一、伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株红内期虫体超微结构的比较（论文文献综述）
王华晶[1]（2021）在《从脾脏控制疟疾感染的角度初步探索青蒿素“耐药”的涵义》文中提出据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）统计,2019年全球约有疟疾病例2.29亿例,其中死亡病例40.9万例。大部分疟疾病例分布在非洲,其次是东南亚和地中海东部地区[1]。青蒿素及其衍生物对恶性疟原虫的红内期具有较高的抗疟活性,为避免单一用药可能带来的潜在耐药风险,WHO提出以青蒿素类药物为基础的联合用药疗法（Artemisinin-based combination therap,ACT）作为单纯性疟疾的一线治疗方法[2]。该治疗方法最初在全球范围内的抗疟效果显着,但在2009年以来,东南亚国家相继报道出ACT三日治疗以后部分疟疾患者体内的疟原虫清除时间延长。这引发了关于疟原虫对青蒿素产生耐药性的一系列讨论及研究。2015年,WHO将青蒿素耐药性定义为:单用青蒿琥酯或ACTs治疗后疟疾患者血液内疟原虫的清除半衰期≥5 h[3]。恶性疟原虫K13 falciparum kelchl3,Pfkelch13)基因突变被认为是疟原虫对青蒿素类药物产生耐药性的主要原因。但是,并非所有的K13基因突变都会造成疟原虫对青蒿素类药物产生耐药性,即使是同时感染K13突变疟原虫的患者,在抗疟治疗过程中,疟原虫的清除时间也有很大差异[4],K13突变可能只是青蒿素耐药性的机制之一,其涉及的分子机制还有待于进一步研究。青蒿素耐药性定义与传统药理学的耐药定义内涵不太一致,传统药理学对于药物耐药性的定义是:病原体与药物多次接触后,对药物的敏感性下降甚至消失,致使药物对该病原体的疗效降低或无效的一种可遗传的生理特性。病原体产生耐药性的机理是（1）细菌产生灭活抗菌药物的酶使抗菌药物失活;（2）抗菌药物作用靶位改变;（3）细菌外膜通透性改变[5]。传统药理学耐药性的定义重在微生物内在变化致使对药物的敏感程度降低甚至消失;青蒿素耐药性则强调寄生病原体本身在宿主体内的存留曲线变化。二者描述方面虽有部分生物学意义上的交叠,但本质上迥然相异,前者重视病原微生物本体基因型或者表观变化,而后者几乎纯属消除现象描述。疟原虫的体内清除是抗疟药物的杀虫功效、宿主免疫功能调节（如吞噬细胞的识别处理）、免疫器官（如脾脏）的外排异物功能等多方参与的复杂过程[6]。而且ACT三日疗法从未被确定为治愈疗法,延长治疗时间或调整联合用药方法,仍可达到疟疾治疗效果。无论宿主防御机制如何,以青蒿素类药物为基础的联合用药治疗以后疟原虫清除时间的延迟是否应定义为青蒿素“耐药”?疟疾的发病机理和临床表现受宿主年龄、免疫力和遗传背景、环境条件和寄生虫遗传学等因素的影响而存在复杂的变化[7-8]。在存在或不存在青蒿素治疗的情况下,宿主防御机制（例如通过脾脏和单核吞噬系统清除循环寄生虫）在快速控制感染中起着重要作用[9]。东南亚地区一直是对各抗疟药物产生耐药性的首发地,在对氯喹、磺胺多辛、奎宁、甲氟喹等抗疟药物产生抗药性以后,又首次发现P.falciparum对青蒿素类药物产生耐药性。而占全球90%疟疾病例的非洲地区却鲜有青蒿素“耐药”病例的报道。从宿主控制疟疾感染的角度寻找疟原虫清除时间延长的原因显得尤为必要。脾脏通过特异性孔蚀功能清除疟疾患者体内的疟原虫,但是脾脏对疟原虫的清除作用与ACTs治疗后出现的疟原虫清除时间延长即耐药有没有相关性,目前尚不明确。而且不同地域、初次感染疟疾或反复感染疟疾的人群,其脾脏清除疟原虫的能力是否存在差异,进而影响疟原虫的清除时间,都有待进一步研究。目的1.探究脾脏清除疟原虫的能力在控制疟疾感染中的重要性。2.探究脾脏清除血液循环中疟原虫的主要方式。3.探究影响脾脏清除血液循环中疟原虫的因素。4.探究青蒿素“耐药”现象的本质,为解决青蒿素“耐药”问题提供理论基础。方法使用C57BL/6、BALB/c、ICR及KM四个品系小鼠,每个品系分为对照组和感染组,感染组小鼠同时腹腔接种1×107个伯氏疟原虫K173青蒿素敏感株染虫红细胞（PbK173 iRBCs）,测生存期组感染后每天记录小鼠的体重、存活时间及尾静脉采血涂片计算染虫率,其他感染组分别在感染后第1、3、5、8天采集小鼠外周血液、心、肝、脾。用全自动血液分析仪检测小鼠外周血液参数,各脏器称重并计算脏器系数,脾脏分为两份:一份用4%多聚甲醛固定液固定24小时后做石蜡切片用于病理分析;用流式细胞计数仪检测剩余脾组织中的脾细胞。PbK173青蒿素敏感株与抗性株进行平行实验,使用C57BL/6小鼠,根据体重随机分为对照组与感染组,各感染组小鼠分别同时腹腔接种1×107个敏感/抗性株的iRBCs,测生存期组感染后每天记录小鼠的体重及尾静脉采血涂片计算染虫率,其他感染组分别在感染后第2、5、9天采集小鼠外周血液、心、肝、脾。观察各组小鼠外周血液参数、脏器系数、脾脏病理切片及脾细胞。PbK173青蒿素敏感株与抗性株进行平行药物治疗实验,使用C57BL/6小鼠,根据体重随机分为对照组与感染组,感染组分为模型组与药物治疗组,药物治疗组包括咯萘啶（MD）组（6 mg/kg）、双氢青蒿素-低剂量（DHA-L）组（10 mg/kg）、双氢青蒿素-中剂量（DHA-M）组（20mg/kg）、双氢青蒿素-高剂量（DHA-H）组（40mg/kg）。感染组分别腹腔接种1×107个敏感/抗性株的iRBCs,测生存期组在治疗及治疗结束后每天记录小鼠的体重及尾静脉采血涂片计算染虫率,其他组分别在治疗结束第一天,治疗结束第五天采集小鼠外周血液、心、肝、脾。观察各组小鼠外周血液参数、脏器系数、脾脏病理切片。结果1.不同品系小鼠对PbK173青蒿素敏感株的耐受性不同、各品系的病程存在差异,ICR小鼠起病急、死亡快;BALB/c小鼠虽起病时间较KM小鼠早,但生存期与KM小鼠无显着性差异,KM小鼠的致死染虫率是65%,而其他品系小鼠的致死染虫率大于80%;C57BL/6小鼠的虫率增长速度较其他品系慢,且生存期较其他品系长。2.脾脏肿大是感染疟疾的典型症状,但不同品系小鼠的脾脏,对疟原虫的耐受性或病理反应有所差异:感染PbK173第八天,C57BL/6和BALB/c染虫小鼠的脾实质结构完整,而ICR和KM染虫鼠的脾脏表现出严重的空泡状病理改变,脾实质结构不完整。KM染虫鼠的脾脏在第五天出现空泡状病理改变,且在红髓部位较明显;到感染第八天,空泡状的病理现象弥漫到整个脾脏。3.不同品系小鼠的脾脏,物理截留疟原虫的功能存在差异:各品系小鼠感染PbK173期间,滞留在C57BL/6、BALB/c染虫鼠脾脏中的疟原虫分布于疟原虫各生长阶段。KM染虫鼠在感染初期,各生长时期的疟原虫均可被截留在脾脏中;感染第八天,脾脏结构发生病理改变,滞留在脾脏中的疟原虫体积偏大。ICR染虫鼠在感染初期,滞留在脾脏中的滋养体时期疟原虫较多。4.本次研究中,PbK173青蒿素敏感株小鼠与抗性株小鼠的染虫率在感染后期无显着性差异,但敏感株小鼠生存期较抗性株小鼠的生存期短（p<0.01）,可以认为PbK173青蒿素抗性株的致死性或毒性降低。5.C57BL/6小鼠,感染PbK173青蒿素敏感株/抗性株,不经药物治疗时,抗性株染虫鼠的脾脏系数在感染第五天以后一直较敏感株染虫鼠的大（p<0.01）。6.100倍油镜下观察染虫小鼠外周血液涂片,正常红细胞呈圆形,显淡红色;感染疟原虫初期,虫体被染为蓝色,胞核为红色;感染中后期,随着虫体生长,红细胞体积明显增大,虫体及胞核均呈蓝色;MD与DHA-H对敏感株染虫鼠的治愈力达100%,在停药第一天,两组的血液涂片中红细胞大小不均,掺杂一些体积较大,无虫体的蓝色细胞（受损红细胞）;在停药第五天的血液涂片中,受损红细胞明显减少,红细胞体积大小较均一。这可能是抗疟药物虽抑制了疟原虫,但被感染过的红细胞仍留存在血液循环中,疟原虫感染造成小鼠血液系统功能紊乱并没有立即恢复,而是在停止治疗以后靠机体自身免疫力（如脾脏过滤清除受损红细胞）得以缓解。7.MD治疗组,PbK173青蒿素敏感株或抗性株染虫鼠的治愈率达100%,在停药第一天,两个虫株染虫鼠的脾脏系数、血液中红细胞计数无统计学差异;血液涂片中均存在受损红细胞,且细胞体积大小不均一。但是在停药第五天,敏感株染虫鼠外周血液中的红细胞计数、血红蛋白浓度较抗性株染虫鼠低（p<0.05）,敏感株染虫鼠的脾脏在停药以后持续增大,血液涂片中,受损红细胞明显减少,红细胞体积大小较均一。抗性株染虫鼠的脾脏在这期间没有继续增大,血液涂片中依然存在较多受损红细胞。这一反差可能是因为:脾脏具有截留血液循环中受损红细胞的功能,抗性株受损红细胞的柔韧性增加,更容易通过内皮细胞间隙;而敏感株受损红细胞容易被截留,所以敏感株染虫鼠的脾脏在治疗结束以后持续增大。结论1.脾脏通过脾静脉窦内皮细胞间隙的截留功能与巨噬细胞的免疫反应共同清除血液循环中的疟原虫。2.不同遗传背景宿主脾脏清除疟原虫的能力不同。3.脾静脉窦内皮细胞间隙的截留功能在脾脏清除疟原虫中发挥主要作用。4.脾静脉窦应力纤维的弹性与红细胞柔韧性影响脾脏的截留功能。5.对青蒿素敏感性不同虫株染虫红细胞的柔韧性可能存在差异。
李若曦[2]（2021）在《老药二次研发策略在抗疟疾和抗罕见病结膜黑色素瘤新药研发中的应用》文中研究指明本论文聚焦老药二次研发方向,以抗肿瘤临床候选药物Quisinostat为先导结构精准设计合成了一系列新型抗疟疾HDAC抑制剂,并系统研究了其抗疟疾活性、安全性、成药性和作用机制;同时发现抗心律不齐临床药物普罗帕酮具有抗结膜黑色素瘤新用途,并以普罗帕酮为先导结构进行了初步的药物化学改造工作。本论文由两部分组成:第一部分为基于Quisinostat的抗疟疾HDAC抑制剂的设计合成与活性研究。疟疾（malaria）是一种由疟原虫引起的全球性恶性传染病,其中恶性疟原虫（Plasmodium falciparum,Pf）流行性最广,危害最大。由于耐药疟疾的威胁愈演愈烈,目前临床上急需具有新结构、新作用机制与多时期杀虫药效的抗疟疾新药。多年研究表明恶性疟原虫组蛋白去乙酰化酶（Plasmodium falciparum histone deacetylase,PfHDAC）具有成为新型抗疟疾药物靶标的潜力。前期研究中本团队合作方中科院上海巴斯德研究所江陆斌研究员团队发现临床Ⅱ期异羟肟酸类抗肿瘤HDAC抑制剂Quisinostat具有良好的体内外多时期抗疟疾药效。Quisinostat由于细胞毒性大、治疗窗口窄,限制了其临床应用潜力,但Quisinostat可作为药物化学结构修饰绝佳的起点。因此,本论文以Quisinostat为先导化合物展开老药二次研发,旨在通过结构改造提高衍生物的安全性,同时保持Quisinostat原有的优秀抗疟疾活性。根据HDAC抑制剂的结构特征以及Quisinostat与PfHDAC1的分子对接结果,可将Quisinostat结构分为Zn2+结合基团（ZBG）、连接链（linker）和表面结合基团（CAP）三个区域。首先,我们保持Quisinostat原有嘧啶异羟肟酸药效团（ZBG区）和N-甲基吲哚（CAP区）不变,基于骨架跃迁策略合成了具有新结构的二胺linker衍生物A1～A6,并基于对人源细胞选择性较高的衍生物A5与A2,通过精心修饰CAP基团,分别合成了具有全新结构骨架的衍生物B1～B39与C1～C30。其中,衍生物B35、B39和C9体外抑制红内期野生型恶性疟原虫3D7的IC50值分别为11.3 nM、11.5 nM和3.19 nM,与Quisinostat 的活性相当（IC50=5.2 nM）,而 B35、B39 和 C9 对人源细胞（HepG2 和 293T）的选择性分别比Quisinostat提高60～80倍、100～140倍和8～10倍,充分表明通过结构改造可以显着提升衍生物的安全性。B35、B39和C9可有效抑制数种多重耐药型红内期临床恶性疟原虫增殖,不与常用抗疟疾临床药物产生交叉抗性,特别是环期生存实验表明C9可以有效抑制青蒿素耐药的恶性疟原虫6218和6320的增殖,表明新衍生物具有克服临床耐药疟疾的潜力。体外肝微粒体实验与小鼠药代实验表明B35、B39与C9的代谢稳定性与部分药代性质优于Quisinostat。小鼠急性毒性和体内药效实验表明B35、B39与C9等新衍生物的动物安全性优于Quisinostat,其中B35和B39在75～150 mg/kg下具有部分红内期体内药效,C9可在60 mg/kg下治愈小鼠红内期约氏疟原虫（P.yoelii）感染,30 mg/kg下部分治愈小鼠肝期伯氏疟原虫（P.berghei）感染,同时在有效剂量下不影响小鼠存活情况。该结果初步表明C9具有多时期（红内期和肝期）体内抗疟疾疗效。红内期时期特异性杀虫实验表明C9与Quisinostat类似,可清除红内期的环状体、滋养体与裂殖体疟原虫,其中针对裂殖体的药效最好,是一个有良好开发潜力的临床前抗疟疾候选化合物。为了探究新衍生物抗疟疾作用机制,我们首先通过Western blot表征恶性疟原虫组蛋白H3乙酰化水平实验证明B35、B39与C9均为PfHDAC抑制剂。我们进而利用glmS核酶构建了PfHDAC1/2基因敲减虫株,并通过测试化合物抑制基因敲减虫株增殖的活性表明PfHDAC1是C9的作用靶点。体外重组蛋白活性抑制实验进一步表明C9抑制PfHDAC1活性的IC50为0.34 nM,强于其它已知PfHDAC1抑制剂,仅弱于Quisinostat（IC50=3 pM）。人源HDAC抑制实验表明C9抑制Ⅰ型人源HDAC的活性与Quisinostat相近,而B35与B39抑制Ⅰ型人源HDAC的活性下降10～20倍。综上所述,本论文以Quisinostat为先导设计并合成了 75个嘧啶异羟肟酸类衍生物并系统研究了其体内外抗疟疾药效、安全性和成药性,从中发现具有针对红内期与肝期的多时期杀虫活性、可有效清除耐药恶性疟原虫且体内外安全性显着提升的新型PfHDAC1抑制剂C9。本论文的研究结果进一步表明PfHDAC1作为新型抗疟疾药物靶点的研究潜力。目前基于C9的深入结构改造与药效及机制研究正在进行中。同时我们发现泛PfHDAC抑制剂B35与B39安全性显着提升且具有一定的抗疟疾活性,同样具有较大的研究潜力。第二部分为普罗帕酮抗罕见病结膜黑色素瘤新用途衍生物的设计合成与活性研究。结膜黑色素瘤（conj unctival melanoma,以下简称CM）是一种致命性的眼部恶性肿瘤,是近年来才逐渐得到重视的罕见疾病领域。目前临床上既无公认的CM治疗方案,也无治疗CM的有效药物,且缺乏系统的CM治疗新药开发与临床研究报道。因此,开发安全有效的抗CM药物迫在眉睫。通过与上海市第九人民医院的贾仁兵研究员课题组共同合作筛选本团队老药库抑制CM细胞增殖的活性,我们首次发现1C型抗心律不齐药物盐酸普罗帕酮具有抗CM新用途。然而普罗帕酮体内外抗CM活性不能满足临床治疗需求。为了推动抗CM新药研发,本论文以普罗帕酮为先导化合物展开抗CM药物化学研究,旨在通过结构改造提高衍生物的抗CM活性与安全性。根据普罗帕酮的结构特点,我们将其划分为三个结构域,并经过三阶段结构改造合成了衍生物D1～D46。体外研究表明衍生物D33和D34抑制CRMM1细胞增殖活性（IC50分别为0.57和0.13 μM）分别比普罗帕酮（IC50=24.70 μM）提高了 43倍和190倍。同时,D33和D34对人源黑色素细胞PIG1的选择性（SI分别为14.5和19.1）分别比普罗帕酮（SI=2.3）提高了 6.3倍和8.3倍。综上所述,我们以普罗帕酮为先导,通过结构改造获得体外抑制CM细胞增殖活性与选择性显着提升的新衍生物,初步达到提高衍生物的抗CM活性与安全性的目的。目前基于新衍生物的抗CM结构改造与机制研究正在进行中。
李爽[3]（2020）在《抗疟纳米材料的筛选及金属纳米粒子Fe2+PP抗疟原虫活性研究》文中认为背景疟疾（malaria）是以按蚊为主要传播媒介的全球性寄生虫传染病,给全球造成了巨大的健康负担。在导致人类罹患疟疾的5种疟原虫中,恶性疟原虫是最致命的。然而,抗疟药耐药性是反复出现的问题,恶性疟原虫对其最后一线治疗药物青蒿素产生抗性已被证实,研发新型抗疟药物迫在眉睫。随着纳米技术的飞速发展,金属纳米粒子已被发现在抗疟治疗方面具有广阔的应用前景。引起宿主临床症状的主要是红细胞内期疟原虫,感染疟原虫的红细胞处于严重的氧化应激状态,使得扰乱铁稳态成为针对疟疾治疗的一个具有巨大吸引力的策略。目的本研究基于恶性疟原虫表型的鉴定,筛选潜在的以铁为核心的抗疟纳米材料,并分析金属纳米粒子Fe2+PP杀伤疟原虫的机理,为新型抗疟药物的研发提供依据。方法体外培养5种恶性疟原虫虫株,3D7、SBC、803、Dd2和K1株,分析其发育周期、外观、DNA含量变化等表型特征;采用SYBR Green I体外药敏实验对4种以铁为核心的纳米材料的抗疟活性进行初步筛选,并进一步通过SYBR Green I体外药敏实验、皮尔逊四天抑制实验研究金属纳米粒子Fe2+PP体外对不同恶性疟原虫虫株、体内对鼠疟的生长抑制作用;通过红细胞溶血实验、细胞毒性实验以及检测Fe2+PP处理后细胞内抗氧化指标MDA、GSH/GSSG值的变化来探究Fe2+PP的抗疟作用机理。结果通过对恶性疟原虫不同虫株表型进行研究,发现红内期恶性疟原虫不同虫株的发育周期、表观及不同发育阶段DNA含量不一致;通过对4种与以铁为核心的纳米材料筛选,我们发现金属纳米粒子Fe2+PP的抗疟效果最佳;体外敏感性试验发现,Fe2+PP对恶性疟原虫3D7、SBC、803、Dd2及K1株均具有较强的杀伤作用,其 IC50分别为19.6μmol/1、42.6μmol/l、35.7μmol/1、49.7μmol/l、58.7μmol/1;体内敏感性试验发现,Fe2+PP在小鼠体内可显着抑制伯氏疟原虫的生长;流式结果显示Fe2+PP与IRBC不结合;疟原虫对铁过载较人脐静脉内皮细胞更为敏感;与正常红细胞相比,Fe2+PP处理后的宿主红细胞的GSH/GSSG 比值降低、MDA含量升高,未引起细胞溶血。结论疟原虫不同虫株表型不同,相关研究应纳入多种虫株以具有可比性。金属纳米粒子Fe2+PP在体内、体外均具有较好的抗疟作用,其抗疟机制可能是由于Fe2+PP降低细胞抗氧化能力的同时增加细胞内的氧化压力,但具体抗疟机制还有待进一步深入研究。
刘影[4]（2019）在《高剂量维生素C与氯喹或青蒿素联用对疟原虫的作用研究》文中提出疟疾（Malaria）是一种以雌性按蚊为传播媒介的寄生虫疾病,严重威胁着非洲等发展中国家人民的生命,尤其是孕妇和儿童。目前流行最广泛且致死率最高的疟原虫种属是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum,Pf）。由于恶性疟原虫耐药株的不断出现,全面消除疟疾仍未实现。因此,在尝试阻断疟疾传播的同时,继续寻找新的抗疟药物及治疗方案已成为亟待解决的问题。已有研究表明高剂量维生素C通过破坏肿瘤细胞内氧化还原状态、降低ATP水平和引起细胞凋亡等机制抑制肿瘤细胞的生长。由于寄生于红细胞的疟原虫主要依赖糖酵解获取能量,该特性与肿瘤细胞相似,因此我们推测高剂量的维生素C可能也会抑制疟原虫的生长。此前涉及维生素C与抗疟疾药物联合应用治疗疟疾的实验中,维生素C的剂量均未超过180mg/kg,且在此低剂量维生素C作用下疟原虫的虫血率并未受到影响。本课题组前期研究发现对患疟鼠腹腔注射高剂量维生素C（4g/kg）对虫血率有抑制作用;维生素C的氧化形式脱氢抗坏血酸（Dehydroascorbate,DHA）可以通过红细胞表面的葡萄糖转运体（GLUTs）以及恶性疟原虫表面的己糖转运体（Hexose Transporter,PfHT）进入红细胞和虫体内,破坏红细胞和疟原虫的氧化还原平衡,引起红细胞衰亡（eryptosis）和疟原虫凋亡。基于前期研究基础,本课题拟进一步明确高剂量维生素C与抗疟药联合应用治疗疟疾的效果,特别是针对耐药性疟原虫的作用,主要进行以下两部分研究。第一部分研究我们采用了恶性疟原虫药物敏感株（Pf3D7）、耐氯喹虫株（PfDd2）和耐青蒿素虫株（Pf803）,分别用不同浓度的维生素C每日处理上述三种虫株,通过连续的虫血率计数来观察不同浓度维生素C对这三种虫株的作用。结果表明,维生素C均可在生理安全剂量内显着抑制三种虫株的生长,即高剂量维生素C对耐药性恶性疟原虫也具有杀伤作用。此外,我们将维生素C与氯喹或青蒿素联合应用,分别作用于两种耐药虫株,结果提示氯喹或青蒿素不会影响维生素C对耐药虫株的抑制作用。第二部分研究我们首先构建了伯氏疟原虫感染小鼠的患疟鼠模型,并分为对照组、单一用药组和联合用药组,分别给予不同的药物组合:维生素C、氯喹、青蒿素、维生素C+氯喹、维生素C+青蒿素,通过每天计数虫血率观察各组治疗效果的差异。结果表明联合用药对伯氏疟原虫生长的抑制均比单一用药组明显。同时检测患疟鼠的肝功能生化指标、肝脾重量、炎症因子表达、内质网应激分子表达和细胞凋亡因子的表达水平,从各方面分析不同治疗方案对疟原虫的杀伤作用及对小鼠健康状况的影响。结果表明,与单一用药组相比,联合用药可显着改善患疟鼠的肝脾功能,抑制肝脾细胞炎症反应和内质网应激,抑制肝细胞凋亡。综上所述,高剂量维生素C可以在体外有效杀灭红内期的耐氯喹和耐青蒿素恶性疟原虫,且在体外进行联合用药时仍能正常发挥抗疟作用;高剂量维生素C在体内与氯喹或青蒿素联用时比单一用药更能有效抑制伯氏疟原虫生长、改善患疟鼠的脏器损伤,且无明显副作用。我们的研究结果为后续维生素C的抗疟性研究开拓了新的发展方向,为寻找新的抗疟药和抗疟方案提供了新的思路。
徐诚[5]（2019）在《垂枝暗罗叶醇提物对伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟的疗效研究》文中认为目的:疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染性疾病之一,目前在多个国家和地区,已经陆续有传统抗疟药物敏感性降低的临床报道,鉴于此,我们有必要筛选出新的潜在抗疟药物。垂枝暗罗（Polyalthia longifolia var.pendula）作为传统热带地区植物,已有文献证实其叶片提取物具有良好的抗疟特性以及较低的毒副作用,可以作为一个很好的新型抗疟药物来源。本实验在此背景下,首先在已有模型基础上继续培育出具有高度抗性且稳定遗传特性的伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,进一步通过实验考察所配置的垂枝暗罗叶醇提物的急性毒性和药物的合理用药区间。在此基础上,分别采用不同剂量下的垂枝暗罗叶醇提物进行对伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟的疗效实验,通过实验结果验证垂枝暗罗叶醇提物的有效抗疟剂量以及在抗性鼠疟中的作用疗效。方法:1.按抗性培育递增给药原则,继续培育伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟至第53代,计算耐药鼠疟的ED50并得出抗性指数。2.垂枝暗罗叶经乙醇萃取后,按最大剂量给药法进行急性毒性试验,比较小鼠的体重、死亡情况以及各脏器病理变化,得出合理的给药浓度区间。3.根据实验前期结果和相关文献确定垂枝暗罗叶醇提物与青蒿素的标准剂量后,实验进一步选取伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟作为模型,先在给药48小时后以及每周采尾血涂片镜检一次,计算各组小鼠的疟原虫平均感染率、平均抑制率、平均转阴率以及14天治愈率,接着对小鼠的体重、肝脾系数、肝脾病理变化以及肝功能相关生化指标总胆红素（TBil）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的变化进行分析。比较不同剂量的垂枝暗罗叶醇提物与标准剂量下的青蒿素分别使用后对伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟的疗效差异。结果:1.继续培育伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型至53代,ED50为4165.31mg/kg,抗性指数为16.50,高于前期实验以及相关文献抗性指数。2.垂枝暗罗叶醇提取物最大浓度5000mg/kg灌胃给药后,组间小鼠的一般情况、死亡状况、体重、脾脏与肝脏脏器指数以及各脏器病理学观察与空白组比较均未见明显异常（P<0.05）。3.在伯氏疟原虫敏感鼠疟中,标准剂量青蒿素的14天治愈率最高,为90%。比较疟疾感染指标、脾脏系数和血清肝生化指标也与空白组无明显差异（P<0.05）。其余各剂量组的垂枝暗罗叶醇提物均低于青蒿素组,其中2倍标准剂量的垂枝暗罗叶醇提物（1600mg/kg）疗效仍高于其余低剂量组,其14天治愈率仅次于青蒿素,为50%。4.在伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟中,2倍标准剂量下的垂枝暗罗叶醇提物（1600mg/kg）的治疗效果最明显。给予2倍标准剂量垂枝暗罗叶醇提取物的抗性小鼠平均感染率为1.83±1.03%,显着低于其余给药组的小鼠（P<0.05）。观察其平均抑制率为88.13±0.75%,其抑制效果最为明显（P<0.05）,同时40%的感染小鼠出现不同程度的转阴,在给药14天后小鼠的完全治愈率为30%,此结果也高于其余各组给药小鼠包括青蒿素组。分析肝脾系数以及血清TBIL、ALT、AST均低于其余各组,接近正常值（P<0.05）。结论:1.确立了伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,其抗性指数高且培育稳定。2.垂枝暗罗叶醇提取物LD50远远大于5000mg/kg,在此用药浓度下安全且无毒性。3.两倍标准剂量的垂枝暗罗叶醇提物（1600mg/kg）在伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟中均具有明显的疗效,能不同程度杀灭伯氏疟原虫,尤其在抗性鼠疟中具有良好的抗疟药物开发前景。
梁媛[6]（2019）在《Pbk173株对青蒿素和哌喹的抗性培育及K13基因多态性研究》文中提出目的:疟疾是一种虫媒传染病,病原体是疟原虫,可经雌性按蚊叮咬传播。感染疟疾后会出现高热、大汗、神昏头痛等症状,且发作呈现周期性,反复多次发作可能会导致脾肿大或者贫血,严重影响人类健康。疟疾在全球尤其是东南亚和非洲等地流行,造成每年数亿的发病和数十万的死亡,对抗疟疾的脚步不容放松。在消除疟疾道路上的一块绊脚石是疟原虫对各类抗疟药耐药性的产生和扩散。青蒿素复方疗法是世界卫生组织推荐的一线抗疟方案,由一种青蒿素类药物如青蒿素或其衍生物双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚配伍一种半衰期较长,发挥作用较缓慢的药物如哌喹组成复方,既能提高疗效,又可以延缓耐药性的产生。青蒿素是我国医药工作者挖掘中医药宝藏的成果,青蒿素配伍哌喹制成的Artequick（ATQ）治疗疟疾是中医药防治重大疾病的成功实践。然而,近年来,东南亚部分地区陆续出现了疟原虫对青蒿素复方敏感性下降的情况,使得对青蒿素及青蒿素复方中的组分药物的抗性机制研究显得更为迫切。本课题以研究疟原虫对青蒿素产生抗性的分子机制为目的,在鼠疟模型上进行疟原虫对青蒿素和哌喹的抗性培育,观察不同药物耐药性产生的先后及抗性程度的差异;对具有一定抗性的青蒿素和哌喹抗性株进行基因测序,探索基因突变与药物耐药性的关系。方法:1.用昆明小鼠建立鼠疟模型,用药物剂量递增法对伯氏疟原虫K173株进行对青蒿素和哌喹的抗性培育,在本实验室已经进行的抗性培育20代的基础上继续培育至50代。在抗性培育过程中,每隔5代进行一次抗性指数的测定,抗性指数的测定采用Peters4天抑制实验,根据测得的抗性指数的高低和培育过程中对感染率的监控,适时调整用药剂量,但保证剂量不低于前一次抗性指数测定的代数抗性培育时所用的剂量。分析抗性培育情况。2.在抗性培育过程中,在每代抗性培育结束后,小鼠取全血,并从采集的小鼠全血中进行DNA的提取,后对疟原虫抗性株进行Kelch13（K13）片段的聚合酶链式反应（PCR）,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认后,进行基因测序。3.昆明小鼠40只,雌雄各半,适应性培养一周后随机分为四组,分别感染伯氏疟原虫K173敏感株,记为K173组;伯氏疟原虫K173对青蒿素抗性培育30代抗性株,记为A30组;伯氏疟原虫K173对青蒿素抗性培育50代抗性株,记为A50组和伯氏疟原虫K173对哌喹抗性培育50代抗性株,记为P50组,之后每天取小鼠尾血涂薄血片镜检监测感染率增长情况,当感染率达到1.5%时,摘眼球采血,收集血清用于小鼠磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）含量测定,收集血中疟原虫,提取脂质,用于测定疟原虫磷脂酰肌醇-3-磷酸PI（3）P含量,比较各组之间差异。结果:1.抗性培育进行至50代,疟原虫对青蒿素和哌喹均表现出一定抗性:疟原虫对青蒿素抗性培育从21代开始至50代,用药剂量从574.20mg/kg增加到883.96mg/kg,抗性指数从20代时的5.8增长至30代时12.37,但之后抗性指数又有下降,从40代至50代一直在5左右波动,50代时,抗性指数为4.97;疟原虫对哌喹的抗性培育用药剂量从21代时47.67mg/kg增加到50代时76.82mg/kg,抗性指数略有波动但整体呈上升趋势,50代时,达到148.82。2.对伯氏疟原虫K173敏感株及疟原虫对青蒿素和哌喹抗性株均进行K13片段的扩增和测序,测序结果与ENA中的伯氏疟原虫K173株K13片段的序列（CXJ03505.1）比对,敏感株未发现碱基变化,抗性株发现了超过30处基因突变,其中错义突变共9处,分别为 A128T、A189G、A311G、G361A、A368G、G398A、A464G、A531T 和 C1643T,对应的氨基酸变化为 Y43F、I63M、N104S、A121T、N123S、S133N、N155S、E177D 和S548L,其余为沉默突变。3.经测定,小鼠血清PI3K含量分别为:K173组为82.67±15.09 pmol/L,A30组为 84.33±19.39pmol/L,A50组为 109.27±10.13pmol/L,P50组为 99.54±10.98pmol/L。A50组小鼠PI3K含量高于K173组和A30组小鼠PI3K含量,差异有统计学意义（P<0.05）,对于疟原虫PI（3）P含量,与敏感株相比,青蒿素抗性株疟原虫PI（3）P含量有升高,而哌喹抗性株疟原虫PI（3）P含量有下降,差异无统计学意义。结论:1.在抗性培育过程中,伯氏疟原虫K173株对青蒿素的抗性增长缓慢且常有波动,对哌喹的抗性整体呈持续快速上升趋势,最终得到了对青蒿素和哌喹表现出抗性的抗性株。2.在持续的药物压力下,疟原虫的K13片段发生了多处基因突变,其中有9处错义突变。青蒿素和哌喹引起了疟原虫K13片段相同的突变。3.包含有K13片段基因突变的疟原虫青蒿素抗性株感染小鼠后宿主血清PI3K含量及疟原虫PI（3）P含量升高,可能与青蒿素的抗性机制相关。
孙红霞[7]（2017）在《暗罗素对青蒿素抗性和氯喹抗性鼠疟的抗疟活性以及与传统抗疟药配伍的可行性研究》文中进行了进一步梳理目的:1、建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,考察其抗性指数;2、在前期实验的基础上继续考察复方蒿甲醚和暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟和氯喹抗性鼠疟的疗效差异;3、探讨暗罗素抗鼠疟特点以及配伍青蒿素类抗疟药治疗鼠疟的疗效差异。方法:在前期伯氏疟原虫青蒿素抗性株培育的基础上,继续以四天抑制给药法每代逐步增加给药剂量,并通过尾静脉取血涂片镜检转阴率,测定最新得到的耐药虫株的ED50,并计算抗性指数。以伯氏疟原虫常规鼠疟为模型设置复方蒿甲醚、蒿甲醚、青蒿素、本芴醇、暗罗素五种药物的等效剂量组,分别考察复方蒿甲醚和暗罗素在1倍、1.5倍、2倍、2.5倍和3倍等效剂量下对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效差异;考察暗罗素配伍复方蒿甲醚与单独使用暗罗素及复方蒿甲醚对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效差异;考察复方蒿甲醚、蒿甲醚、本芴醇及其配伍暗罗素后对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟的疗效差异。抗疟药效实验采用四天抑制给药法,采血镜检给药后24小时原虫血症密度、转阴率及28天治愈率。结果:1、伯氏疟原虫常规株经青蒿素逐量递增给药法连续培养到第53代,其中对50代进行抗性考察,ED50为3957.632 mg/kg,抗性指数为15.68,与前期相比有所提升（第42代抗性指数为14.15）。2、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍及3倍等效剂量的复方蒿甲醚对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟均有抑制作用,但均没有达到28天100%治愈率,各组间转阴率变化比较有统计学意义。青蒿素抗性株对复方蒿甲醚有可疑耐药（原虫血症密度>0.005）。复方蒿甲醚对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟28天治愈率为100%,本芴醇与蒿甲醚对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟28天治愈率均未达到100%,各组见转阴率变化有统计学意义,氯喹抗性株对蒿甲醚与本芴醇亦产生交叉耐药。3、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍及3倍标准计量的暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性株均有抑制作用,但均没有达到28天100%治愈率,各组间转阴率变化比较有统计学意义。2倍标准计量的暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟28天治愈率最高,为30%,2.5倍和3倍标准计量的暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟28天死亡率为100%。4、暗罗素配合复方蒿甲醚与单独使用暗罗素及复方蒿甲醚治疗青蒿素抗性鼠疟后,原虫生长抑制有所提升,各组之间转阴率变化有差异（P<0.05）。5、复方蒿甲醚配合暗罗素治疗伯氏疟原虫氯喹耐药鼠疟后治愈率可达100%,本芴醇、蒿甲醚单药及其配合暗罗素治疗伯氏疟原虫氯喹耐药鼠疟后治愈率均小于100%。复方蒿甲醚配合暗罗素后疗效改善无明显差异（P>0.05）,本芴醇、蒿甲醚配合暗罗素后疗效改善有差异（P<0.05）。结论:实验结果表明,伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型确认建立,抗性指数为15.68;青蒿素抗性鼠疟对复方蒿甲醚疑似耐药,提高用药剂量后对目前培育的青蒿素抗性鼠疟治疗均不能达到100%治愈率;复方蒿甲醚对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟有较好疗效,且药后24h转阴率明显优于本芴醇及蒿甲醚;配合暗罗素后可以一定程度增加疗效;暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性株及氯喹抗性株均有直接的治疗作用,暗罗素剂量增加,杀虫效果提升,毒性亦提升。
高岩[8]（2013）在《Artequick及其组分对伯氏疟原虫K173抗性培育的初步观察》文中研究指明1研究目的抗疟药的抗药性问题是目前疟疾研究工作的重点,开展对青蒿素类药物及其复方的抗性监测及研究,对疟疾的防控具有重要意义。本研究采用鼠疟伯氏疟原虫K173株,培育青蒿素哌喹复方Artequick及其组分的抗性虫系,并比较抗性系和敏感株在感染小鼠TNF-α、IFN-γ表达及杀虫速度方面存在的差异,对青蒿素等抗疟药物的抗性研究进行初步探讨。2研究方法2.1采用大剂量复燃法分别培育伯氏疟原虫K173对Artequick及其组分的抗性系,每5代用Peters4天抑制试验检测ED90并计算抗性指数Ⅰ90,以Ⅰ90的大小来判断药物抗性水平。2.2采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组小鼠血清肿瘤坏死因子（TNF-α）和干扰素（IFN-γ）的水平,观察抗性组与敏感株组是否存在差异。2.3对培育出的具有明显抗药性的哌喹抗性系进行杀虫速度实验,并以具有重度抗性的磷酸哌喹抗性系做对照,观察原虫下降的速度,并比较抗性系与敏感株在杀虫速度上存在的差异。3结果与结论3.1抗性培育至35代,Artequick抗性系与青蒿素抗性系的抗性指数Ⅰ90分别为8.7和4.4,均属于轻度抗性；哌喹抗性系培育至25代抗性指数Ⅰ90为12.5,至第35代,其抗性指数I。。增至43.0,属于中度抗性。表明Artequick与青蒿素不易产生抗药性；哌喹比较容易产生抗药性。3.2Artequick、青蒿素、哌喹抗性系小鼠血清TNF-a含量分别为1787.5±501.6Pg/mL、1034.4±225.6pg/mL、1210.3±190.7pg/mL,敏感组小鼠血清TNF-α含量为288.3±56.2Pg/mL,该差异具有统计学意义（P<0.05）；Artequick、青蒿素、哌喹抗性系小鼠血清IFN-Y含量分别为1522.2±137.7pg/mL、911.7±52.0pg/mL.2888.0±385.1Pg/mL,敏感组为3587.3±249.0pg/mL,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.3杀虫速度实验结果显示,具有明显抗药性的哌喹、磷酸哌喹抗性系与其敏感株在杀虫速度方面存在显着差异。
黄宪希,周利民,易国辉,吴金燕,潘在用,薛伟玲,郭虹[9]（2012）在《伯氏疟原虫ANKA株抗哌喹系小鼠模型免疫学分析》文中研究说明目的观察伯氏疟原虫（Plasmodium berghei,Pb）ANKA抗哌喹（PQR）系小鼠模型的免疫学特征方法64只昆明小鼠随机分为3组,A组和C组各16只,B组32只（其中16只用于观察存活天数）。A组B组小鼠分别经腹腔感染伯氏疟原虫ANKA株哌喹敏感系（PbPQS）和抗性系（PbPQR）红内期原虫1×107个（200μl血）,C组（健康对照组）注射等量生理盐水。每组于感染后4、8、12和16d各取4只小鼠,取尾血制薄血膜镜检,计算红细胞原虫感染率（简称原虫率）。脱颈处死小鼠,无菌取脾制备脾淋巴细胞悬液,用CCK-8法测定各组小鼠脾淋巴细胞经刀豆球蛋白A（ConA）刺激后的增殖反应,用Griess法和ELISA分别测定脾淋巴细胞培养上清中N0含量和γ干扰素（IFN-γ）水平。另取10只昆明小鼠,每鼠腹腔接种PbPQR系原虫约1×107个,待原虫率上升后下降,典型的原虫转变为蓝染细胞时,腹腔感染PbPQS系原虫（1×106个）进行攻击感染,观察小鼠原虫率和小鼠存活情况。结果 A组小鼠平均存活（9.0±3.0）d,感染后6～12d原虫率均>50%,出现严重贫血。感染后16d,B组小鼠全部存活,原虫率为（26.66±2.54）%。A、B两组小鼠的脾淋巴细胞经Con A刺激后增殖显着,感染后12d,分别为0.65±0.08和0.86±0.20（P<0.01）。脾淋巴细胞培养上清中,N0含量随感染时间延长而上升,感染后12d,A、B和C组分别为（48.80+3.49）、（54.80±2.17）和（7.80±0.71）μmol/L,三者比较差异有统计学意义（P<0.01）、A组脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平随感染时间延长而上升,感染后12d达到最高,为（752.20+39.49）pg/ml,B组于感染后8d升至峰值[（855.80±33.65）pg/ml],感染后12d降至（620.20±27.11）pg/ml;感染后8d和12d,A组和B组IFN-γ水平的差异有统计学意义（P<0.01）。用PbPQS系攻击感染PbPQR系小鼠模型后10d,原虫率为（2.44±2.07）%,随之逐渐消失,感染后40d未检出虫体,无小鼠死亡。结论伯氏疟原虫ANKA株哌喹抗性系感染小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、NO水平和IFN-γ含量均显着高于PbANKA株PQS系感染小鼠,可诱导小鼠产生一定保护性免疫反应。
王红[10]（2010）在《磷酸萘酚喹抗药性机制的研究》文中进行了进一步梳理疟疾是世界上发病率和死亡率最高的虫媒传染病之一。在四种寄生于人体的疟原虫中,恶性疟原虫感染人导致的恶性疟症状最为严重,死亡率也最高。自恶性疟原虫对氯喹产生抗药性以来,疟原虫的抗药性不断蔓延,抗性程度不断增强,在某些地区甚至出现了多药抗性、交叉抗性,使疟疾防治面临严峻困难,甚至影响了新药的使用。美军从1963-1974年用12年时间从25万个化合物中筛选出26个较有希望的新化合物进入临床研究,其中只有4--喹啉甲醇类中的甲氟喹被美军作为王牌药推向市场,但甲氟喹上市仅半年在泰国就报道出现抗性。对此,国内外学者对抗疟药抗性机制展开了大量研究。但目前唯一能确定抗性机制的仅有抗叶酸药,认为恶性疟原虫二氢叶酸还原酶（Dihyrofolateredctase, DHFR）基因的突变导致了这类药物抗性的产生,而其他常用抗疟药如氯喹等喹啉类抗疟药的抗性机制目前仍未明确。磷酸萘酚喹是我所研制的I类抗疟新药,与氯喹同属4-氨基喹啉类抗疟药。动物实验显示,磷酸萘酚喹具有很高的抗疟活性。临床实验显示磷酸萘酚喹消除半衰期长达255h以上。长半衰期药物的优点是临床用药疗程短、依从性好,缺点是由于血液中较长时间存在低浓度药物,故与短半衰期药物相比容易产生抗性。因此,为保护新药,更合理地使用新药,延长新药的使用寿命,有必要对我国研制的抗疟新药磷酸萘酚喹抗性产生的情况及其抗性机制进行了解和研究。目前国内外均未见有关磷酸萘酚喹抗性机制的报道,但对氯喹的抗性机制已有大量的研究报道。研究普遍认为恶性疟原虫多药抗性基因1（Plasmodium falciparum multidrug resistance gene1, pfmdr1）、cg2和恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白（Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter, pfcrt）基因与氯喹抗性有关,其中研究的热点是crt基因,认为crt突变是氯喹抗性产生的关键。因此,本实验从crt基因入手,利用基因打靶技术展开磷酸萘酚喹抗性机制的研究。对基因功能研究最直接有效的办法就是进行等位基因替换,目前在疟原虫体内进行的等位基因替换实验大多是通过基因转染技术完成的。pPyrFlu是伯氏疟原虫转染的有效介质,将质粒载体与crt基因构建得到CRT targeting重组质粒,通过基因转染技术,利用质粒可进行的单交换机制,将敏感株和抗性株的crt等位基因进行替换来研究crt基因与磷酸萘酚喹抗性的关系。方法：（1）首先建立磷酸萘酚喹抗性株模型。在鼠疟动物模型上采用小剂量递增（ST）法培育磷酸萘酚喹抗性株,经4日抑制实验法测定ED50、ED90和抗性指数I50、I90；停药体内血传10代及冷冻保存12个月检测该抗性株抗性是否稳定；测定交叉抗性,评价该抗性株对青蒿素、氯喹、本芴醇和乙胺嘧啶等的药物敏感性；（2）参考伯氏疟原虫ANKA株的crt基因设计反转录及PCR引物,获得K173株、NQR株、CQR株的crt基因,分析所得目的基因与其它疟原虫crt基因和蛋白的同源性并比较磷酸萘酚喹抗性株crt基因与K173株、CQR株crt基因之间的差别；（3）构建CRT突变重组株并对其抗性表型进行鉴定。首先是crt Targetting质粒的构建,将K173株或抗性株的crt基因片段克隆到伯氏疟原虫转染质粒pPyrFlu中,获得以单交换机制整合的重组质粒PyrFlu/Pbcrt,经双酶切及PCR鉴定；其次是转染条件的优化,通过重组质粒线性化,伯氏疟原虫体外培养和设定不同的电转体系选择最优的转染条件；再次是乙胺嘧啶药物筛选及荧光显微镜下观察获得阳性转化子并做PCR鉴定；最后,测定重组K173-NQR/CQR株、NQR-K173株和CQR-K173株对磷酸萘酚喹、氯喹的敏感性分析重组株抗性表型的变化。结果：（1）在磷酸萘酚喹的持续压力下血传100代,历时23个月培育得到了伯氏疟原虫磷酸萘酚喹高度抗性株NQR,经测定EDs0、ED90分别为41.25mg/kg和152.23mg/kg,抗性指数I50和I90分别为105.8和200.3,均达到高度抗性；经停药血传10代和冷冻保存12个月测定,其抗性指数仍然保持200以上,未发生明显变化,说明其抗性程度比较稳定；交叉抗性实验中发现该抗性株对青蒿素、本芴醇和乙胺嘧啶具有中度交叉抗性,而与氯喹具有高度交叉抗性（I90=14.5）；（2）经RT-PCR首次扩增得到了伯氏疟原虫K173株的crt基因编码序列,经序列测定目的基因长1278bp,编码426个氨基酸,具有10个跨膜结构的膜转运蛋白；经比对该序列与其它疟原虫的crt基因和蛋白具有很高的同源性；序列比对发现NQR株目的基因全长1275bp,编码425个氨基酸,与K173株相比,NQR株crt基因存在41个碱基突变及3个碱基缺失,其中有意义的氨基酸突变有11个；NQR株、CQR株的crt基因序列相同；（3）得到以单交换机制获得整合的重组质粒PyrFlu/Pbcrt,经双酶切及PCR鉴定,证明目的基因crt已整合到载体中；体外培养伯氏疟原虫同步化于成熟裂殖体期的优化条件为20%胎牛血清的1640培养基,细胞压积比1%,在37℃蜡烛缸中培养18-22h；分别采用梯度密度离心法和磁珠分选法富集成熟裂殖体,比较富集得到的裂殖体比例及裂殖体活性,发现两种方法所获裂殖体质量均较好,无较大差别,只是操作时间上存在差别,梯度密度离心法富集裂殖体需要30min而磁珠分选法需要2h以上；选择100-400ul不同的电转体系,1.1kv,25uF,电阻无穷大的条件下进行电转化,只在300ul电转体系中获得了阳性转化子；经2轮乙胺嘧啶筛选后的阳性转化子在荧光显微镜下发出绿色荧光,经PCR鉴定也扩增得到了2kb的预期片段,说明重组质粒已正确地整合在伯氏疟原虫基因组中并进行了表达；（4）经测定,重组K173-NQR/CQR株的药物敏感性显着下降,对磷酸萘酚喹、氯喹的ED90分别为36.06±2.79mg/kg和93.70±8.83mg/kg,抗性表型I90分别为60.1和44.2;而重组NQR-K173株对磷酸萘酚喹、氯喹的敏感性则显着提高,ED90分别为2.76±0.79mg/kg和6.92±1.07mg/kg,I90分别为4.6和11.5；重组CQR-K173株对磷酸萘酚喹、氯喹的敏感性也显着提高,ED90分别为4.66±1.32mg/kg和19.08±3.39mg/kg,I90分别为2.2和9.0。结论：（1）通过ST法培育得到稳定的磷酸萘酚喹抗性株,实验显示磷酸萘酚喹在鼠疟模型上很容易产生抗性,且抗性程度高而强。因此,对其抗性机制的研究很有必要。研究证实,该抗性株对氯喹具有高度交叉抗性,提示我们在氯喹抗性区使用磷酸萘酚喹时要提高警惕,避免抗性程度的交叉累积。本研究提示,磷酸萘酚喹的抗性机制与氯喹有相同之处但不完全相同；（2）首次获得伯氏疟原虫K173株的crt基因；分析结果说明该基因突变很有可能与NQR抗性产生有关,且该基因与磷酸萘酚喹抗性产生的关系与氯喹抗性产生类似；（3）建立了伯氏疟原虫基因打靶技术,并运用此技术获得了表达NQR株crt基因、CQR株crt基因的重组伯氏疟原虫K173株和表达K173株crt基因的重组伯氏疟原虫NQR株、CQR株；（4）通过测定重组株的抗性表型,重组伯氏疟原虫K173对药物敏感性显着降低及重组伯氏疟原虫抗性株对药物敏感性显着增高充分说明crt基因在磷酸萘酚喹抗性产生过程中的关键作用；（5）除crt基因,可能还有其它因素共同决定了磷酸萘酚喹抗性的产生。有关磷酸萘酚喹的抗性机制还有待进一步深入研究。
二、伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株红内期虫体超微结构的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株红内期虫体超微结构的比较（论文提纲范文）
（1）从脾脏控制疟疾感染的角度初步探索青蒿素“耐药”的涵义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 一、疟疾概述 |
| 1 疟疾的流行现状 |
| 2 疟疾的临床症状 |
| 3 疟疾的治疗 |
| 二、青蒿素“耐药”研究进展 |
| 1 抗疟药的应用历史及现状 |
| 2 ACT疗法的应用 |
| 3 青蒿素“耐药”的定义 |
| 4 青蒿素“耐药”的分子机制研究进展 |
| 三、脾脏清除疟原虫机制研究进展 |
| 1 脾脏结构与功能 |
| 1.1 红髓的2条血液循环通路 |
| 1.2 白髓的免疫功能 |
| 1.3 边缘区的免疫功能 |
| 2 脾脏清除疟原虫的机制 |
| 2.1 免疫清除 |
| 2.2 孔蚀清除 |
| 3 影响孔蚀的因素 |
| 3.1 疟原虫生长周期 |
| 3.2 青蒿素类药物 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 不同品系小鼠的脾脏在控制疟疾感染中的差异研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验耗材及器械 |
| 1.6 配制甘油磷酸冻存液 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 复苏PbK173虫株 |
| 2.2 小鼠尾静脉采血涂片计算染虫率 |
| 2.3 实验动物分组 |
| 2.4 建立感染PbK173的四种不同品系实验小鼠模型 |
| 2.5 冻存PbK173虫株 |
| 2.6 染虫鼠虫率及生存期分析 |
| 2.7 取样及实验样本分析 |
| 2.8 数据处理与统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 四种品系染虫鼠的感染率及生存期 |
| 3.2 四种品系染虫鼠的血液学参数分析 |
| 3.3 四种品系染虫鼠的脏器系数分析 |
| 3.4 四种品系染虫鼠脾脏的病理切片观察 |
| 3.5 四种品系染虫鼠的脾细胞分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 C57BL/6小鼠的脾脏在控制伯氏疟原虫K173青蒿素敏感株与抗性株感染中的差异研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验耗材及器械 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 复苏PbK173青蒿素敏感株与抗性株 |
| 2.2 小鼠尾静脉采血涂片计算染虫率 |
| 2.3 实验动物分组 |
| 2.4 建立感染PbK173青蒿素敏感株/抗性株实验小鼠模型 |
| 2.5 冻存PbK173虫株 |
| 2.6 染虫鼠虫率及生存期分析 |
| 2.7 取样及实验样本分析 |
| 2.8 数据处理与统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 感染不同虫株染虫鼠的感染率及生存期 |
| 3.2 感染不同虫株染虫鼠的血液学参数分析 |
| 3.3 感染不同虫株染虫鼠的脏器系数分析 |
| 3.4 感染不同虫株染虫鼠脾脏的病理切片观察 |
| 3.5 感染不同虫株染虫鼠的脾细胞分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 PbK173青蒿素敏感株/抗性株对药物敏感性及染虫小鼠治疗期与恢复期的脾脏功能差异研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物 |
| 1.5 实验试剂 |
| 1.6 实验耗材及器械 |
| 1.7 配制溶剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 复苏PbK173青蒿素敏感株/抗性株 |
| 2.2 小鼠尾静脉采血涂片计算染虫率 |
| 2.3 实验动物分组 |
| 2.4 建立感染PbK173青蒿素敏感株/抗性株实验小鼠模型 |
| 2.5 冻存PbK173虫株 |
| 2.6 给药、染虫鼠虫率及生存期分析 |
| 2.7 取材及实验样本分析 |
| 2.8 数据处理与统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 染虫鼠经治疗后的感染率及生存期 |
| 3.2 停药第一天及停药第五天外周红细胞参数分析 |
| 3.3 停药第一天及停药第五天血液涂片分析 |
| 3.4 停药第一天及停药第五天脾脏系数分析 |
| 3.5 停药第一天及停药第五天脾脏的病理切片观察 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件 |
（2）老药二次研发策略在抗疟疾和抗罕见病结膜黑色素瘤新药研发中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 老药新用与老药二次研发简介 |
| 第一部分 基于Quisinostat的新型抗疟疾衍生物设计合成与活性研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 疟疾及其危害 |
| 1.2 疟原虫及其生命周期 |
| 1.2.1 疟原虫在人体内的发育阶段 |
| 1.2.2 疟原虫在按蚊体内的发育阶段 |
| 1.3 疟疾防治药物的历史与现状 |
| 1.4 耐药疟疾的威胁 |
| 1.5 抗疟疾临床候选新药研究概况 |
| 1.6 抗疟疾新药开发面临的问题与对策 |
| 1.7 本团队拟解决的主要问题及研究思路 |
| 第2章 HDAC抑制剂在抗疟疾研究中的应用 |
| 2.1 疟原虫HDAC表观遗传学研究的重要性 |
| 2.2 恶性疟原虫HDAC的分类及生理功能 |
| 2.3 抗疟疾HDAC抑制剂研究进展 |
| 2.3.1 异羟肟酸类HDAC抑制剂 |
| 2.3.2 其它种类HDAC抑制剂 |
| 2.4 抗疟疾HDAC抑制剂的优势与不足 |
| 2.5 新型抗疟疾HDAC抑制剂Quisinostat的发现 |
| 2.6 本论文的研究目标与思路 |
| 第3章 衍生物的设计与合成 |
| 3.1 前期研究进展 |
| 3.2 衍生物设计思路 |
| 3.3 衍生物的合成 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 衍生物的体内外生物活性研究 |
| 4.1 Linker衍生物A1～A6的红内期体外抗疟疾活性与细胞毒性 |
| 4.2 衍生物B1～B39的红内期体外抗疟疾活性与细胞毒性 |
| 4.3 衍生物C1～C30的红内期体外抗疟疾活性与细胞毒性 |
| 4.4 衍生物的构效关系总结 |
| 4.4.1 衍生物构效关系总论 |
| 4.4.2 Linker衍生物A1～A6的构效关系 |
| 4.4.3 CAP衍生物B1～B39与C1～C30的构效关系 |
| 4.5 衍生物体外代谢稳定性评价 |
| 4.6 衍生物B35和B39的小鼠急性毒性评估 |
| 4.7 衍生物红内期体内抗疟疾药效评价 |
| 4.7.1 B35与B39红内期体内抗疟疾药效评价 |
| 4.7.2 A2、C9与C14～C17红内期体内抗疟疾药效评价 |
| 4.7.3 红内期体内药效实验小结 |
| 4.8 衍生物肝期体内抗疟疾药效评价 |
| 4.8.1 B35与B39的肝期体内抗疟疾药效评价 |
| 4.8.2 C9的肝期体内抗疟疾药效评价 |
| 4.9 衍生物小鼠体内药代性质评价 |
| 4.10 衍生物抑制多重抗性疟疾临床虫株活性评价 |
| 4.11 衍生物红内期时期特异性抗疟疾性质评价 |
| 4.12 本章小结 |
| 第5章 衍生物抑制恶性疟原虫与人源HDAC活性研究 |
| 5.1 衍生物抑制PfHDAC活性研究 |
| 5.2 PfHDAC1/2基因条件性敲减虫株的构建 |
| 5.3 衍生物抑制PfHDAC1活性研究 |
| 5.4 衍生物对人源HDAC的抑制作用 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 实验部分 |
| 6.1 化合物的合成与表征 |
| 6.2 疟原虫相关药效与机制测试 |
| 6.2.1 恶性疟原虫的培养 |
| 6.2.2 化合物红内期体外杀虫活性测试 |
| 6.2.3 化合物细胞毒性测试 |
| 6.2.4 化合物肝微粒体代谢测试 |
| 6.2.5 体内药效实验中化合物溶液的配置 |
| 6.2.6 化合物红内期体内杀虫活性测试 |
| 6.2.7 化合物肝期体内杀虫活性测试 |
| 6.2.8 化合物红内期时期特异性抗疟疾药效实验 |
| 6.2.9 RSA测试 |
| 6.2.10 流式细胞计数 |
| 6.2.11 Western Blot实验 |
| 6.2.12 PfHDAC1/2敲减虫株的构建及化合物抑制活性测试 |
| 6.2.13 化合物体外抑制重组人源HDAC活性测试 |
| 6.2.14 化合物体外抑制重组PfHDAC1活性测试 |
| 6.2.15 化合物药代动力学性质测试 |
| 6.2.16 统计分析 |
| 第二部分 普罗帕酮抗罕见病结膜黑色素瘤新用途衍生物的设计合成与活性研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 罕见病CM及其临床预后情况 |
| 1.2 CM的分子生物学研究进展 |
| 1.3 CM临床治疗研究进展 |
| 1.3.1 CM传统治疗方法 |
| 1.3.2 CM的潜在疗法 |
| 1.4 CM治疗药物(孤儿药)研发的困境 |
| 1.5 本团队拟解决的主要问题及研究思路 |
| 第2章 普罗帕酮抗结膜黑色素瘤新用途的发现 |
| 2.1 新型抗CM化合物普罗帕酮的发现 |
| 2.2 普罗帕酮的临床用途、老药二次研发现状及其抗CM研究潜力 |
| 2.3 本论文的研究目标与思路 |
| 第3章 衍生物的设计、合成与体外活性研究 |
| 3.1 衍生物的设计 |
| 3.2 衍生物的合成 |
| 3.3 衍生物的体外抑制CM细胞增殖活性与细胞毒性研究 |
| 3.4 衍生物构效关系小结 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 实验部分 |
| 4.1 化合物的合成与表征 |
| 4.2 化合物体外抑制细胞增殖活性测试 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词中英对照表 |
| 博士就读期间发表文章 |
| 博士就读期间申请专利 |
| 致谢 |
（3）抗疟纳米材料的筛选及金属纳米粒子Fe2+PP抗疟原虫活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第1章 恶性疟原虫红内期体外连续培养及表型分析 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 虫株 |
| 1.2 红细胞 |
| 1.3 实验仪器及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 恶性疟原虫的体外连续培养 |
| 2.2 恶性疟原虫表型分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 红内期恶性疟原虫五种虫株生命周期存在差异 |
| 3.2 恶性疟原虫五种虫株外观形态不同 |
| 3.3 恶性疟原虫3D7株不同期态体内DNA含量不同 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第2章 抗疟纳米材料的筛选及金属纳米粒子Fe~(2+)PP的体内、外抗疟作用研究 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 虫株 |
| 1.2 实验纳米材料 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验仪器及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 抗疟纳米材料的筛选 |
| 2.2 金属纳米粒子Fe~(2+)PP的体内、体外抗疟作用研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 选取金属纳米粒子Fe~(2+)PP进行后续研究 |
| 3.2 金属纳米粒子Fe~(2+)PP在体外对恶性疟原虫不同株具有抑制作用 |
| 3.3 金属纳米粒子Fe~(2+)PP在体内对伯氏疟原虫具有抑制作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第3章 金属纳米粒子Fe~(2+)PP抗疟机制研究 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 虫株及细胞株 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 流式细胞术检测Fe~(2+)PP与IRBC结合情况 |
| 2.2 细胞毒性测定 |
| 2.3 溶血实验 |
| 2.4 丙二醛(MDA)含量测定 |
| 2.5 GSH/GSSG比值测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 金属纳米粒子Fe~(2+)PP发挥抗疟作用时可能未进入IRBC内 |
| 3.2 金属纳米粒子Fe~(2+)PP对人肝癌细胞HepG2的细胞毒性实验 |
| 3.3 金属纳米粒子Fe~(2+)PP未造成红细胞膜破裂,疟原虫的死亡并非继发于溶血 |
| 3.4 金属纳米粒子Fe~(2+)PP引起细胞内MDA含量增加 |
| 3.5 金属纳米粒子Fe~(2+)PP引起细胞内GSH/GSSG 比值降低 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）高剂量维生素C与氯喹或青蒿素联用对疟原虫的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、高剂量维生素C对耐药性恶性疟原虫的作用 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 主要相关仪器 |
| 1.1.3 主要相关试剂 |
| 1.1.4 恶性疟原虫的复苏、培养及冻存 |
| 1.1.5 高剂量维生素C对耐药性恶性疟原虫的作用 |
| 1.1.6 疟原虫虫血率的检测 |
| 1.1.7 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 抗氯喹、青蒿素恶性疟原虫的耐药性验证 |
| 1.2.2 高剂量维生素C对耐药性恶性疟原虫的作用 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、高剂量维生素C与氯喹或青蒿素联用对伯氏疟原虫的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要相关仪器 |
| 2.1.3 主要相关试剂 |
| 2.1.4 伯氏疟原虫的感染及冻存 |
| 2.1.5 维生素C与氯喹或青蒿素联合应用对伯氏疟原虫的作用 |
| 2.1.6 小鼠肝脾总RNA的提取及RT-PCR的过程 |
| 2.1.7 小鼠肝脏组织蛋白质的提取 |
| 2.1.8 蛋白质免疫印迹实验(western blot) |
| 2.1.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用降低伯氏疟虫血率 |
| 2.2.2 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用改善小鼠的肝脾功能 |
| 2.2.3 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用可降低患疟鼠肝脾细胞炎症因子的表达 |
| 2.2.4 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用可缓解患疟鼠肝脾内质网应激 |
| 2.2.5 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用抑制患疟鼠肝脏细胞凋亡 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 维生素C在疾病预防和治疗中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）垂枝暗罗叶醇提物对伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟的疗效研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 伯氏疟原虫 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验药物 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型培育研究 |
| 2.1.1 实验药物的配制 |
| 2.1.1.1 青蒿素抗性鼠疟培育中青蒿素的配制 |
| 2.1.1.2 抗性指数考察中青蒿素的配制 |
| 2.1.1.3 液氮冻存液的配制 |
| 2.1.2 原虫虫株的保存与培养方法 |
| 2.1.2.1 伯氏疟原虫敏感虫株的培养与保存 |
| 2.1.2.2 伯氏疟原虫青蒿素抗性虫株的培养与保存 |
| 2.1.3 53代青蒿素抗性鼠疟模型的建立 |
| 2.1.4 实验动物分组及给药 |
| 2.1.5 检测方法 |
| 2.1.6 检测指标 |
| 2.1.6.1 疟原虫感染评价指标 |
| 2.1.6.2 抗性指数 |
| 2.1.7 数据分析 |
| 2.2 垂枝暗罗叶醇提取物昆明小鼠口服给药急性毒理试验 |
| 2.2.1 实验药物的配制 |
| 2.2.1.1 垂枝暗罗叶醇提物的配制 |
| 2.2.1.2 给药剂量设定依据 |
| 2.2.2 实验动物分组及给药 |
| 2.2.3 检测方法 |
| 2.2.4 检测指标 |
| 2.2.4.1 一般行为和死亡状况 |
| 2.2.4.2 体重测定 |
| 2.2.4.3 肝、脾器官系数 |
| 2.2.4.4 组织病理学检查 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 不同剂量的垂枝暗罗叶醇提物对伯氏疟原虫敏感鼠疟及青蒿素抗性鼠疟的治疗研究 |
| 2.3.1 实验药物的配制 |
| 2.3.1.1 青蒿素的配制 |
| 2.3.1.2 垂枝暗罗提取物的配制 |
| 2.3.1.3 吉姆萨染色液的配制 |
| 2.3.2 模型的构建 |
| 2.3.3 实验分组及给药 |
| 2.3.4 检测方法 |
| 2.3.4.1 血膜涂片检测法 |
| 2.3.4.2 肝脾组织吉姆萨染色 |
| 2.3.5 检测指标 |
| 2.3.5.1 疟原虫感染评价指标 |
| 2.3.5.2 体重及肝脾系数 |
| 2.3.5.3 肝脾组织病理变化 |
| 2.3.5.4 血清生化指标 |
| 2.3.6 数据分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 53代伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型的考察结果 |
| 3.1.1 疟原虫感染评价指标数据比较 |
| 3.1.2 抗性指数 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 垂枝暗罗叶醇提物口服给药急性毒理试验结果 |
| 3.2.1 一般情况及死亡观察结果 |
| 3.2.2 小鼠体重变化 |
| 3.2.3 小鼠肝脾系数分析 |
| 3.2.4 组织病理学观察结果 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 不同剂量的垂枝暗罗叶醇提物对伯氏疟原虫敏感鼠疟与青蒿素抗性鼠疟的疗效差异结果 |
| 3.3.1 疟原虫感染评价指标结果比较 |
| 3.3.2 体重结果及肝脾器官系数分析 |
| 3.3.3 肝脾组织病理分析 |
| 3.3.4 血清生化指标结果分析 |
| 3.3.5 小结 |
| 4.讨论 |
| 4.1 疟原虫感染宿体中病理变化的讨论 |
| 4.1.1 疟原虫生活史 |
| 4.1.2 疟原虫的感染过程 |
| 4.1.3 疟原虫感染的病理表现 |
| 4.2 青蒿素类药物作用机制及耐药性机制的研究情况 |
| 4.2.1 抗疟作用机制 |
| 4.2.2 耐药性机制 |
| 4.3 本实验耐药模型建立的意义 |
| 4.4 垂枝暗罗抗疟作用研究进展 |
| 4.5 垂枝暗罗毒理试验结果讨论 |
| 4.6 梯度剂量下垂枝暗罗叶醇提物治疗伯氏疟原虫敏感鼠疟与青蒿素抗性鼠疟的实验结果讨论 |
| 结论 |
| 问题和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 实验附图 |
| 附件1:文献综述 |
| 参考文献 |
| 附件2:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（6）Pbk173株对青蒿素和哌喹的抗性培育及K13基因多态性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 第一章 疟疾的流行及抗疟药的使用 |
| 1 概述 |
| 2 疟疾流行现状 |
| 3 抗疟药的使用 |
| 第二章 抗药性的出现和疟原虫的抗性培育 |
| 1 概述 |
| 2 疟原虫抗性的出现 |
| 3 疟原虫的抗性培育 |
| 第三章 抗性相关基因研究 |
| 1 概述 |
| 2 青蒿素抗性相关基因的研究 |
| 第四章 抗性相关机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 青蒿素结合位点的探索 |
| 3 青蒿素的作用方式 |
| 4 PI3K和PI(3)P与青蒿素抗性的关系 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 伯氏疟原虫K173株对青蒿素和哌喹的抗性培育 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 伯氏疟原虫K173对青蒿素和哌喹抗性株的K13片段基因多态性研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 小鼠PI3K及疟原虫PI(3)P水平研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）暗罗素对青蒿素抗性和氯喹抗性鼠疟的抗疟活性以及与传统抗疟药配伍的可行性研究（论文提纲范文）
| 课题基金来源 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1.引言 |
| 2.实验研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 伯氏疟原虫株来源 |
| 2.1.2 实验动物来源 |
| 2.1.3 主要器材、试剂与仪器 |
| 2.1.4 实验药物 |
| 2.2 方法及技术路线 |
| 2.2.1 伯氏疟原虫株的保存 |
| 2.2.1.1 液氮冻存保存溶液配制 |
| 2.2.1.2 伯氏疟原虫常规株的复苏、传代及保存 |
| 2.2.1.3 伯氏疟原虫氯喹抗性株的复苏、保存、抗性维持及抗性检测 |
| 2.2.1.4 伯氏疟原虫青蒿素抗性株培育及保存： |
| 2.2.2 实验药物的配制 |
| 2.2.2.1 磷酸氯喹的配制 |
| 2.2.2.2 青蒿素的配制 |
| 2.2.2.3 复方蒿甲醚的配制 |
| 2.2.2.4 蒿甲醚的配制 |
| 2.2.2.5 本芴醇的配制 |
| 2.2.2.6 暗罗素的配置 |
| 2.2.3 观察指标及检测方法 |
| 2.2.4 伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型抗性研究 |
| 2.2.4.1 伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型的建立及评定标准 |
| 2.2.4.2 分组及给药 |
| 2.2.4.3 伯氏疟原虫青蒿素抗性株抗性测定方法 |
| 2.2.4.4 检测方法与检测指标 |
| 2.2.5 不同梯度剂量复方蒿甲醚和暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟疗效对比实验研究 |
| 2.2.5.1 实验对象 |
| 2.2.5.2 实验设计依据 |
| 2.2.5.3 实验药物剂量设置 |
| 2.2.5.4 伯氏疟原虫鼠疟模型的建立 |
| 2.2.5.5 实验药物配制 |
| 2.2.5.6 抗疟疗效评价标准 |
| 2.2.5.7 分组及给药 |
| 2.2.5.8 检测方法及检测指标 |
| 2.2.5.9 统计学分析 |
| 2.2.6 暗罗素配合其它青蒿素类抗疟药对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟的疗效实验 |
| 2.2.6.1 实验对象 |
| 2.2.6.2 实验依据 |
| 2.2.6.3 实验药物剂量设置 |
| 2.2.6.4 伯氏疟原虫鼠疟模型建立 |
| 2.2.6.5 实验药物配制 |
| 2.2.6.6 抗疟疗效评价标准 |
| 2.2.6.7 分组及给药 |
| 2.2.6.8 检测方法及检测指标 |
| 2.2.6.9 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 伯氏疟原虫青蒿素抗性株第50代虫株抗性系数考察 |
| 3.2 不同梯度剂量复方蒿甲醚和暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟疗效实验结果 |
| 3.3 复方蒿甲醚、蒿甲醚、本芴醇及其配合暗罗素对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟的疗效实验结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 对伯氏疟原虫青蒿素抗性株第50代抗性系数及抗性强度探讨 |
| 4.2 暗罗素临床应用的研究现状 |
| 4.2.1 中医对陵水暗罗的认识与利用 |
| 4.2.2 陵水暗罗抗疟有效成分研究 |
| 4.2.3 暗罗素的提取以及人工合成方法讨论 |
| 4.3 梯度剂量复方蒿甲醚及其配合暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟治疗的研究.. |
| 4.3.1 复方蒿甲醚、蒿甲醚、本芴醇及青蒿素抗疟药物的特点及应用现状 |
| 4.3.2 复方蒿甲醚对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟疗效比较的讨论 |
| 4.3.3 暗罗素单用及其配合复方蒿甲醚对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟疗效比较的讨论 |
| 4.4 青蒿素类抗疟药单用及其配合暗罗素对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟药效研究 |
| 4.4.1 疟原虫氯喹作用机制与耐药机制的研究 |
| 4.4.2 复方蒿甲醚、蒿甲醚、本芴醇对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟疗效比较研究 |
| 4.4.3 复方蒿甲醚、蒿甲醚、本芴醇配合暗罗素与其单用对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟疗效比较研究 |
| 5.结论 |
| 6.问题与展望 |
| 参考文献 |
| 实验附图 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
（8）Artequick及其组分对伯氏疟原虫K173抗性培育的初步观察（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 疟疾概述 |
| 1.1.1 疟疾的历史 |
| 1.1.2 疟疾的分类及疟原虫生活史 |
| 1.1.3 疟疾的发病机制 |
| 1.1.4 疟疾的临床症状 |
| 1.1.5 常用抗疟药及其分类 |
| 1.1.6 疟疾的蚊媒控制 |
| 1.1.7 疟疾的监测 |
| 1.1.8 疟疾疫苗 |
| 1.2 抗药性问题 |
| 1.2.1 世界及我国抗药性情况 |
| 1.2.2 抗药性机制研究 |
| 1.3 青蒿素及其衍生物研究 |
| 1.4 细胞因子与疟疾 |
| 1.4.1 细胞因子的分类及作用 |
| 1.4.2 细胞因子在原虫感染中的作用 |
| 1.5 鼠疟模型及伯氏疟原虫相关研究 |
| 第二章 实验研究与结果分析 |
| 2.1 Artequick及其组分对伯氏疟原虫K173的抗性培育 |
| 2.1.1 目的 |
| 2.1.2 材料 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.1.4 结果 |
| 2.1.5 讨论 |
| 2.2 抗性系小鼠血清TNF-α、IFN-γ检测 |
| 2.2.1 目的 |
| 2.2.2 材料 |
| 2.2.3 方法 |
| 2.2.4 结果 |
| 2.2.5 讨论 |
| 2.3 杀虫速度实验 |
| 2.3.1 目的 |
| 2.3.2 材料 |
| 2.3.3 方法 |
| 2.3.4 结果 |
| 2.3.5 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（10）磷酸萘酚喹抗药性机制的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 伯氏疟原虫K173株磷酸萘酚喹抗性系的培育 |
| 一. 材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1 Plasmodium berghei Keyberg 173 strain的复苏、传代 |
| 2 药物的配制 |
| 3 磷酸萘酚喹抗性系的培育 |
| 二. 实验结果 |
| 三. 结果讨论 |
| 第二部分 CRT全长cDNA的克隆、鉴定及分析 |
| 一. 材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1 CRT全长cDNA的克隆 |
| 2 CRT序列分析 |
| 二. 实验结果 |
| 三. 结果讨论 |
| 第三部分 CRT突变重组株的构建及抗性表型的鉴定 |
| 一. 材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1 CRT Targeting质粒的构建 |
| 2 转染条件的优化 |
| 3 重组克隆的筛选及鉴定 |
| 4 伯氏疟原虫的保种和接种 |
| 5 PCR检验伯氏疟原虫转化子 |
| 6 有限稀释法克隆伯氏疟原虫转化子 |
| 7 RT-PCR鉴定插入片段 |
| 8 重组株抗性表型的鉴定 |
| 二. 实验结果 |
| 三. 结果讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 论文 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、伯氏疟原虫氯喹敏感株和抗性株红内期虫体超微结构的比较（论文参考文献）
- [1]从脾脏控制疟疾感染的角度初步探索青蒿素“耐药”的涵义[D]. 王华晶. 中国中医科学院, 2021
- [2]老药二次研发策略在抗疟疾和抗罕见病结膜黑色素瘤新药研发中的应用[D]. 李若曦. 华东理工大学, 2021(08)
- [3]抗疟纳米材料的筛选及金属纳米粒子Fe2+PP抗疟原虫活性研究[D]. 李爽. 扬州大学, 2020(04)
- [4]高剂量维生素C与氯喹或青蒿素联用对疟原虫的作用研究[D]. 刘影. 天津医科大学, 2019(02)
- [5]垂枝暗罗叶醇提物对伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟的疗效研究[D]. 徐诚. 成都中医药大学, 2019(04)
- [6]Pbk173株对青蒿素和哌喹的抗性培育及K13基因多态性研究[D]. 梁媛. 广州中医药大学, 2019(04)
- [7]暗罗素对青蒿素抗性和氯喹抗性鼠疟的抗疟活性以及与传统抗疟药配伍的可行性研究[D]. 孙红霞. 成都中医药大学, 2017(12)
- [8]Artequick及其组分对伯氏疟原虫K173抗性培育的初步观察[D]. 高岩. 广州中医药大学, 2013(S1)
- [9]伯氏疟原虫ANKA株抗哌喹系小鼠模型免疫学分析[J]. 黄宪希,周利民,易国辉,吴金燕,潘在用,薛伟玲,郭虹. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2012(01)
- [10]磷酸萘酚喹抗药性机制的研究[D]. 王红. 中国人民解放军军事医学科学院, 2010(02)