而不参与性信息素的识别;而HcunGOBP2可能参与Type Ⅰ性信息素组分的识别。3.美国白蛾性信息素受体的功能分析通过同源克隆技术克隆了美国白蛾典型嗅觉受体Orco和性信息素受体PR3基因的cDNA全长,并利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术测定了HcunPR3/Orco对美国白蛾四种性信息素组分的识别特异性;测定结果显示HcunPR3/Orco能够特异性识别性信息素组分1,Z3,Z6-9S,10R-epoxy-21Hy,而对其他性信息素组分都没有识别能力。当1,Z3,Z6-9S,10R-epoxy-21Hy的浓度为10-3M时能激发HcunPR3/Orco产生最大反应,EC50=1.74x10-5 M;而对Type Ⅰ信息素组分和另外一种Type Ⅱ性信息素组分未表现出生理反应。该研究结果对进一步阐明Type Ⅱ性信息素的分子感受机制奠定基础,对于其它具有Type Ⅱ型性信息素的蛾类昆虫嗅觉感受机制研究具有重要意义。
陈二虎[6]（2019）在《桔小实蝇蛹壳鞣化关键基因的鉴定及其功能研究》文中提出桔小实蝇是世界上最重要的果蔬害虫之一,卵产于果实内,孵化后的幼虫在果实内取食为害。桔小实蝇一生历经多次蜕皮和两次变态发育（幼虫到蛹和蛹到成虫）,这些进程伴随着一系列复杂的形态变化和生理生化反应,新表皮鞣化反应是其中一个关键环节。桔小实蝇化蛹过程中新生成的白色柔软蛹壳会在较短时间内完成鞣化反应（骨化和着色）,以保护虫体和快速适应外界多变的生存环境。鉴定和挖掘害虫特定发育阶段的功能基因,对于研发环境友好型的生长调节剂有重要指导价值。本学位论文以桔小实蝇为研究对象,聚焦幼虫变态发育过程的蛹壳鞣化反应,鉴定化蛹进程中的关键通路基因,并深入分析重要基因的生理功能。主要研究结果如下:1桔小实蝇蛹壳鞣化关键通路基因的鉴定及其表达模式分析采用高通量测序技术对处于化蛹关键时间节点的桔小实蝇进行表达谱测序,共获得74.62 GB干净数据,各样本与桔小实蝇基因组数据的匹配率为70.09%-74.44%,平均GC含量和Q30分别为41.54%和91.61%。进一步分析转录组数据得到11,721条基因序列,其中11,301个基因能够在桔小实蝇基因组中得到注释,约占基因总数的83.76%,420个未能在基因组中得到注释的基因可能为新基因。分析这些基因的表达模式,发现有许多基因在化蛹过程中差异表达,GO、COG和KEGG通路分析显示氧化磷酸化通路、解毒代谢通路（P450）、保幼激素合成与代谢及信号传导和转运通路、蜕皮激素合成和信号通路、几丁质合成与代谢等通路均显着富集,表明它们可能在化蛹过程中发挥重要功能。另外,与昆虫表皮鞣化相关的酪氨酸代谢通路和表皮蛋白基因均在化蛹过程中变化显着,暗示它们在桔小实蝇蛹壳鞣化反应中具有重要作用。基于桔小实蝇基因组数据对酪氨酸代谢通路基因进行注释,共鉴定出24个关键基因。基于课题组已有的桔小实蝇各发育阶段（卵期、1龄幼虫早期、1龄幼虫晚期、2龄幼虫早期、2龄幼虫晚期、3龄幼虫早期、幼虫漫游期、幼虫漫游晚期、白蛹期、6 h蛹壳、12 h蛹壳、3 d蛹、5 d蛹、蛹晚期和刚羽化成虫）的转录组数据,分析上述24个基因的表达模式。结果显示酪氨酸羟化酶（BdTH）、多巴脱羧酶（BdDDC）、BdEbony、天冬氨酸脱羧酶（BdADC）、BdTan、BdMCO4、Bdyellow-c、Bdyellow-f和Bdyellow-f2基因均在蛹壳鞣化的关键时期高表达,同时结合昆虫体壁醌鞣化理论成功推导出桔小实蝇蛹壳鞣化反应的通路图:BdTH酶催化酪氨酸形成多巴（Dopa）,大部分Dopa被BdDDC酶催化生成多巴胺（Dopamine）;一部分Dopamine被BdMCO4、Yellow、Yellow-e和Yellow-h酶催化形成多巴胺色素（深棕色或者黑色）,还有一部分Dopamine在BdEbony、BdADC和BdTan酶的相互配合催化下生成NBAD;接着被BdMCO4酶催化生成NBAD-醌,同时与表皮蛋白相互交联形成鞣化蛋白进而完成蛹壳骨化;而蛹壳着色反应由NBAD-pigment（黄色或者红棕色）和Dopamine色素共同完成。进一步分析显示,桔小实蝇蛹壳和成虫体壁的鞣化反应通路存在差异,羽化过程中的鞣化反应主要依靠NADA-醌来完成。2桔小实蝇酪氨酸羟化酶基因在蛹壳鞣化过程中的功能研究以桔小实蝇蛹壳鞣化反应通路关键的BdTH酶基因（蛹壳鞣化通路的起始反应酶和限速酶）为研究对象,利用巢式PCR技术在桔小实蝇老熟幼虫表皮组织中克隆获得BdTH的cDNA序列,完整开放阅读框1737 bp,编码578个氨基酸残基,预测编码蛋白的分子量65.3 kDa,理论等电点（pI）5.44。多重序列比对发现,BdTH在N-末端不存在信号肽,但是拥有保守的酸性区域（PI=3.78）、丝氨酸位点（ser32）和C末端。系统发育分析结果显示,BdTH序列与实蝇类昆虫TH亲缘关系较近,同时双翅目昆虫TH蛋白单独聚为一支。采用定量qPCR和半定量RT-PCR技术分析BdTH的时空表达模式,结果显示BdTH在老熟幼虫表皮（EP）和中枢神经系统（CNS）组织中高表达,且在幼虫向蛹期转变过程中表达量显着升高,暗示BdTH在蛹壳鞣化（骨化和着色）反应中具有重要功能。对桔小实蝇5日龄幼虫注射dsBdTH后,BdTH的mRNA表达量减少50-60%,试虫羽化率下降到63%（对照组为94%）。相应地对幼虫注射或饲喂不同浓度的TH酶抑制剂（3-IT）后,试虫羽化率随着抑制剂浓度增加而显着降低。饲喂高浓度TH抑制剂3-IT（10 mg/g）后,桔小实蝇幼虫都能顺利化蛹,但蛹壳颜色变浅（着色不完全）,且蛹壳柔软（骨化不完全）,蛹重显着降低。扫描电镜结果显示,抑制剂处理后的蛹壳表面呈现异常表型,清晰的横纹消失。而且饲喂抑制剂导致试虫体内多巴胺含量显着降低,下游基因BdDDC和BdEbony表达量显着上调,表明蛹壳鞣化通路存在反馈机制。上述结果证明BdTH对于桔小实蝇蛹壳鞣化反应至关重要,伴随BdTH基因表达量下调和酶活被抑制,造成多巴胺合成路径受阻,进而对蛹壳鞣化反应造成影响。此外,饲喂抑制剂3-IT导致老熟幼虫体内黑色素产生量显着减少,4个抗菌肽基因（Bddefensin,Bdattacin,Bdcecropin-A和Bdcecropin-B）的表达量显着下降,且对大肠杆菌的抵抗能力显着降低。以上结果说明BdTH不仅参与桔小实蝇蛹壳的鞣化反应,还参与幼虫化蛹过程中的免疫反应。3桔小实蝇多巴脱羧酶基因在蛹壳鞣化过程中的功能研究采用巢式PCR技术,在桔小实蝇老熟幼虫表皮中克隆获得BdDDC的cDNA序列,完整开放阅读框1428 bp,编码475个氨基酸残基,预测蛋白的分子量和理论等电点（pI）分别为53.3 kDa和6.29。多重序列比对显示桔小实蝇DDC氨基酸序列分别与黑腹果蝇（82.53%）、家蚕（72%）和赤拟谷盗（74.53%）有较高的相似性。BdDDC序列在N-端含有糖基化位点、吡哆醛-5-磷酸结合位点和一段富含甘氨酸区域。系统发育关系分析结果显示双翅目昆虫DDC蛋白单独聚为一支。采用qPCR和半定量RT-PCR技术对BdDDC基因的时空表达模式进行分析,结果显示BdDDC主要在老熟幼虫表皮和中枢神经系统高表达,且该基因的表达量在桔小实蝇蛹壳鞣化（蛹壳着色和变硬）的关键时期显着升高。进一步从蛋白水平检测不同发育阶段BdDDC酶的活性变化,结果与BdDDC基因的表达模式一致,据此推测BdDDC在桔小实蝇化蛹及蛹壳鞣化反应中具有重要功能。使用多巴脱羧酶抑制剂（L-α-M-D）饲喂桔小实蝇5日龄幼虫,结果显示高浓度抑制剂（20 mg/g）处理导致试虫BdDDC酶活性显着下降,参与表皮着色的4个关键基因（BdMCO4、Bdyellow-c、Bdyellow-f和Bdyellow-f2）的表达量均有一定程度的升高,试虫体内多巴胺含量显着降低,化蛹时间推迟,出现大量黑化蛹,蛹重和羽化率显着降低。扫描电镜观察结果显示,饲喂高浓度BdDDC抑制剂（20 mg/g）导致试虫蛹壳表面横纹消失,且呈现不规则形态;冷冻切片结果发现蛹壳厚度显着降低。上述结果证实BdDDC酶基因对于桔小实蝇蛹壳鞣化反应至关重要。4桔小实蝇CPs基因鉴定及CPAP3家族基因在蛹壳形成过程中的功能研究4.1桔小实蝇CPs基因全基因组鉴定及其表达模式分析基于桔小实蝇基因组（NCBI Assembly:ASM78921v2）,通过同源序列比对共鉴定出164个CPs基因,分属于9个家族,包括:97个CPR、25个Tweedle、10个CPAP1、8个CPAP3、9个CPLCA、4个CPLCG、5个CPLCP、1个CPCFC和5个CPF家族基因。序列分析发现,桔小实蝇各个表皮蛋白家族基因均有其特定的保守序列。CPR家族包含R&R基序;Tweedle蛋白拥有4个保守氨基酸区域,区域I包含1个KX2Y/F基序,区域II有1个KX4-5FIKAP序列,区域III包含1个TX2YVL基序,区域IV则包含KPEVYXFV/IKY序列;CPAP1和CPAP3蛋白分别有1个和3个几丁质结合域（ChtBD2）;CPLCA蛋白包含保守的retinin结构域;CPLCG蛋白序列包含35个氨基酸保守基序,且在这35个序列第9-20位上存在1个标签基序G-X2-H-X-A-P-X2-G-H;CPLCP家族蛋白序列中拥有高密度脯氨酸PV和PY重复序列;CPF家族拥有44个氨基酸残基保守序列;CPCFC蛋白序列包含3个重复的16个氨基酸保守区域,且每个拷贝均以C-X5-C基序结尾。选取黑腹果蝇（模式昆虫）、地中海实蝇（与桔小实蝇亲缘关系较近）以及鳞翅目、膜翅目和鞘翅目昆虫的CPs进行系统发育分析。结果得出双翅目昆虫所特有的CPs基因簇和表皮发展模式;一些CPs基因在不同种类昆虫间独立进化,另一些则主要基于特定保守结构域进化。不同组织的表达模式分析显示多数CPs基因在桔小实蝇外周表皮中有表达;内部器官如脂肪体、肠道、卵巢和精巢等组织中也检测到相应CPs基因的表达,表明表皮蛋白家族基因功能的重要性和多样性。桔小实蝇CPAP3家族基因序列不仅在昆虫间非常保守,而且相较于其它CPs基因,其几乎所有家族成员均在老熟幼虫（化蛹前期）表皮中显着高表达,暗示它们可能参与桔小实蝇蛹壳的形成过程。4.2桔小实蝇CPAP3家族基因在蛹壳形成过程中的功能研究桔小实蝇CPAP3家族蛋白拥有3个保守几丁质结合域,暗示拥有潜在几丁质结合能力。选取CPAP3-D2和E蛋白,通过原核表达技术获得重组蛋白,将纯化获得的蛋白与几丁质树脂进行孵育,二者与几丁质的结合效率分别为66.72%和52.78%,高于对照牛血清蛋白（18.06%）。CPAP3家族基因的时空表达模式显示,CPAP3-A1、B、E和E2基因不仅在桔小实蝇老熟幼虫表皮组织中高表达,而且它们的表达量均在幼虫化蛹关键时期显着上调;保幼激素类似物处理试虫导致4个基因的表达量被显着抑制,而蜕皮激素20E处理后这4个基因的表达均被显着诱导。以上结果说明CPAP3家族基因可能在小实蝇化蛹过程中发挥作用。使用RNA干扰技术,对桔小实蝇5日龄幼虫分别注射CPAP3-A,B,E and E2基因的dsRNA,沉默效率在35%-60%之间,结果导致幼虫发育显着延迟,化蛹时间显着延长。特别是RNA干扰降低BdCPAP-E基因的表达量后,造成40%的幼虫死亡（躯体变得僵硬和紧绷,缺乏应有的松弛性）。CPAP3-D2在卵期的表达量显着高于其它任何一个发育阶段,免疫组化分析结果显示CPAP3-D2是桔小实蝇卵壳重要的结构蛋白。定量结果显示CPAP3-D2基因表达水平在桔小实蝇卵巢发育成熟过程中显着升高,RNA干扰沉默该基因导致卵巢发育和卵巢管形成受到显着抑制。上述结果明确了桔小实蝇表皮蛋白家族基因不仅参与蛹壳形成,而且对于昆虫的生殖发育亦至关重要。综上所述,本学位论文聚焦桔小实蝇幼虫化蛹这一关键时期,在完成该发育阶段表达谱数据库构建,推导出蛹壳鞣化反应通路图的基础上,分别靶向蛹壳鞣化通路的关键基因BdTH、BdDDC和CPAP3,并进行深入的功能探究,挖掘它们在桔小实蝇蛹壳鞣化反应中的重要功能。研究结果不仅加深了对桔小实蝇鞣化反应的认识,同时筛选出的一些关键功能基因有可能成为害虫防治新的作用靶点。
崔晓宁[7]（2018）在《苹果小吉丁虫对寄主植物挥发物的行为反应及嗅觉相关基因功能研究》文中指出苹果小吉丁虫（Agrilus mali Masumura）是一种重要的蛀干害虫,主要危害蔷薇科、苹果属的多种经济林树种。近年来,在新疆苹果树上发生严重,特别对新疆天山野果林主要建群树种—新疆野苹果几乎造成毁灭性破坏。该害虫幼虫期长,钻蛀植物韧皮部取食为害,成虫生活期短,取食寄主植物叶片补充营养后,选择合适的产卵场所繁殖后代,所以成虫期是防治的关键时期。寄主植物挥发物在成虫选择寄主植物过程中发挥重要作用,苹果小吉丁虫能够通过灵敏的嗅觉系统感受寄主释放的主要挥发物组分识别寄主植物。目前对该害虫化学生态方面的研究还是空白,解析害虫与寄主植物的互作有利于明确该虫的寄主选择机制,为发展以植物源诱捕剂为主的绿色防治手段提供理论和技术依据。本研究鉴定了寄主和非寄主植物叶片释放的挥发性物质,利用二代转录组测序技术挖掘苹果小吉丁虫触角中相关的嗅觉基因,测定气味结合蛋白和化学感受蛋白基因结合寄主植物挥发物的能力,通过电生理和行为生理试验筛选出对害虫有较强吸引趋性的挥发性化合物,主要结果如下:苹果小吉丁虫对4种植物垂丝海棠、秦冠苹果、杜梨和秦王的选择偏好性和取食量存在明显差异。雌虫偏好在海棠和苹果上取食活动,对梨和桃的选择率较低。无竞争和两项竞争条件下,雌虫对海棠叶片的取食量最大,其次为苹果,但不取食梨和桃树叶片,表明海棠和苹果是该虫的寄主植物,梨和桃是非寄主植物。利用动态顶空吸附法收集寄主和非寄主植物叶片释放的挥发物,GC-MS共鉴定到71种化合物,包括5种烷烃,2种醚,11种醇,2种酮,8种醛,23种酯,4种烯烃,15种萜类和1种腈类物质,每种化合物的含量在4种植物间存在差异。通过对所有挥发性化合物含量进行因子分析,发现这些物质聚类形成3个代表性复合因子,累计解释总方差概率的93.62%。复合因子1、2、3中贡献率较大（绝对值大于0.7）的物质分别有25、19和15种,分别解释了总方差概率的41.98%、31.82%和19.83%。对3个复合因子总得分进行方差分析,结果表明对复合因子1、2、3贡献率大的分别是苹果、桃和海棠叶片释放的挥发物组分。利用复合因子1和2进行主成份分析,表明苹果和桃树叶片释放的挥发物组分含量差异较大,海棠和梨树叶片释放的挥发物组分含量差异较小。采用Illumina HiSeq二代测序平台对苹果小吉丁虫雌、雄虫触角转录组进行测序,共鉴定到63条嗅觉相关基因,包括11条OBP、8条CSP、17条OR、9条GR、17条IR和1条SNMP基因。系统进化树结果表明苹果小吉丁虫触角AmalOBPs、AmalCSPs、基因分别与其它鞘翅目昆虫序列聚类到不同的分枝,说明在进化过程中较分化;共同受体AmalORco、AmalIR8a和AmalIR25a以及AmalSNMP1基因分别与其它鞘翅目昆虫序列聚类到同一分枝,表现出进化过程中的高度保守性。苹果小吉丁虫触角中共鉴定到11条OBP基因,全部具有完整的开放阅读框,编码132149个氨基酸,序列N端分布有1620个氨基酸组成的信号肽。其中5条基因序列中包含6个保守的的半胱氨酸,属于“Classic OBP”亚族,分别为AmalOBP1,AmalOBP2,AmalOBP3,AmalOBP4,AmalOBP5;5条基因序列中包含4个半胱氨酸,与“Classic OBP”相比缺少第2和第5位的半胱氨酸,属于“Minus-C OBP”亚族,分别为AmalOBP7,AmalOBP8,AmalOBP9,AmalOBP10,AmalOBP11;AmalOBP6属于“Plus-C OBP”亚族,序列中含有8个保守的半胱氨酸,并在第六个半胱氨酸后紧接一个脯氨酸。苹果小吉丁虫触角中共鉴定到8条CSP基因,除了AmalCSP7在3′端缺失部分碱基不完整,其余7条均具有完整的开放阅读框,编码119137个氨基酸,在N端具有1622个氨基酸组成的信号肽。荧光定量PCR结果表明AmalOBP1、AmalOBP2、AmalOBP3、AmalOBP4、AmalOBP6和AmalOBP7这6条基因在雌、雄虫触角中特异性或高丰度表达,但在头、胸、腹、足和翅中表达量很低,表明它们可能执行嗅觉反应功能。有3条基因（即AmalOBP5,AmalOBP8和AmalOBP9）不仅在雌、雄虫触角中有较高的表达量,而且在成虫腹部和翅中也表现较高的表达水平,说明它们在参与嗅觉识别过程的同时,也参与到其它的生理过程。AmalOBP10和AmalOBP11分别在雄虫和雌虫腹部特异性地表达,表明它们可能与成虫感受和释放信息素的生理过程有关。AmalCSP2和AmalCSP3均在雌、雄触角中特异性表达,表明它们可能识别气味物质,参与成虫嗅觉反应过程。通过对苹果小吉丁虫触角中表达量较高的4条OBP和2条CSP基因进行原核表达,发现这6个蛋白均以包涵体的形式表达。通过对重组蛋白包涵体稀释复性,利用Ni离子亲和层析柱纯化重组蛋白,获得了高纯度的目的蛋白。蛋白印记杂交分析表明纯化后的重组蛋白在1417 KDa左右出现明显的单一目的条带,说明目的蛋白纯化质量高。采用BCA方法测得纯化后的目的蛋白AmalOBP1、AmalOBP3、AmalOBP7、AmalOBP8、AmalCSP2和AmalCSP3的质量浓度分别为1.28、1.53、0.61、0.58、0.90和1.12 mg/mL。利用GraphPad Prism 5软件对重组蛋白与荧光探针1-NPN结合产生的最大荧光强度值进行非线性回归拟合,测得重组蛋白AmalOBP1、AmalOBP3、AmalOBP7、AmalOBP8、AmalCSP2和AmalCSP3的结合常数（Kd）分别为1.17、8.63、4.52、4.69、8.87和8.10μM。荧光竞争结合试验结果表明AmalOBP1和AmalOBP7对寄主植物挥发物的结合谱较窄,AmalOBP1仅能结合法尼醇（Ki=23.27±0.06μM）、2,4-癸二烯酸乙酯（Ki=35.54±0.22μM）、己酸叶醇酯（Ki=36.67±0.21μM）和莰烯（Ki=35.36±0.06μM）;AmalOBP7对十二醇（Ki=14.94±0.36μM）、法尼醇（Ki=21.60±0.35μM）和十二醛（Ki=14.46±0.21μM）表现出较高的结合能力,也能结合α-罗勒烯（Ki=32.28±0.26μM）。AmalOBP3和AmalOBP8能广谱地结合15和22种化合物,包括醇、醛、酯和萜类物质,不结合烯烃和烷烃类物质。AmalOBP3和AmalOBP8均能强烈地结合主链碳原子数在C12-15的十二醇、十四醇、橙花叔醇和法尼醇（Ki?6μM）;它们对主链碳原子数在C10-12的乙酸辛酯、甲酸香叶酯、桃醛、2,4-癸二烯酸乙酯和己酸叶醇酯也表现出很强的结合能力（Ki=7.0931.90μM）。此外,AmalOBP3和Amal OBP8均对（4E,6Z）-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯和α-罗勒烯（Ki=7.7215.71μM）表现很强的结合能力。AmalCSP2和AmalCSP3分别能选择性的结合9和7种化合物（Ki?40μM）,其中AmalCSP3对十四醇（Ki=1.52±0.01μM）具有特别强的结合能力。以上结果表明这6条基因均能识别寄主植物挥发物组分,共同参与到成虫对寄主挥发物的嗅觉反应过程中。在23种与重组蛋白AmalOBPs和AmalCSPs结合效果较好的寄主植物挥发物中,雌虫对癸醛、甲酸香叶酯、2,4-癸二烯酸乙酯、己酸叶醇酯和（4E,6Z）-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯,雄虫对法尼醇、癸醛和己酸叶醇酯表现强烈的触角电位反应,EAG相对值均大于1.0。双向嗅觉行为试验表明（4E,6Z）-2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯、甲酸香叶酯、己酸叶醇酯、癸醛和十四醇对雌虫具有显着的吸引效果,己酸叶醇酯对雄虫表现出强烈的吸引作用,其它物质均不能引起雄虫明显的行为反应,表明以上几种气味化合物在成虫选择合适的寄主植物取食和产卵过程中发挥重要作用。田间诱捕试验表明雌、雄虫均对黄色诱虫板的趋性最强,每个诱捕器10天诱捕量为雌虫14.33±1.09头、雄虫5.67±1.52头和总虫数20.00±2.57头,其次为绿色,雌虫11.67±0.88头、雄虫5.33±0.72头和总虫数17.00±1.16头,这两种颜色均适合用于田间诱捕试验。此外,癸醛对雌、雄成虫具有良好的诱捕效果,每个诱捕器10天的诱捕量为雌虫14.00±1.53头、雄虫7.00±1.53头和总虫数21.00±2.00头。
陈菲[8]（2017）在《BmCPVS5、S10dsRNA片段编码的sORF功能研究》文中认为小开放阅读框（small open reading frame,sORFs）作为<100个连续密码子所编码的基因片段,在许多重要的生物进程中发挥着重要的作用,其能够调控细胞的增殖、分化、信号传递等多种生物学进程,具有多种生物学效应,家蚕质型多角体病毒1型（Bo b x mori cypovirus type-1,BmCPV-1,以下简称 BmCPV）作为呼肠孤病毒家族的一员,是质型多角体病毒的典型种,能够特异性感染家蚕中肠组织。BmCPV的基因组由S1-S10 dsRNAs片段构成,通常认为包括BmCPV在内的质型多角体病毒基因组的每一个dsRNA片段为单顺反子,编码一种蛋白。目前已有研究报道认为部分病毒可以编码功能性sORF,但BmCPV的基因组dsRNA能否编码功能性sORFs还未见报道。1、BmCPVS5-sORF 的功能BmCPV S5 dsRNA编码非结构蛋白NS1,利用sORF Finder软件预测发现S5 dsRNA的反义链（-）具有编码一个sORF的潜能,本文将该sORF命名为S5-sORF-1089,简称S5-sORF。设计特异性引物PCR扩增S5-sORF的编码序列,扩增产物克隆进原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备了 S5-sORF多克隆抗体。细胞免疫荧光检测结果显示,在感染BmCPV的细胞核中可检测到S5-sORF小肽,表明BmCPV确能编码sORF。为了探讨S5-sORF的功能,我们构建了过表达S5-sORF转化细胞,qPCR检测结果显示,BmCPV在S5-sORF转化细胞中的增殖被抑制,过表达S5-sORF对细胞凋亡、免疫通路相关基因的表达无明显影响;进一步通过基于BmCPV体外转录的病毒RNA的反向遗传学系统,构建了 S5-sORF起始密码突变的重组BmCPV-S5-sORFmut,qPCR检测结果显示,BmCPV-S5-sORFmut的S1基因的表达水平高于重组BmCPV病毒,推测S5-sORF编码的小肽对病毒的增殖有抑制作用;用人工合成的带有穿透肽的S5-SORF小肽处理培养细胞,结果显示BmCPV的增殖以剂量依赖方式被抑制,进一步证实S5-sORF编码的小肽可抑制病毒的增殖。利用Co-IP法筛选S5-sORF的互作蛋白,通过质谱鉴法共鉴定到TFAP4,Akirin蛋白和小分子泛素化修饰蛋白等7种互作蛋白,推测S5-sORF能与这些蛋白互作调节病毒的增殖。另外,我们还发现BmCPV的增殖在起始密码缺失的S5-sORF的体外转录RNA的转染细胞中受到抑制,推测S5-sORF的RNA也可能作为NS1基因的反义RNA发挥作用。2、BmCPV S10-sORF 的功能BmCPV S10 dsRNA编码多角体蛋白基因,利用sORF Finder软件预测发现S10 dsRNA的正义链（+）具有编码一个sORF的潜能,本文将该sORF命名为S10-sORF-393,简称S10-sORF。将S10-sORF序列克隆进原核表达载体进行表达,利用重组表达蛋白免疫小鼠制备S10-sORF多克隆抗体,细胞免疫荧光检测结果显示,S10-sORF小肽主要定位于细胞质内。qPCR检测结果显示,S10-sORF的mRNA水平与多角体蛋白基因的mRNA水平相当,推测S10-sORF和多角体蛋白基因共用同一个mRNA模板翻译蛋白;为了探讨S10-sORF对BmCPV自身及宿主细胞的影响,本研究构建过表达S10-sORF转化细胞以及过表达S10-sORF起始码后端序列突变的S10片段（S10-sORFmut）)转化细胞系,qPCR检测结果显示,BmCPV在二种转化细胞中增殖均受到抑制,且发现S10-sORF过表达抑制BmSOCS6（JAK/STAT 通路）、BmPGRP-LB（Imd 通路）、Bmago2（RNAi 通路）和Bmdrc2（RNAi通路）基因的表达,提高caspase基因表达。进一步通过基于BmCPV体外转录的病毒RNA的反向遗传学系统,构建了 S10-sORF起始密码后端序列突变的重组 BmCPV-S10-sORFmut病毒,qPCR 检测结果显示,rBmCPV-S10-sORFmut病毒的增殖水平低于重组BmCPV病毒;细胞转染缺失起始密码的S10-sORF体外转录RNA对BmCPV的增殖有一定的抑制作用。利用Co-IP法筛选S10-sORF的互作蛋白,通过质谱鉴法共鉴定到14种候选互作宿主蛋白,主要与转录调控、蛋白翻译等相关联。3、BmCPV入侵BmN细胞途径的研究由于到目前为止,对于BmCPV感染细胞的途径仍然不是很清楚,为了研究BmCPV感染细胞的途径,通过电镜观察BmCPV早期感染BmN细胞的切片发现,BmCPV进入细胞的途径可能与内吞作用相关。据此,利用内吞抑制剂来研究BmCPV的感染途径,结果表明,丹磺酰胺,氯丙嗪,染料木黄酮及PP2均可抑制BmCPV的感染,同时氯丙嗪对于BmCPV感染的抑制效果最强,推测BmCPV通过依赖于网格蛋白介导的内吞途径入侵细胞。为进一步了解染料木黄酮及PP2对于BmCPV感染性的抑制作用,通过病毒粒子与溶酶体共定位后发现,经药处理的细胞其能够诱发BmCPV病毒粒子的无效感染,即将病毒错误运输至溶酶体,使得BmCPV被降解,从而抑制BmCPV的感染作用。
靳亮,许翠萍,王金昌,关丽梅,张稳超,黄朝,高学梅,王洪秀[9]（2016）在《马尾松毛虫质型多角体病毒NSP1蛋白在昆虫细胞表达及定位》文中认为马尾松毛虫质型多角体病毒（Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus,Dp CPV）基因组S5片段编码一个由881个氨基酸组成、分子量为101 k D的非结构蛋白（NSP1）。为探寻Dp CPV NSP1蛋白的功能,将Dp CPV 1基因组S5-1片段的抗原区（1-600 bp）进行了原核表达,并将纯化蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。将稀释后的病毒液感染甜菜夜蛾幼虫,感染后每天解剖甜菜夜蛾并取中肠样品,通过Western blot检测NSP1蛋白的合成时间曲线。Western blot检测结果显示,S5片段表达的蛋白在病毒感染第1天就有合成,并且除了检测到全长的蛋白（101 k D）外,也检测到了80 k D和20 k D的蛋白条带,说明NSP1蛋白为早期表达蛋白,并且蛋白发生了切割。另外,首次对Dp CPV 1 S5片段进行了在昆虫细胞中表达和昆虫亚细胞定位,结果显示,昆虫细胞定位于细胞的细胞质。
吕卡伦[10]（2016）在《SRBSDV 12个基因植物表达载体构建及转基因水稻表型初探》文中进行了进一步梳理南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）,是呼肠孤病毒科（Reoviradae）斐济病毒属（Fijivirus）的一个暂定新种。该病毒侵染水稻后病株表现矮缩,叶色深绿,叶片基部产生皱褶,茎节部有倒生须根及茎表瘤突、高节位分蘖及根系褐化。前人研究发现SRBSDV全基因组由10条线性dsRNA组成,根据各片段从大到小分别命名为S1S10,其中S5、S7和S9分别编码两个蛋白其余各片段均编码一个蛋白。目前,SRBSDV部分基因功能及其致病机理尚未清晰,尤其是病毒蛋白与寄主水稻之间的互作机制方面仍需要更深入的探索。为研究SRBSDV各基因所编码蛋白的功能和致病机理,本研究分别构建了SRBSDV 12个基因的植物表达载体。利用农杆菌介导法,分别获得由SRBSDV S1和S10编码的RdRP和CP转水稻植株,并重点对T1代转基因水稻的表型进行观察和利用RT-qPCR技术检测CP的相对表达量。取得如下研究结果:1.克隆了SRBSDV 12个编码基因,构建了12个基因的植物表达载体,并获得了相应的工程农杆菌。通过RT-PCR,以SRBSDV感病水稻叶组织总RNA为模板,扩增获得了病毒S1、S3、S4、S5-1、S5-2、S6、S7-1、S7-2、S8、S9-1、S9-2和S10编码的共12个基因,经测序确认后连接到植物表达载体pCambia1302上,获得各基因的植物表达重组质粒,分别命名为pC1302-P1、pC1302-P3、pC1302-P4、pC1302-P51、pC1302-P52、pC1302-P6、pC1302-P71、pC1302-P72、pC1302-P8、pC1302-P91、pC1302-P92和pC1302-P10,利用电激法将上述重组质粒成功转化到农杆菌EHA105菌株中。2.分别获得了4株转RdRP和6株转CP的水稻植株。以水稻品种“日本晴”胚性愈伤组织为受体,用携带植物表达重组质粒pC1302-P1和pC1302-P10的农杆菌EHA105侵染愈伤组织,经过潮霉素抗性筛选,预分化和分化,生根炼苗等过程分别获得4株P1阳性和6株P10阳性植株,Southern blot检测外源基因S10均为单拷贝。3.对T1代P1转基因水稻植株的表型进行观察发现,各株系T1代群体幼苗期时与非转基因水稻表型没有明显差异。分蘖期时,部分转基因水稻植株表现出白化现象。白化植株的心叶表现正常,但其余叶片均有不同程度的白化,且长势较弱。4.获得了T1代P10转基因水稻植株,并对其进行了分子检测和表型观察。对T1代P10转基因水稻植株进行PCR检测,结果表明,6个株系的外源基因基本均以3:1的比例进行遗传分离,符合孟德尔单基因遗传规律。T1代P10转基因植株幼苗期时与非转基因植株没有明显的表型差异。分蘖期时,部分转基因植株长势明显减弱,表现出矮化,分蘖减少等表型。5.建立了转基因水稻病毒CP相对表达量RT-qPCR检测技术。利用RT-qPCR技术,分别在幼苗期、分蘖期和抽穗期对转基因水稻植株的病毒CP的相对表达量进行了检测,结果表明,外源基因在转基因水稻三个时期均能成功转录。这些结果为进一步研究病毒P1和P10两个基因在SRBSDV侵染水稻过程中的致病机制提供了材料基础。
二、马尾松毛虫CPV基因组S7的序列分析及部分序列的原核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、马尾松毛虫CPV基因组S7的序列分析及部分序列的原核表达（论文提纲范文）
（1）反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜的联合杀虫作用及对其GSTs基因表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 供试昆虫与真菌 |
| 1.1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.1.3 生物信息学分析 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 球孢白僵菌和反式茴香脑对桃蚜的生物测定 |
| 1.2.2 从桃蚜转录组中鉴定GSTs基因 |
| 1.2.3 GSTs基因克隆 |
| 1.2.4 GST酶活性的测定方法 |
| 1.2.5 不同发育期表达谱 |
| 1.2.6 应对球孢白僵菌和反式茴香脑单独处理桃蚜的表达模式分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 球孢白僵菌和反式茴香脑对桃蚜的生物测定 |
| 2.1.1 球孢白僵菌对桃蚜的毒力测定 |
| 2.1.2 正交结果和极差分析 |
| 2.1.3 球孢白僵菌和反式茴香脑混合后对桃蚜的联合作用效果 |
| 2.2 桃蚜GSTs基因鉴定和序列分析 |
| 2.2.1 桃蚜GSTi基因鉴定 |
| 2.2.2 桃蚜GSTs的生物学信息分析 |
| 2.2.3 桃蚜GSTs基因的系统进化分析 |
| 2.2.4 桃蚜GSTs基因与其他物种蛋白的序列联配 |
| 2.3 反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜GST酶活性和GSTs基因表达的影响 |
| 2.3.1 反式茴香脑和球孢白僵菌单独处理对GST酶活性的影响 |
| 2.3.2 反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜GSTs基因表达模式分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜的生物测定 |
| 3.2 桃蚜GSTs基因的鉴定及生物信息学分析 |
| 3.3 反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜GST酶活性和GSTs基因表达的影响 |
| 4 结论 |
| 4.1 反式茴香脑和球孢白僵菌处理桃蚜最优配比 |
| 4.2 桃蚜GSTs基因的鉴定及生物信息学分析 |
| 4.3 反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜GST酶活性和GSTs基因表达的影响 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）桔小实蝇发育阶段转变前后转录组分析及几丁质酶基因功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 昆虫变态发育 |
| 2 几丁质 |
| 3 几丁质酶 |
| 4 几丁质酶及酶原基因功能研究的方法 |
| 5 学位论文研究的目的和意义 |
| 第二章 桔小实蝇发育阶段转变前后转录组文库构建及分析 |
| 第一节 桔小实蝇发育阶段转变前后转录组建库 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇发育阶段转变前后差异表达基因分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 桔小实蝇发育阶段转变前后激素相关通路分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第四节 桔小实蝇发育阶段转变前后表皮相关通路分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第三章 桔小实蝇几丁质酶基因的鉴定及表达特性分析 |
| 第一节 桔小实蝇几丁质酶基因的鉴定及注释 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇几丁质酶基因在不同发育阶段的表达模式解析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 桔小实蝇几丁质酶基因在幼虫及成虫不同组织的表达模式解析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第四节 桔小实蝇几丁质酶基因在不同应激条件下的表达特性 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第四章 桔小实蝇几丁质酶BdCht8重组蛋白酶学特性解析 |
| 第一节 桔小实蝇几丁质酶BdCht8原核表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇几丁质酶BdCht8真核表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第五章 桔小实蝇几丁质酶基因在生长发育中的功能研究 |
| 第一节 桔小实蝇BdCht1/7/10在幼虫生长发育中的功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇BdCht5/10在化蛹过程中的功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 第三节 桔小实蝇BdCht1/8在成虫发育中的功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第六章 主要结果和结论、创新点及研究展望 |
| 1 主要结果和结论 |
| 2 创新点 |
| 3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参研课题情况 |
| 致谢 |
（3）仁扇舟蛾嗅觉相关基因鉴定及GOBP2蛋白功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 仁扇舟蛾简介 |
| 1.1.1 仁扇舟蛾的形态特征 |
| 1.1.2 仁扇舟蛾的生物学特性及危害状 |
| 1.1.3 仁扇舟蛾的防治方法 |
| 1.2 昆虫化学通讯中的信息物质 |
| 1.2.1 植物挥发物 |
| 1.2.2 昆虫信息素 |
| 1.3 昆虫嗅觉感受机制 |
| 1.3.1 气味结合蛋白 |
| 1.3.2 化学感受蛋白 |
| 1.3.3 气味受体 |
| 1.3.4 其他蛋白 |
| 1.3.5 嗅觉信号的胞内传导 |
| 1.4 研究意义和研究内容 |
| 1.4.1 研究目的和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 仁扇舟蛾触角转录组测序和嗅觉相关基因挖掘 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 仁扇舟蛾触角RNA提取 |
| 2.1.3 c DNA文库构建与Illumina测序 |
| 2.1.4 序列拼接、组装与功能注释 |
| 2.1.5 基因表达水平分析 |
| 2.1.6 仁扇舟蛾嗅觉相关基因的鉴定 |
| 2.1.7 序列分析和系统发育树构建 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 转录组测序数据基本情况 |
| 2.2.2 转录组基因功能注释 |
| 2.2.3 气味结合蛋白基因鉴定和序列分析 |
| 2.2.4 化学感受蛋白基因鉴定和序列分析 |
| 2.2.5 气味受体基因鉴定和序列分析 |
| 2.2.6 其他化学感受相关基因鉴定和序列分析 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 第三章 仁扇舟蛾OBP基因克隆和表达模式分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 总RNA提取和c DNA合成 |
| 3.1.3 利用RACE技术克隆基因全长 |
| 3.1.4 仁扇舟蛾OBP基因克隆 |
| 3.1.5 荧光定量PCR实验 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 仁扇舟蛾OBP基因的序列分析 |
| 3.2.2 仁扇舟蛾内参基因筛选和扩增效率测定 |
| 3.2.3 仁扇舟蛾OBP基因表达模式分析 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第四章 仁扇舟蛾CSP基因克隆和表达模式分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 总RNA提取和c DNA合成 |
| 4.1.3 利用RACE技术克隆CSP基因全长 |
| 4.1.4 仁扇舟蛾CSP基因克隆 |
| 4.1.5 荧光定量PCR实验 |
| 4.1.6 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 仁扇舟蛾CSP基因的序列分析 |
| 4.2.2 仁扇舟蛾CSP基因表达模式分析 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第五章 仁扇舟蛾GOBP2功能研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 表达载体构建 |
| 5.1.3 重组质粒诱导表达 |
| 5.1.4 蛋白纯化 |
| 5.1.5 抗体制备 |
| 5.1.6 蛋白免疫印迹 |
| 5.1.7 荧光竞争结合实验 |
| 5.1.8 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 CresGOBP2 蛋白的原核表达与纯化 |
| 5.2.2 Western Blot分析 |
| 5.2.3 CresGOBP2 结合特性分析 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 第六章 仁扇舟蛾气味结合蛋白同源建模与分子对接 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 同源建模 |
| 6.1.2 分子对接 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 仁扇舟蛾GOBP三维结构同源模拟 |
| 6.2.2 CresGOBP与杨树叶片挥发物分子对接 |
| 6.3 结论与讨论 |
| 第七章 仁扇舟蛾对寄主挥发物的触角电位反应 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验方法 |
| 7.1.3 数据分析 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 仁扇舟蛾成虫对不同类型挥发物触角电位反应 |
| 7.2.2 仁扇舟蛾雌、雄成虫对杨树挥发物触角电位反应差异 |
| 7.3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 附表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 参考文献 |
（4）茉莉酸甲酯诱导下神农香菊萜类物质合成相关基因的挖掘及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 芳香植物的应用现状 |
| 1.2.1 芳香植物概述 |
| 1.2.2 芳香植物在园林绿化中的应用 |
| 1.2.3 芳香植物香气成分的应用 |
| 1.2.4 芳香植物分子育种 |
| 1.3 茉莉酸类物质对植物影响的研究进展 |
| 1.3.1 茉莉酸类物质对植物次生代谢的影响 |
| 1.3.2 茉莉酸类物质对植物生长发育的影响 |
| 1.4 观赏植物基因转录组学研究进展 |
| 1.4.1 转录组概述 |
| 1.4.2 转录组研究方法 |
| 1.4.3 转录组技术在植物基因挖掘及结构优化中的应用 |
| 1.4.4 转录组技术在植物分子标记中的应用 |
| 1.4.5 转录组技术在植物代谢通路分析中的应用 |
| 1.4.6 转录组技术在植物遗传育种和进化中的应用 |
| 1.5 观赏植物萜类代谢分子调控研究进展 |
| 1.5.1 植物萜类代谢途径 |
| 1.5.2 植物萜类代谢途径上主要酶基因 |
| 1.5.3 调控植物萜类物质生物合成的转录因子 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 茉莉酸甲酯对神农香菊毛状体及其分泌物的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同浓度处理对叶片表皮毛密度的影响 |
| 2.2.2 不同时间处理对叶片表皮毛密度的影响 |
| 2.2.3 不同浓度处理对叶片表面分泌物的影响 |
| 2.2.4 不同时间处理对叶片表面分泌物的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 茉莉酸甲酯诱导下的神农香菊转录组测序及分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料处理 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 神农香菊总RNA的质量分析 |
| 3.2.2 神农香菊转录组测序和组装结果分析 |
| 3.2.3 神农香菊转录组基因功能注释 |
| 3.2.4 神农香菊转录组差异表达基因分析 |
| 3.2.5 响应MeJA的JA生物合成和信号转导途径差异表达基因 |
| 3.2.6 响应MeJA的萜类物质合成途径差异表达基因 |
| 3.2.7 响应MeJA的苯丙烷类代谢途径差异表达基因 |
| 3.2.8 响应MeJA的脂肪酸类代谢途径差异表达基因 |
| 3.2.9 响应MeJA的植物后修饰酶类差异表达基因 |
| 3.2.10 响应MeJA的转录因子差异表达基因 |
| 3.2.11 qRT-PCR结果验证 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 神农香菊萜类物质合成途径关键基因CiGPS和CiFPS的克隆及其功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试剂及菌株 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CiGPS和CiFPS基因ORF框的克隆 |
| 4.2.2 CiGPS和CiFPS基因的生物信息学分析 |
| 4.2.3 CiGPS和CiFPS基因的表达模式分析 |
| 4.2.4 神农香菊CiGPS和CiFPS基因表达载体构建 |
| 4.2.5 转CiGPS和CiFPS基因烟草的获得及分子鉴定 |
| 4.2.6 转基因烟草外部形态观察 |
| 4.2.7 转基因烟草叶绿素含量的分析 |
| 4.2.8 转基因烟草叶片表皮毛形态和密度的分析 |
| 4.2.9 转基因烟草叶片分泌物含量的分析 |
| 4.2.10 转基因烟草GPS和FPS酶活性的分析 |
| 4.2.11 转基因烟草萜类物质合成途径基因的表达分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 神农香菊CiMYC2转录因子的克隆及其功能分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试剂及菌株 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 CiMYC2基因ORF框的克隆 |
| 5.2.2 CiMYC2基因的生物信息学分析 |
| 5.2.3 CiMYC2基因的表达模式分析 |
| 5.2.4 神农香菊CiMYC2基因表达载体构建 |
| 5.2.5 神农香菊CiMYC2基因亚细胞定位检测 |
| 5.2.6 转CiMYC2基因烟草的获得及分子鉴定 |
| 5.2.7 转基因烟草外部形态观察 |
| 5.2.8 转基因烟草叶绿素含量的分析 |
| 5.2.9 转基因烟草叶片表皮毛密度的分析 |
| 5.2.10 转基因烟草叶片分泌物含量的分析 |
| 5.2.11 转基因烟草萜类物质合成途径基因的表达分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）美国白蛾气味结合蛋白与信息素受体的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫嗅觉感受 |
| 1.2 昆虫气味结合蛋白 |
| 1.3 昆虫嗅觉受体 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 美国白蛾性信息结合蛋白基因鉴定和功能分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 美国白蛾普通气味结合蛋白基因鉴定和功能分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 美国白蛾性信息素受体PR3的功能分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 硕士期间发表的论文 |
（6）桔小实蝇蛹壳鞣化关键基因的鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 昆虫蛹壳形成过程 |
| 2 昆虫体壁表皮及其鞣化机制 |
| 2.1 昆虫体壁表皮 |
| 2.2 昆虫体壁表皮化学组分 |
| 2.3 昆虫体壁表皮的鞣化反应 |
| 3 酪氨酸代谢通路关键酶的研究 |
| 3.1 酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase) |
| 3.2 酪氨酸羟化酶功能的研究进展 |
| 3.3 多巴脱羧酶(DOPA decarboxylase) |
| 3.4 多巴脱羧酶功能的研究进展 |
| 4 昆虫表皮蛋白的研究 |
| 4.1 昆虫表皮蛋白概述 |
| 4.2 昆虫表皮蛋白CPAP3 家族基因研究进展 |
| 5 本论文研究目的与意义 |
| 第二章 桔小实蝇蛹壳鞣化关键通路基因的鉴定及其表达模式分析 |
| 第一节 桔小实蝇化蛹过程的表达谱测序 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 样品准备及总RNA的提取 |
| 1.4 cDNA文库构建及表达谱测序 |
| 1.5 表达谱数据分析 |
| 1.6 定量PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组数据分析 |
| 2.2 差异表达基因及通路分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇酪氨酸代谢通路基因鉴定及表达模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 桔小实蝇酪氨酸代谢通路基因的鉴定 |
| 1.2 桔小实蝇酪氨酸代谢通路基因不同发育阶段表达模式分析 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第三章 桔小实蝇酪氨酸羟化酶基因在蛹壳鞣化过程中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 cDNA克隆及序列分析 |
| 1.4 定量PCR分析 |
| 1.5 RNA干扰及表型观察 |
| 1.6 抑制剂处理及表型观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 桔小实蝇TH氨基酸序列分析 |
| 2.2 桔小实蝇TH基因时空表达模式分析 |
| 2.3 dsRNA注射及抑制剂处理对桔小实蝇蛹壳鞣化的影响 |
| 2.4 TH抑制剂处理对桔小实蝇免疫反应的影响 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第四章 桔小实蝇多巴脱羧酶基因在蛹壳鞣化过程中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 cDNA克隆及序列分析 |
| 1.4 定量PCR分析及BdDDC酶活测定 |
| 1.5 抑制剂处理及表型观察 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 桔小实蝇DDC氨基酸序列分析 |
| 2.2 桔小实蝇DDC基因时空表达模式及不同发育阶段酶活性分析 |
| 2.3 DDC抑制剂处理对桔小实蝇发育的影响 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第五章 桔小实蝇表皮蛋白基因鉴定及CPAP3家族基因在蛹壳形成过程中的功能研究 |
| 第一节 桔小实蝇表皮蛋白基因鉴定及其表达模式分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 桔小实蝇表皮蛋白基因的全基因组鉴定 |
| 1.2 系统发育分析 |
| 1.3 桔小实蝇表皮蛋白基因不同组织的表达模式分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 桔小实蝇CPs基因的鉴定与注释 |
| 2.2 CPR家族基因 |
| 2.3 Tweedle家族基因 |
| 2.4 CPAP家族基因 |
| 2.4 低复杂度表皮蛋白家族基因 |
| 2.5 CPF家族基因 |
| 2.6 CPCFC家族基因 |
| 2.7 桔小实蝇表皮蛋白基因不同组织的表达模式分析 |
| 3 小结 |
| 第二节 桔小实蝇表皮蛋白CPAP3 基因在蛹壳形成过程中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 桔小实蝇CPAP3 家族基因鉴定及序列分析 |
| 1.4 几丁质结合能力测定 |
| 1.5 桔小实蝇CPAP3 家族基因的时空表达模式分析 |
| 1.6 烯虫酯和20E处理对桔小实蝇CPAP3 家族基因表达的影响 |
| 1.7 注射ds CPAP3-A1,B,E和E2 对桔小实蝇化蛹的影响 |
| 1.8 桔小实蝇CPAP3-D2 基因的生理功能研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 桔小实蝇CPAP3 家族基因序列分析及几丁质结合能力测定 |
| 2.2 桔小实蝇CPAP3 家族基因的时空表达模式分析 |
| 2.3 烯虫酯和20E处理对4个CPAP3 基因表达量的影响 |
| 2.4 桔小实蝇CPAP3 基因在化蛹过程中的功能分析 |
| 2.5 桔小实蝇CPAP3-D2 基因的功能解析 |
| 3 小结 |
| 本章讨论 |
| 第六章 主要结论、创新点及研究展望 |
| 1 主要结论 |
| 1.1 推导出桔小实蝇蛹壳鞣化反应的通路图 |
| 1.2 桔小实蝇酪氨酸羟化酶基因参与蛹壳鞣化及免疫反应 |
| 1.3 桔小实蝇多巴脱羧酶基因参与蛹壳鞣化反应 |
| 1.4 桔小实蝇表皮蛋白CPAP3 家族基因参与蛹壳形成及生殖发育 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参研课题情况 |
| 发表期刊论文目录 |
| 参会情况 |
| 申请专利 |
| 参研课题情况 |
| 致谢 |
（7）苹果小吉丁虫对寄主植物挥发物的行为反应及嗅觉相关基因功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 寄主植物挥发物 |
| 1.1.1 寄主植物挥发物对昆虫行为的影响 |
| 1.1.2 昆虫对气味物质的嗅觉反应机制 |
| 1.2 昆虫嗅觉相关基因研究 |
| 1.2.1 昆虫触角基因组和转录组研究 |
| 1.2.2 气味结合蛋白 |
| 1.2.3 化学感受蛋白 |
| 1.2.4 气味受体 |
| 1.2.5 离子受体 |
| 1.2.6 感觉神经元膜蛋白 |
| 1.3 苹果小吉丁虫研究进展 |
| 1.3.1 苹果小吉丁虫概述 |
| 1.3.2 苹果小吉丁虫防治 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 第二章 苹果小吉丁虫对四种植物的偏好性及相关挥发物分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫和植物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 苹果小吉丁虫对4种植物的选择偏好性 |
| 2.1.5 苹果小吉丁虫对4种植物叶片的取食量 |
| 2.1.6 植物挥发物采集和化合物组分鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 苹果小吉丁虫对四种植物的选择偏好性 |
| 2.2.2 苹果小吉丁虫对四种植物叶片的取食量 |
| 2.2.3 四种植物叶片释放的挥发物组分和含量 |
| 2.2.4 四种植物叶片挥发物的因子分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 苹果小吉丁虫嗅觉相关基因的鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 触角总RNA的提取 |
| 3.1.4 构建cDNA文库和转录组测序 |
| 3.1.5 序列组装与生物信息学分析 |
| 3.1.6 嗅觉基因的鉴定和表达量分析 |
| 3.1.7 序列分析和系统发育树构建 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 总RNA质量和浓度检测 |
| 3.2.2 转录组测序和序列组装 |
| 3.2.3 转录组基因序列的同源比对 |
| 3.2.4 转录组基因序列的功能注释 |
| 3.2.5 转录组基因序列的KOG分析 |
| 3.2.6 转录组基因序列的KEGG分析 |
| 3.2.7 气味结合蛋白基因的鉴定 |
| 3.2.8 化学感受蛋白基因的鉴定 |
| 3.2.9 气味受体基因的鉴定 |
| 3.2.10 味觉受体基因的鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 苹果小吉丁虫OBPs和CSPs的组织表达特异性分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试昆虫 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 总RNA的提取及cDNA模板合成 |
| 4.1.5 OBP和CSP基因的克隆验证 |
| 4.1.6 荧光定量PCR反应 |
| 4.1.7 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 苹果小吉丁虫OBP基因的表达量分析 |
| 4.2.2 苹果小吉丁虫CSP基因的表达量分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 苹果小吉丁虫OBPs和CSPs的原核表达及荧光竞争结合特性 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 重组质粒的表达载体构建 |
| 5.1.4 重组质粒的诱导表达分析 |
| 5.1.5 蛋白纯化 |
| 5.1.6 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 5.1.7 蛋白印迹杂交分析 |
| 5.1.8 重组蛋白与荧光探针1-NPN的结合 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 OBP和CSP基因的序列分析 |
| 5.2.2 目的基因表达载体的构建 |
| 5.2.3 重组蛋白的诱导表达和Westernblot分析 |
| 5.2.4 重组蛋白与荧光探针1-NPN的结合常数 |
| 5.2.5 重组蛋白AmalOBPs与配体化合物的结合特性 |
| 5.2.6 重组蛋白AmalCSPs与配体化合物的结合特性 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 苹果小吉丁虫对寄主植物挥发物的行为生测反应及田间诱捕试验 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 供试昆虫 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 触角电位测定 |
| 6.1.5 双向嗅觉行为 |
| 6.1.6 不同颜色诱虫板对苹果小吉丁虫的诱捕试验 |
| 6.1.7 不同寄主植物挥发物对苹果小吉丁虫的诱捕试验 |
| 6.1.8 数据处理 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 触角电位反应 |
| 6.2.2 嗅觉行为反应 |
| 6.2.3 不同颜色诱捕器对苹果小吉丁虫的诱捕效果 |
| 6.2.4 不同寄主植物挥发物对苹果小吉丁虫的诱捕效果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 全文总结与研究展望 |
| 7.1 全文主要结论 |
| 7.2 本论文的创新点 |
| 7.3 下一步工作展望 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）BmCPVS5、S10dsRNA片段编码的sORF功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 BmCPV的研究进展 |
| 1.1 BmCPV的片段功能研究 |
| 1.2 BmCPV的入侵途径研究 |
| 2 病毒的反向遗传学研究 |
| 3 sORF功能的研究进展 |
| 3.1 sORF的结构与功能 |
| 3.2 sORF的研究方法 |
| 3.3 病毒sORF的研究进展 |
| 4 研究目的与内容 |
| 4.1 研究的目的与意义 |
| 4.2 研究的主要内容 |
| 4.3 技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 BmCPV的S5-sORF功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 常用仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BmCPV S5-sORF基因的克隆、序列测定及多克隆抗体的制备 |
| 2.2 BmCPV S5-sORF的细胞亚定位 |
| 2.3 S5-sORF转染BmN细胞的筛选及稳定系细胞的鉴定 |
| 2.4 过表达S5-sORF基因对BmCPV自身增殖的影响 |
| 2.5 过表达S5-sORF对BmN细胞的凋亡及免疫应答相关基因的影响 |
| 2.6 突变S5-sORF病毒的构建 |
| 2.7 缺失起始密码子的S5-sORF体外转录RNA对BmCPV增殖的影响 |
| 2.8 小肽干扰对BmCPV增殖的影响 |
| 2.9 Co-IP及质谱分析 |
| 2.10 S5-sORF互作宿主蛋白的筛选及鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 BmCPV S10-sORF功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及常用仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BmCPV S10-sORF的分子克隆及多克隆抗体的制备 |
| 2.2 BmCPV S10(±)链拷贝数检测 |
| 2.3 BmCPV S10-sORF的细胞定位图 |
| 2.4 转染细胞的筛选 |
| 2.5 稳定转化S10-sORF的细胞免疫荧光鉴定 |
| 2.6 过表达S10-sORF,S10-sORF~(mut)-EGFP对病毒增殖的影响 |
| 2.7 S10-sORF及S10-sORF~(mut)-EGFP过表达对BmN细胞的凋亡及免疫应答相关基因的影响 |
| 2.8 突变S10-sORF病毒的构建 |
| 2.9 无起始码的S10-sORF体外转录的RNA对病毒增殖的影响 |
| 2.10 Co-IP及质谱分析 |
| 2.11 S10-sORF互作蛋白的筛选 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 BmCPV入侵BmN细胞途径研究 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 电镜观察BmCPV病毒粒子进入细胞的途径 |
| 2.2 MTT药物毒性检测 |
| 2.3 内吞途径4种抑制剂对病毒增殖的作用 |
| 2.4 染料木黄酮和PP2对BmCPV感染细胞途径的影响 |
| 2.5 内吞抑制剂对于家蚕感染BmCPV的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附件 |
| 一、缩略词表 |
| 二、实验所用载体图谱 |
| 三、实验原始数据 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（9）马尾松毛虫质型多角体病毒NSP1蛋白在昆虫细胞表达及定位（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 昆虫,质粒及菌种 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 引物合成 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Dp CPV 1 S5-1 ORF全长的原核表达 |
| 1.2.2 抗体制备 |
| 1.2.3 Dp CPV感染甜菜夜蛾幼虫 |
| 1.2.4 甜菜夜蛾幼虫中肠样品SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.5 间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗血清的效价 |
| 1.2.6 抗血清的Western blot检测 |
| 1.2.7 NSP1的亚细胞定位 |
| 1.2.8 序列统计分析与系统发育树构建 |
| 2 结果 |
| 2.1 Dp CPV 1基因组S5片段和其编码非结构蛋白NSP1的系统发育分析 |
| 2.2 Dp CPV S5片段的分子克隆和抗体制备 |
| 2.3 昆虫中肠细胞中S5编码蛋白的Western blot检测 |
| 2.4 非结构蛋白NSP1蛋白的亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（10）SRBSDV 12个基因植物表达载体构建及转基因水稻表型初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 南方水稻黑条矮缩病毒研究进展 |
| 1.1.1 南方水稻黑条矮缩病的发生与危害 |
| 1.1.2 南方水稻黑条矮缩病毒的分类地位 |
| 1.1.3 南方水稻黑条矮缩病的典型症状 |
| 1.1.4 南方水稻黑条矮缩病毒的寄主和传播介体 |
| 1.2 南方水稻黑条矮缩病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 南方水稻黑条矮缩病毒粒体特性 |
| 1.2.2 南方水稻黑条矮缩病毒基因组结构 |
| 1.2.3 南方水稻黑条矮缩病毒基因组功能 |
| 1.3 转基因植物的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器与设备 |
| 2.1.2 主要试剂与配方 |
| 2.1.3 供试材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SRBSDV编码基因的克隆与序列测定 |
| 2.2.2 SRBSDV植物表达载体p Cambia1302的构建 |
| 2.2.3 SRBSDV植物表达载体p Cambia1302转化根癌农杆菌 |
| 2.2.4 根癌农杆菌介导的水稻转化 |
| 2.2.5 转Rd RP与CP水稻植株的分子检测 |
| 2.2.6 T1代阳性转基因水稻植株的分子检测与表型观察 |
| 2.2.7 T1代转CP水稻的外源基因表达水平检测方法的建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 SRBSDV植物表达载体p Cambia1302的构建 |
| 3.1.1 SRBSDV编码基因的克隆 |
| 3.1.2 SRBSDV各编码基因植物表达载体的构建 |
| 3.1.3 SRBSDV各编码基因植物表达载体工程农杆菌的获得 |
| 3.2 转基因水稻的获得 |
| 3.2.1 水稻胚性愈伤组织的诱导与培养 |
| 3.2.2 愈伤组织的遗传转化、抗性筛选与分化 |
| 3.2.3 T0代转基因水稻植株的获得 |
| 3.3 T0代P1及P10转基因水稻植株的分子检测 |
| 3.3.1 T0代P1及P10转基因水稻植株的PCR检测 |
| 3.3.2 T0代P10转基因水稻植株的Southern blot检测 |
| 3.4 T0代P1与P10转基因水稻植株表型观察 |
| 3.4.1 T0代P1转基因水稻植株表型观察 |
| 3.4.2 T0代P10转基因水稻植株表型观察 |
| 3.5 T0代P1与P10转基因水稻植株结实与种子收获 |
| 3.5.1 T0代P1转基因水稻植株结实情况 |
| 3.5.2 T0代P10转基因水稻植株结实情况 |
| 3.6 T1代P1转基因水稻植株分子检测与表型观察 |
| 3.6.1 T1代P1转基因水稻植株的培育 |
| 3.6.2 T1代P1转基因水稻植株的PCR检测 |
| 3.6.3 T1代P1转基因水稻植株的表型初步观察 |
| 3.7 T1代P10转基因水稻植株分子检测与表型观察 |
| 3.7.1 T1代P10转基因水稻植株的培育 |
| 3.7.2 T1代转基因水稻植株的PCR检测 |
| 3.7.3 T1代转基因水稻植株的表型初步观察 |
| 3.7.4 T1代转基因水稻CP表达量RT-q PCR检测方法的建立 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 SRBSDV基因组各组分植物表达载体的选择与构建 |
| 4.2.2 农杆菌介导法对水稻愈伤的遗传转化优化 |
| 4.2.3 P1转基因水稻表型变化的可能性分析 |
| 4.2.4 P10转基因水稻表型变化的可能性分析 |
| 4.2.5 转基因水稻体内CP相对表达量检测方法的建立 |
| 4.3 进一步的研究建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A SRBSDV基因组12个基因ORF测序结果 |
| 附录B 组织培养各培养基配方 |
| 附录C 攻读学位期间发表的学位论文 |
| 附录D 攻读学位期间参加的学术活动 |
四、马尾松毛虫CPV基因组S7的序列分析及部分序列的原核表达（论文参考文献）
- [1]反式茴香脑和球孢白僵菌对桃蚜的联合杀虫作用及对其GSTs基因表达的影响[D]. 陈威. 安徽农业大学, 2020(03)
- [2]桔小实蝇发育阶段转变前后转录组分析及几丁质酶基因功能研究[D]. 刘世火. 西南大学, 2020
- [3]仁扇舟蛾嗅觉相关基因鉴定及GOBP2蛋白功能研究[D]. 顾天滋. 南京林业大学, 2019
- [4]茉莉酸甲酯诱导下神农香菊萜类物质合成相关基因的挖掘及功能分析[D]. 高文杰. 东北林业大学, 2019(01)
- [5]美国白蛾气味结合蛋白与信息素受体的功能研究[D]. 张小晴. 安徽农业大学, 2019(05)
- [6]桔小实蝇蛹壳鞣化关键基因的鉴定及其功能研究[D]. 陈二虎. 西南大学, 2019(01)
- [7]苹果小吉丁虫对寄主植物挥发物的行为反应及嗅觉相关基因功能研究[D]. 崔晓宁. 西北农林科技大学, 2018(11)
- [8]BmCPVS5、S10dsRNA片段编码的sORF功能研究[D]. 陈菲. 苏州大学, 2017(01)
- [9]马尾松毛虫质型多角体病毒NSP1蛋白在昆虫细胞表达及定位[J]. 靳亮,许翠萍,王金昌,关丽梅,张稳超,黄朝,高学梅,王洪秀. 生物技术通报, 2016(11)
- [10]SRBSDV 12个基因植物表达载体构建及转基因水稻表型初探[D]. 吕卡伦. 华南农业大学, 2016(03)