一、双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌（论文文献综述）
钟宜科[1]（2020）在《基于HAND系统15种食源性致病菌多重实时PCR检测方法的建立》文中进行了进一步梳理近年来,食源性疾病的发病率居高不下,在全世界范围内都是一个日益严重的公共卫生问题。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）统计显示由病原微生物引起的食源性疾病比例达50%以上,因此急需建立一种有效的食源性致病菌检测方法。传统的食源性病原体检测和鉴定方法费时费力,不足以满足食品快速检测的要求。为阻止疾病的传播、监控食品的卫生安全,保障人民的安全,急需建立一种快速、简单和有效的检测技术。本文将肠粘附性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌、结肠弯曲菌、空肠弯曲菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌、类志贺邻单胞菌、嗜水气单胞菌和福氏志贺氏菌为模式菌株,建立一种快速检测15种食源性致病菌的多重实时PCR技术。主要研究结果如下:（1）通过HAND系统建立了一种能够同时检测15种食源性致病菌多重实时PCR方法,具有特异性高、灵敏度好、重复性和稳定性高等特点,并且适用于复杂样本的检测;（2）通过玻璃化技术,将多重实时PCR中热不稳定成分（Taq酶、dNTP、染料和引物）玻璃化到PCR管盖上。实验表明,试剂的活性不受玻璃化的影响实验,并且被玻璃化成分高度稳定,能够在室温（25℃）下保存12年,从而克服了冷链运输和低温储存的局限性;（3）针对复杂样本的快速提取,研制了一种以Chelex-100和TritonX-100为主要裂解成分的核酸提取液,评价其对15种食源性致病菌核酸提取的效果,结果显示只需要在90℃裂解10 min,即可适用于荧光定量PCR检测技术,具有操作简便、裂解效果好、不影响后续反应的特点,且不受粪便和食品等复杂样本的影响。综上所述,本研究通过HAND系统与玻璃化技术相结合建立了一种能够同时检测15种食源性致病菌快速检测方法,具有良好的特异性与敏感性,解决了样本核酸提取和加样繁琐、复杂以及试剂在非低温环境下易失活的问题。
凌娇[2]（2018）在《副溶血弧菌qPCR检测及T6SS-1效应因子的筛选和功能研究》文中研究指明副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae,Vc）均属于革兰氏阴性菌,是引起食源性胃肠炎或败血症的重要病原体。它们广泛分布于河口、沿海水域及沉积物,随着海产品消售量日益增加,建立一种能同时检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的快速准确的检测方法至关重要。致病性副溶血弧菌公认的毒力因子为耐热稳定性直接溶血素（TDH）与TDH相关溶血素（TRH）。近几年发现的VⅥ型分泌系统（T6SS）广泛存在于革兰氏阴性细菌中,在细菌的生存及致病性上起着非常重要的作用。由T6SS递送的多种蛋白质,被称为“效应因子”,现在已被鉴定并在靶细胞中呈现各种毒性活性。本研究首次建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌（toxR）和霍乱弧菌（ompW）的双重荧光定量PCR方法,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。采用超滤管浓缩法、Label-free蛋白组学分析及Western-blot技术,从野生株SH112和双缺失株△vipA1-hcp1中成功筛选并鉴定分泌蛋白VP0837和VP0285均属于副溶血弧菌T6SS-1的效应因子。此外,通过对效应蛋白VP0837基因缺失株生物学特性和致病性分析,表明T6SS-1在副溶血弧菌的致病过程中扮演着重要的角色。试验Ⅰ 副溶血弧菌与霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与探针。结果表明:此方法对这两种菌的最低检测限均达到10CFU/mL,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌（如:大肠杆菌0157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌）均无交叉反应;重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品并及时检测,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/mL和50 CFU/mL,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/mL和50 CFU/mL。两种细菌在虾肉中富集2h后的最低检出限均为1 CFU/mL。结论:本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点,包括DNA提取的整个检测过程可在1～3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效方法。试验Ⅱ 副溶血弧菌T6SS-1效应蛋白的筛选与鉴定为初步筛选、鉴定副溶血弧菌T6SS-1效应蛋白。基于本实验室前期研究成果,采用超滤管浓缩法分别提取副溶血弧菌野生株SH112和△vipA1-hcp1双缺失株的分泌蛋白。蛋白酶解后用于LC-MS/MS检测,将所筛选的蛋白进行基因本体注释（GO）分析和LFQ（Label Free Quantitation）分析。另外,选取两种分泌蛋白VP0837和VP0285进行原核表达,制备多克隆抗体,并采用Western-blot方法对提取的分泌蛋白进行鉴定。结果显示:利用LC-MS/MS方法成功鉴定了 52个差异蛋白质,其中在△vipA1-hcp1中下调的蛋白有36个,上调的有16个;GO结果表明所鉴定的蛋白主要参与代谢作用、生物学定位、信号分子、氧化还原、生物学结合等过程。Western-blot表明,鼠抗VP0837和VP0285的血清均能特异性识别副溶血弧菌野生株SH112的上清蛋白,而未能识别双缺失株△vipA1-hcp1的上清蛋白;表明分泌蛋白VP0837和VP0285均属于副溶血弧菌T6SS-1的效应蛋白,并且对T6SS-1的分泌功能起着重要作用。本试验结果为进一步研究VP0837和VP0285蛋白功能及副溶血弧菌快速检测方法奠定了基础。试验Ⅲ 副溶血弧菌T6SS-1效应蛋白VP0837基因缺失株的构建及致病性分析本试验旨在研究T6SS-1在副溶血孤菌生物学特性和致病性中发挥的作用,以T6SS-1分泌蛋白VP0837为研究对象,构建副溶血弧菌SH112株vp0837基因缺失株和互补株。通过分析各菌株的生长特性、运动性、生物被膜形成能力的差异;比较缺失株对细胞黏附入侵与毒性、细胞炎性因子转录水平的差异以及对小鼠致死率的影响。试验结果显示:与野生株相比,缺失株△vp0837与互补株C△vp0837的生长速度和生物被膜形成能力均差异不显着;△vp0837对Caco-2细胞的毒性、黏附与入侵作用明显降低,而使Caco-2细胞炎性因子IL-1β和IL-6表达显着上调;对ICR小鼠的致死率显着下降。上述结果提示副溶血弧菌T6SS-1中分泌蛋白vp0837基因不仅参与了对宿主的细胞毒力和致炎性等致病过程,而且对鼠死亡率也发挥着明显的作用,充分说明vp0837基因在副溶血弧菌的感染致病过程中扮演重要的角色。
王义涛[3]（2018）在《威海地区食源性细菌的分布及病原性海洋弧菌多重降落PCR方法的建立》文中研究指明背景与目的:海洋性弧菌广泛分布于内湾、沿岸、外洋水域、海洋生物体和沉积物中,能够感染鱼类或哺乳动物,并可在人群中引起食物中毒。不少弧菌会导致人或其他动物发病,以霍乱弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌致病力最强。随着海产品消费的不断增多,因海产品传播的细菌性疾病发生范围和频率也逐渐增大。常规的海洋弧菌检测方法即培养法不能满足快速诊断的需要,且某些海洋性弧菌培养困难,因此建立病原性海洋弧菌的快速检测技术,对病原性海洋性弧菌感染的诊断、治疗和维护公共健康具有重要意义。本研究旨在了解威海地区食源性疾病中致病菌的分布情况,建立一种可以同时检测临床标本中创伤弧菌及副溶血性弧菌的多重降落PCR方法,为临床快速诊断创伤弧菌和副溶血弧菌感染提供一种有效手段。方法:收集2017年3月10月威海市立医院食源性疾病就诊患者的粪便标本357例,采用常规培养法结合质谱分析对标本中病原菌进行鉴定。设计针对创伤弧菌（Vibrio vulnificus）细胞溶解素编码基因vvh A和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）胶原蛋白酶编码基因col的特异性引物,建立单一降落PCR和多重降落PCR反应体系并进行优化,检测各种标准菌株和临床菌株评价单一降落和多重降落PCR的特异性和敏感性。应用多重降落PCR检测103例粪便标本中创伤弧菌和副溶血弧菌,并与细菌培养法结果进行比较,评价多重降落PCR在临床标本检测中的可行性。结果:（1）共检出致病微生物98株,5种疾控要求监测病原微生物致泻大肠埃希菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、诺如病毒和志贺氏菌的比率依次为26.53%、21.43%、20.41%、10.20%和7.14%;另外还检出其它致病性海洋弧菌14株（14.28%）,包括创伤弧菌6株（6.12%）、哈氏弧菌3株（3.06%）、溶藻弧菌3株（3.06）和灿烂弧菌2株（2.04%）,海洋性弧菌的总检出比率为35.71%。（2）单一降落PCR只分别对创伤弧菌或副溶血弧菌检测到特异扩增条带,对其它种类弧菌和非弧菌未出现特异扩增条带;对创伤弧菌和副溶血弧菌的最低检测限分别为104 CFU/ml和103CFU/ml。（3）多重降落PCR可在目标测试菌中同时检测到创伤弧菌和副溶血弧菌的特异性扩增条带,对其它种类弧菌和非弧菌未出现特异扩增条带;对创伤弧菌和副溶血弧菌的最低检测限亦分别为104 CFU/ml和103 CFU/ml。（4）与细菌培养法比较,多重降落PCR检测103份粪便标本中创伤弧菌的灵敏度和特异性分别为l00%和97.94%,副溶血性弧菌的灵敏度与特异性分别为100%和95.12%。结论:（1）威海地区食源性疾病中海洋性弧菌检出率高,需要对其进行监测。（2）成功建立快速检测创伤弧菌和副溶血性弧菌的多重降落PCR方法,灵敏度高,特异性强,可直接用于临床标本中创伤弧菌和副溶血性弧菌的快速检测。
魏霜,马新华,汪天杰,龙阳,纪强,任娇,吴希阳[4]（2016）在《双重DPO-PCR检测副溶血弧菌和霍乱弧菌》文中指出根据副溶血弧菌collagenase基因和霍乱弧菌omp W基因,分别设计特异性DPO（dual priming oligonucleotide）引物,建立一种快速检测这两种弧菌的多重DPO-PCR方法,并对其特异性和灵敏度进行了评价。结果显示,设计的DPO引物特异性较强,副溶血弧菌和霍乱弧菌DNA可分别扩增出307 bp与463 bp的特异性条带,检测灵敏度均达0.1 ng/μL。该检测方法对退火温度不敏感。利用该方法对69株疑似弧菌菌株进行鉴定,结果与生理生化鉴定结果一致。该方法特异性强、灵敏度高,适合于对食品、水产品等中副溶血弧菌和霍乱弧菌的进行快速筛检。
韩辉,毕玉国,祁军,胡群,谭绪良,吴海磊,王静,徐宝梁[5]（2015）在《霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法的建立》文中进行了进一步梳理目的建立霍乱弧菌和拟态弧菌的实时荧光PCR快速检测方法。方法根据霍乱弧菌外膜蛋白W基因（out membrane protein W,omp W）和拟态弧菌溶血素基因（Vibrio mimicus hemolysin gene,vmh）的保守序列设计引物和Taq Man探针,建立快速检测并区分霍乱弧菌和拟态弧菌的双重荧光PCR方法,并对所建立的方法进行灵敏度和特异度评价。结果建立了霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR快速检测方法。优化的反应体系中,omp W引物和探针的浓度分别为100 nmol/L和200 nmol/L;vmh引物和探针的浓度均为100 nmol/L。对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为100.9%和99.7%。灵敏度和特异度均为100.0%。结论基于Taq Man探针的omp W和vmh双重荧光PCR检测方法,具有好的灵敏度和特异度。并且能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,为繁琐费时的传统检测方法提供了一种快速可靠的替代选择。
周冬根,孙大为,倪敏君,王燕,张升,翟敏[6]（2012）在《多重实时荧光PCR法快速检测水体中致病性弧菌的研究》文中指出致病性弧菌检测方法主要是生化鉴定法,费时费力,而且对于生化反应不典型或生化反应极为相似的弧菌属无法准确鉴别,传统的生化鉴定法在大规模的病害调查过程和生产实践中无法做到快速准确方便。多重荧光PCR方法是在DNA分子水平进行微生物检测的一种新方法,根据样本中各种微生物的特异性基因对目标菌进行鉴定,可以稳定准确地在种属和菌株水平上鉴别微生物,弥补传统生化鉴定方法的缺陷。本研究通过优化多重荧光PCR方法体系,建立了水体中致病性弧菌的两个多重荧光PCR检测方法,该方法通过富集水体细菌,
韩辉,李海山,胡群,姚李四,谭绪良,贾琳[7]（2011）在《霍乱毒素基因（ctx）和耐热直接溶血素基因（tdh）双重TaqMan实时PCR检测方法的建立》文中认为[目的]建立霍乱毒素和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时-PCR实验室检测方法。[方法]根据霍乱毒素基因（Cholera toxin gene,ctx）和耐热直接溶血素基因（thermostable direct hemolysin,tdh）的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测霍乱毒素和耐热直接溶血素两种毒力基因的双重TaqMan实时PCR方法。对所建立的霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。[结果]建立了霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR的实验室检测方法。优化的tdh和ct双重TaqMan实时PCR反应体系中,ct引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L;tdh引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为94%和97.7%。[结论]本研究建立了基于TaqMan探针的tdh和ct双重实时PCR检测方法,具有令人满意的灵敏度和特异度。检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,高于普通PCR100倍。并且双重实时PCR能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,这为费时又繁琐的传统检测方法提供了一种可靠又快速的替代选择。
覃倚莹[8]（2010）在《沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌同时检测方法的研究》文中进行了进一步梳理本文建立了沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的同时检测方法,包括共增培养基及其三重荧光PCR检测方法,使水产品中主要致病菌的检测能够通过一步增殖培养和一步检测完成,大大缩短检测时间,简化检测步骤,提高检测效率。以BPW作为基础培养基,选择对目标菌具有促进作用或者对非目标菌具有抑制作用的添加剂进行单因素实验和响应面分析实验,研制了共增培养基SVV,其最佳配为：缓冲蛋白胨水20.1g/L、NaCl20g/L、亚碲酸钾1mg/L、3号胆盐2.5g/L、柠檬酸钠5g/L葡萄糖1.25g/L、甘露醇1.25g/L、亚硫酸钠1.25g/L以及丙酮酸纳0.05g/L。结果显示,SVV培养基能有效抑制竞争菌群,经过一步增殖即可有效富集单个目标菌或者混合目标菌生长至105-108cfu/mL。同时,SVV共增培养基具有良好的适用性,与PCR检测技术联用时与传统检测法的符合率达100%,能有效监测目标菌。以沙门氏菌的invA基因、副溶血弧菌的toxR基因和霍乱弧菌的hlyA基因为靶基因设计引物探针,对设计的多对引物探针组合进行实验筛选优化,获得最佳引物探针组合。向反应体系中添加抗干扰物质BSA 0.04%（w/v）和甲酰胺0.01%（w/v）提高PCR反应体系的抗干扰能力。通过优化反应组分浓度和反应条件,建立了抗干扰三重荧光PCR检测方法。25μL反应体系包含：1×Buffer, MgCl2 3.75mmol/L, dNTP mixture 1mmol/L,沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的上下游引物浓度分别为0.5mmol/L、0.4 mmol/L、0.46mmol/L,探针浓度分别为0.18μmol/L、0.2μmol/L、0.22μmol/L, Taq DNA聚合酶2.5U,模板2μL。扩增程序为：94℃4min,94℃10s、60℃45s,40个循环。结果显示,该法的检测特异性达到100%,对目标菌的检测灵敏度分别为沙门氏菌1300cfu/mL、副溶血弧菌6400cfu/mL、霍乱弧菌2100cfu/mL。用本法与SVV共增培养基联用检测52份实际样品,准确率达100%,并能有效克服传统方法对副溶血弧菌的漏检。共增培养SVV突破了传统培养法中需要针对单一细菌进行两步培养,使三种目标菌通过一步培养即达到检测限以上。本文的三重荧光PCR能与简单的DNA提取方法联用,进一步简化了检测过程,并能保证PCR反应顺利进行。本文建立的SVV共增培养联合三重荧光PCR检测方法能快速、准确地监测沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌,可以应用于进出口水产品检验检疫和其它食品的日常监测。
王海波[9]（2009）在《重要致病性弧菌TaqMan实时PCR检测方法的建立》文中研究指明【目的】建立重要致病性弧菌TaqMan实时PCR检测方法,具体包括:（1）霍乱弧菌和拟态弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法（2）O1群和O139群霍乱弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法（3）霍乱毒素基因（ctx）TaqMan实时PCR检测方法（4）副溶血弧菌TaqMan实时PCR检测方法（5）耐热直接溶血素基因（tdh）和耐热直接溶血素相关溶血素基因（trh）双重TaqMan实时PCR检测方法（6）创伤弧菌和溶藻弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法（7）霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR检测方法（8）嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法。[方法]对“目的”中涉及的前7个实时PCR检测方法,本研究采取如下实验方案:（1）查阅文献确定待检测的目的基因,通过序列比对确定待检基因的保守序列,然后借助引物探针设计软件Beacon Designer 7.0设计单重和（或）双重TaqMan实时PCR引物和探针。（2）引物扩增待测基因,PCR产物经胶回收后与T载体连接制备扩增产物克隆子,挑选阳性克隆子提取质粒,测序确认。用EasyDilution将上述质粒依次稀释成1.0×1010拷贝/μl—1.0×100拷贝/μl。（3）分别在100—1000 nmol/L 10个浓度梯度和100—500 nmol/L 5个浓度梯度内,借助方差分析优化引物和探针的浓度。（4）单重实时PCR灵敏度和特异度的评价。（5）以1.0×108拷贝/μl—1.0×100拷贝/μl 9个浓度梯度的质粒为模板,每个浓度梯度做8个平行样,在伯乐公司的CFX96荧光定量PCR仪上进行扩增,确定单重实时PCR反应体系的检测下限以及扩增效率。（6）将优化了的单重实时PCR反应体系组合成双重TaqMan实时PCR反应体系,并对双重实时PCR的检测下限进行评价。对嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测方法,检测下限的评价包括菌液的检测下限和DNA的检测下限。将一系列稀释度的嗜水气单胞菌菌液人工污染健康人的粪便,评价该检测方法从未经增菌处理的粪便中以及增菌3小时、8小时和16小时的粪便中检测出嗜水气单胞菌的能力。【结果】建立了重要致病性弧菌的TaqMan实时PCR检测方法。具体结果为:（1）霍乱弧菌外膜蛋白W基因（out membrane protein w,ompW）和拟态弧菌的溶血素基因（Vibrio mimicus hemolysin,vmh）作为霍乱弧菌和拟态弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法的待检基因。优化的反应体系中,霍乱弧菌引物和探针的浓度分别为100 nmol/L和200 nmol/L;拟态弧菌引物和探针的浓度分别为100 nmol/L和100 nmol/L。该反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为:100.9%和99.7%。（2）O1和O139的O抗原合成基因rfb基因作为O1群和O139群霍乱弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法的待检基因。优化的反应体系中,O1的引物和探针的浓度均为200 nmol/L;O139的引物和探针的浓度均为200 nmol/L。该反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为:101.4%和99.9%。（3）优化的霍乱毒素基因实时PCR反应体系中,ctx引物和探针的浓度均为200 nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对ctx质粒模板的检测下限为1.0×102拷贝/μl,扩增效率为99.8%。（4）副溶血弧菌的toxR基因被选作副溶血弧菌的特异性基因。优化的toxR引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L;反应体系的灵敏度和特异度均为100%。该反应体系对toxR质粒模板的检测下限为1.0×102拷贝/μl,扩增效率为100.1%。（5）优化的tdh和trh双重TaqMan实时PCR反应体系中,tdh引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L;trh引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L。该反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为:97.3%和100.1%。（6）创伤弧菌的溶血素基因（Vibrio vulnificus hemolysin,vvh）和溶藻弧菌的胶原酶基因（Vibrio alginolyticus collagenase,col）被选作为创伤弧菌和溶藻弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法的待检基因。优化的反应体系中,创伤弧菌引物和探针的浓度均为200 nmol/L;溶藻弧菌引物和探针的浓度均为200 nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为:100.5%和101.5%。（7）优化的tdh和ct双重TaqMan实时PCR反应体系中,ct引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L;tdh引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为:94%和97.7%。（8）嗜水气单胞菌的主要粘附素基因（Aeromonas hydrophila major adhesiongene,aha）被选为嗜水气单胞菌的特异性基因。优化的引物和探针的浓度分别为200 nmol/L和100 nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。该反应体系对纯培养物DNA的检测下限为1 pg/μl,对菌液的检测下限为80 CFU/ml。对未经增菌的人工污染粪便标本的检测下限为8×103 CFU/ml,增菌3小时对检测下限没有影响,增菌8小时和16小时后,检测下限能达到8 CFU/ml。【结论】本研究建立了基于TaqMan探针的重要致病性弧菌的实时PCR检测方法。实验结果证明它们具有令人满意的灵敏度和特异度。检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,高于普通PCR 10-1000倍。并且双重实时PCR能够在一个反应体系中同时检测两种菌或者两个致病基因,大大减少了实验时间和对试剂的消耗。因此,上述检测方法可用于重要致病性弧菌的快速检测及筛查,尤其是当样本量很大或者爆发疫情时。
王海波,王多春,阚飙,毕振强[10]（2009）在《副溶血弧菌TaqMan双重实时-聚合酶链反应检测方法的建立》文中研究指明目的建立副溶血弧菌TaqMan实时-PCR和毒力基因TaqMan双重实时-PCR筛检的实验室检测方法。方法根据副溶血弧菌toxR基因的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测副溶血弧菌的实时-PCR方法;根据副溶血弧菌耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin,tdh）和耐热相关溶血素（thermostable relatedhemolysin,trh）基因的保守序列设计引物和探针,建立检测致病性副溶血弧菌毒力基因的双重TaqMan实时-PCR方法。对所建立的副溶血弧菌实时-PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。结果副溶血弧菌的检测下限为102拷贝/μl,tdh和trh双重实时PCR的检测下限为102拷贝/μl。针对toxR基因建立的副溶血弧菌实时-PCR方法对11种其他弧菌和肠道细菌的染色体无扩增。结论建立的方法能够特异和敏感地检测副溶血弧菌,并能确定致病性副溶血弧菌的毒力基因,能作为副溶血弧菌的灵敏和快速检测方法。
二、双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌（论文提纲范文）
（1）基于HAND系统15种食源性致病菌多重实时PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 食源性致病菌 |
| 1.2 病原微生物常用鉴别方法 |
| 1.2.1 传统培养法 |
| 1.2.2 传统培养法的优化 |
| 1.2.3 免疫学检测 |
| 1.2.4 核酸检测 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 第2章 基于HAND系统食源性致病菌实时PCR检测技术的建立 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 菌株及来源 |
| 2.1.2 培养基和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌株的培养和模板DNA的制备 |
| 2.2.2 靶序列与引物 |
| 2.2.3 单重荧光定量PCR体系的建立 |
| 2.2.4 单重实时PCR的特异性 |
| 2.2.5 单重实时PCR的敏感性 |
| 2.2.6 单重实时PCR的重复性和稳定性 |
| 2.2.7 多重实时PCR体系的建立 |
| 2.2.8 多重时候PCR的特异性 |
| 2.2.9 多重实时PCR的敏感性 |
| 2.2.10 多重实时PCR的重复性和稳定性 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 单重荧光定量PCR体系的建立 |
| 2.3.2 单重荧光定量PCR特异性结果 |
| 2.3.3 单重实时PCR敏感性结果 |
| 2.3.4 单重实时PCR重复性和稳定性结果 |
| 2.3.5 多重实时PCR体系的建立 |
| 2.3.6 多重荧光定量PCR特异性结果 |
| 2.3.7 多重荧光定量PCR敏感性结果 |
| 2.3.8 多重荧光定量PCR重复性和稳定性结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 多重实时PCR体系的玻璃化 |
| 3.1 材料与设备 |
| 3.1.1 菌株及来源 |
| 3.1.2 培养基和试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 菌株的培养和模板DNA的制备 |
| 3.2.2 反应体系的玻璃化 |
| 3.2.3 玻璃化试剂稳定性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 反应体系的玻璃化 |
| 3.3.2 玻璃化试剂稳定性 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 复杂样本的快速提取 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株及来源 |
| 4.1.2 培养基与试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 复杂样本快速提取方法 |
| 4.2.1 食品模拟样本 |
| 4.2.2 粪便模拟标本 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和科研成果 |
（2）副溶血弧菌qPCR检测及T6SS-1效应因子的筛选和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 副溶血弧菌相关毒力因子及其致病机理 |
| 1 副溶血弧菌的致病力及流行 |
| 2 副溶血弧菌的检测方法 |
| 2.1 常规分离鉴定 |
| 2.2 免疫学检测方法 |
| 2.3 分子生物学检测方法 |
| 3 副溶血弧菌的主要毒力因子 |
| 3.1 溶血素 |
| 3.2 黏附相关因子 |
| 3.3 Ⅲ型分泌系统 |
| 3.4 Ⅵ型分泌系统 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 副溶血弧菌与霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与引物设计 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 双重荧光定量PCR方法的建立 |
| 1.4 敏感性试验 |
| 1.5 特异性试验 |
| 1.6 重复性试验 |
| 1.7 人工染菌虾和贝类样品的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 双重荧光定量PCR扩增 |
| 2.2 敏感性试验 |
| 2.3 特异性试验 |
| 2.4 重复性试验 |
| 2.5 人工染菌样品的检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 副溶血弧菌T6SS-1效应蛋白的筛选与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株、质粒和感受态细胞 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试验试剂与仪器 |
| 1.4 副溶血弧菌T6SS-1分泌蛋白的提取 |
| 1.5 上清蛋白SDS-PAGE分析 |
| 1.6 Label-free定量蛋白质组学分析 |
| 1.7 原核表达引物设计与合成 |
| 1.8 vp0837和vp0285基因的PCR扩增 |
| 1.9 重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.10 重组质粒的诱导表达 |
| 1.11 重组蛋白的纯化 |
| 1.12 重组蛋白VP0837和VP0285多克隆抗体的制备 |
| 1.13 ELISA测定表达产物免疫效价 |
| 1.14 Western-blot鉴定效应蛋白VP0837和VP0285 |
| 2 结果 |
| 2.1 副溶血弧菌T6SS-1分泌蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.2 Label-free鉴定和定量结果评估 |
| 2.3 vp0837和vp0285基因的PCR扩增 |
| 2.4 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.5 原核表达产物的SDS-PAGE及可溶性分析 |
| 2.6 重组蛋白的纯化 |
| 2.7 ELISA测定表达产物免疫效价 |
| 2.8 Western-blot鉴定效应蛋白VP0837和VP0285 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 副溶血弧菌T6SS-1效应蛋白vp0837基因缺失株的构建及致病性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与引物设计 |
| 1.2 细胞及试验动物 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 1.4 vp0837基因缺失株的构建 |
| 1.5 vp0837基因互补株的构建 |
| 1.6 荧光定量PCR检测基因转录水平 |
| 1.7 遗传稳定性分析 |
| 1.8 生长曲线的测定 |
| 1.9 细菌运动性检测 |
| 1.10 透射电镜下的鞭毛结构观察 |
| 1.11 不同菌株生物被膜形成能力测定 |
| 1.12 细胞黏附与入侵能力测定 |
| 1.13 细胞毒性测定 |
| 1.14 细胞因子测定 |
| 1.15 半数致死量(LD_(50))的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 vp0837基因缺失株的构建与鉴定结果 |
| 2.2 C△vp0837互补株的构建与鉴定结果 |
| 2.3 荧光定量PCR检测结果 |
| 2.4 遗传稳定性分析结果 |
| 2.5 生长曲线的测定结果 |
| 2.6 细菌运动性检测结果 |
| 2.7 透射电镜下的鞭毛结构观察结果 |
| 2.8 生物被膜形成能力测定结果 |
| 2.9 细胞黏附与入侵能力测定结果 |
| 2.10 细胞毒性测定结果 |
| 2.11 细胞因子测定结果 |
| 2.12 半数致死量(LD_(50))的测定结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）威海地区食源性细菌的分布及病原性海洋弧菌多重降落PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 引言 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 标准菌株及临床菌株 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验溶液配制 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 临床标本采集与处理 |
| 3 细菌的分离培养、鉴定和药物敏感实验 |
| 3.1 标准菌株和临床菌株的培养和鉴定 |
| 3.2 临床标本中细菌的分离培养和鉴定 |
| 3.3 细菌质谱鉴定 |
| 3.4 药物敏感试验 |
| 4 细菌基因组DNA的提取 |
| 5 PCR引物设计 |
| 6 单一降落PCR |
| 6.1 PCR反应体系的优化 |
| 6.2 单一降落PCR特异性检测 |
| 6.3 单一降落PCR敏感性检测 |
| 7 多重降落PCR |
| 7.1 PCR反应体系的优化 |
| 7.2 多重降落PCR特异性检测 |
| 7.3 多重降落PCR敏感性检测 |
| 8 多重降落PCR检测临床标本 结果 |
| 1 威海地区食源性疾病致病菌的鉴定及分布 |
| 1.1 细菌分离培养及鉴定结果 |
| 1.2 威海地区食源性疾病致病菌的分布 |
| 1.3 抗生素药敏试验结果 |
| 2 单一降落PCR检测结果 |
| 2.1 单一降落PCR特异性检测结果 |
| 2.2 单一降落PCR敏感性检测结果 |
| 3 多重降落PCR检测结果 |
| 3.1 多重降落PCR特异性检测结果 |
| 3.2 多重降落PCR敏感性检测结果 |
| 4 临床标本验证结果 讨论 结论 参考文献 综述 |
| 综述参考文献 攻读学位期间的研究成果 致谢 |
（4）双重DPO-PCR检测副溶血弧菌和霍乱弧菌（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 基因组DNA的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 双重DPO-PCR体系 |
| 1.2.4 双重DPO-PCR体系退火温度敏感性实验 |
| 1.2.5 双重DPO-PCR体系的特异性评价 |
| 1.2.6 双重DPO-PCR体系的灵敏度评价 |
| 1.2.7 双重DPO-PCR体系检测实际样品 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 两种弧菌的双重DPO-PCR检测方法建立 |
| 2.2 双重DPO-PCR退火温度敏感性实验 |
| 2.3 双重DPO-PCR体系的特异性评价 |
| 2.4 双重DPO-PCR体系的灵敏度评价 |
| 2.5 双重DPO-PCR体系对实际样品的检测 |
| 3 结论 |
（5）霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（7）霍乱毒素基因（ctx）和耐热直接溶血素基因（tdh）双重TaqMan实时PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验菌株 |
| 1.1.2 ctx和tdh双重引物和探针的设计 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细菌染色体DNA的提取 |
| 1.2.2 质粒的制备 |
| 1.2.3 实验条件的优化 |
| 1.2.3. 1 引物浓度的优化 |
| 1.2.3. 2 探针浓度的优化 |
| 1.2.4 实时PCR的反应条件 |
| 1.2.4. 1 ctx和tdh基因单重实时PCR反应条件 |
| 1.2.4. 2 ctx和tdh基因双重实时PCR反应条件 |
| 1.2.5 灵敏度的检测 |
| 1.2.6 特异度检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 实验条件的优化 |
| 2.1.1 引物浓度的优化 |
| 2.1.2 探针浓度的优化 |
| 2.2 灵敏度的检测 |
| 2.2.1 ctx和tdh基因单重实时PCR灵敏度 |
| 2.2.2 ctx和tdh双重实时PCR灵敏度 |
| 2.3 特异度检测 |
| 2.4 扩增效率 |
| 3 讨论 |
（8）沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌同时检测方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.1.1 沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌是水产品中的主要致病菌 |
| 1.1.2 致病菌的检测现状 |
| 1.1.3 沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共性 |
| 1.2 课题的研究意义和研究内容 |
| 1.2.1 研究意义 |
| 1.2.2 拟解决的关键问题 |
| 1.2.3 主要研究内容 |
| 第二章 沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌共增培养基SVV的研制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 基础培养基的选择 |
| 2.2.2 抑制剂的选择 |
| 2.2.3 促进剂的选择 |
| 2.2.4 抑制剂单因素实验 |
| 2.2.5 促进剂单因素实验 |
| 2.2.6 响应面分析优化 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌共增培养基SVV增菌效果的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 仪器与试剂 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 SVV的单独增菌效果研究 |
| 3.2.2 SVV的复合增菌效果研究 |
| 3.2.3 SVV的选择性研究 |
| 3.2.4 竞争菌群对SVV共增效果影响研究 |
| 3.2.5 SVV应用于人工接种样品 |
| 3.2.6 SVV应用于实际样品 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌三重荧光PCR检测方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 DNA模板的制备 |
| 4.2.2 PCR反应促进物质的选择 |
| 4.2.3 引物探针组合筛选 |
| 4.2.4 反应体系优化 |
| 4.2.5 目标菌单重荧光PCR扩增结果 |
| 4.2.6 目标菌双重荧光PCR扩增结果 |
| 4.2.7 目标菌三重荧光PCR扩增结果 |
| 4.2.8 三重荧光PCR检测特异性 |
| 4.2.9 三重荧光PCR灵敏度实验 |
| 4.2.10 三重荧光PCR检测技术适用性结果 |
| 4.3 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、课题创新性阐述 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 评定意见 |
（9）重要致病性弧菌TaqMan实时PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 霍乱弧菌和拟态弧菌双重TaqMan实时PCR检测体系的建立 |
| 前言 |
| 一、霍乱弧菌和拟态弧菌双重TaqMan实时PCR检测方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和结果 |
| 3.讨论 |
| 4.参考文献 |
| 二、O1和O139双重TaqMan实时PCR检测方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和结果 |
| 3.讨论 |
| 4.参考文献 |
| 三、霍乱毒素基因(ctx)TaqMan实时PCR检测方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和结果 |
| 3.讨论 |
| 4.参考文献 |
| 四、小结 |
| 第二部分 副溶血弧菌双重TaqMan实时PCR检测体系的建立 |
| 前言 |
| 一、副溶血弧菌toxR基因实时PCR检测方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和结果 |
| 3.讨论 |
| 二、tdh和trh双重TaqMan实时PCR检测方法的建立 |
| 1.材料 |
| 2.方法和结果 |
| 3.tdh和trh双重TaqMan实时PCR检测方法的应用 |
| 4.讨论 |
| 三、小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 创伤弧菌和溶藻弧菌双重TaqMan实时PCR检测体系的建立 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法和结果 |
| 3.讨论 |
| 4.参考文献 |
| 第四部分 ctx和tdh双重TaqMan实时PCR检测体系的建立 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法和结果 |
| 3.讨论 |
| 4.参考文献 |
| 第五部分 嗜水气单胞菌TaqMan实时PCR检测体系的建立 |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法和结果 |
| 3.讨论 |
| 4.参考文献 |
| 研究总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）副溶血弧菌TaqMan双重实时-聚合酶链反应检测方法的建立（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验菌株 |
| 1.2 引物和探针的设计 |
| 1.3 细菌染色体DNA的提取 |
| 1.4 质粒的制备 |
| 1.5 实验参数的优化 |
| 1.5.1 引物浓度的优化 |
| 1.5.2 探针浓度的优化 |
| 1.6 实时PCR的反应条件 |
| 1.6.1 toxR、tdh和trh |
| 1.6.2 检测tdh和trh基因的双重实时PCR反应条件 |
| 1.7 灵敏度的检测 |
| 1.7.1 单重实时PCR灵敏度的检测 |
| 1.7.2 tdh和trh双重实时PCR灵敏度的检测 |
| 1.8 toxR检测副溶血弧菌特异度检测 |
| 1.9 tdh和trh双重实时PCR的应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 实验参数的优化 |
| 2.1.1 引物浓度的优化 |
| 2.1.2 探针浓度的优化 |
| 2.2 灵敏度的检测 |
| 2.3 toxR检测副溶血弧菌特异度检测 |
| 2.4 tdh和trh双重实时PCR的应用 |
| 3 讨论 |
四、双重实时PCR快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌（论文参考文献）
- [1]基于HAND系统15种食源性致病菌多重实时PCR检测方法的建立[D]. 钟宜科. 河北工程大学, 2020(02)
- [2]副溶血弧菌qPCR检测及T6SS-1效应因子的筛选和功能研究[D]. 凌娇. 南京农业大学, 2018(07)
- [3]威海地区食源性细菌的分布及病原性海洋弧菌多重降落PCR方法的建立[D]. 王义涛. 青岛大学, 2018(01)
- [4]双重DPO-PCR检测副溶血弧菌和霍乱弧菌[J]. 魏霜,马新华,汪天杰,龙阳,纪强,任娇,吴希阳. 食品工业科技, 2016(22)
- [5]霍乱弧菌和拟态弧菌双重荧光PCR检测方法的建立[J]. 韩辉,毕玉国,祁军,胡群,谭绪良,吴海磊,王静,徐宝梁. 中国国境卫生检疫杂志, 2015(03)
- [6]多重实时荧光PCR法快速检测水体中致病性弧菌的研究[J]. 周冬根,孙大为,倪敏君,王燕,张升,翟敏. 中华微生物学和免疫学杂志, 2012(04)
- [7]霍乱毒素基因（ctx）和耐热直接溶血素基因（tdh）双重TaqMan实时PCR检测方法的建立[J]. 韩辉,李海山,胡群,姚李四,谭绪良,贾琳. 现代预防医学, 2011(18)
- [8]沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌同时检测方法的研究[D]. 覃倚莹. 华南理工大学, 2010(04)
- [9]重要致病性弧菌TaqMan实时PCR检测方法的建立[D]. 王海波. 山东大学, 2009(06)
- [10]副溶血弧菌TaqMan双重实时-聚合酶链反应检测方法的建立[J]. 王海波,王多春,阚飙,毕振强. 疾病监测, 2009(04)