一、里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表达载体的构建（论文文献综述）
刘琴[1]（2021）在《β-甘露聚糖酶在里氏木霉中的高效表达》文中研究指明甘露聚糖是植物细胞壁的主要成分之一,广泛存在于多种植物组织中。β-甘露聚糖酶是主要的甘露聚糖降解酶,已经在动物饲料、食品、生物精炼、纺织、洗涤以及造纸等多种行业得到了应用。因此,提高β-甘露聚糖酶产量,降低β-甘露聚糖酶生产成本具有重大应用价值和现实意义。里氏木霉等丝状真菌具有高效合成分泌纤维素酶和半纤维素酶的能力,在β-甘露聚糖酶的生产中具有较好的应用前景。高效启动子是异源蛋白表达的关键元件。筛选、改造高效启动子是实现目标蛋白高效表达的重要策略。在本论文中,我们选择来源于草酸青霉的β-甘露聚糖酶Man5A,对其在里氏木霉中的高效表达策略进行了研究:（1）使用组成型启动子Pcdna1实现了 Man5A在葡萄糖培养基中的表达。构建了Pcdna1启动的man5A表达盒,随机插入到里氏木霉菌株QP4基因组中,获得的Qman菌株可产生纯度较高的Man5A。对所得到的Man5A的性质进行了初步研究,发现其在pH2.5-5.5的范围内均能保持较高的活性。Man5A最适反应温度在80℃,差示扫描量热法测得的熔解温度为80℃。对影响Pcdna1启动效率的关键序列进行了鉴定,在Pcdna1序列由原本的1159 bp缩短至831bp时,启动效率降为原来的81%,缩短至505 bp时启动效率明显降低,仅为原来的10%。此外,探究了含有Man5A的里氏木霉纤维素酶粗酶液与草酸青霉生产的富含α-半乳糖苷酶的纤维素酶粗酶液复配时在豆粕降解中的应用效果,发现当两者比例相当时,豆粕降解产生的还原糖水平最高。（2）使用诱导型启动子Pcbh1实现了 Man5A在纤维素培养基中的高效表达,并通过启动子序列改造和转录激活因子改造进一步提高了其表达水平。通过序列截短以及替换、删除Pcbh1序列中转录因子结合位点,构建了 3种不同的Pcbh1突变体。通过测定Man5A的表达水平,发现对Pcbh1中转录因子XYR1结合位点进行替换得到的突变体Pcbh1-IR的启动效率提高至原来的2.5倍。在获得了 β-甘露聚糖酶多拷贝表达菌株的基础上,通过过表达XYR1A824V持续激活突变体基因,获得了在葡萄糖培养条件和纤维素诱导条件下β-甘露聚糖酶均能够高表达的菌株。
刘杜娟[2]（2020）在《低纤维素酶背景里氏木霉表达宿主菌的构建》文中研究指明丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）是重要的纤维素酶工业生产菌株。由于它卓越的产酶性能,近年来越来越多的研究将其作为异源基因的表达宿主。里氏木霉产生的内源纤维素酶数量较多,它们主要包括纤维二糖水解酶（外切葡聚糖酶）和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。本实验应用CRISPR/Cas9技术并结合RNAi干扰技术,敲除和干扰里氏木霉中的主要的纤维素酶基因,构建里氏木霉低纤维素酶表达菌株。实验还发现,以低纤维素酶背景菌株作为表达宿主,可以明显提高部分异源基因的表达水平。本研究进行了如下工作:1.应用CRISPR/Cas9技术敲除里氏木霉中主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术沉默内切葡聚糖酶eg2基因在里氏木霉中的表达应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。使用这种方法获得了一株纤维素酶表达显着下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的转录水平较出发菌株SUS5降低了98%。2.在SUS6菌株中表达外源基因NfBgl3A以SUS6为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的beta-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U/mL,远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达beta-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U/mL）。然而,表达黑曲霉来源的甘露聚糖酶时酶活并没有明显的提高。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可选择性的显着提高某些异源基因的表达水平。3.在SUS6菌株的基础上应用CRISPR/Cas9技术敲除主要分泌蛋白木糖苷酶xyl3A和纤维素酶cbh2、eg1基因本实验在SUS6菌株的基础上,首先通过5-FOA反向选择,将木霉菌种的pyr4筛选标记去除,而后通过胞内表达Cas9核酸酶并结合gRNA的表达,敲除xyl3A基因,在48个转化子中筛选到一株xyl3A基因被敲除的菌株SUS7。再以SUS7菌株作为宿主菌,敲除pyr4筛选标记,后应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并结合同源重组臂,共同转化里氏木霉以分别定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh2基因以及内切葡聚糖酶eg1基因,进一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达体系。4.里氏木霉中基于CRISPR/Cas9的新型编辑方法的探索CRISPR/Cas9系统作为第三代基因组编辑技术,具有高效的基因编辑能力,但是当我们在里氏木霉中应用时,发现其效率仍然很低。针对这一问题,我们对CRISPR/Cas9系统从各个角度尝试进行改进,如对驱动gRNA的启动子的改造、对Cas9蛋白进行突变、加入非同源DNA、加入小分子物质、使用热胁迫条件等,以期提高CRISPR/Cas9系统在里氏木霉中的基因编辑效率。综上所述,本研究综合应用各种方法,构建了里氏木霉低纤维素酶背景的表达菌株;以构建过程中的菌株作为表达宿主,能明显提高某些异源基因的表达水平。此外我们还对一些新型的编辑方法进行了有益的探索。
易拾[3]（2019）在《木质纤维素酶的生产优化、定向进化和生物乙醇应用研究》文中研究表明本研究以农业废弃物着手,本着变废为宝和保护环境的宗旨,优化木质纤维素酶的固态共发酵工艺,改造木质纤维素酶的最适温度,志在解决二代生物乙醇的生产瓶颈。本研究为木质纤维素酶的高水平表达和二代生物乙醇高水平生产提供技术支撑,为木质纤维素酶最适温度的分子改造提供科学依据。具体研究内容和结果如下:1)以农业废弃物稻草和麸皮为原料,基于草酸青霉16（Po16）和里氏木霉Rut-C30的各自产酶优势,首次利用它们固态共发酵体系生产木质纤维素酶,采用单因素和响应曲面法优化生产工艺,使滤纸酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶（BGL）分别达到38.0IU/gds、352.9IU/gds、713.2IU/gds、15.7IU/gds、188.6IU/gds,与优化前相比,分别提高了4.2倍、2.9倍、2.03倍、1.08倍和1.96倍。2)利用上述1)获得的木质纤维素酶水解未处理麸皮（WB）、预处理稻草（pre-RS）,以及未处理麸皮和预处理稻草的混合物（WB+pre-RS）,利用不等温半同步糖化发酵方法生产二代生物乙醇。具体为,以20IU/gds（FPase/克干物质）和10%固体载物量的投放量于pH5、45℃和150rpm条件下进行48h糖化,WB的糖化效率达到94.26%,pre-RS达到42.04%,WB+pre-RS达到93.23%;糖化后加入酿酒酵母UV-20于35℃静置发酵48h,WB的乙醇转化效率高达98.41%,pre-RS达到67%,WB+pre-RS达到90.8%,WB乙醇转化效率明显高于pre-RS转化效率。3)BGL是木质纤维素水解的关键限速酶。Po16BGL能耐受任何浓度的木质素衍生物和呋喃衍生物,对乙醇、无机盐和有机酸盐也具有较好的耐受性,这表明它在生物乙醇生产中具有潜在的应用价值。抑制剂对Po16BGL的抑制程度为:水杨苷-有机酸>有机酸>水杨苷-有机酸钠盐>有机酸钠盐>水杨苷>水杨苷-KCl>水杨苷-NaCl>水杨苷-乙醇=乙醇。4)为缩短BGL最适温度与酿酒酵母最适发酵温度的差距,以Po16BGL为研究对象,采用易错PCR方法,构建pGAPZαA-bgl载体并整合到毕赤酵母GS115,根据96孔板的高通量筛选方法,以便获得最适温度降低且活性高的突变酶。与初始酶相比较,Y-1-B1突变酶的比活提高至1.8倍,最适温度从70℃降低为50℃,Kcat/Km达76.521 mL/mg.min,催化效率是初始酶的1.53倍。
罗长财[4]（2018）在《一种耐高温β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中高效表达及其耐高温机理分析》文中指出β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）能通过催化β-1,4-甘露糖苷键,将甘露聚糖水解为甘露糖和甘露低聚糖。作为一种重要的工业用酶制剂,β-甘露聚糖酶被广泛应用于动物饲料、食品加工、生物漂白、纺织、可再生能源等领域。由于一些应用领域在加工过程中需要进行高温处理,如饲料制粒、可再生能源生产等,这就要求所开发的β-甘露聚糖酶具有良好的耐高温性能。目前,市面上存在的β-甘露聚糖酶在耐高温性能方面往往达不到要求,因此,开发一种具有优良耐高温能力的β-甘露聚糖酶就显得非常迫切,具有良好的应用前景。在本研究中,我们从热泉中（水温高于68℃）分离、筛选出一株产β-甘露聚糖酶的嗜热枯草芽孢杆菌（TBS2）。以TBS2为出发菌株,经过基因克隆,在毕赤酵母X33中进行表达,获得了一种重组耐高温β-甘露聚糖酶（ReTMan26）。采用纯化后的ReTMan26,完成了该酶的相关酶学性质检测并对其耐高温机理进行了相应分析。在此基础上,通过密码子优化,大幅提高了ReTMan26在毕赤酵母中的表达水平。此外,还确定了来源于生物柴油生产过程中产生的副产物粗甘油可以作为一种廉价碳源,用于毕赤酵母进行ReTMan26的发酵生产。主要研究结果如下:（1）从热泉中分离、筛选出一株产β-甘露聚糖酶的细菌,通过形态观察、生理生化培养特征、16S rDNA序列比对及构建系统发育树,鉴定出该细菌为一种嗜热枯草芽孢杆菌（TBS2）。该菌可在pH 4.0-9.0、35-80℃条件下生长,最适生长pH为6.0-7.0、最适生长温度为50℃。TBS2所产的β-甘露聚糖酶（BS-Man）的最适反应pH为6.0,最适反应温度为55℃,在90℃、水溶液状态下处理10 min,剩余酶活达到63.6%。（2）通过从NCBI中查找出其它来源于枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶保守序列,设计引物,成功克隆出来源于嗜热枯草芽孢杆菌TBS2中的耐高温β-甘露聚糖酶基因TBS2-Man。TBS2-Man基因序列长957 bp,编码318个氨基酸。通过蛋白结构及基因序列分析,该β-甘露聚糖酶属于第26糖苷水解酶家族,含有3个潜在的N-糖基化位点（N8、N26与N255）及2个半胱氨酸位点（C48、C68）。在此基础上,采用克隆出的基因TBS2-Man,构建并筛选出了一株产重组耐高温β-甘露聚糖酶（ReTMan26）的毕赤酵母工程菌Orig-pPICZαA-X33,该菌株在摇瓶中的发酵水平为312 U×mL-1,在50 L罐中通过高密度液体发酵的表达水平为5435 U×m L-1。（3）对重组毕赤酵母Orig-pPICZαA-X33表达的ReTMan26纯化后进行酶学性质检测,结果表明:该酶的最适pH为6.0,在pH 2.0-8.0范围内稳定;最适反应温度为60℃,有效作用温度范围为20-100℃,且在100℃、水溶液条件下处理10 min后,剩余酶活仍然可以达到58.6%;10 mmol×L-1的Mg2+、Mn2+对ReTMan26活性具有促进作用,而Ag+、Hg2+及SDS对ReTMan26具有较强的抑制作用;ReTMan26的Vmax为1612 U×mg-1蛋白,Km值为4.35 mg×mL-1。此外,ReTMan26表现出较强的抗蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）的消化能力。以上酶学性质表明,除其它潜在工业应用外,ReTMan26适宜作为一种饲料酶进行应用。（4）为探究ReTMan26的耐高温机理,对该酶进行了氨基酸序列比对及蛋白质三维结构分析。结果表明:更短的氨基酸序列、部分氨基酸位点不同、二硫键及N-糖基化可能是造成ReTMan26具有优良耐高温性能的根本原因。为进一步确定N-糖基化及二硫键对ReTMan26的稳定性,尤其是耐高温性能的影响,分别采用天然蛋白去糖基化试剂盒及定点突变的方法,去除了ReTMan26中的N-多糖链及2个半胱氨酸位点（C48、C68）。研究发现,N-糖基化可提高ReTMan26的最适反应温度、耐热性能分别为5℃和7℃。此外,N-糖基化还可提高ReTMan26抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化性能分别为23.7%及25.6%。二硫键对ReTMan26的最适反应温度及提高抗消化酶性能没有影响,但可提高耐热性能约3℃。（5）为进一步提高ReTMan26在毕赤酵母X33中的表达水平,对来自于TBS2中的原始ReTMan26编码基因TBS2-Man（Orig）进行了密码子优化,并构建出了一株含优化基因（CoOp）的新重组毕赤酵母CoOp-p PICZαA-X33生产菌株。该菌株在高密度液体发酵中,ReTMan26的表达水平为10750 U×m L-1,在相同条件下,其生产性能比原重组毕赤酵母Orig-pPICZαA-X33(5412 U×mL-1)提高了98.6%。另外,在经过密码子优化的基因（CoOp）基础上,继续对该基因上游的信号肽（α-factor）进行了Kozak序列（GCCACCATG）改造,实验结果表明,该方法对提高ReTMan26在毕赤酵母中的表达水平没有效果,但这对今后构建毕赤酵母重组工程菌表达系统,具有一定的参考作用。（6）为降低ReTMan26的生产成本,充分利用废弃资源,采用来源于生物柴油生产的副产物粗甘油作为毕赤酵母快速生长期间的唯一碳源,结果表明:粗甘油中的皂类物质在添加浓度低于0.3%（相对于发酵培养基的质量体积比）时,不会抑制高密度液体发酵时的毕赤酵母菌体生长及ReTMan26生产。在此基础上,不经任何前处理的粗甘油,可替代纯甘油用于ReTMan26的发酵生产。通过采用粗甘油替代纯甘油,ReTMan26的全部发酵生产成本可降低约4.2%。
宋妍[5]（2018）在《产气肠杆菌B19 β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究》文中研究表明β-甘露聚糖酶（beta-mannanase）是一种水解类酶,能够随机切割线性甘露聚糖,半乳甘露聚糖,葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等主链的β-1,4-D-甘露糖甘键。由于β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖的价值和需求,来源于微生物的β-甘露聚糖酶的化学特性和结构性质,以及在各种应用被广泛而深入的研究。β-甘露聚糖酶可以应用在纸浆漂白、降低咖啡粘度、洗涤剂配方和食品和动物饲料等领域中。因此,对β-甘露聚糖酶进行异源表达,分离纯化以及酶学性质探究具有重要的研究意义。根据本实验室筛选产气肠杆菌B19菌株的16S rDNA,利用NCBI数据库中的BLAST功能在线比对16S rDNA,得到同源性较高的Enterobacter cloacae P101中的β-甘露聚糖酶基因序列,故以该菌株的β-甘露聚糖酶基因全长序列为模板,通过构建克隆载体,扩增并获得β-甘露聚糖酶的基因序列,将验证正确的β-甘露聚糖酶基因构建到pET28a（+）表达载体上,以大肠杆菌BL21（DE3）作为β-甘露聚糖酶异源表达的宿主菌,成功表达出β-甘露聚糖酶。通过Ni柱亲和层析法分离纯化得到纯度较高的β-甘露聚糖酶,该酶蛋白的分子大小约为82.5 kDa。通过重组表达菌株BL21（DE3）-pET28a（+）-ManE异源表达进行β-甘露聚糖酶发酵条件优化。最佳的培养条件为:在重组表达菌株OD600约为0.6时加入0.6 mmol/L诱导剂IPTG,诱导温度为20℃,160 rpm诱导表达12-16 h。重组β-甘露聚糖酶的酶学性质研究结果显示:最适反应温度和最适pH分别为55℃和6.5,重组β-甘露聚糖酶在5055℃温度范围内热稳定性较好,1 h后残余酶活仍可保持在85%以上;重组β-甘露聚糖酶在pH 4.07.0区间内该重组酶的稳定较好,保温1h后测定的残余酶活保持80%以上。低浓度Co2+、Mn2+、Zn2+、Ba2+和Ca2+对重组β-甘露聚糖酶的酶活有不同程度的激活作用。而K+、Mg2+和Cu2+对该重组酶有不同程度的阻碍作用,其中Cu2+对该重组酶催化活性的抑制作用最强,酶活降低到最大酶活力的65.3%,说明Cu2+是该酶的活性抑制剂。
李程程[6]（2018）在《里氏木霉高产纤维素酶的机理研究和应用》文中研究表明里氏木霉（Trichodermareesei）因其蛋白分泌量大（100g/L）、遗传性状稳定、生长繁殖迅速、培养条件简单和生物安全性等特点,已被广泛用于工业生产及各种异源蛋白的表达载体。并且,该菌在特定条件下可以产生大量的具有抗癌、抗病毒、抗菌特性的次级代谢产物黄色色素类物质,具有广泛的商业价值,次级代谢产物黄色色素的产生对纤维素酶的产生有一定的影响,二者受到相关调节因子的调控。同时,里氏木霉多个菌株的全基因组测序已经完成,这为研究里氏木霉纤维素酶、色素类物质的高产机制以及二者之间的相关性奠定了基础,也为基因改造获得具有优良特性的高产菌株提供了辅助手段。本论文主要以里氏木霉RUT-C30为出发菌株通过基因工程改造获得了在纤维素诱导条件下高产纤维素酶的基因工程菌TRB1、在纤维素和乳糖诱导下都能高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌SEU-7以及高产色素的基因工程菌ZC121121,并针对以上构建的基因工程菌研究了纤维素酶的高产机制、里氏木霉纤维素酶和色素产生之间的相互转化机制。之后,我们采用荧光标记的办法对里氏木霉三种主要的纤维素酶进行标记以研究纤维素酶的真实分布情况以及分泌机制。最后采用转录组测序及基因干扰等手段对纤维素酶的产生及其和色素产生的转化关系进行了深入研究。具体说来主要包含以下内容:1.构建了高产pNPGase/BGL（β-葡萄糖苷酶）的基因工程菌TRB1,并揭示了基因cel3d在纤维素酶高产中的作用及机理以里氏木霉RUT-C30为出发菌株,采用农杆菌介导的方法构建了高产β-葡萄糖苷酶的基因工程菌TRB1。qRT-PCR以及基因克隆实验显示TRB1中cel3d基因受到了干扰,是纤维素酶增加的原因之一。2.构建了乳糖诱导下高产纤维素酶的基因工程菌SEU-7并研究其高产机制首次构建了一株可以在乳糖诱导下高产纤维素酶的基因工程菌SEU-7。与出发菌株RUT-C30相比,SEU-7的纤维素酶和半纤维素酶活性无论在纤维素还是在乳糖诱导条件下都大幅度提高。以乳糖作为诱导物,在分批培养条件下,FPase（滤纸酶活）活性可以达到13IU/mL;分批补料培养时,活性提高至47IU/mL,此外,在分批培养过程中,SEU-7在纤维素和乳糖诱导条件下均表现出了极高的pNPGase活性,分别为81和144IU/mL,是目前已知菌株中最高的。之后采用qRT-PCR、qPCR以及基因组重测序分析研究了其在不同碳源下的高产机理。3.敲除基因121121过程中引起的并行突变在里氏木霉纤维素酶和黄色色素产生中的开关作用通过构建基因121121干扰的基因工程菌及过表达121121的菌株,揭示了基因121121以及干扰该基因带来的并行突变在纤维素酶产生和黄色色素类物质sorbicillin分泌过程的开关作用,即,干扰121121以及带来的并行突变会降低纤维素酶产量但极大程度增加黄色色素sorbicillin的产量,并对该基因工程菌进行了 RNA-seq分析。同时采用液质联用（HPLC-MS）的方法检测了敲除菌株ZC121121和过表达菌株OE121121的代谢产物。4.里氏木霉纤维素酶的产生、分布以及分泌机制研究采用红色荧光蛋白对三种主要的纤维素酶BGL、CMC/CMCase（内切葡聚糖酶）和CBH/pNPCase（外切葡聚糖酶）进行了标记,研究了三种纤维素酶产生的先后顺序、在细胞内的分布情况以及分泌情况,结果发现BGL在菌丝体内表达量最多,而后是CMC和CBH,然而,BGL的分泌却晚于CMC和CBH。共聚焦观察结果表明BGL和CBH是定位到细胞膜上的,而CMC没有定位到膜上,GC-Cholesterol-PEG-FITC共染、原生质体制备以及超高分辨结果更进一步的证明了 BGL定位到了细胞膜上。通过进一步的内质网共染实验证明了三种主要的纤维素酶都会被输送到内质网进行加工修饰,并且三种酶都存在于囊泡中,高尔基体共染实验证明BGL和CMC都要经过高尔基体分泌到胞外,而CBH则可能不通过或少量通过高尔基体分泌。
张国秀[7]（2017）在《里氏木霉纤维素酶高产菌株遗传改造及新型糖苷水解酶的挖掘》文中研究表明里氏木霉是生物质降解酶的重要生产者之一,其生产的酶被广泛应用于工业生产。一些里氏木霉高产突变菌株已经通过传统诱变方法获得。然而,生物质降解酶生产的高成本仍然是其商业化应用的巨大挑战。此外,这些突变菌株相应表型下的遗传机制仅仅被部分地理解。全面地理解遗传改变对纤维素酶生产的影响有利于开发更高效的纤维素酶生产菌株。在里氏木霉中,pH也是影响纤维素酶生产的重要因素。质膜H+-ATP酶在调节胞内pH稳态和营养摄取等生理过程中发挥着关键作用。然而,里氏木霉的质膜H+-ATP酶的功能到目前为止仍然没有被研究。多种糖苷水解酶的组合使用已经广泛应用于工业生产。为了满足糖苷水解酶在工业生产中的需求,工业上迫切需要具有高表现力的糖苷水解酶来降低生产成本。宏基因组学已经成为一种强有力的方法直接研究微生物群落的多样性和挖掘新型生物催化剂。为了开发更高效的酶制剂生产菌株和挖掘新的糖苷水解酶,本文从以下三个方面展开了研究。1)一株里氏木霉突变菌株SS-Ⅱ通过多次的NTG诱变在菌株NG14的基础上分离获得。与菌株RUT-C30相比,拥有完整Cre1蛋白的SS-Ⅱ在微晶纤维素或乳糖培养下展现出更快的生长和约1.5倍高的羧甲基纤维素酶活性。通过SS-Ⅱ和RUT-C30的转录组数据的对比分析,我们发现有1764个基因在微晶纤维素、葡萄糖、乳糖和小麦秸秆下差异化表达。在此基础上,65个纤维素降解相关的酶、41个转录因子和152个转运蛋白的转录数据被进一步分析。为了鉴定在SS-Ⅱ中发生的遗传突变,我们对其基因组进行了测序。在SS-Ⅱ中,总共有184个单核苷酸位点突变和40个小的插入/缺失被鉴定。此外,157个受突变影响的基因被鉴定。在这些基因中,大多数涉及运输、分泌、蛋白质代谢和转录。9个在SS-Ⅱ中受突变影响的基因被进一步分析。微晶纤维素培养下,在RUT-C30中敲除其中的3个基因会明显影响纤维素酶的生产。菌株SS-Ⅱ和RUT-C30的转录组比较分析有助于理解代谢转变在纤维素酶生产中的影响。基因组重测序揭露了一些可能影响纤维素酶生产的新的位点和其他一些被忽视的领域。我们的研究为鉴定更多的涉及纤维素酶生产的基因提供了资源,这为构建更高效的生产菌株提供了坚实的理论基础。此外,我们也构建了里氏木霉光控表达系统用于异源蛋白表达。2)里氏木霉的两个质膜H+-ATP酶通过基因敲除策略被首次鉴定和功能化表征。通过分析我们发现基因tre76238作为质膜H+-ATP酶在里氏木霉中发挥主要功能,而基因tre78757发挥次要功能。基因tre78757的敲除并不影响菌株表型,而基因tre76238的敲除则会损害菌株将质子从胞内泵出到胞外的能力,pH稳态的失调导致菌株在葡萄糖培养下能够持续的累积纤维素酶。转录水平分析显示在敲除菌株De1238中纤维素酶合成相关的基因的转录水平大幅度提升。尽管xyr1的转录水平并没有提升,但是EMSA分析显示在菌株De1238中的确有其他的蛋白与cbh1启动子发生了结合。通过pull-down技术以及质谱分析,三个可能涉及纤维素酶基因调控的锌指蛋白被鉴定。这些发现为里氏木霉纤维素酶的表达调控提供了新的见解,同时也为通过调节胞内pH稳态来改善丝状真菌纤维素酶的生产提供了新的策略。3)为了挖掘新的糖苷水解酶,我们利用棉花生物质作为碳源对土壤样品微生物进行了富集培养。为了理解棉花生物质的降解过程,我们对微生物群落分泌的糖苷水解酶谱进行表征,结果显示在这个微生物群落中细胞和纤维素底物之间的物理接触是纤维素高效降解所必需的。通过16SrRNA分析,具有代表性的微生物群落结构被鉴定,噬纤维细菌很可能在这个群落中对棉花生物质降解起重要作用。通过对宏基因组序列的分析,32个主要的糖苷水解酶家族被鉴定,总共含有2058个候选的基因。16个糖苷水解酶编码基因被克隆并在大肠杆菌中成功表达,这些蛋白分别对4-硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷、4-硝基苯基-β-D-木糖苷、昆布多糖、4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、4-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸、羧甲基纤维素和4-硝基苯基-β-D-甘露糖苷具有水解活性。此外,3个蛋白与最近似的同源物的一致性低于60%。土壤微生物基因组分析为挖掘新型生物质降解酶提供了良好的策略。克隆的十几个糖苷水解酶在生物质转化和产品生产中也具有潜在的应用价值。我们的研究为理解植物生物质降解的途径以及酶的组成和相互作用提供了一定的见解。
马清,蔡瑞,姜风超,马立娟,杜丽平,肖冬光[8]（2017）在《N-糖基化对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中异源表达的影响》文中进行了进一步梳理为研究N-糖基化对里氏木霉β-甘露聚糖酶（β-mannanase,Man1）在毕赤酵母GS115中异源表达的影响,采用定点突变的方法,将Man1上3个N-糖基化修饰位点（N131、N158和N329）上的天冬酰胺用中性谷氨酰胺取代。结果发现,N-糖基化位点的突变对Man1的转录水平无明显影响,突变后获得的Man1表观分子质量有轻微下降,与Man1相比,3个突变体N131、N158和N329的甘露聚糖酶活力分别降低了85.43%和79.48%和16.3%;而热稳定性分别提高了7.87%、13.5%和15.37%。由此可见,N-糖基化修饰对于β-甘露聚糖酶的高效表达是必需的,其中N131和N158糖基化位点尤为重要,但是会稍微降低β-甘露聚糖酶的热稳定性。
张飞[9]（2017）在《利用人工锌指蛋白技术提高里氏木霉Rut-C30纤维素酶产量》文中提出石油资源储量不断减少,而且石油基燃料和化学品大量使用产生的环境污染及气候变化等问题日益突出,严重影响经济和社会的可持续发展。木质纤维素类生物质资源丰富且可再生,特别是各类农林废弃物,其主要成分半纤维素和纤维素可以水解为糖,进而通过微生物发酵生产生物燃料和生物基化学品。这一生物炼制技术路线,可望替代石油依赖型经济,已经得到国内外的广泛关注。半纤维素易于水解,但纤维素作为植物细胞壁的主要成分提供保护作用,自然进化使其对水解有强抗性,特别是对酶的作用。因此,高效低成本纤维素酶成为建立基于纤维素水解的糖平台,乃至生物炼制的瓶颈之一。纤维素酶是复合酶系,主要由纤维二糖水解酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶等组成,高效降解木质纤维素类生物质需要多种酶组分的协同作用。来自丝状真菌里氏木霉的Trichoderma reesei Rut-C30是纤维素酶高产菌株之一,已广泛应用于工业生产,但纤维素酶发酵过程酶产量低导致成本高的问题特别突出,无法用于木质纤维素类生物质资源的生物炼制。T.reeseI纤维素酶合成调控机制研究表明,纤维素酶的生物合成主要由Xyr1、Crel等内源转录调控因子调控,但其他影响因素还有待进一步阐明。锌指蛋白具有锌指结构,是多种生命体系中普遍存在的转录因子,利用人工设计的锌指蛋白文库进行改造并选育突变体,调控基因转录,已广泛应用于大肠杆菌和酵母等微生物,并成功获得了耐温性等表型或外源蛋白过量表达的突变体,但是目前为止还未见其应用在丝状真菌中的报道。本研究工作首次探讨了人工锌指蛋白（Artificial Zinc Finger Protein,AZFP）对里氏木霉纤维素酶生产的影响,利用AZFP文库转化T.reesei Rut-C30,筛选高产纤维素酶的丝状真菌突变体,并与对照菌株比较,研究突变体纤维素酶组分和蛋白分泌情况。本文主要内容如下:构建了适用于丝状真菌的表达载体,比较了原生质体转化和根癌农杆菌介导转化方法,并对根癌农杆菌介导转化方法进行了条件优化,确定最佳转化条件为:根癌农杆菌AGL-1生长OD660值达到0.8时,在βH5.3、24℃及乙酰丁香酮浓度200 μM条件下进行转化共培养,转化效率可达到200个转化子/106孢子。进而,构建丝状真菌人工锌指蛋白表达载体文库并转化T.reesei Rut-C30,获得了近600个转化子,通过纤维素平板培养和摇瓶液体发酵筛选,获得了高产纤维素酶的T.reeseiRut-C30转化子（U3）。对U3进行性能验证,发现其纤维素酶活性比出发菌株提高了 55%,通过RNA定量分析和纤维素酶组分酶学性质测定,确定U3菌株的β葡萄糖苷酶活性比出发菌株提高了 8倍,同时内切葡聚糖酶活性提高了 28%。利用粗酶液对碱预处理玉米秸秆进行水解,其葡萄糖收率比出发菌株T.reesei Rut-C30粗酶液水解过程提高了 115%。这些结果表明:U3菌株纤维素酶酶系的组成在其人工锌指蛋白AZFP-U3的作用下发生了显着变化,从而提高了纤维素组分的酶解效率。对AZFP-U3潜在的靶点基因进行分析,结合实时定量PCR的验证结果,进一步选择并对四个可能的靶基因进行功能验证,分别编码两个功能未知假定的转录因子（TrireC30125610和TrireC307183）、线粒体内膜转运蛋白（TrireC30<sub>46633）和糖苷水解酶（TrireC3088814）基因。构建表达载体,将上述基因在T.reesei Rut-C30中过量表达,检测其对纤维素酶生产的影响,发现转录因子125610的过表达使Rut-C30胞外纤维素酶酶活提高了 200%,同时转化子T125610胞外蛋白分泌能力提高了 219%。通过人工锌指蛋白文库筛选得到的另外一个转化子U5比U3具有更强的纤维素降解能力,其胞外分泌的纤维素酶活性比出发菌株提高了 112%,同时检测到其胞外蛋白分泌量提高了大约86%。比较U5和出发菌株发酵获得的粗酶液对碱预处理后的玉米秸秆进行酶解效果,发现其葡萄糖收率提高了 33.9%。主要纤维素酶基因转录分析和各组分酶活测定都表明U5纤维素酶各组分酶活发生显着变化,对U5和出发菌株进行比较转录组学分析,进一步揭示人工锌指蛋白提高纤维素酶合成的分子机理。转录组学分析结果表明:培养24 h时,U5突变株糖苷水解酶、转运蛋白、转录因子及蛋白酶体,参与mRNA监测途径、内质网蛋白加工途径的基因,转录水平比出发菌株有显着提高,而且过氧化物酶体、CoA合成途径、N-糖苷合成途径、氨酰-tRNA合成途径、烟酰胺代谢途径、脂肪酸代谢途径相关基因转录水平也有上调,为纤维素酶转录和蛋白修饰加工过程中提供氨基酸前体、辅酶和能量。此外,U5中丝状真菌蛋白分泌压力响机制（RESS）受到激活,在48 h时尤为明显,RESS的激活可使过多的mRNA迅速降解,尽管RESS与纤维素酶合成的关系还有待深入研究,此时突变体U5中主要糖苷水解酶和内质网蛋白加工相关蛋白基因转录量与出发菌株相比仍然显着上调,表明AZFP-U5对糖苷水解酶转录和翻译后修饰具有促进作用。AZFP-U5潜在的靶点基因转录分析也发现变化,这些基因包括负责蛋白翻译后修饰、信号传递、氨基酸代谢的基因。比较转录组学数据分析结果,为进一步探讨人工锌指转录因子在T.reesei中的作用机制,并寻找关键调控基因进行进一步代谢工程改造奠定了基础。本研究工作利用人工锌指蛋白技术对T.reesei Rut-C30进行了代谢工程改造,证明人工转录因子可以有效用于提高其纤维素酶活性和蛋白分泌能力,为进一步选育高产纤维素酶T.reesei菌株奠定了基础,也为改造其他丝状真菌,提高蛋白表达和分泌能力提供了借鉴。
蔡瑞[10]（2016）在《里氏木霉β-甘露聚糖酶的克隆表达及结构域的研究》文中认为木质纤维素生物质是一种丰富的可再生资源,然而由于半纤维素与木质素将纤维素紧紧的包裹在里面,这种结构导致生物质很难被有效利用。目前被广泛接受的技术路线就是酶解法,因此本论文针对一种具有应用潜力的半纤维素酶β-甘露聚糖酶,对其结构功能及协同纤维素酶的水解能力进行探讨研究。里氏木霉β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）由糖苷水解酶GH5家族的催化结构域、Linker区域和真菌型碳水结合模块（CBM）三部分组成。通过RT-PCR方法得到β-甘露聚糖酶全长和两个截短酶（命名为manl、man1△C1M和man1△LCBM）三种基因片段。Man1和Man1△CBM均能在Pichia pastoris GS115中高效表达,酶活分别达到34.5 IU/mL和42.9 IU/mL,而Man1 △LCBM酶活却因Linker和CBM模块的缺失导致蛋白结构发生变化,酶活仅仅为0.36 IU/mL。重组Man1和Man1 △CBM具有相似的酶学性质,但在温度稳定性上表现出明显的差异,当在60 ℃下处理120 h后Man1能够维持72.7%的酶活力,Man1 △CBM则仅能维持47.9%的酶活力。但当70 ℃下处理60 min后,截短酶却比全长提高了 13.3%。与重组Man1 △CBM相比,Man1对可溶性底物刺槐豆胶和半乳甘露聚糖均表现出相对低的特异性;而当协助纤维素酶水解纤维素和碱处理的甘蔗渣时,Man1的添加则体现出明显的优势,尤其在纤维素酶ECⅡ基础上添加甘露聚糖酶,使还原糖产量分别提高28.54%和20.31%。利用定点突变用中性谷氨酰胺G1n取代β-甘露聚糖酶N-糖基化修饰位点上的天冬酰胺Asn。结果发现突变后甘露聚糖酶酶活均有所下降,因此N-糖基化修饰对于β-甘露聚糖酶的高效表达是必需的,其中N131和N158糖基化位点尤为重要,突变后分别使甘露聚糖酶酶活降低了 85.43%和79.48%。N329突变体酶活降低幅度较小,仅仅为16.3%,而稳定性却有所提高,与原重组甘露聚糖酶Man1相比提高15.37%。
二、里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）β-甘露聚糖酶在里氏木霉中的高效表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略词说明 |
| 第一章 研究背景与立题依据 |
| 1.1 丝状真菌蛋白表达系统 |
| 1.1.1 启动子的选择与改造 |
| 1.1.2 转录因子改造在蛋白表达中的应用 |
| 1.2 CRISPR/Cas9系统在真菌基因编辑中的应用 |
| 1.3 β-甘露聚糖酶的研究进展 |
| 1.3.1 β-甘露聚糖 |
| 1.3.2 β-甘露聚糖酶的分类 |
| 1.3.3 β-甘露聚糖酶的酶学性质 |
| 1.3.4 β-甘露聚糖酶的应用 |
| 1.4 本论文的立题依据及研究内容 |
| 第二章 草酸青霉甘露聚糖酶Man5A在里氏木霉中的组成型表达及性质研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 里氏木霉中man5A组成型表达盒的构建 |
| 2.1.3 常用培养基和储备液 |
| 2.1.4 大肠杆菌转化 |
| 2.1.5 大肠杆菌质粒提取 |
| 2.1.6 里氏木霉原生质体的制备及转化 |
| 2.1.7 转化子的分离纯化 |
| 2.1.8 里氏木霉基因组DNA提取方法 |
| 2.1.9 酶活力的测定 |
| 2.1.10 胞外蛋白浓度的测定 |
| 2.1.11 总还原糖量测定 |
| 2.1.12 荧光定量PCR |
| 2.1.13 豆粕的酶解处理 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 man5A在里氏木霉基因组中的随机插入表达 |
| 2.2.2 man5A在里氏木霉基因组中的定点插入表达 |
| 2.2.3 不同长度组成型表达启动子Pcdna1启动效率评价 |
| 2.2.4 Man5A酶学性质的初步研究 |
| 2.2.5 β-甘露聚糖酶在豆粕处理中的应用 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 草酸青霉甘露聚糖酶Man5A在里氏木霉中的诱导型表达研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 表达盒的构建 |
| 3.1.3 常用培养基和储备液 |
| 3.1.4 大肠杆菌转化 |
| 3.1.5 大肠杆菌质粒提取 |
| 3.1.6 里氏木霉原生质体的制备及转化 |
| 3.1.7 转化子的分离纯化 |
| 3.1.8 里氏木霉基因组DNA提取方法 |
| 3.1.9 酶活力的测定 |
| 3.1.10 胞外蛋白浓度测定 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 基于CRISPR/Cas9基因编辑定点插入Pcbh1(mutants)-man5A |
| 3.2.2 基于经典同源重组方法定点插入Pcbh1(mutants)-man5A |
| 3.2.3 过表达XYR1~(A824V)实现man5A的高效表达 |
| 3.3 本章小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间参与发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 学位论文评闻及答辩情况表~~ |
（2）低纤维素酶背景里氏木霉表达宿主菌的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 里氏木霉表达系统 |
| 1.1.1 里氏木霉简介 |
| 1.1.2 里氏木霉分泌的内源酶 |
| 1.1.2.1 纤维素酶与半纤维素酶 |
| 1.1.2.2 里氏木霉产纤维素酶优势 |
| 1.1.2.3 纤维素酶的应用 |
| 1.1.3 里氏木霉异源蛋白表达策略 |
| 1.1.3.1 构建纤维素酶缺失菌株 |
| 1.1.3.2 启动子改造 |
| 1.1.3.3 密码子优化 |
| 1.1.3.3 异源蛋白融合表达 |
| 1.2 里氏木霉转化体系 |
| 1.2.1 优良的宿主菌 |
| 1.2.2 里氏木霉的转化 |
| 1.2.2.1 电穿孔转化法 |
| 1.2.2.2 T-DNA介导的根瘤农杆菌转化法 |
| 1.2.2.3 基因枪法 |
| 1.2.2.4 PEG介导的原生质体转化法 |
| 1.2.3 里氏木霉的筛选标记 |
| 1.2.3.1 抗生素抗性基因 |
| 1.2.3.2 营养获得型 |
| 1.2.3.3 营养缺陷型 |
| 1.3 里氏木霉遗传操作体系简介 |
| 1.3.1 同源重组 |
| 1.3.1.1 同源重组简介 |
| 1.3.1.2 同源重组在里氏木霉中的应用 |
| 1.3.2 RNAi技术 |
| 1.3.2.1 RNAi技术的作用机理 |
| 1.3.2.2 RNAi在真菌功能研究中的策略 |
| 1.3.2.3 RNAi技术在里氏木霉中的应用 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9 系统 |
| 1.3.3.1 CRISPR/Cas9 系统的起源 |
| 1.3.3.2 CRISPR/Cas9 系统的组成 |
| 1.3.3.3 CRISPR/Cas9 系统作用机理 |
| 1.3.3.4 CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应 |
| 1.3.3.5 CRISPR/Cas9 系统在里氏木霉中的应用 |
| 1.4 β-葡萄糖苷酶 |
| 1.4.1 β-葡萄糖苷酶简介 |
| 1.4.2 β-葡萄糖苷酶的应用 |
| 1.5 β-甘露聚糖酶 |
| 1.5.1 β-甘露聚糖酶简介 |
| 1.5.2 β-甘露聚糖酶的应用 |
| 1.6 本研究的内容及意义 |
| 第二章 结合CRISPR/Cas9和RNAi技术同时对主要纤维素酶cbh1和eg2 基因进行编辑 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 培养基与溶液配制 |
| 2.1.2.1 培养基 |
| 2.1.3 实验仪器与生化试剂 |
| 2.1.3.1 实验仪器 |
| 2.1.3.2 生化试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌和里氏木霉的培养 |
| 2.2.2 里氏木霉总DNA的提取 |
| 2.2.3 pEG2i质粒的构建 |
| 2.2.3.1 基因片段获得 |
| 2.2.3.2 构建中间质粒载体p Pdc1-Eno1 |
| 2.2.4 gRNA-cbh1 的制备 |
| 2.2.4.1 gRNA的体外转录 |
| 2.2.5 里氏木霉转化 |
| 2.2.6 阳性转化子的筛选 |
| 2.2.7 纤维素酶的诱导表达 |
| 2.2.8 SDS-PAGE及质谱分析 |
| 2.2.9 里氏木霉总RNA的提取 |
| 2.2.10 基因转录水平的测定 |
| 2.2.11 纤维素酶酶活的测定 |
| 2.2.11.1 标准曲线的制定 |
| 2.2.11.2 外切纤维素酶酶活的测定 |
| 2.2.11.3 内切纤维素酶酶活的测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Cas9/gRNA复合物敲除里氏木霉cbh1 基因 |
| 2.3.2 选定转化子中CBH1和EG2分泌表达情况 |
| 2.3.2.1 SDS-PAGE检测目的蛋白 |
| 2.3.2.2 纤维素酶酶活的测定 |
| 2.3.3 eg2基因转录水平分析 |
| 2.3.4 质谱鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 低纤维素酶背景促进β-葡萄糖苷酶在里氏木霉中的异源表达 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 培养基与溶液配制 |
| 3.1.3 实验仪器与生化试剂 |
| 3.1.4 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 大肠杆菌和里氏木霉的培养 |
| 3.2.2 pyr4筛选标记的敲除 |
| 3.2.3 表达外源基因载体转化里氏木霉 |
| 3.2.4 阳性转化子的筛选 |
| 3.2.5 异源β-葡萄糖苷酶和异源甘露聚糖酶基因的诱导表达 |
| 3.2.6 SDS-PAGE检测目的蛋白的分子大小 |
| 3.2.7 β-葡萄糖苷酶的酶活测定 |
| 3.2.7.1 pNP标准曲线的绘制 |
| 3.2.7.2 β-葡萄糖苷酶酶活测定方法 |
| 3.2.8 甘露聚糖酶的酶活测定 |
| 3.2.8.1 甘露糖标准曲线的绘制 |
| 3.2.8.2 甘露聚糖酶酶活测定方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 β-葡萄糖苷酶基因Nf Bgl3A的异源表达 |
| 3.3.1.1 p RS-Nf Bgl3A-solo质粒图谱 |
| 3.3.1.2 筛选阳性转化子 |
| 3.3.1.3 蛋白表达检测 |
| 3.3.1.4 pNP标准曲线绘制 |
| 3.3.1.5 β-葡萄糖苷酶酶活的测定 |
| 3.3.2 An Man5A(opt)在里氏木霉中的异源表达 |
| 3.3.2.1 p Pcbh1-An Man5A(opt)-Tcbh1-TEL质粒图谱 |
| 3.3.2.1 阳性转化子的PCR验证 |
| 3.3.2.2 标准曲线的绘制 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 木糖苷酶xyl3A和纤维素酶基因cbh2、eg1 的敲除 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 培养基与溶液配制 |
| 4.1.3 实验仪器与生化试剂 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 大肠杆菌和里氏木霉的培养 |
| 4.2.2 里氏木霉总DNA的提取 |
| 4.2.3 使用CRISPR/Cas9 敲除xyl3A基因 |
| 4.2.3.1 筛选高效切割xyl3A基因的gRNA |
| 4.2.3.2 sgRNA-xyl3A表达盒的构建 |
| 4.2.3.3 APA-Cas9-sgRNA-xyl3A质粒的构建 |
| 4.2.3.4 Donor DNA的构建 |
| 4.2.4 Cas9/gRNA RNP复合物分别敲除cbh2和eg1 基因 |
| 4.2.4.1 gRNA的制备 |
| 4.2.4.2 Donor DNA的制备 |
| 4.2.5 里氏木霉转化 |
| 4.2.6 阳性转化子的筛选 |
| 4.2.7 纤维素酶的诱导表达 |
| 4.2.8 SDS-PAGE检测目的蛋白的分子大小 |
| 4.2.9 pyr4筛选标记的敲除 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 使用胞内表达Cas9 方法敲除xyl3A基因 |
| 4.3.1.1 针对xyl3A基因的gRNA筛选 |
| 4.3.1.2 sgRNA-xyl3A与 Cas9 的表达载体的构建 |
| 4.3.1.3 筛选发生基因组编辑的转化子 |
| 4.3.1.4 转化子分泌蛋白的电泳分析 |
| 4.3.2 SUS7 菌株中分别敲除cbh2和eg1 基因 |
| 4.3.2.1 SUS7尿嘧啶缺陷型菌株的获得 |
| 4.3.2.1 转化子筛选 |
| 4.3.1.4 转化子分泌蛋白的电泳分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 不同CRISPR/Cas9 基因组编辑方法在里氏木霉中的应用探索 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 培养基与溶液配制 |
| 5.1.3 实验仪器与生化试剂 |
| 5.1.4 引物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 大肠杆菌和里氏木霉的培养 |
| 5.2.2 里氏木霉总DNA的提取 |
| 5.2.3 设计II型启动子驱动gRNA |
| 5.2.3.1 crRNA表达盒的构建 |
| 5.2.3.2 tracRNA表达盒的构建 |
| 5.2.3.3 pAPA-gpd1P-eno1T-cr/trac RNA质粒的构建 |
| 5.2.3.4 扩增用以里氏木霉转化的Cas9 DNA表达盒片段 |
| 5.2.4 5S rRNA启动子用于引导gRNA的高效表达 |
| 5.2.5 应用Cas9(D10A)突变体进行基因编辑 |
| 5.2.5.1 Cas9蛋白作用的eg1基因的体外切割验证实验 |
| 5.2.5.2 sgRNA表达盒的构建 |
| 5.2.5.3 APA-Cas9(D10A)-sgRNA-eg1 质粒的构建 |
| 5.2.5.4 Donor DNA的构建 |
| 5.2.6 应用小分子调节CRISPR/Cas9 的基因编辑效率 |
| 5.2.6.1 Cas9蛋白作用的基因的体外切割验证实验 |
| 5.2.7 通过添加非同源DNA来增加基因的破坏效率 |
| 5.2.7.1 Cas9蛋白作用的基因的体外切割验证实验 |
| 5.2.8 利用热胁迫提高CRISPR/Cas9 的基因编辑效率 |
| 5.2.8.1 Cas9蛋白作用的基因的体外切割验证实验 |
| 5.2.9 里氏木霉转化 |
| 5.2.10 阳性转化子的筛选 |
| 5.2.11 纤维素酶的诱导表达 |
| 5.2.12 SDS-PAGE检测目的蛋白的分子大小 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 使用 II 型启动子驱动 gRNA的表达 |
| 5.3.1.1 pAPA-gpd1P-eno1T-cr/tracRNA质粒的构建 |
| 5.3.1.2 转化子筛选 |
| 5.3.1.3 转化子的产孢表型 |
| 5.3.1.4 SDS-PAGE分析 |
| 5.3.2 使用5S rRNA启动子引导gRNA表达 |
| 5.3.2.1 阳性转化子的验证 |
| 5.3.3 应用Cas9(D10A)突变体进行基因编辑 |
| 5.3.3.1 Cas9蛋白作用的eg1基因的体外切割验证实验 |
| 5.3.3.2 阳性转化子的验证 |
| 5.3.3.3 SDS-PAGE分析 |
| 5.3.4 使用小分子化合物调节CRISPR/Cas9 介导的同源重组效率 |
| 5.3.5 添加非同源DNA来增加基因的编辑效率 |
| 5.3.6 利用热胁迫尝试提高CRISPR/Cas9 的基因编辑效率 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）木质纤维素酶的生产优化、定向进化和生物乙醇应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 木质纤维素 |
| 1.2 木质纤维素酶 |
| 1.2.1 木质纤维素酶简介 |
| 1.2.2 木质纤维素酶的结构与功能 |
| 1.2.3 木质纤维素酶的分类 |
| 1.2.3.1 纤维素酶 |
| 1.2.3.2 半纤维素酶 |
| 1.2.3.3 淀粉酶 |
| 1.2.4 木质纤维素酶的生产者 |
| 1.3 木质纤维素酶的固态共发酵 |
| 1.4 二代生物乙醇生产 |
| 1.4.1 国内外生物乙醇研究进展 |
| 1.4.2 二代生物乙醇生产瓶颈 |
| 1.4.3 二代生物乙醇发酵模式 |
| 1.4.3.1 分步糖化发酵 |
| 1.4.3.2 同步糖化发酵 |
| 1.4.3.3 统合生物工艺 |
| 1.4.3.4 不等温半同步糖化发酵 |
| 1.5 木质纤维素预处理衍生物对酶的影响 |
| 1.5.1 木质纤维素的预处理 |
| 1.5.2 木质纤维素预处理主要衍生物 |
| 1.5.2.1 有机酸 |
| 1.5.2.2 木质素衍生物 |
| 1.5.2.3 呋喃衍生物 |
| 1.5.3 木质纤维素预处理衍生物对酶的影响 |
| 1.6 木质纤维素酶的分子改造 |
| 1.6.1 BGL活性的定向进化 |
| 1.6.2 BGL温度的定向进化 |
| 1.6.3 高通量筛选方法 |
| 1.7 本研究立题依据及研究内容 |
| 第2章 木质纤维素酶的固态共发酵优化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 药品 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 培养基的配制 |
| 2.2.5 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 葡萄糖标准曲线的制作 |
| 2.3.2 木质纤维素酶活的测定 |
| 2.3.3 对硝基苯酚标准曲线的制作 |
| 2.3.4 纤维素外切酶活和BGL酶活的测定 |
| 2.3.5 木糖标准曲线的制作 |
| 2.3.6 木聚糖酶活的测定 |
| 2.3.7 蛋白质标准曲线的制作 |
| 2.3.8 蛋白质浓度的测定 |
| 2.3.9 接种延滞时间的优化 |
| 2.3.10 单因素优化 |
| 2.3.10.1 碳源优化 |
| 2.3.10.2 氮源优化 |
| 2.3.11 响应曲面设计 |
| 2.3.11.1 Plackett-Burman设计 |
| 2.3.11.2 Central Composite设计 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 标准曲线的确定 |
| 2.4.1.1 葡萄糖标准曲线 |
| 2.4.1.2 对硝基苯酚标准曲线 |
| 2.4.1.3 木糖标准曲线 |
| 2.4.1.4 蛋白质标准曲线 |
| 2.4.2 木质纤维素水解酶产量的比较 |
| 2.4.3 Co-48单因素优化结果 |
| 2.4.3.1 最优碳源 |
| 2.4.3.2 最优氮源 |
| 2.4.4 Co-48响应曲面优化结果 |
| 2.4.4.1 响应曲面因子的确定 |
| 2.4.4.2 最优回归方程 |
| 2.4.4.3 二次多项式模型的方差分析 |
| 2.4.4.4 RSM可视化图形分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 二代生物乙醇生产 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 乙醇含量标准曲线的制作 |
| 3.3.2 乙醇浓度的测定 |
| 3.3.3 总糖标准曲线的制作 |
| 3.3.4 总糖浓度的测定 |
| 3.3.5 葡萄糖浓度的测定 |
| 3.3.6 麸皮和稻草中成分含量的测定 |
| 3.3.7 稻草的预处理 |
| 3.3.8 不等温半同步糖化发酵模式 |
| 3.3.8.1 酿酒酵母种龄优化 |
| 3.3.8.2 糖化及其时间的优化 |
| 3.3.8.3 发酵温度优化 |
| 3.3.8.4 二代生物乙醇生产 |
| 3.3.9 水解效率和乙醇产率计算公式 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 乙醇标准曲线 |
| 3.4.2 总糖标准曲线 |
| 3.4.3 最适接种种龄 |
| 3.4.4 最适发酵温度 |
| 3.4.5 最适糖化时间 |
| 3.4.6 二代生物乙醇产量 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 木质纤维素预处理衍生物对β-葡萄糖苷酶的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 药品 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 主要仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 引物设计 |
| 4.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.3.3 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit胶回收 |
| 4.3.4 大肠杆菌TOP10感受态的制备 |
| 4.3.5 大肠杆菌TOP10的转化 |
| 4.3.6 质粒提取方法 |
| 4.3.7 毕赤酵母GS115感受态的制备 |
| 4.3.8 电转杯的灭菌 |
| 4.3.9 毕赤酵母GS115的电转化 |
| 4.3.10 真菌总DNA的提取方法 |
| 4.3.11 表达载体的构建 |
| 4.3.12 Po16BGL的异源表达 |
| 4.3.12.1 Po16BGL基因的获取 |
| 4.3.12.2 Po16BGL与载体连接 |
| 4.3.12.3 阳性克隆子的验证 |
| 4.3.12.4 毕赤酵母GS115基因工程菌的验证 |
| 4.3.12.5 Po16BGL的表达 |
| 4.3.13 SDS-PAGE电泳分析 |
| 4.3.14 菌种保藏 |
| 4.3.15 Po16BGL酶学性质的表征 |
| 4.3.15.1 最适pH的测定 |
| 4.3.15.2 最适温度的测定 |
| 4.3.16 Po16BGL酶促反应动力学的测定 |
| 4.3.16.1 残余酶活的测定 |
| 4.3.16.2 抑制剂条件下反应速率的测定 |
| 4.3.16.3 动力学常数计算 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 Po16BGL序列分析及酶学性质的研究结果 |
| 4.4.1.1 Po16BGL序列和结构分析 |
| 4.4.1.2 Po16BGL的分子量 |
| 4.4.1.3 Po16BGL的最适温度和最适pH |
| 4.4.2 抑制剂对Po16BGL的影响 |
| 4.4.2.1 有机酸对Po16BGL的抑制 |
| 4.4.2.2 有机酸钠盐、无机盐对Po16BGL的抑制 |
| 4.4.2.3 乙醇对Po16BGL的抑制 |
| 4.4.2.4 酚类化合物、呋喃衍生物对Po16BGL活性的影响 |
| 4.4.3 Po16BGL酶促反应抑制动力学的研究结果 |
| 4.4.3.1 有机酸抑制的酶促反应动力学 |
| 4.4.3.2 有机酸钠抑制的酶促反应动力学 |
| 4.4.3.3 乙醇抑制的酶促反应动力学 |
| 4.4.3.4 无机盐抑制的酶促反应动力学 |
| 4.4.3.5 抑制剂的抑制强度 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 β-葡萄糖苷酶最适温度的定向进化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 药品 |
| 5.2.3 试剂 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.2.5 主要仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 引物设计 |
| 5.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.3.3 E.Z.N.A.Gel Extraction Kit胶回收 |
| 5.3.4 大肠杆菌TOP10感受态的制备 |
| 5.3.5 大肠杆菌TOP10的转化 |
| 5.3.6 质粒提取方法 |
| 5.3.7 毕赤酵母GS115感受态的制备 |
| 5.3.8 电转杯的灭菌 |
| 5.3.9 表达载体的构建 |
| 5.3.10 毕赤酵母GS115的电转化 |
| 5.3.11 Po16BGL最适温度的定向进化 |
| 5.3.11.1 Po16BGL DNA突变与合成 |
| 5.3.11.2 突变DNA与pGAPZαA连接 |
| 5.3.11.3 阳性克隆子的验证 |
| 5.3.12 高通量筛选 |
| 5.3.13 菌种保藏 |
| 5.3.14 SDS-PAGE电泳分析 |
| 5.3.15 突变酶酶学表征研究 |
| 5.3.15.1 最适pH的测定 |
| 5.3.15.2 最适温度的测定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 Po16BGL定向进化研究结果 |
| 5.4.1.1 易错PCR的DNA电泳 |
| 5.4.1.2 阳性克隆子的电泳检测 |
| 5.4.1.3 电转前的线性化电泳检测 |
| 5.4.1.4 高通量筛选后的PCR验证 |
| 5.4.1.5 突变酶SDS-PAGE电泳 |
| 5.4.2 突变酶酶学性质表征 |
| 5.4.2.1 突变酶活性和比活 |
| 5.4.2.2 最适温度和最适pH |
| 5.4.3 突变酶分子动力学参数 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表论文(着)及科研情况 |
（4）一种耐高温β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中高效表达及其耐高温机理分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 项目背景 |
| 1.2 国内外研究、应用进展 |
| 1.2.1 β-甘露聚糖酶的国内外研究、应用进展 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达系统的研究、应用进展 |
| 1.3 存在的问题 |
| 1.4 立题目的、意义及主要研究内容 |
| 1.4.1 立题目的、意义 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第二章 耐高温 β-甘露聚糖酶天然生产菌种的分离、筛选及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 培养基组成 |
| 2.2.3 菌体富集培养及筛选 |
| 2.2.4 菌株鉴定 |
| 2.2.5 菌株在不同温度、pH条件下的生长测试 |
| 2.2.6 菌株摇瓶发酵 |
| 2.2.7 BS-Man的部分酶学性质检测 |
| 2.2.8 β-甘露聚糖酶酶活检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 产 β-甘露聚糖酶的菌株筛选 |
| 2.3.2 菌种鉴定 |
| 2.3.3 TBS2的生长性能 |
| 2.3.4 菌株摇瓶发酵及酶液纯化 |
| 2.3.5 BS-Man的部分酶学性质 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 耐高温β-甘露聚糖酶重组毕赤酵母工程菌的构建、表达及其酶学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 载体和菌株 |
| 3.2.2 主要工具酶和试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 培养基和主要试剂配制 |
| 3.2.5 TBS2基因组DNA提取及克隆 |
| 3.2.6 序列分析及重组表达载体构建 |
| 3.2.7 重组毕赤酵母工程菌构建、筛选 |
| 3.2.8 高密度液体发酵 |
| 3.2.9 重组耐高温β-甘露聚糖酶的分离、纯化 |
| 3.2.10 酶学性质检测 |
| 3.2.11 检测方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 TBS2基因组提取及克隆 |
| 3.3.2 基因序列分析及重组表达载体构建 |
| 3.3.3 重组毕赤酵母工程菌的构建及筛选 |
| 3.3.4 高密度液体发酵 |
| 3.3.5 ReTMan26蛋白纯化 |
| 3.3.6 ReTMan26酶学性质 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 Re TMan26的耐高温机理分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 表达载体与菌株 |
| 4.2.2 主要工具酶和试剂、培养基配制 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 ReTMan26蛋白质三维结构建模及分析 |
| 4.2.5 ReTMan26脱N-糖基化及纯化 |
| 4.2.6 ReTMan26中二硫键定点突变、菌体构建、发酵培养及酶蛋白纯化 |
| 4.2.7 稳定性对比实验 |
| 4.2.8 酶动力学常数检测 |
| 4.2.9 酶活检测方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 ReTMan26蛋白质结构分析 |
| 4.3.2 ReTMan26脱N-糖基化处理及纯化 |
| 4.3.3 二硫键定点突变、菌体构建、发酵培养及酶蛋白纯化 |
| 4.3.4 稳定性对比 |
| 4.3.5 酶动力学常数 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 ReTMan26基因优化、改造及其在毕赤酵母中的高效表达 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 载体和菌株 |
| 5.2.2 主要工具酶和试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 培养基和主要试剂配制 |
| 5.2.5 基因优化、Kozak序列改造及重组质粒构建 |
| 5.2.6 重组毕赤酵母工程菌的构建、筛选 |
| 5.2.7 基因拷贝数及m RNA丰度检测 |
| 5.2.8 高密度液体发酵 |
| 5.2.9 检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 密码子优化、Kozak序列改造及重组表达质粒构建 |
| 5.3.2 转化及阳性重组子筛选 |
| 5.3.3 摇瓶发酵培养及菌株筛选 |
| 5.3.4 基因拷贝数及m RNA丰度 |
| 5.3.5 高密度液体发酵 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 粗甘油用于ReTMan26发酵生产的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 生产菌株、培养基及试剂 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.2.3 不控制pH的摇瓶培养 |
| 6.2.4 控制pH的5L罐分批发酵培养 |
| 6.2.5 粗甘油中杂质对毕赤酵母菌体生长及ReTMan26生产的影响 |
| 6.2.6 分批高密度液体发酵 |
| 6.2.7 检测方法 |
| 6.2.8 粗甘油成分检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 所用粗甘油性质 |
| 6.3.2 不控制pH的摇瓶培养 |
| 6.3.3 控制pH的5L罐分批发酵培养 |
| 6.3.4 粗甘油中各杂质对毕赤酵母菌体生长及ReTMan26生产的影响 |
| 6.3.5 分批高密度液体发酵 |
| 6.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 1 主要结论 |
| 2 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（5）产气肠杆菌B19 β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 甘露聚糖 |
| 1.2 β-甘露聚糖酶介绍 |
| 1.2.1 β-甘露聚糖酶的定义 |
| 1.2.2 β-甘露聚糖酶的催化机制 |
| 1.2.3 β-甘露聚糖酶的来源及性质 |
| 1.3 β-甘露聚糖酶的分子生物学研究进展 |
| 1.3.1 β-甘露聚糖酶基因的克隆 |
| 1.3.2 β-甘露聚糖酶其序列分析 |
| 1.3.3 β-甘露聚糖酶的表达 |
| 1.4 β-甘露聚糖酶的应用 |
| 1.4.1 β-甘露聚糖酶在饲料工业中的应用 |
| 1.4.2 β-甘露聚糖酶在食品工业中的应用 |
| 1.4.3 β-甘露聚糖酶在造纸工业中的应用 |
| 1.4.4 β-甘露聚糖酶在石油开采中的应用 |
| 1.4.5 β-甘露聚糖酶在洗涤剂中的应用 |
| 1.4.6 β-甘露聚糖酶在纺织工业中的应用 |
| 1.4.7 β-甘露聚糖酶在烟草业中的应用 |
| 1.4.8 β-甘露聚糖酶作为工具酶的应用 |
| 1.4.9 β-甘露聚糖酶的其它应用 |
| 1.5 本课题研究内容与目的意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 目的意义 |
| 第二章 β-甘露聚糖酶基因的克隆和异源表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 主要化学试剂 |
| 2.2.3 培养基和试剂的配置 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 所用引物及序列 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌株活化 |
| 2.3.2 B19基因组的提取 |
| 2.3.3 克隆载体PMD19-T-ManE的构建 |
| 2.3.4 重组质粒pET28a(+)-ManE的构建 |
| 2.3.5 β-甘露聚糖酶基因序列的生物信息学分析 |
| 2.3.6 重组蛋白的异源表达 |
| 2.3.7 表达蛋白的SDS-PAGE电泳 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 产气肠杆菌B19基因组DNA的提取 |
| 2.4.2 β-甘露聚糖酶基因的扩增 |
| 2.4.3 克隆载体pMD19-T-ManE的验证 |
| 2.4.4 表达载体pET28a(+)-ManE的验证 |
| 2.4.5 β-甘露聚糖酶基因序列分析 |
| 2.4.6 生物信息学分析 |
| 2.4.7 蛋白酶异源表达的SDS-PAGE检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 重组酶异源表达条件优化及酶学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 主要化学试剂 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 不同温度对重组酶表达量的影响 |
| 3.3.2 不同IPTG诱导浓度对重组酶表达量的影响 |
| 3.3.3 不同培养时间对重组酶表达量的影响 |
| 3.3.4 重组酶的分离纯化 |
| 3.3.5 蛋白质溶液浓度测定 |
| 3.3.6 β-甘露聚糖酶酶活力的测定 |
| 3.3.7 酶学性质研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 温度对重组酶异源表达量的影响 |
| 3.4.2 IPTG浓度对重组酶异源表达量的影响 |
| 3.4.3 诱导时间对重组酶异源表达量的影响 |
| 3.4.4 标准曲线的绘制 |
| 3.4.5 重组酶的纯化 |
| 3.4.6 酶学性质 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 解淀粉芽孢杆菌DC12转化的探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 主要化学试剂 |
| 4.2.3 培养基与缓冲液的配制 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 克隆载体pMD18-T-tyb的构建 |
| 4.3.2 重组质粒pKSV7-tyb的构建 |
| 4.3.3 解淀粉芽孢杆菌FZB42感受态细胞制备及转化 |
| 4.3.4 解淀粉芽孢杆菌DC12感受态细胞制备及转化 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 基因组DNA的提取 |
| 4.4.2 上下游同源臂的扩增 |
| 4.4.3 扩增同源臂tyb |
| 4.4.4 克隆载体pMD18-T-tyb的验证 |
| 4.4.5 重组质粒pKSV7-tyb的验证 |
| 4.4.6 重组质粒pKSV7-tyb转化解淀粉芽孢杆菌FZB |
| 4.4.7 重组质粒pKSV7-tyb转化解淀粉芽孢杆菌DC |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 本文主要结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（6）里氏木霉高产纤维素酶的机理研究和应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 选题背景 |
| 1.2 里氏木霉简介 |
| 1.3 里氏木霉纤维素酶的研究进展 |
| 1.3.1 发酵条件影响里氏木霉纤维素酶的产生 |
| 1.3.2 里氏木霉纤维素酶的分泌 |
| 1.3.3 里氏木霉纤维素酶产生的调控机制 |
| 1.3.4 提高纤维素酶产量的有效途径 |
| 1.4 里氏木霉次级代谢产物黄色色素的研究进展 |
| 1.4.1 里氏木霉黄色色素的作用 |
| 1.4.2 里氏木霉色素产生的调控 |
| 1.5 论文的研究目的和内容 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 本论文选题思路及主要研究内容 |
| 1.5.3 本论文创新点 |
| 参考文献 |
| 第二章 高产β-葡萄糖苷酶基因工程菌的应用及cel3d在高产纤维素酶中的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 菌株、质粒 |
| 2.2.2 试剂、培养基和培养条件 |
| 2.2.3 里氏木霉RUT-C30 DNA的提取 |
| 2.2.4 里氏木霉RUT-C30 RNA的提取 |
| 2.2.5 BGL1表达载体的构建 |
| 2.2.6 菌株遗传转化 |
| 2.2.7 纤维素酶活的测定 |
| 2.2.8 TRB1碳源特异性评价 |
| 2.2.9 TRB1的葡萄糖耐受性评价 |
| 2.2.10 DA预处理的玉米秸秆(EDA-PCS)的糖化分析 |
| 2.2.11 发酵上清液SDS-PAGE电泳和MUG (4-甲基伞形基-β -D-吡喃葡糖苷)酶谱分析 |
| 2.2.12 荧光定量PCR |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 里氏木霉过表达bgl1基因表达载体的构建及琼脂糖凝胶电泳验证 |
| 2.3.2 里氏木霉转化子的筛选及验证 |
| 2.3.3 过表达bgl1基因对里氏木霉纤维素酶活的影响 |
| 2.3.4 里氏木霉TRB1纤维素酶的高产特性不具有碳源依赖性 |
| 2.3.5 相比于里氏木霉RUT-C30,TRB1表现出了较好的或持平的碳代谢阻遏抑制作用 |
| 2.3.6 EDA-PCS的水解 |
| 2.3.7 SDS-PAGE与MUG分析蛋白分泌特性 |
| 2.3.8 TRB1中cel3d基因表达被破坏 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 乳糖诱导下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌SEU-7及其高产机制和应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 菌株、质粒以及培养条件 |
| 3.2.2 实验材料与试剂 |
| 3.2.3 菌株的培养 |
| 3.2.4 培养基以及所用试剂配方 |
| 3.2.5 里氏木霉基因工程菌的构建 |
| 3.2.6 菌株遗传转化 |
| 3.2.7 纤维素酶活的测定 |
| 3.2.8 发酵上清液SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.2.9 EDA预处理玉米秸秆的糖化能力分析 |
| 3.2.10 基因拷贝数的检测 |
| 3.2.11 基因组重测序 |
| 3.2.12 荧光定量PCR |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 高产纤维素酶基因工程菌的构建 |
| 3.3.2 里氏木霉基因工程菌SEU-7无论在纤维素还是乳糖诱导下相比于RUT-C30表现出了极强的产酶能力 |
| 3.3.3 乳糖浓度优化以及补料进一步提高了基因工程菌SEU-7的产酶能力 |
| 3.3.4 添加低浓度葡萄糖促进纤维素酶产生 |
| 3.3.5 高浓度葡萄糖仍可促进SEU-7纤维素酶的产生 |
| 3.3.6 里氏木霉SEU-7的生物学特性研究 |
| 3.3.7 里氏木霉SEU-7产生的纤维素酶的水解纤维素能力显着增加 |
| 3.3.8 并行突变的确定 |
| 3.3.9 过表达bgl1在里氏木霉SEU-7高产纤维素酶中起着重要作用 |
| 3.3.10 里氏木霉SEU-7纤维素酶、半纤维素酶基因以及调节因子的转录水平分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 敲除基因121121过程中带来的并行突变在里氏木霉纤维素酶和黄色色素产生中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 菌株和试剂 |
| 4.2.2 ZC121121的构建及其在纤维素诱导下的产酶情况 |
| 4.2.3 里氏木霉RUT-C30和ZC121121的生长、显微镜观察以及孢子萌发 |
| 4.2.4 酶活以及生物质的检测 |
| 4.2.5 ZC121121、OE121121和RUT-C30在不同碳源条件下黄色色素的产生 |
| 4.2.6 RNA提取以及荧光定量PCR |
| 4.2.7 RNA-seq分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 里氏木霉ZC121121菌株的构建及纤维素酶的产生 |
| 4.3.2 121121基因干扰带来的并行突变导致了黄色色素分泌增加 |
| 4.3.3 敲除121121基因过程带来的并行突变抑制了不同碳源诱导条件下纤维素酶和半纤维素酶的产生 |
| 4.3.4 里氏木霉121121转化子ZC121121的特性 |
| 4.3.5 敲除121121基因过程带来的并行突变导致了纤维素条件和葡萄糖条件下纤维素酶调节因子表达量的变化 |
| 4.3.6 1212121调节pks相关基因及ypr1、ypr2和xpp1的表达 |
| 4.3.7 ZC121121中sorbicillin的生物合成 |
| 4.3.8 121121基因编码的蛋白具有广谱性 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 里氏木霉纤维素酶产生、分布及分泌机理研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 菌株、质粒和培养条件 |
| 5.2.2 重组里氏木霉菌株的构建 |
| 5.2.3 菌株的生长 |
| 5.2.4 利用红色荧光蛋白跟踪纤维素酶的分布 |
| 5.2.5 原生质体的制备 |
| 5.2.6 BFA对里氏木霉纤维素酶合成的影响 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 转化子的构建 |
| 5.3.2 在所有检测的纤维素酶当中BGL出现的最早 |
| 5.3.3 BGL的分泌比CMC和CBH都慢 |
| 5.3.4 STED观察到BGL定位到细胞膜上 |
| 5.3.5 用FITC对β-葡萄糖苷酶和细胞膜进行共定位 |
| 5.3.6 采用原生质体制备的方法证明了BGL确实定位到了细胞膜上 |
| 5.3.7 RBGL、RCMC和RCBH与内质网染料的共染 |
| 5.3.8 BFA对里氏木霉中总蛋白合成的影响 |
| 5.3.9 CBH的分泌不经过或少量经过高尔基体 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 本论文工作总结 |
| 6.2 后续工作的展望 |
| 博士期间研究成果 |
| 致谢 |
（7）里氏木霉纤维素酶高产菌株遗传改造及新型糖苷水解酶的挖掘（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 研究背景 |
| 1.1 里氏木霉发展简史 |
| 1.2 里氏木霉的诱变及筛选 |
| 1.2.1 Natick实验室和在日本开发的突变菌株 |
| 1.2.2 罗格斯大学开发的突变菌株 |
| 1.3 系统生物学方法理解里氏木霉纤维素酶的生产 |
| 1.3.1 里氏木霉的基因组 |
| 1.3.2 CAZymes编码基因在里氏木霉基因组中的分布 |
| 1.3.3 基因组重测序鉴定对纤维素酶生产具有潜在影响的基因 |
| 1.3.4 里氏木霉转录组分析 |
| 1.4 里氏木霉CAZymes的表达调控 |
| 1.4.1 里氏木霉分泌的CAZymes |
| 1.4.2 碳源影响纤维素酶和半纤维素酶表达 |
| 1.4.3 转录因子调控纤维素酶和半纤维素酶基因表达 |
| 1.4.4 转运蛋白参与纤维素酶和半纤维素酶表达 |
| 1.5 质膜H~+-ATP酶对胞质pH的调节 |
| 1.5.1 Pma的结构、功能及调节 |
| 1.5.2 细胞响应pH压力 |
| 1.5.3 pH对里氏木霉纤维素酶和半纤维素酶表达的影响 |
| 1.6 纤维素酶和半纤维素酶在工业上的应用 |
| 1.6.1 纤维素酶及其生产菌株的分离 |
| 1.6.2 纤维素酶的工业应用 |
| 1.6.3 半纤维素酶及其生产菌株的分离 |
| 1.6.4 半纤维素酶的工业应用 |
| 1.7 利用宏基因组手段挖掘新型糖苷水解酶基因 |
| 1.7.1 目标基因富集的策略 |
| 1.7.2 利用宏基因组挖掘新酶的策略 |
| 1.8 本文研究内容及意义 |
| 1.8.1 研究内容 |
| 1.8.2 研究意义 |
| 第2章 重测序和转录组分析里氏木霉纤维素酶高产菌株 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株与质粒 |
| 2.2.2 引物序列 |
| 2.2.3 主要试剂和耗材 |
| 2.2.4 常用试剂配制 |
| 2.2.5 主要培养基配制 |
| 2.2.6 主要仪器和设备 |
| 2.2.7 实验所用程序及软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PCR |
| 2.3.2 DNA凝胶电泳 |
| 2.3.3 胶回收DNA片段 |
| 2.3.4 DNA片段与载体快速连接 |
| 2.3.5 质粒小量提取 |
| 2.3.6 酶切体系及条件 |
| 2.3.7 载体与DNA片段连接 |
| 2.3.8 质粒转化 |
| 2.3.9 根瘤农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.10 电转 |
| 2.3.11 结合转移 |
| 2.3.12 孢子扩培、收集和保存 |
| 2.3.13 里氏木霉转化子筛选和鉴定 |
| 2.3 14 基因组提取 |
| 2.3.15 RNA提取 |
| 2.3.16 cDNA合成和qPCR |
| 2.3.17 标准曲线的制作 |
| 2.3.18 纤维素内切酶活力的测定 |
| 2.3.19 滤纸酶活的测定 |
| 2.3.20 纤维素外切酶活力的测定 |
| 2.3.21 蛋白表达及纯化 |
| 2.3.22 脱氢酶活性检测 |
| 2.3.23 里氏木霉菌株生长检测 |
| 2.3.24 蛋白浓度检测 |
| 2.3.25 基因组重测序及数据处理 |
| 2.3.26 转录组测序及数据处理 |
| 2.3.27 SNPs和indels位点验证 |
| 2.3.28 统计学分析 |
| 2.3.29 质粒构建 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 高产菌株SS-Ⅱ和RUT-C30表型分析 |
| 2.4.2 菌株SS-Ⅱ和RUT-C30在四种碳源下的转录组数据比较分析 |
| 2.4.3 纤维素降解相关基因在SS-Ⅱ和RUT-C30中差异表达分析 |
| 2.4.4 转录调控因子差异表达分析及人工光控转录因子的构建 |
| 2.4.5 转运体在SS-Ⅱ和RUT-C30中差异表达分析 |
| 2.4.6 菌株SS-Ⅱ基因组重测序数据分析 |
| 2.4.7 菌株SS-Ⅱ碱基突变模式分析 |
| 2.4.8 受突变影响的基因GO功能分类 |
| 2.4.9 候选基因用于敲除分析 |
| 2.4.10 敲除菌株纤维素酶活性分析 |
| 2.4.11 敲除菌株△56839和△112034纤维素酶编码基因转录水平分析 |
| 2.4.12 基因tre56839和tre112034的功能分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 里氏木霉质膜H~+-ATP酶的鉴定及其敲除对菌株影响的分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 引物序列 |
| 3.2.3 主要试剂和耗材 |
| 3.2.4 常用试剂及培养基的配制 |
| 3.2.5 主要仪器和设备 |
| 3.2.6 所用程序及软件 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 敲除菌株的构建 |
| 3.3.2 生物信息分析及系统进化分析 |
| 3.3.3 菌株培养及RNA提取 |
| 3.3.4 cDNA合成及qPCR分析 |
| 3.3.5 酶活性分析 |
| 3.3.6 胞内外pH检测 |
| 3.3.7 生物质干重和葡萄糖残量检测 |
| 3.3.8 细胞核蛋白提取 |
| 3.3.9 改良型Lowry法测量细胞核蛋白浓度 |
| 3.3.10 制备生物素标记的探针 |
| 3.3.11 电泳迁移率检测(EMSA) |
| 3.3.12 链亲和素亲和层析分离与探针结合的蛋白 |
| 3.3.13 筛选标记的缺失及验证 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 基因tre76238和tre78757的鉴定 |
| 3.4.2 基因tre76238的敲除对菌株纤维素酶生产的影响 |
| 3.4.3 敲除菌株Del238表型分析 |
| 3.4.4 敲除基因tre76238影响菌株将质子泵出到胞外 |
| 3.4.5 敲除基因tre78757不影响菌株纤维素酶生产 |
| 3.4.6 敲除基因tre78757不影响菌株将质子泵出到胞外 |
| 3.4.7 基因tre76238和tre78757双敲除彻底损害菌株生长 |
| 3.4.8 菌株Del238中纤维素酶合成相关的基因的转录分析 |
| 3.4.9 EMSA分析cbh1启动子区域 |
| 3.4.10 与cbh1启动子片段结合的蛋白的分离及鉴定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 宏基因组分析棉花降解微生物群及挖掘新型糖苷水解酶 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 土壤样品 |
| 4.2.2 菌株与质粒 |
| 4.2.3 引物序列 |
| 4.2.4 主要试剂和耗材 |
| 4.2.5 常用试剂配制 |
| 4.2.6 主要培养基配制 |
| 4.2.7 主要仪器和设备 |
| 4.2.8 实验所用软件及工具 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 土壤采样及加工 |
| 4.3.2 样品微生物富集 |
| 4.3.3 宏基因组DNA抽提 |
| 4.3.4 MiSeq测序和16S数据分析 |
| 4.3.5 HiSeq测序及数据分析 |
| 4.3.6 候选基因克隆和表达 |
| 4.3.7 标准曲线的绘制 |
| 4.3.8 糖苷水解酶活力的测定 |
| 4.3.9 酶最适反应温度的测定 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 棉花生物质降解 |
| 4.4.2 棉花降解过程中酶的组分分析 |
| 4.4.3 土壤微生物群落组成分析 |
| 4.4.4 宏基因组序列分析 |
| 4.4.5 宏基因组序列功能分析 |
| 4.4.6 糖苷水解酶编码基因的挖掘 |
| 4.4.7 候选糖苷水解酶编码基因的克隆和表达 |
| 4.4.8 候选糖苷水解酶活性表征 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 研究总结及展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）N-糖基化对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中异源表达的影响（论文提纲范文）
| 引文格式: |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与载体 |
| 1.2 试剂与培养基 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 软件分析β-甘露聚糖酶Man1中易发生N-糖基化的位点 |
| 1.4.2 突变载体的构建 |
| 1.4.3 毕赤酵母重组菌株的构建与筛选 |
| 1.4.4 甲醇诱导培养 |
| 1.4.5 突变体转录水平的测定 |
| 1.4.6 突变体酶活力的测定 |
| 1.4.7 突变体和非突变体重组甘露聚糖酶的纯化 |
| 1.4.8 突变体热稳定性的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 糖基化位点的预测 |
| 2.2 突变载体的构建与鉴定 |
| 2.2.1 突变载体的构建 |
| 2.2.2 重组质粒的验证 |
| 2.3.1 转录水平的比较 |
| 2.3.2 酶活力水平的比较 |
| 2.3.3 纯化后的SDS-PAGE分析 |
| 2.3.4 热稳定性的比较 |
| 3 结论 |
（9）利用人工锌指蛋白技术提高里氏木霉Rut-C30纤维素酶产量（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词 |
| 1 引言 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 纤维素酶在不同领域中的应用 |
| 2.2 纤维素酶及纤维素酶生产菌 |
| 2.3 丝状真菌纤维素酶转录调控进展 |
| 2.4 里氏木霉蛋白分泌压力响应进展 |
| 2.5 丝状真菌转化方法和基因工程改造进展 |
| 2.6 人工锌指蛋白转录因子研究进展 |
| 2.7 本论文立题依据及研究意义 |
| 3 人工锌指蛋白文库构建和里氏木霉纤维素酶转化子筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 里氏木霉Rut-C30转化方法的选择 |
| 3.3.2 根癌农杆菌转化方法的优化 |
| 3.3.3 人工锌指蛋白文库和里氏木霉转化子获得 |
| 3.3.4 里氏木霉纤维素酶转化子的筛选 |
| 3.4 小结 |
| 4 里氏木霉U3纤维素酶高产分析及生物质酶解特性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 里氏木霉Rut-C30与U3表型差异分析 |
| 4.3.2 里氏木霉U3蛋白分泌和酶活变化 |
| 4.3.3 里氏木霉U3主要纤维素酶和转录因子转录变化 |
| 4.3.4 里氏木霉U3纤维素酶降解预处理生物质 |
| 4.3.5 人工转录因子AZFP-U3功能分析 |
| 4.3.6 人工转录因子AZFP-U3靶基因预测和功能验证 |
| 4.4 小结 |
| 5 里氏木霉U5纤维素酶性质与转录组分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 里氏木霉Rut-C30与U5表型分析 |
| 5.3.2 里氏木霉U5蛋白分泌和酶活变化 |
| 5.3.3 里氏木霉U5纤维素酶降解预处理生物质 |
| 5.3.4 里氏木霉U5主要纤维素酶和转录因子转录变化 |
| 5.3.5 人工转录因子AZFP-U5功能分析 |
| 5.3.6 里氏木霉U5转录组学分析 |
| 5.3.7 关键代谢通路和基因分析 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 人工锌指转录因子蛋白序列 |
| 附录B 比较转录组中ERAD和UPR相关基因转录变化 |
| 附录C 比较转录组中AZFP-U5潜在靶基因转录比较 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（10）里氏木霉β-甘露聚糖酶的克隆表达及结构域的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 木质纤维素 |
| 1.2 木质纤维素降解酶类 |
| 1.3 β-甘露聚糖酶 |
| 1.3.1 β-甘露聚糖酶的来源及性质 |
| 1.3.2 β-甘露聚糖酶的作用机制 |
| 1.3.3 β-甘露聚糖酶的国内外研究进展 |
| 1.3.4 β-甘露聚糖酶的应用 |
| 1.4 里氏木霉 |
| 1.5 毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.5.1 毕赤酵母表达系统的优点 |
| 1.5.2 毕赤酵母表达宿主 |
| 1.5.3 毕赤酵母表达载体 |
| 1.5.4 外源基因的整合与转化 |
| 1.5.5 影响毕赤酵母中外源蛋白表达的因素 |
| 1.6 蛋白质糖基化的研究进展 |
| 1.7 课题的立题背景及研究内容 |
| 1.7.1 立题背景 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 常用培养基和主要溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 β-甘露聚糖酶基因克隆 |
| 2.2.2 毕赤酵母重组表达载体的构建与验证 |
| 2.2.3 转化和筛选毕赤酵母重组子 |
| 2.2.4 重组毕赤酵母的诱导表达 |
| 2.2.5 重组甘露聚糖酶的纯化和去糖基化分析 |
| 2.2.6 重组甘露聚糖酶的结构分析 |
| 2.2.7 重组甘露聚糖酶的酶学性质分析 |
| 2.2.8 吸附实验 |
| 2.2.9 协同纤维素酶水解实验 |
| 2.2.10 N-糖基化对重组甘露聚糖酶的影响 |
| 2.3 分析方法 |
| 2.3.1 酶活测定 |
| 2.3.2 蛋白分析 |
| 2.3.3 木质纤维素含量的测定 |
| 2.3.4 总还原糖含量的测定 |
| 2.3.5 单糖含量的测定 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 β-甘露聚糖酶基因重组毕赤酵母的构建与表达 |
| 3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.1.2 甘露聚糖酶基因成熟肽编码序列的克隆 |
| 3.1.3 重组表达载体的构建与验证 |
| 3.1.4 重组毕赤酵母的筛选和诱导表达 |
| 3.1.5 重组甘露聚糖酶的纯化与蛋白分析 |
| 3.1.6 圆二色谱与三维结构 |
| 3.1.7 小结 |
| 3.2 重组Man1和Man1△CBM的酶学性质 |
| 3.2.1 最适pH值及pH值稳定性 |
| 3.2.2 最适温度及温度稳定性 |
| 3.2.3 EDTA及金属离子的影响 |
| 3.2.4 比活力和动力学常数 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 重组酶协同纤维素酶水解反应的研究 |
| 3.3.1 重组酶的吸附性能研究 |
| 3.3.2 重组酶协同纤维素酶水解木质纤维素材料的影响 |
| 3.3.3 小结 |
| 3.4 去N-糖基化位点对重组Man1的影响 |
| 3.4.1 突变体的构建 |
| 3.4.2 三种突变体与重组Man1的比较 |
| 3.4.3 小结 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
四、里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]β-甘露聚糖酶在里氏木霉中的高效表达[D]. 刘琴. 山东大学, 2021(09)
- [2]低纤维素酶背景里氏木霉表达宿主菌的构建[D]. 刘杜娟. 中国农业科学院, 2020(01)
- [3]木质纤维素酶的生产优化、定向进化和生物乙醇应用研究[D]. 易拾. 江西师范大学, 2019(03)
- [4]一种耐高温β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中高效表达及其耐高温机理分析[D]. 罗长财. 江南大学, 2018(12)
- [5]产气肠杆菌B19 β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究[D]. 宋妍. 华南理工大学, 2018(01)
- [6]里氏木霉高产纤维素酶的机理研究和应用[D]. 李程程. 东南大学, 2018(12)
- [7]里氏木霉纤维素酶高产菌株遗传改造及新型糖苷水解酶的挖掘[D]. 张国秀. 华东理工大学, 2017(07)
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- [10]里氏木霉β-甘露聚糖酶的克隆表达及结构域的研究[D]. 蔡瑞. 天津科技大学, 2016(07)