一、按大肠杆菌高表达序列设计的人干扰素α-2b基因的化学合成和克隆（论文文献综述）
杨瑞[1]（2020）在《表达猪圆环病毒2型Cap蛋白稳转CHO细胞系的建立及免疫增强剂的开发》文中研究指明猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2,PCV2）被认为是猪圆环病毒相关疾病（Porcine Circovirus Associated Disease,PCVAD）的主要传播病原体之一,每年给我国乃至全球仔猪养殖和育种业的发展造成巨大的经济损失。目前,疫苗接种是控制和预防PCVAD的主要措施。研究表明,衣壳蛋白（Cap）是PCV2的最具免疫原性的蛋白,与PCV2的感染和免疫力密切相关。因此,Cap蛋白是开发PCV2疫苗的潜在靶蛋白。为了获得高效表达PCV2 Cap蛋白的稳转细胞株,本研究首先以荧光素酶（Luciferase,Luc）为报告基因,筛选不同的启动子和信号肽对其在CHO-K1细胞中表达的影响,在此基础上,构建可表达PCV2 Cap蛋白的真核表达载体,转染CHO-K1细胞后筛选得到稳定表达Cap蛋白的细胞株。另外,为了提高Cap蛋白的免疫原性,本研究也探讨了脑膜炎球菌外膜蛋白PorB对其免疫原性的增强作用。将CMV和CAG 2种启动子和5种不同来源的信号肽（人血清白蛋白、氮杂环蛋白前体蛋白、小鼠信号肽Ig Gκ、人干扰素-α2、人白细胞介素-2）分别与Luc报告基因进行融合构建重组真核表达载体,转染CHO-K1细胞后通过化学发光仪检测Luc蛋白的表达量,最终筛选出CAG启动子及人干扰素-α2信号肽（命名为SP4）可显着增加Luc蛋白的表达,结果证明了CHO细胞高效表达体系的成功建立。最后,将经密码子优化后的Cap基因构建到p CDNA3.1-CAG-SP4-Luc真核表达载体中,构建重组质粒p CDNA3.1-CAG-SP4-Cap,通过脂质体法转染CHO-K1细胞,G418筛选获得单克隆,经有限稀释法扩大培养后得到能够高效表达Cap蛋白的细胞株SP4-1,并分离纯化该细胞株扩大培养后的蛋白,得到的重组Cap蛋白进行Western bloting鉴定。结果表明,Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中稳定表达。将收集的重组Cap蛋白通过镍柱进行纯化,使用BCA法测定蛋白浓度为637±0.165mg/L。最后,以原核表达系统制备的重组脑膜炎球菌外膜蛋白PorB为免疫增强剂免疫动物,结果证明,经CHO-K1细胞表达的Cap蛋白具备良好的免疫原性,且原核表达的重组PorB蛋白具有显着的免疫增强作用。本研究为开发新型有效防治猪圆环病毒的疫苗及相关佐剂奠定基础。
梁涛[2]（2020）在《人源多肽：N-乙酰氨基半乳糖基转移酶ppGalNAc-Ts的原核表达及体外合成O-糖基化修饰的白介素-2》文中提出O-GalNAc糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰形式,不仅在蛋白质加工、细胞增殖分化、免疫炎症等过程中具有重要功能,还在重组蛋白类药物修饰中具有重要意义,如缺乏糖基化修饰会缩短重组蛋白药物的体内半衰期或降低药效。多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶（polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase,ppGalNAc-T,EC:2.4.1.41）是催化蛋白质O-GalNAc糖基化修饰的起始糖基转移酶,是调控人体蛋白质发生O-糖基化修饰及其糖蛋白生物功能的关键酶。体外高产量获得人源ppGalNAc-T酶对于重组治疗性O-糖蛋白药物的合成,疫苗生产及工具酶的开发都具有重要意义。由于ppGalNAc-T从进化上只存在于真核后生动物中,在细菌和酵母中不存在可以取代的同功酶。长期以来人们只能通过化学合成多肽的方式来取得O-GalNAc修饰糖肽,但对于大分子蛋白药物的O-糖链合成仍存在局限。利用昆虫细胞或人源HEK 293T细胞表达ppGalNAc-T酶存在表达量低、培养成本高等问题,无法适应日益增长的多肽蛋白类药物生产的需求。而过往在利用原核系统表达人源ppGalNAc-T酶时存在需要多个分子伴侣共表达帮助该酶折叠而导致表达效率低等问题。因此,本研究我们开发了一种可以获得产量达12 mg/L以上并具有稳定酶活的ppGalNAc-T酶的大肠杆菌表达系统。本研究使用了Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS作为表达菌株,通过在该菌株胞内共表达人源蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide-isomerase,PDI,EC:5.3.4.1）,成功从大肠杆菌中表达纯化了高酶活的ppGalNAc-T酶。本论文主要内容和研究结果如下:（1）建立了一种操作简便、表达量高以及酶活强的大肠杆菌表达ppGalNAc-T酶的方法。研究发现在Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS菌株胞内共表达人源重组PDI和ppGalNAc-T酶,可以帮助ppGalNAc-T酶二硫键形成并且正确折叠。以ppGalNAc-T2酶为例,经过表达条件优化后可以从1 L培养基中获得超过12 mg的有活性的ppGalNAc-T2酶。（2）利用基于HPLC的酶动力学实验、圆二色谱实验等实验,我们系统性比较了E.coli和HEK 293T细胞表达系统生产的ppGalNAc-T2酶之间的差异。发现E.coli-T2和293T-T2针对受体底物EA2多肽和供体底物UDP-GalNAc具有相似的Vmax,但是E.coli-T2相比293T-T2对EA2和UDP-GalNAc的亲和力更强。圆二色谱结果表明,E.coli-T2具有和293T-T2相似的热稳定性,但是二者的α螺旋结构存在轻微差异。（3）利用体外酶法合成及点突变技术,我们证实大肠杆菌表达的ppGalNAc-T2酶可以选择性的在白介素-2（Interleukin-2,IL-2）蛋白T23位点上进行O-GalNAc糖基化修饰。该结果一方面验证了大肠杆菌表达的ppGalNAc-T酶的活性,同时为理解ppGalNAc-T酶精密调控底物蛋白糖基化的机制提供实例。综上所述,本研究中我们通过PDI共表达等方法构建了一种新型的ppGalNAc-T酶的大肠杆菌表达系统,该系统操作简便,可以生产大量有活性的ppGalNAc-T酶。以IL-2为例,我们证实这种大肠杆菌表达的ppGalNAc-T酶能够用于体外催化蛋白上O-GalNAc糖链合成。本研究为体外合成均一化的O-糖蛋白药物提供了新的技术支持,同时相似的策略可以用来尝试表达其他的糖基转移酶。
于荣荣[3]（2019）在《改造和优化人干扰素α-2b基因序列并在大肠杆菌中做表达验证》文中研究表明提高外源基因的表达水平一直是生物技术探讨的热点问题。在理论上,探讨更有效的基因序列改造和优化方案,对于提高外源基因的表达水平具有重要意义和实用价值。本研究提出了针对人干扰素α-2b基因的改造和优化方案,期望在大肠杆菌中获得高效表达。研究两个部分,第一部分在理论上将人干扰素α-2b基因（IFNα-2b）编码序列（CDS）改造成大肠杆菌高表达基因的偏好模式,然后配置选定的启动子区和终止子区序列以便构成完整基因。第二部分是为了检验我们的理论方法的可靠性,将改造和优化的人IFNα-2b基因在大肠杆菌中表达。（一）人干扰素α-2b基因改造和优化方案。对编码序列改造分为两步,首先将编码序列中的密码子置换成大肠杆菌高表达基因的最适同义密码子。其次将编码序列中紧邻密码子第三位点的碱基关联置换成大肠杆菌高表达基因的强关联模式。在此过程中,在强关联模式和最适或次最适同义密码子的置换上做出最佳选择。以大肠杆菌中高表达基因lpp的启动区和终止区序列作为改造基因的启动区和终止区序列。以lpp启动区中的SD序列作为高表达启动区的SD序列,将低表达基因的SD序列替换lpp启动区中的SD序列作为对照序列。构造三条完整的人干扰素α-2b基因,它们是“高表达SD+改造前CDS”基因（GWGB）,“高表达SD+改造后CDS”基因（GGB）和“低表达SD+改造后CDS”基因（DGB）。（二）GWGB基因和GGB基因作为第一对照组,检验编码序列改造前和改造后的表达差异。GGB基因和DGB基因作为第二对照组,检验的是高表达SD序列和低表达SD序列对基因表达水平的影响。在大肠杆菌中做表达对比实验,我们采用了两种方式完成表达实验,（1）由于我们设计的序列是一条完整的基因序列,将重组克隆载体p GM-T-IFNα-2b转化至大肠杆菌中进行表达。（2）将重组表达载体p ET-28a（+）-IFNα-2b转化至大肠杆菌进行表达（表达载体中的T7启动子被抑制）。（3）最后通过ELISA检测两个载体中人干扰素α-2b基因的表达量。结果显示:在克隆载体中,编码序列改造后的基因（GGB基因）的表达量显着高于编码序列改造前的基因（GWGB基因）的表达量,表达量提高了55.1%;高表达SD基因的表达量显着高于低表达SD基因的表达量,表达量提高了52.8%。在表达载体中,编码序列改造后的基因的表达量显着高于编码序列改造前的基因的表达量,表达量提高了9.1%;高表达SD基因的表达量显着高于低表达SD基因的表达量,表达量提高了18.2%。结果表明,基因改造和优化的理论方案得到了实验验证。我们的理论方案对于提高外源基因的表达效率具有重要的参考价值。
姚凌云[4]（2018）在《犬干扰素α2的克隆表达与抗病毒活性分析》文中研究表明干扰素是由多种细胞分泌的蛋白家族成员之一,具有广谱的抗病毒、抗肿瘤细胞增殖和免疫调节等生物学功能。根据干扰素的核苷酸序列和染色体定位,及其与特定受体的相互作用方式、结构与理化性质等,干扰素可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3大类。干扰素α属Ⅰ型干扰素家族,是由白细胞分泌产生的一种糖蛋白,具有较高的抗病毒活性,在试验研究和抗病毒治疗中具有很高的临床应用价值。干扰素也存在半衰期短、给药频繁等缺陷,限制了它的临床应用。血清白蛋白是天然存在于动物体内的一类大分子蛋白质,具有性质稳定和半衰期长的特点,在维持胶体渗透压、运输物质和清除自由基等方面有着重要的生理作用,适合用来与干扰素融合表达以延长干扰素的半衰期。本试验通过大肠杆菌表达系统和昆虫/杆状病毒表达系统表达犬干扰素α2,并鉴定其抗病毒活性;再在昆虫/杆状病毒表达系统中分泌表达犬血清白蛋白与犬干扰素α2的融合干扰素,并进一步检测其抗病毒活性,为犬干扰素的研究与临床应用奠定基础。试验1、犬干扰素α2在大肠杆菌的表达与抗病毒活性分析根据Genbank公布的犬干扰素α2序列（M28625.1）,设计并合成编码犬干扰素α2（CaIFN-α2）的成熟蛋白基因,同时引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。将合成的CaIFN-α2基因插入表达载体pET-28a（+）,构建表达质粒pET-28a-CaIFN-α2。将鉴定正确的表达质粒pET-28a-CaIFN-α2转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western bolt分析可见分子量约为23 kDa的目的蛋白,主要以包涵体的形式存在,表达量约占菌体总蛋白的52.5%。蛋白包涵体经变性、复性和纯化后,获得的重组CaIFN-α2纯度为92%。用犬肾细胞（MDCK）/水疱性口炎病毒（VSV）系统检测重组CaIFN-α2的抗病毒活性为3.16×106U/ml。本试验成功构建pET-28a-CaIFN-α2表达质粒,并在大肠杆菌中实现表达,表达的重组CaIFN-α2具有较好的抗病毒活性,为进一步研究新型犬用干扰素制品提供了依据。试验2、犬干扰素α2在昆虫细胞的表达与抗病毒活性测定本试验将合成的编码CaIFN-α2成熟蛋白基因插入pFastBacHTA载体,转化DH1OBac细胞。经过3次筛选纯化,获得重组穿梭质粒Bacmid-CaIFN-α2,并转染Sf 9细胞后收获重组杆状病毒rBac-CaIFN-α2。rBac-CaIFN-α2传至第3代后,用P3代rBac-CaIFN-α2感染Sf 9昆虫细胞3 d,收获昆虫细胞进行SDS-PAGE、IFA和Western blot分析CaIFN-α2的表达。IFA结果表明,CaIFN-α2可在昆虫细胞中表达,SDS-PAGE和Western blot均检测到25和28 kDa的表达产物。利用MDCK/VSV系统检测重组CaIFN-α2的抗病毒活性,表达的重组CaIFN-α2能够有效抑制VSV对MDCK细胞的攻击,细胞裂解物的抗病毒活性为5.58×105 U/mL。试验3、犬融合干扰素α2在昆虫细胞的表达将编码犬血清白蛋白（Alb）基因与CaIFN-α2成熟蛋白基因用柔性肽（GGGGS）连接,并在犬血清白蛋白基因N端接入蜂素信号肽基因（HBM）。将合成的融合基因HBM-Alb-CaIFN-α2插入pFastBacI载体,转化DH1OBac细胞。经过3次筛选纯化,获得重组穿梭质粒Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-α2,并转染Sf9细胞后获得重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2。重组杆状病毒传至第3代后,用P3代感染Sf 9昆虫细胞3 d,收获昆虫细胞进行SDS-PAGE、IFA和Western blot分析重组犬融合干扰素α2的表达。IFA结果表明,重组犬融合干扰素α2可在昆虫细胞表达;SDS-PAGE和Western blot均检测到上清培养物存在90 kDa的表达产物,表明获得分泌性表达,符合预期结果。用MDCK/VSV系统检测重组犬融合干扰素a2的抗病毒活性,表达的重组犬融合干扰素α2对MDCK细胞遭受VSV的攻击具有抑制作用,细胞培养上清的抗病毒活性为 1.78×104U/mL。
张德芳[5]（2017）在《重组干扰素α-2b合成研究进展》文中研究表明干扰素α-2b具有抗病毒、抗肿瘤、影响细胞分化和调节机体免疫功能等活性,临床上得到了广泛的应用。本文就干扰素α-2b的重组基因合成、发酵、蛋白表达的研究进展进行综述,同时探讨干扰素α-2b的长效化研究,展望干扰素α-2b的研究和应用方向。
马芳[6]（2013）在《卢氏鸡IFN-γ成熟蛋白基因的克隆与原核表达产物处理方法研究》文中认为干扰素具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等功能，可作为一种天然治疗剂和佐剂，鉴于目前尚未见到关于地方优良品种卢氏鸡IFN-γ的相关研究报道，本文对卢氏鸡IFN-γ成熟基因序列进行了克隆、基因遗传变异分析及原核表达，并通过超声波破碎法、超声波和溶菌酶联合使用法、高压匀浆法、高压匀浆和溶菌酶联合使用法等四种方法对卢氏鸡IFN-γ重组蛋白进行了提取，进而对不同方法的提取效果进行了研究，旨在为卢氏鸡IFN-γ今后的开发应用奠定理论基础。试验的主要内容包括：1.卢氏鸡IFN-γ成熟基因序列克隆、鉴定及表达结果分析应用RT-PCR技术扩增出卢氏鸡IFN-γ的完整序列，利用在线生物学软件预测其信号肽所在位置，从而设计卢氏鸡IFN-γ成熟蛋白基因序列引物。采用PCR技术进行卢氏鸡IFN-γ成熟蛋白基因序列的扩增，并将其克隆到PET-28a载体上，获得重组表达质粒（PET28a-IFN-γ），并将其转化入大肠杆菌BL21中，通过酶切、PCR、测序、SDS-PAGE进行结果鉴定。结果显示，鸡IFN-γ成熟蛋白基因片段克隆成功，约438bp；并在大肠杆菌BL21中成功表达，约22KDa。2.卢氏鸡IFN-γ与其他禽类IFN-γ的同源性分析将卢氏鸡IFN-γ成熟基因与其它禽类的IFN-γ基因进行了同源性分析，并绘制了系统进化树。结果表明，卢氏鸡IFN-γ与白莱航鸡、印度原鸡、原鸡的核苷酸序列同源性均为99.5%，与火鸡、雉鸡、鹌鹑的核苷酸序列的同源性分别为96.6%、95.2%、95.0%，与吐绶鸡的同源性为92.5%，与大雁、白色吐绶鸡、青铜吐绶鸡、珍珠鸡的同源性均为70.8%，与野鸽的同源性为31.5%。3.卢氏鸡IFN-γ四种提取方法获得的重组蛋白热原质、内毒素的测定结果分析通过动物发热试验结果可知，四种提取方法获得的鸡IFN-γ重组蛋白所含热原的限度均符合规定，超声波与溶菌酶联合作用组与其它方法组相比，试验动物的体温变化最小，说明该方法获得的重组蛋白所含热原质的量最低。通过凝胶法对内毒素含量进行测定，结果显示四种方法获得的鸡IFN-γ重组蛋白内毒素含量均不超过规定限值（10EU/mL），符合国家相关规定。4.鸡IFN-γ四种提取方法获得的重组蛋白对家禽生长和免疫器官指数的影响口服组和注射组中的五个试验组法氏囊指数、脾脏指数在免疫后0d21d之间不存在显着性差异；各试验组的胸腺指数的平均值在721d均高于对照组，并在21d时，超声波与溶菌酶联合作用组显着高于对照组，通过结果分析，可得知使鸡IFN-γ对法氏囊、脾脏的生长无影响，对胸腺的生长有促进作用。同时通过观察试验动物的生长情况，口服组、注射组的试验动物的精神状态、饮食情况、粪便、剖检、体重情况等与对照组没有明显的区别。5.鸡IFN-γ四种提取方法获得的重组蛋白对NDVⅣ系弱毒苗抗体水平影响的测定结果分析四种提取方法获得的重组蛋白分别采取口服和注射方式和NDVⅥ系弱毒苗联合使用，结果表明：口服组、注射组在免疫后7d各组之间的抗体滴度均高于对照组。说明鸡IFN-γ以包涵体的形式可以提高NDVⅥ系弱毒苗的免疫水平。
樊兴冬[7]（2013）在《犬α-干扰素基因的克隆、原核表达及生物学活性鉴定》文中研究说明随着一些人畜共患病的发生，尤其是一些具有高致死性病毒性疾病的发生以及病原新毒株、变异株的不断出现，使得人们越来越重视家畜的疾病防治。自1957年，Isaacs和Lindanmann发现干扰素（Interferon, IFN）以来，干扰素的分子结构、基因表达和生物学活性一直被人们所关注。干扰素是一族具有抗病毒、影响细胞生长、分化和调节免疫功能等活性的蛋白质。干扰素作为生物体内的第一病毒防御系统，一直是各种生物体内重要的细胞因子之一。大量研究表明，犬干扰素具有广谱抗病毒活性，抗增生和免疫调节功能。犬α-干扰素对犬的许多病毒性疾病都有治疗效果。生产实践之中，将犬干扰素作为疫苗佐剂，可以研制出免疫效果很好的新型疫苗，这将对犬病防治产生积极的作用。利用基因重组干扰素来防治家畜的病毒性疾病，是一种非常有效的手段。通过对犬α-干扰素成熟蛋白基因（以下简称犬α-干扰素基因）天然序列的分析，并参照天然犬干扰素基因-α，利用各种在线软件和免费软件分析，将犬α-干扰素基因去掉信号肽后设计并合成引物，引入两个酶切位点，利用PCR技术从犬肝脏基因组DNΑ中扩增犬α-干扰素基因，克隆至表达载体pBV220，转化大肠杆菌表达系统，进行重组表达载体的构建。实现了犬α-干扰素在大肠杆菌DH-5α中的高效表达，表达产物以包涵体形式存在，经过SDS-PAGE分析后，在约18.0kDa处出现了条带，其大小和理论值相符合。表达产物约占菌体总蛋白的32%。变性的包涵体经过Sephacryl S-200初步纯化后，经过优化的氧化还原体系，在4℃条件下，将变性的样品稀释到终浓度为100～200μg/mL的复性缓冲液之中复性。此种方法极大的提高了复性的收率和效率。复性之后的蛋白质经过DEAE-FF进一步纯化，得到了纯度为95%的纯化蛋白。纯化之后的蛋白，经过MDCK-VSV系统以细胞病变抑制法检测其活性，活性结果为5.56×106U/mg。
张海涛[8]（2012）在《重组人干扰素-α2b与内皮抑素肽融合蛋白抗肿瘤研究》文中提出人干扰素（Interferon）α2b是重要的肿瘤免疫治疗药物，在许多医院中作为一线的肿瘤治疗药物被广泛使用。己获美国FDA批准用于多种病毒性疾病和恶性肿瘤的治疗。然而，IFNα2b在临床治疗中需要大剂量长期给药，因此常常引发如急性和慢性毒性、神经系统损害和血液系统损害等明显的毒副作用，严重制约了其在临床上的广泛应用。人血管内皮抑素（Endostatin）是血管生成的抑制剂，在抑制肿瘤血管生成类药物中表现优秀，2009年被SFDA批准用于治疗肿瘤。经过大量的研究证实，人血管内皮抑素N末端的27个氨基酸是其核心功能区域。在内皮抑素N末端的27个氨基酸基础上进行氨基酸的替换和增补，引入串联的RGD（Arg-Gly-Asp）序列，形成内皮抑素多肽（29amino acid, EP29），在保持内皮抑素抑制肿瘤血管生成活性的同时，RGD序列赋予内皮抑素27肽靶向肿瘤血管内皮细胞、抑制肿瘤细胞生长与转移和增强其抗肿瘤活性的效果。实验室研究证实，EP29体外抗肿瘤活性明显高于天然内皮抑素，体内抗肿瘤活性也略高于天然内皮抑素，病理切片研究显示肿瘤组织大面积坏死，肿瘤萎缩。因此，有望成为新一代抗肿瘤小分子药物。在本研究中，我们采用基因工程技术，将EP29融合在IFNα2b的C末端形成IFNα2b-内皮抑素29个氨基酸多肽（IEP29）融合蛋白，在大肠杆菌中进行表达。期望该融合蛋白通过EP29的RGD序列与肿瘤新生血管内皮细胞的整合素αvβ3/αvβ5特异结合，使IEP29在肿瘤组织的新生血管处富集，既能针对性地发挥EP29抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤作用，又可以抑制整合素介导的新生血管形成，从而降低IFNα2b临床用药量，提高量效比。通过一系列的体内和体外实验分析证实，IEP29蛋白具有较高的生物活性，能够抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成，同时具有良好的肿瘤靶向性。因此，符合最初的设计，具有较高的临床应用开发价值，有望成为新一代抗肿瘤药物。研究具体内容如下：1. IEP29融合蛋白上游研究本实验采用DNA重组技术，成功构建含IEP29融合基因的原核表达载体pET3a-IEP29，将表达载体转染BL21工程菌，经IPTG诱导后以包涵体形式表达重组蛋白，表达量占菌体总蛋白的10%左右，重组蛋白条带能够和抗IFNα2b单克隆抗体特异性结合。重组工程菌使用5L的NBS发酵罐培养，收集菌体经裂解、包涵体洗涤、溶解变性和透析复性，最后经亲和层析和离子交换柱纯化获得纯度大于95%的重组蛋白，内毒素检测完全符合药典标准。为适应临床前试验研究的需要，我们优化了发酵和纯化工艺，并将发酵和纯化工艺放大至中试规模。采用NBS5L发酵罐连续培养三批工程菌，每批次收获湿菌体约150g，IEP29蛋白表达量约占总蛋白量的10%。纯化三批次IEP29蛋白，纯度均达到95%以上，蛋白产量为每批3050mg，生产规模基本达到中试要求。按照基因工程药物质量标准的要求对IEP29融合蛋白的理化性质、纯度、生物活性、内毒素含量和杂质残留等进行检测和控制。2. IEP29融合蛋白活性研究为了验证融合蛋白是否同时具有IFNα2b和EP29的生物活性，我们通过肿瘤细胞侵袭和肿瘤细胞生长抑制实验来验证融合蛋白体外活性。通过内皮细胞粘附实验来验证融合蛋白在体外与肿瘤特异的内皮细胞亲和能力。结果说明，在体外IEP29融合蛋白有效抑制肿瘤细胞繁殖和迁移，其能力明显高于IFNα2b和EP29，同时特异粘附于内皮细胞。3. IEP29融合蛋白抗肿瘤研究通过小鼠体内抑瘤实验、药物体内分布研究、肿瘤病理组织切片研究、鸡胚尿囊膜试验等，一方面研究和探讨IEP29融合蛋白在小鼠体内的抑瘤效果和间接证明药物的肿瘤靶向性。另一方面初步探讨融合蛋白抑制肿瘤生长的作用机理。结果显示IEP29的抗肿瘤效果比IFNα2b和EP29更加显着，有效抑制肿瘤血管生成，具有肿瘤靶向性。为了进一步研究IEP29是否保持着IFNα2b和EP29的生物学功能，我们进行了一系列的抗肿瘤研究，有助于揭示靶向性药物的作用途径，同时对融合蛋白药物的开发也具有指导意义。在抑瘤实验中，IEP29融合蛋白能明显减轻S180、H22和Lewis肿瘤细胞荷瘤裸鼠的瘤重，和对照组比具有显着性差别，并且具有明显的量效关系。IEP29融合蛋白组抑瘤率均明显高于同剂量的EP29组，且和同剂量IFNα2b组比较有显着性差别。体内分布试验显示，给药30min后IEP29在肿瘤组织的浓度是IFNα2b的5倍，给药1h后IEP29在肿瘤组织的浓度是IFNα2b的1.8倍，表明IEP29可以在小鼠肿瘤组织中有效聚集。在鸡胚绒毛尿囊膜实验中，EP29、IFNα2b和IEP29蛋白在不影响原有血管的前提下，均有一定程度的抑制新生血管的生长。EP29和IEP29抑制新生血管的能力明显强于IFNα2b。从结果可以看出对照组血管生长良好，毛细血管清晰可见，主血管粗壮，分支适中。IFNα2b组有部分毛细血管减少，但不明显。EP29组毛细血管数量部分减少，局部血管变模糊。而IEP29组的血管抑制较明显，许多毛细血管开始消失，大部分血管变模糊。综上所述，我们获得了IEP29蛋白，经过体内和体外实验研究证实IEP29融合蛋白与IFNα2b和EP29相比，是一种高效抗肿瘤新生血管形成和抑制肿瘤生长的药物，本研究结果为IEP29重组蛋白将来的工业化生产和临床研究奠定了基础。此外，建立了比较稳定的生产工艺流程，确定了优化的融合蛋白表达和纯化系统及质量控制标准。
王中安[9]（2012）在《利用大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重组人干扰素-α2b N端的起始甲硫氨酸》文中认为摘要目的获取大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶（reMAP）基因，构建重组大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶的原核高表达载体pACYCDuet-1-MAP，利用大肠杆菌BL21作为宿主菌进行原核表达，并利用表达的reMAP切除重组人干扰素-α2b（rhIFN-α2b）N末端的初始甲硫氨酸。方法提取大肠杆菌BL21基因组作为模板，用PCR方法扩增得到大肠杆菌MAP基因，并克隆到载体质粒pGEM-7zf（-）中，将重组质粒pGEM-7zf（-）-MAP转化感受态大肠杆菌DH5α，蓝-白斑筛选及测序验证正确后，将reMAP基因克隆至表达载体质粒pACYCDuet-1，Nco I/BamH I双酶切及PCR验证正确后，将重组表达质粒pACYCDuet-1-MAP转化至感受态大肠杆菌BL21中，筛选得到阳性克隆通过IPTG诱导进行可溶性表达，经SDS-PAGE和Westernblot分析及活性检测后，通过两种方法作用rhIFN-α2b：①将纯化后reMAP和rhIFN-α2b在体外适当的缓冲液中作用；②构建reMAP和rhIFN-α2b的共表达体系，实现在细胞内对rhIFN-α2b进行作用，并对两种作用方式的结果进行比较。结果Nco I/BamH I双酶切、PCR验证及测序结果表明重组表达质粒pACYCDuet-1-MAP构建成功；SDS-PAGE和Western blot分析结果表明reMAP和rhIFN-α2b均得到正确表达；酶活性检测结果表明reMAP具有水解N端甲硫氨酸的活性，切除MET的活性>30pmol/μg/min；两种方法作用后的rhIFN-α2b经氨基酸序列测定后显示N端起始甲硫氨酸均被切除，其中体内作用切除率＞94%、体外作用切除率＞96%。结论reMAP可以用于rhIFN-α2b N末端的初始甲硫氨酸的切除。
王中安,邹文艺,刘磊,范清林,宋礼华[10]（2012）在《利用大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重组人干扰素-α2b N端的起始甲硫氨酸》文中认为目的构建重组大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶（re-MAP）的原核表达体系,并利用表达的reMAP切除重组人干扰素-α2b（rhIFN-α2b）N末端的初始甲硫氨酸。方法将PCR扩增得到的大肠杆菌MAP基因克隆到表达载体质粒pACYCDuet-1中,并在宿主菌E.coli BL21中通过IPTG诱导进行可溶性表达,经SDS-PAGE和Western blot分析及活性检测后,通过两种方法作用rhIFN-α2b:①将纯化后reMAP和rhIFN-α2b在体外适当的缓冲液中作用;②构建reMAP和rhIFN-α2b的共表达体系,实现在细胞内对rhIFN-α2b进行作用,并对两种作用方式的结果进行比较。结果 reMAP和rhIFN-α2b均得到正确表达,酶活性检测结果表明reMAP具有水解N端甲硫氨酸的活性,两种方法作用后的rhIFN-α2b经氨基酸序列测定后显示N端起始甲硫氨酸均被切除,其中体内作用切除率>94%、体外作用切除率>96%。结论 reMAP可以用于rhIFN-α2b N末端的初始甲硫氨酸的切除。
二、按大肠杆菌高表达序列设计的人干扰素α-2b基因的化学合成和克隆（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、按大肠杆菌高表达序列设计的人干扰素α-2b基因的化学合成和克隆（论文提纲范文）
（1）表达猪圆环病毒2型Cap蛋白稳转CHO细胞系的建立及免疫增强剂的开发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1 PCV2的研究进展 |
| 1.1 PCV2的基因组结构 |
| 1.2 PCV2疫苗研究现状 |
| 1.2.1 减毒疫苗和灭活疫苗 |
| 1.2.2 亚单位疫苗 |
| 1.2.2.1 DNA疫苗 |
| 1.2.2.2 嵌合PCV1-2疫苗 |
| 1.3 PCV2作用机制 |
| 2 CHO细胞表达系统简介 |
| 3 脑膜炎球菌外膜蛋白PorB免疫增强作用 |
| 3.1 脑膜炎球菌外膜蛋白PorB的结构 |
| 3.2 外膜蛋白PorB免疫增强作用 |
| 第二章 研究方案设计 |
| 1 研究目的及意义 |
| 2 研究内容 |
| 3 技术路线 |
| 第三章 CHO细胞高效表达体系的建立 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂耗材 |
| 2.3 相关实验试剂的制备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 CMV和 CAG启动子的筛选 |
| 3.1.1 pcDNA3.1-Luc、pcDNA3.1-CAG-Luc重组载体的构建 |
| 3.1.1.1 目的基因的扩增 |
| 3.1.1.2 目的基因的酶切与连接 |
| 3.1.1.3 连接产物的转化 |
| 3.1.1.4 重组质粒的鉴定 |
| 3.1.1.5 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.1.2 CHO-K1细胞的复苏、培养及冻存 |
| 3.1.3 重组质粒的提取和转染 |
| 3.1.3.1 无内毒素重组质粒的提取 |
| 3.1.3.2 重组质粒转染CHO-K1细胞 |
| 3.1.4 蛋白表达的鉴定 |
| 3.2 信号肽的筛选 |
| 3.2.1 含有5 种不同信号肽的pcDNA3.1-CAG-SPX-Luc重组载体的构建 |
| 3.2.1.1 基因序列及相关引物设计与合成 |
| 3.2.1.2 目的基因的酶切与连接 |
| 3.2.1.3 连接产物的转化 |
| 3.2.1.4 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.2.1.5 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒转染CHO-K1细胞 |
| 3.2.2.1 无内毒素重组质粒的提取 |
| 3.2.2.2 重组质粒转染CHO-K1细胞 |
| 3.2.3 鉴定Luc蛋白表达的情况 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 含CMV和 CAG启动子的重组表达载体的鉴定 |
| 4.1.1 pcDNA3.1-Luc、pcDNA3.1-CAG-Luc重组表达载体的鉴定 |
| 4.1.2 检测Luc蛋白的表达 |
| 4.2 含有5 种不同信号肽重组表达载体pcDNA3.1-CAG-SPX-Luc的相关鉴定 |
| 4.2.1 5 种不同信号肽pcDNA3.1-CAG-SPX-Luc重组表达载体的鉴定 |
| 4.2.2 检测Luc蛋白的表达 |
| 5 讨论 |
| 第四章 稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白CHO细胞的建立 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 pcDNA3.1-CAG-SP4-Cap真核表达载体的构建 |
| 3.1.1 基因序列及相关引物设计与合成 |
| 3.1.2 目的基因的酶切与连接 |
| 3.1.3 连接产物的转化 |
| 3.1.4 重组质粒的鉴定 |
| 3.1.5 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.2 无内毒素重组质粒的提取 |
| 3.3 筛选稳定表达的单克隆细胞株 |
| 3.3.1 用G418方法筛选细胞株 |
| 3.3.1.1 确定CHO-K1细胞中G418最佳筛选浓度 |
| 3.3.1.2 重组质粒转染CHO-K1细胞 |
| 3.3.1.3 单克隆细胞株筛选 |
| 3.3.2 Western bloting检测Cap蛋白表达 |
| 3.3.3 CHO-K1 细胞的总RNA提取及反转录 |
| 3.3.3.1 从细胞提取总RNA |
| 3.3.3.2 RT-PCR |
| 3.3.4 MTT检测单克隆细胞株的活力 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 pcDNA3.1-CAG-SP4-Cap重组表达载体的相关鉴定 |
| 4.1.1 PCR扩增产物鉴定 |
| 4.1.2 重组质粒的相关鉴定 |
| 4.2 Cap蛋白表达的鉴定及分析 |
| 4.2.1 CHO-K1细胞G418最佳筛选浓度确定 |
| 4.2.2 重组质粒转染CHO-K1 细胞后Cap蛋白的表达鉴定 |
| 4.2.3 CHO-K1 细胞总RNA提取及PCR鉴定 |
| 4.3 筛选高表达的单克隆细胞株 |
| 4.3.1 筛选单克隆细胞株 |
| 4.3.2 筛选后阳性细胞增殖检测 |
| 4.3.3 重组Cap蛋白的纯化 |
| 5 讨论 |
| 第五章 脑膜炎球菌外膜蛋白PorB免疫增强作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验材料、试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 试剂耗材 |
| 2.1.3 相关实验试剂的制备 |
| 2.2 基因序列及相关引物设计与合成 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 PorB重组表达质粒的构建 |
| 3.1.1 目的基因的扩增 |
| 3.1.2 目的基因的酶切与连接 |
| 3.1.3 连接产物的转化 |
| 3.1.4 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.1.5 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.2 PorB蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.3 PorB蛋白表达的鉴定 |
| 3.4 小鼠免疫实验分析 |
| 3.4.1 BALB/c小鼠的免疫 |
| 3.4.2 淋巴细胞增殖试验 |
| 3.4.3 特异性抗体检测 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 重组表达载体的鉴定 |
| 4.2 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 4.3 不同剂量PorB蛋白在动物体内对Cap蛋白的免疫效应 |
| 4.3.1 特异性抗体的检测 |
| 4.3.2 淋巴细胞增殖水平检测 |
| 4.4 PorB蛋白在动物体内对Mhp的免疫作用 |
| 4.4.1 特异性抗体的检测 |
| 4.4.2 淋巴细胞增殖水平检测 |
| 5 讨论 |
| 第六章 PCV2 Cap蛋白免疫原性分析 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂耗材与相关实验试剂的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂耗材 |
| 2.3 相关实验试剂的制备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 免疫样品的制备 |
| 3.2 小鼠免疫实验分析 |
| 3.2.1 BALB/c小鼠的分组和免疫 |
| 3.2.2 免疫小鼠的血清滴度检测 |
| 3.2.3 脾淋巴细胞增殖实验 |
| 4 结果分析 |
| 4.1 特异性抗体的检测 |
| 4.2 淋巴细胞增殖水平检测 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间学术成果 |
| 致谢 |
（2）人源多肽：N-乙酰氨基半乳糖基转移酶ppGalNAc-Ts的原核表达及体外合成O-糖基化修饰的白介素-2（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质糖基化修饰对重组蛋白药物的影响 |
| 1.2 蛋白质O-GalNAc糖基化修饰及ppGalNAc-T酶 |
| 1.3 重组治疗性蛋白药物表达系统综述 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.2 酵母表达系统 |
| 1.3.3 昆虫细胞表达系统 |
| 1.3.4 哺乳动物细胞表达系统 |
| 1.3.5 总结 |
| 1.4 本课题的研究内容以及研究意义 |
| 第二章 人源多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶ppGalNAc-T的大肠杆菌表达方法构建及条件优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 ppGalNAc-T酶家族序列结构、二硫键及糖基化修饰分析 |
| 2.3.2 在Rosetta大肠杆菌中表达ppGalNAc-T2酶 |
| 2.3.3 四种ppGalNAc-T2 酶表达方法筛选 |
| 2.3.4 PDI对大肠杆菌中ppGalNAc-T2 酶表达的影响 |
| 2.3.5 大肠杆菌表达ppGalNAc-T2 酶的条件优化 |
| 2.4 本章小结与讨论 |
| 第三章 大肠杆菌和HEK293T细胞表达的ppGalNAc-T酶结构及功能比较 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 E.coli-T2和293T-T2 酶活及酶动力学参数比较 |
| 3.3.2 E.coli-T2和293T-T2 二级结构比较 |
| 3.3.3 E.coli-T2和293T-T2 底物选择性比较 |
| 3.3.4 O-糖基化修饰对ppGalNAc-T2 酶活及二级结构影响 |
| 3.3.5 在大肠杆菌中表达ppGalNAc-T1和ppGalNAc-T13 |
| 3.3.6 E. coli-T1和E. coli-T13 二级结构检测 |
| 3.4 本章小结与讨论 |
| 第四章 体外酶法合成O-糖基化修饰的白介素-2 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 白介素-2 结构及ppGalNAc-T酶对白介素-2 糖基化偏好性分析 |
| 4.3.2 在大肠杆菌中表达白介素-2 |
| 4.3.3 使用E.coli-T2/T1 体外酶法合成O-GalNAc修饰的白介素-2 |
| 4.4 本章小结与讨论 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 本论文的创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
（3）改造和优化人干扰素α-2b基因序列并在大肠杆菌中做表达验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 干扰素简介 |
| 1.2 基因工程菌-大肠杆菌 |
| 1.3 影响外源基因表达的因素 |
| 1.4 SD序列对基因表达的影响 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 第二章 人干扰素α-2b基因的改造和优化 |
| 2.1 大肠杆菌编码序列与基因表达的关系 |
| 2.2 基因序列设计 |
| 2.2.1 人干扰素α-2b蛋白的氨基酸序列 |
| 2.2.2 编码序列的改造方法 |
| 2.2.3 SD序列的选取 |
| 2.3 完整基因序列的构建 |
| 第三章 材料与方法 |
| 3.1 常用仪器与设备 |
| 3.2 质粒与菌株 |
| 3.2.1 克隆载体pGM-T |
| 3.2.2 表达载体pET-28a(+) |
| 3.2.3 大肠杆菌菌株 |
| 3.3 其它试剂及工具酶 |
| 3.4 引物设计 |
| 3.5 常用溶液 |
| 3.6 实验方法 |
| 3.6.1 微生物学技术 |
| 3.6.2 分子生物学方法 |
| 3.6.3 重组质粒构建 |
| 第四章 基因克隆 |
| 4.1 目的序列与克隆载体的连接 |
| 4.2 连接产物的转化 |
| 4.3 人干扰素α-2b在克隆载体中的表达及检测 |
| 4.4 ELISA法测人干扰素α-2b表达量 |
| 4.5 表达量的显着性检验 |
| 第五章 基因表达 |
| 5.1 表达载体的构建 |
| 5.1.1 目的DNA片段的回收 |
| 5.1.2 表达载体pET-28a(+)的酶切及回收 |
| 5.1.3 目的DNA片段和表达载体的连接 |
| 5.2 人干扰素α-2b在表达载体中的表达及鉴定 |
| 5.3 表达检测 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）犬干扰素α2的克隆表达与抗病毒活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 绪论 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 干扰素的研究进展与应用 |
| 1 干扰素的起源与生物进化 |
| 2 干扰素的分类与分布 |
| 3 干扰素的诱导产生及机理 |
| 3.1 干扰素诱导剂及诱导产生 |
| 3.2 干扰素的产生机理 |
| 4 干扰素作用的信号转导通路 |
| 5 犬干扰素研究进展 |
| 5.1 犬干扰素分类与特点 |
| 5.2 重组犬干扰素研究现状 |
| 6 干扰素在犬病治疗中的应用 |
| 6.1 干扰素的抗肿瘤作用 |
| 6.2 干扰素的抗病毒作用 |
| 6.3 干扰素的免疫调节作用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第二章 犬干扰素α2在大肠杆菌的表达与抗病毒活性分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 菌株、载体、病毒及细胞 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 成熟CaIFN-α2基因的设计与合成 |
| 2.2 成熟CaIFN-α2基因的扩增 |
| 2.3 重组表达质粒pET-28a-CaIFN-α2的构建 |
| 2.4 重组CaIFN-α2的表达与鉴定 |
| 2.5 重组CaIFN-α2表达条件的优化 |
| 2.6 重组CaIFN-α2包涵体的变性、复性及纯化 |
| 2.7 重组CaIFN-α2的抗病毒活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 成熟CaIFN-α2的扩增 |
| 3.2 重组表达质粒(pET-28a-CaIFN-α2)的鉴定 |
| 3.3 重组CaIFN-α2的表达分析 |
| 3.4 重组CaIFN-α2的可溶性分析 |
| 3.5 重组CaIFN-α2的Western blot检测 |
| 3.6 诱导表达条件的优化 |
| 3.7 重组CaIFN-α2的纯化 |
| 3.8 重组CaIFN-α2的抗病毒活性分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 犬干扰素α2在昆虫细胞的表达与抗病毒活性测定 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 菌株、载体、病毒及细胞 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 成熟CaIFN-α2基因的获得 |
| 2.2 重组转移质粒pFastBacHTA-CaIFN-α2的构建 |
| 2.3 重组转移质粒pFastBacHTA-CaIFN-α2的筛选与鉴定 |
| 2.4 重组穿梭质粒Bacmid-CaIFN-α2的构建与鉴定 |
| 2.5 重组杆状病毒rBac-CaIFN-α2的构建与鉴定 |
| 2.6 重组CaIFN-α2在Sf9昆虫细胞中的表达与检测 |
| 2.7 重组CaIFN-α2的抗病毒活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 转移载体pFastBacHTA-CaIFN-α2的构建 |
| 3.2 重组穿梭载体Bacmid-CaIFN-α2的构建 |
| 3.3 转染Sf9昆虫细胞后的病变情况 |
| 3.4 重组杆状病毒rBac-CaIFN-α2的获得与鉴定 |
| 3.5 重组CaIFN-α2在Sf9细胞中表达的SDS-PAGE分析 |
| 3.6 重组CaIFN-α2的Western blot鉴定 |
| 3.7 间接免疫荧光(IFA)检测重组CaIFN-α2的表达 |
| 3.8 重组CaIFN-a2的抗病毒活性测定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 犬融合干扰素α2在昆虫细胞的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 菌株、载体、病毒及细胞 |
| 1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2 方法 |
| 2.1 融合基因HBM-Alb-CaIFN-α2的设计与获得 |
| 2.2 重组转移质粒pFastBacI-HBM-Alb-CaIFN-a2的筛选与鉴定 |
| 2.3 重组穿梭质粒Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-a2的构建与鉴定 |
| 2.4 重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-a2的构建与鉴定 |
| 2.5 重组HBM-Alb-CaIFN-α2在Sf9昆虫细胞的表达与检测 |
| 2.6 重组HBM-Alb-CaIFN-α2的抗病毒活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 转移载体pFastBacI-HBM-Alb-CaIFN-α2的鉴定 |
| 3.2 重组穿梭载体Bacmid-HBM-Alb-CaIFN-α2的构建 |
| 3.3 转染Sf9昆虫细胞后的病变情况 |
| 3.4 重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2的获得与鉴定 |
| 3.5 间接免疫荧光(IFA)检测重组融合CaIFN-α2的表达 |
| 3.6 SDS-PAGE分析 |
| 3.7 重组融合CaIFN-α2的Western blot鉴定 |
| 3.8 重组融合CaIFN-α2的抗病毒活性测定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录: 常用试剂的配制 |
| 致谢 |
（5）重组干扰素α-2b合成研究进展（论文提纲范文）
| 1 以大肠杆菌为宿主菌表达干扰素α-2b进展 |
| 2 以酵母菌为宿主菌表达干扰素α-2b进展 |
| 3 干扰素α-2b长效化进展 |
| 4 展望 |
（6）卢氏鸡IFN-γ成熟蛋白基因的克隆与原核表达产物处理方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 干扰素 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 干扰素的生物学功能 |
| 1.2 鸡 IFN-γ的研究进展 |
| 1.2.1 鸡 IFN-γ的理化性质及来源 |
| 1.2.2 鸡 IFN-γ的基因结构 |
| 1.2.3 鸡 IFN-γ的功能 |
| 1.2.4 鸡 IFN-γ基因的研究进展 |
| 1.3 基因工程 IFN 的研究进展 |
| 1.3.1 关于干扰素基因序列的改造 |
| 1.3.2 关于干扰素基因表达产物提取方法的研究 |
| 1.3.3 关于原核表达条件的筛选 |
| 1.3.4 关于原核表达产物制备方法的研究 |
| 1.3.5 关于规模生产工艺的研究 |
| 1.4 目的与意义 |
| 第2章 卢氏鸡 IFN-γ成熟蛋白基因的克隆、鉴定及表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、载体、鸡胚及疫苗 |
| 2.1.2 试验试剂、酶、仪器和实验动物 |
| 2.1.3 试验相关试剂的配制 |
| 2.1.4 主要的仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 大肠杆菌 BL21、JM109 感受态的制备（CaCl2法） |
| 2.2.3 卢氏鸡 IFN-γ基因的诱导转录 |
| 2.2.4 总 RNA 的提取 |
| 2.2.5 RT-PCR 及 PCR |
| 2.2.6 PCR 产物的回收与纯化 |
| 2.2.7 IFN-γ全基因与 pMD18-T 载体连接、转化 |
| 2.2.8 质粒的提取 |
| 2.2.9 重组质粒（pMD18T-IFN-γ）的 PCR 鉴定 |
| 2.2.10 PCR 产物与 PET28a 载体的酶切及其产物的回收 |
| 2.2.11 PCR 产物与 PET28a 载体的连接与转化 |
| 2.2.12 重组质粒（PET28a-IFN-γ）的 PCR 鉴定及酶切鉴定 |
| 2.2.13 重组质粒的测序 |
| 2.2.14 IFN-γ成熟蛋白的诱导表达 |
| 2.2.15 同源性分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 RT-PCR 扩增结果 |
| 2.3.2 重组 pMD18T-IFN-γ质粒的鉴定 |
| 2.3.3 卢氏鸡 IFN-γ去信号肽序列的 PCR 扩增结果 |
| 2.3.4 重组质粒(PET28a-IFN-γ)的 PCR 及酶切鉴定结果 |
| 2.3.5 测序结果与分析 |
| 2.3.6 SDS-PAGE 电泳鉴定结果 |
| 2.3.7 卢氏鸡 IFN-γ基因与其他禽类核苷酸序列的比较 |
| 2.3.8 IFN-γ基因遗传进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 鸡 IFN-γ重组蛋白不同提取方法的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验所用的主要试剂 |
| 3.1.2 相关试剂的配制 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 试验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 鸡 IFN-γ重组蛋白的四种不同提取方法 |
| 3.2.2 四种提取方法获得的重组蛋白含量的测定 |
| 3.2.3 四种提取方法获得的重组蛋白热原质、内毒素的测定 |
| 3.2.4 四种提取方法获得的重组蛋白对免疫器官指数的影响 |
| 3.2.5 四种提取方法获得的重组蛋白对 NDVⅣ系弱毒苗免疫后抗体水平的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 四种提取方法提取的蛋白含量的测定结果 |
| 3.3.2 四种提取方法获得的重组蛋白热原质、内毒素的测定结果 |
| 3.3.3 四种提取方法获得的重组蛋白对家禽生长和免疫器官指数的影响 |
| 3.3.4 四种提取方法获得的重组蛋白对 NDVⅣ系弱毒苗免疫后抗体水平测定结果 |
| 3.3.5 四种提取方法在工业化生产中的可操作性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 展望 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
（7）犬α-干扰素基因的克隆、原核表达及生物学活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1、绪论 |
| 1.1 干扰素分类及干扰素系统生物进化 |
| 1.1.1 干扰素分类 |
| 1.1.2 干扰素系统生物进化及其功能 |
| 1.2 干扰素的产生条件 |
| 1.3 犬干扰素分子生物学特性 |
| 1.3.1 干扰素的理化特性 |
| 1.3.2 犬α-干扰素的结构特点 |
| 1.3.3 犬干扰素受体 |
| 1.3.4 犬干扰素的信号传递信息途径 |
| 1.4 干扰素生物学功能及其作用机制 |
| 1.4.1 抗病毒功能 |
| 1.4.2. 干扰素的免疫调节作用 |
| 1.4.3 干扰素的抗肿瘤作用 |
| 1.4.4 干扰素其他作用 |
| 1.5 基因工程干扰素的研究进展 |
| 1.5.1 对干扰素表达系统的改造 |
| 1.5.2 对干扰素基因序列的改变 |
| 1.5.3 对干扰素生产工艺的改进 |
| 1.5.4 为了提高干扰素的效用而进行的研究 |
| 1.6 重组犬干扰素的研究现状 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌和病毒 |
| 2.1.2 试剂盒和生化试剂 |
| 2.1.3 软件和网站 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 犬肝脏组织基因组的提取 |
| 2.2.3 扩增犬肝脏细胞基因组的 DNA |
| 2.2.4 犬α-干扰素基因的克隆及鉴定 |
| 2.2.5 犬α-干扰素基因的序列分析 |
| 2.2.6 重组表达载体 pBV220-CaIFN-α的构建及转化 |
| 2.2.7 犬α-干扰素蛋白原核表达和表达条件优化 |
| 2.2.8 包涵体的提取及蛋白质变性 |
| 2.2.9 蛋白的复性和纯化 |
| 2.2.10 生物学活性的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 犬α-干扰素基因的扩增结果 |
| 3.2 阳性重组质粒的鉴定结果 |
| 3.3 IFN-α基因序列比较及进化分析 |
| 3.4 犬α-干扰素的表达及条件优化 |
| 3.4.1 诱导时间的条件优化 |
| 3.4.2 宿主菌的优化结果 |
| 3.4.3 阳性工程菌的诱导表达结果 |
| 3.4.4 包涵体的提取结果 |
| 3.5 蛋白的初步纯化和复性 |
| 3.5.1 蛋白质的初步纯化 |
| 3.5.2 蛋白的复性 |
| 3.6 重组犬α-干扰素的活性测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 犬α-干扰素的研究 |
| 4.2 干扰素-α基因的表达及条件优化 |
| 4.3 包涵体的提取和蛋白质的变性 |
| 4.4 蛋白的复性 |
| 4.4.1 氧化还原体系的选择 |
| 4.4.2 复性温度和蛋白浓度的选择 |
| 4.5 蛋白质的纯化 |
| 4.6 复性后蛋白活性测定 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（8）重组人干扰素-α2b与内皮抑素肽融合蛋白抗肿瘤研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肿瘤及其治疗方法研究进展 |
| 1.1.1 肿瘤 |
| 1.1.2 肿瘤研究现状 |
| 1.1.3 肿瘤的治疗 |
| 1.2 肿瘤免疫治疗 |
| 1.2.1 干扰素肿瘤免疫治疗 |
| 1.2.2 干扰素 alpha 的理化性质 |
| 1.2.3 IFN 作用的受体及信号通路 |
| 1.2.4 IFN 抗肿瘤作用机理 |
| 1.2.5 IFN 抗肿瘤的临床应用 |
| 1.2.6 新型 IFN 的研究 |
| 1.2.7 问题与展望 |
| 1.3 抑制肿瘤血管生成 |
| 1.3.1 血管生成与肿瘤的发生和发展 |
| 1.3.2 肿瘤血管生成和调控 |
| 1.3.3 抑制肿瘤血管生成药物 |
| 1.3.4 肿瘤血管生成抑制疗法的优势 |
| 1.3.5 抗肿瘤血管生成治疗面临的问题与展望 |
| 1.4 内皮抑素 |
| 1.4.1 内皮抑素及其结构特性 |
| 1.4.2 血管内皮抑素的作用机制 |
| 1.4.3 内皮抑素抑制肿瘤研究 |
| 1.4.4 内皮抑素 27 肽 |
| 1.4.5 内皮抑素的问题与展望 |
| 1.5 RGD、整合素与肿瘤生长转移 |
| 1.5.1 RGD、整合素家族概述 |
| 1.5.2 肿瘤血管生成与整合素 |
| 1.5.3 整合素与肿瘤生长和转移 |
| 1.5.4 RGD 肽在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.6 内皮抑素 29 个氨基酸多肽 |
| 1.7 IEP29 融合蛋白 |
| 1.8 研究的目的和意义 |
| 1.9 研究的技术路线 |
| 第二章 IEP29 融合蛋白载体构建与表达 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 IEP29 融合蛋白基因的克隆 |
| 2.1.2 表达载体的提取、酶切和纯化 |
| 2.1.3 感受态菌的制备 |
| 2.1.4 目的基因与载体的连接和转化 |
| 2.1.5 重组蛋白的表达 |
| 2.1.6 鉴定表达产物 |
| 2.1.7 目的蛋白的纯化和鉴定 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组质粒 pET3a-IEP29 的构建 |
| 2.2.2 融合蛋白的表达和鉴定 |
| 2.2.3 融合蛋白的初步纯化 |
| 2.2.4 等电点分析 |
| 2.2.5 融合蛋白肽图 HPLC 分析 |
| 2.2.6 菌种稳定性的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 IEP29 蛋白抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 细胞的培养 |
| 3.1.2 肿瘤细胞生长抑制实验 |
| 3.1.3 MTT 比色实验 |
| 3.1.4 肿瘤细胞侵袭实验 |
| 3.1.5 内皮细胞粘附实验(Endothelial Attachment Assay) |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 肿瘤细胞抑制实验 |
| 3.2.2 内皮细胞粘附实验 |
| 3.2.3 肿瘤细胞侵袭实验 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 IEP29 蛋白抗肿瘤机理研究 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 鸡胚绒毛尿囊膜实验(Chickchorioallantoicmembrane, CAM) |
| 4.1.2 小鼠体内抑瘤实验 |
| 4.1.3 药物体内分布实验 |
| 4.1.4 肿瘤病理组织切片研究 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 鸡胚绒毛尿囊膜实验 |
| 4.2.2 肿瘤抑制实验 |
| 4.2.3 融合蛋白组织分布特点 |
| 4.2.4 肿瘤组织切片研究 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文及成果 |
| 致谢 |
（9）利用大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重组人干扰素-α2b N端的起始甲硫氨酸（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、按大肠杆菌高表达序列设计的人干扰素α-2b基因的化学合成和克隆（论文参考文献）
- [1]表达猪圆环病毒2型Cap蛋白稳转CHO细胞系的建立及免疫增强剂的开发[D]. 杨瑞. 浙江理工大学, 2020
- [2]人源多肽：N-乙酰氨基半乳糖基转移酶ppGalNAc-Ts的原核表达及体外合成O-糖基化修饰的白介素-2[D]. 梁涛. 上海交通大学, 2020(01)
- [3]改造和优化人干扰素α-2b基因序列并在大肠杆菌中做表达验证[D]. 于荣荣. 内蒙古大学, 2019(09)
- [4]犬干扰素α2的克隆表达与抗病毒活性分析[D]. 姚凌云. 南京农业大学, 2018(07)
- [5]重组干扰素α-2b合成研究进展[J]. 张德芳. 海峡药学, 2017(07)
- [6]卢氏鸡IFN-γ成熟蛋白基因的克隆与原核表达产物处理方法研究[D]. 马芳. 河南科技大学, 2013(06)
- [7]犬α-干扰素基因的克隆、原核表达及生物学活性鉴定[D]. 樊兴冬. 齐齐哈尔大学, 2013(01)
- [8]重组人干扰素-α2b与内皮抑素肽融合蛋白抗肿瘤研究[D]. 张海涛. 哈尔滨师范大学, 2012(09)
- [9]利用大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重组人干扰素-α2b N端的起始甲硫氨酸[D]. 王中安. 安徽医科大学, 2012(01)
- [10]利用大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶去除重组人干扰素-α2b N端的起始甲硫氨酸[J]. 王中安,邹文艺,刘磊,范清林,宋礼华. 安徽医科大学学报, 2012(03)
标签：干扰素论文; 重组人干扰素α-2b凝胶论文; 重组蛋白论文; 大肠杆菌论文; 基因合成论文;