一、改良Kamada法大鼠原位肝移植模型的建立（论文文献综述）
张黎[1]（2019）在《CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究》文中研究表明第一部分大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒载体的构建及鉴定[目 的]构建大鼠CaMKⅡγ基因的过表达及干扰慢病毒载体并鉴定,为下一步探讨慢病毒介导CaMKⅡγ基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及其在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤的作用提供基础。[方 法]根据大鼠CaMKⅡγ目的基因的mRNA序列,全基因合成CaMKⅡγ目的基因,构建大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,根据本课题组前期实验中已筛出的干扰效率最高的siRNA序列构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγyshRNA慢病毒空载体,转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞并进行测序验证,随后转染293T细胞进行慢病毒包装并用绝对定量qPCR测定慢病毒滴度。应用Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体的蛋白表达情况,确定大鼠CaMKⅡγ过表达的有效性。根据不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A,将其分为生理盐水空白对照组（CON组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体组（CON-mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ过表达慢病毒载体组（mCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒空载体组（CON-shCaMKⅡγ组）,CaMKⅡγ干扰慢病毒载体组（shCaMKⅡγ组）,应用Western Blot检测各组CaMKⅡγ蛋白表达情况。[结 果]成功构建了大鼠CaMKIIⅡγ过表达慢病毒载体及CaMKⅡγ过表达慢病毒空载体,Western Blot检测大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体蛋白的表达。根据已知干扰效率最高的siRNA序列成功构建大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体及CaMKⅡγshRNA慢病毒空载体。绝对定量qPCR测定大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒载体、大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体滴度均为2E+9TU/mL。不同慢病毒转染大鼠肝细胞BRL-3A 48h后,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ蛋白表达最高,shCaMKⅡγ的CaMKⅡγ表达最低,mCaMKⅡγ组的CaMKⅡγ表达高于CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01）,shCaMKⅡγ组的 CaMKⅡγ表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。[结 论]大鼠CaMKⅡγ基因的过表达慢病毒在293T细胞中构建成功并表达,大鼠CaMKⅡγshRNA慢病毒载体在293T细胞中构建成功。大鼠CaMKⅡγ过表达慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中蛋白表达显着增加,而大鼠CaMKⅡγ干扰慢病毒在大鼠肝细胞BRL-3A中的蛋白表达量显着下降,为后续研究CaMKⅡγ作为靶基因干扰调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路及在大鼠DCD肝移植术缺血-再灌注损伤的作用提供基础。第二部分建立SD大鼠DCD原位肝移植模型[目 的]建立稳定的SD大鼠DCD原位肝移植模型并确定在本课题后续实验中SD大鼠DCD原位肝移植模型的最佳热缺血时间。[方 法]本实验通过Kamada“二袖套”法,控制不同热缺血时间（热缺血Omin、热缺血15min及热缺血30min）建立SD大鼠DCD原位肝移植模型,并通过移植术后存活时间及肝脏变化确定本实验最佳动物模型热缺血时间。[结 果]供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型术后7d的生存率分别为90%、80%及60%,随着热缺血时间延长,肝脏损伤加重,肝功能ALT、AST及TBIL逐渐升高,肝脏病理切片结果显示肝细胞从轻度水肿到点状坏死,再从桥接样坏死到大片状坏死。[结 论]在SD大鼠DCD原位肝移植模型中,热缺血时间的长短是直接影响供肝质量的关键因素,随着热缺血时间延长,供肝肝功能损伤逐渐加重,与病理结果一致,术后受体存活率随热缺血时间延长而显着下降。经过对比,热缺血15min是建立SD大鼠DCD原位肝移植模型并为后续进一步试验的理想造模时间,既可保证移植术后受体有一定的存活率,又可观察后续慢病毒干预对肝损伤是否有效。第三部分CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]用第二部分建立的供肝热缺血Omin、15min及30min的SD大鼠DCD原位肝移植模型,三组分别于肝移植术后1d、3d及7d处死20只大鼠,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、CytC的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ蛋白表达,探讨CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[结 果]三组移植术后1dCa2+水平达到高峰,术后3d Ca2+下降,到术后7d Ca2+又逐渐升高,同一时点,热缺血15min组及30min组Ca2+浓度水平高于热缺血Omin组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例随时间延长逐渐升高,提示线粒体膜势能下降比例逐渐升高,术后1d,三组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血15min组及30min组绿色荧光细胞比例高于热缺血Omin组（P<0.01）。Tunel检测肝细胞凋亡比例随时间延长逐渐升高,术后1d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,热缺血15min组与热缺血Omin组无统计学差异,术后3d,热缺血15min组及30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）,术后7d,热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血Omin组（P<0.05）且热缺血30min组肝细胞凋亡比例高于热缺血15min组（P<0.05）。Western Blot测CaaM、CaMKⅡγ、AIF及Cyt C蛋白表达随热缺血时间延长而逐渐增加（P<0.05,P<0.01）,同一时点,热缺血15min组及30min组的蛋白表达高于热缺血Omin组,QRT-PCR及免疫组化测CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA及 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与 Western Blot 结果趋势大致相同。[结 论]热缺血时间是影响供肝质量的关键因素,SD大鼠DCD原位肝移植术后,供肝热缺血时间越长,供肝功能损伤越重,移植术后Ca2+浓度逐渐升高,从分子、蛋白及组织水平验证了随热缺血时间的延长,CaM及CaMKⅡγ表达增加,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,线粒体膜势能下降细胞比例增加,AIF及CytC从线粒体内释放,线粒体凋亡增加,由线粒体凋亡引起的肝细胞凋亡随之增加。第四部分慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系[目 的]探讨慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系。[方 法]建立热缺血15min SD大鼠DCD原位肝移植模型,每只大鼠术中通过门静脉按1.0×108TU/mL注射CaMKⅡγ过表达及其对照慢病毒。（mCaMKⅡγ组、CON-mCaMKⅡγ组）、CaMKⅡγ干扰及其对照慢病毒（shCaMKⅡγ组及CON-shCaMKⅡγ组）、生理盐水（CON组）转染移植肝脏,于术后1d、3d、7d分别处死20只大鼠。取血清行肝功能检测,取肝细胞行流式细胞术测Ca2+浓度水平、线粒体膜势能,Tunel法测肝组织中肝细胞的凋亡,Western Blot测肝组织中CaM、CaMKⅡγ及肝细胞质中AIF、Cyt C的蛋白水平表达,QRT-PCR测肝组织中CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA,免疫组化测肝组织中CaM、CaMKⅡγ的蛋白表达,电镜检测肝组织中肝细胞、线粒体的超微结构变化。[结 果]CaMKⅡγ过表达慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为83.3%、78.3%及70.0%,而CaMKⅡγ干扰慢病毒组移植术后1d、3d及7d的生存率分别为98.3%、93.3%及88.3%,提示干扰CaMKⅡγ的表达对大鼠DCD肝移植术后肝损伤是保护因素,可提高大鼠DCD肝移植术后生存率。肝功能结果示:血清 ALT、AST 术后各时点 mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,血清TBIL于术后1d各组无显着差异,术后3d及7d结果同血清ALT、AST。移植术后Ca2+浓度于术后1d达到高峰,各组间无显着差异,术后3d逐渐下降,术后7d再次升高,术后3d及7d,mCaMKⅡγ组高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。JC-10标记绿色荧光细胞比例在术后1d及3d,shCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）,术后 7d,mCaMKⅡγ组绿色荧光细胞比例高于 CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）。Tunel法测肝细胞凋亡结果示:术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组肝细胞凋亡比例低于CON-shCaMKⅡγ组（p<0.01）。Western Blot 测 CaM、CaMKⅡγ、AIF 蛋白表达于术后 1d,mCaMKⅡγ组表达高于 CON-mCaMKⅡγ组（P<0.01,P<0.05）,术后 3d 及 7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于CON-shCaMKⅡγ组（P<0.01）,CytC蛋白表达于术后1d、3d及7d,mCaMKⅡγ组表达高于CON-mCaMKⅡγ组,shCaMKⅡγ组表达低于 CON-shCaMKⅡγ组（P<0.05,P<0.01）。QRT-PCR 测 CaMmRNA、CaMKⅡγmRNA 的表达及免疫组化测 CaM、CaMKⅡγ蛋白阳性率与Western Blot结果趋势相同。电镜结果可见mCaMKⅡγ组出现超微结构损伤,肝细胞肿胀及坏死、线粒体肿胀、嵴消失,而shCaMKⅡγ组受损形态明显改善,肝细胞大致正常,线粒体或肝细胞轻微肿胀,CON组、CON-mCaMKⅡγ组、CON-shCaMKⅡγ组可见肝组织轻微的超微结构损伤,随时间推移,mCaMKⅡγ组损伤逐渐加重,shCaMKⅡγ组损伤逐渐减轻。[结 论]DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致CaMKⅡγ异常表达,可通过激活Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路诱导线粒体损伤,上调CaMKⅡγ可使Ca2+水平升高,CaMKⅡγ作用于线粒体膜,使线粒体膜势能下降,线粒体通透性增加进而导致线粒体肿胀、破裂及凋亡,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质可启动线粒体凋亡,进一步促进肝细胞凋亡;而下调CaMKⅡγ则可使Ca2+水平降低,减少线粒体膜势能下降,线粒体中AIF及Cyt C释放入细胞质减少,进而减少线粒体凋亡及其诱导的肝细胞凋亡,对SD大鼠DCD原位肝移植术后的肝功能损伤有保护作用。CaMKⅡγ过表达在DCD供肝因缺血-再灌注损伤导致的线粒体凋亡中起主导作用,特异性干扰CaMKⅡγ表达可特异性调控Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路,有效改善SD大鼠DCD原位肝移植术后肝损伤及提高术后移植大鼠存活率。
唐波[2]（2018）在《树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分树鼩原位肝移植模型的建立[目的]首次尝试用树鼩建立同种异体原位肝移植动物模型,为肝移植的临床及科学研究提供一种新型的,与人类基因型及免疫系统同源性更高,且更为经济实用的肝移植动物模型。[方法]在Kamada报道的“二袖套”法肝移植模型基础上加以改进,通过对总共60只树鼩进行随机分组为供体组和受体组进行同种异体原位肝移植实验,观察手术成功率,术后树鼩存活率,并行肝脏组织病理学检查,建立稳定的树鼩原位肝移植模型。[结果]定型手术成功率为90.00%（27/30）,树鼩24h存活率为76.67%（23/30）,3 天存活率为 60.00%（18/30）,1 周存活率为 30.00%（9/30）,最长存活时间为11天。3例手术失败原因为:肝上下腔静脉吻合口出血,麻醉过深,气胸死亡各1例。24h内死亡4例,其中1例因吻合口出血,1例吻合口血栓形成,2例死亡原因不明。术后存活超24h死亡23例,原因分别为急性排斥反应15例,占65.22%,其它为:胆道梗阻1例,腹腔感染2例,肝叶坏死1例,不明原因4例。[结论]1树鼩原位肝移植模型建立的难度及操作复杂性比大鼠肝移植更大,综合影响因素更多。合理的围手术期处理及娴熟的显微镜操作是影响肝原位移植模型手术成功的关键。2树鼩肝移植模型成功建立为本研究的创新点,目前未见报道,首次成功用树鼩建立了同种异体原位肝移植模型,作为一种新型动物肝移植模型的建立——改良“二袖套”法在树鼩原位肝移植模型的建立,模型稳定可靠,为今后将树鼩原位肝移植模型运用于肝移植的临床及基础研究奠定了基础。第二部分树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因表达和迁移的体外实验研究[目的]研究雷帕霉素对树鼩外周血淋巴细胞趋化因子CXCL12（SDF-1）趋化功能及其受体CXCR4表达的影响,为移植排斥体内研究提供实验依据。[方法]实验分组:Rapacymin药物组、DMSO对照组和空白组。采用MTS细胞增殖实验,观察雷帕霉素对树鼩淋巴细胞存活及状态的影响;用细胞迁移运动实验检测雷帕霉素对人源性重组CXCL12所诱导树鼩淋巴细胞迁移能力的影响:使用Real-time PCR法检测雷帕霉素对树鼩淋巴细胞CXCR4基因的表达情况。[结果]雷帕霉素对树鼩淋巴细胞活力无显着影响,但对树鼩的淋巴细胞的迁移有抑制作用。同时雷帕霉素可下调树鼩淋巴细胞的CXCR4基因表达。[结论]趋化因子CXCL12及其受体CXCR4表达水平可影响淋巴细胞迁移,为树鼩肝移植急性排斥反应体内实验研究提供依据。第三部分树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究[目的]在肝移植模型建立的基础上加用免疫抑制剂及趋化因子受体阻止剂对趋化因子及其受体的作用进行实验研究。通过表达的差异性,阐明肝移植急性排斥中趋化因子/趋化因子受体（CXCL12/CXCR4）轴调控淋巴细胞迁移发挥的作用和机理等系列问题。为肝移植急性排斥反应发生机制提供重要依据,同时为临床有效的治疗和控制急性排斥反应,促进移植物存活提供实验数据和理论支持。[方法]1树鼩肝移植急性排斥反应模型建立,方法同第一部分。2实验分组;（1）对照组,A组（n=25）:正常树鼩作为对照;（2）排斥组,B组（n=25）:树鼩同种异基因肝移植组;（3）AMD3100组,C组（n=25）:树鼩同种异基因肝移植静脉注射AMD3100,1mg/kg/day;（4）雷帕霉素（Rapacymin,RAPA）抑制组,D组（n=25）。术后1、3、5、7d随机处死5只,收集血液、肝脏、脾脏标本。留下5只观察生存期,绘制生存曲线。3 实验室常规指标测定:收集各组肝移植术后1d,3d,5d,7d的血清,使用血液全自动生化分析仪测定TP,ALT,AST,TB水平。4流式细胞仪检测淋巴细胞CXCR4:分别在肝移植术后1d,3d,5d,7d,收集脾脏淋巴细胞,进行分离、培养,流式细胞检测。5移植物组织形态及病理学检测:免疫组织化学染色（IHC）检测并分析CXCL12的表达情况。肝组织HE染色病理学检查,根据Banff评分系统判断排斥反应程度。6酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中CXCL12（SDF-1）蛋白量。7组织蛋白印迹（Western blot）分析与检测各组移植肝的CXCR4蛋白表达情况。[结果]1 C、D组树鼩移植后中位生存时间明显长于B组,差异有显着意义（P<0.05）,各组与 A 组比较,（P<0.05）。2树鼩肝移植术后实验室常规检查指标:对比各组树鼩肝移植术后1d,3d,5d,7d的相关指标。血清TP同时间点各组之间相比较,B、C、D组明显低于A组,差异有显着性（P<0.05）。而1d时,B、C、D,TP开始下降,但三组间比较,无显着性差异（P>0.05）。B组呈持续性下降,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,开始恢复,呈上升趋势,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性（P<0.05）。D组3d后,TP上升略高于C组,但两组统计无差异（P>0.05）。B组,C组,D组术后血清TB,ALT,AST,急剧上升,与A组在1d,3d,5d,7d同期比较,明显高于A组,差异有显着性（P<0.05）。B组持续性升高,而C、D组术后5d、7d随着时间延长,肝功能开始恢复,略有上升趋势,但较平缓,C、D组5d,7d时点与B组比较,差异有显着性（P<0.05）。而1d时,B、C、D三组间比较,无显着性差异（P>0.05）。3外周脾淋巴细胞流式细胞检测:术后1d、3d,B、C、D组间脾脏淋巴CXCR4表达无明显差异（p>0.05）,与A组有显着性差异（P<0.05）。术后5d、7d各时间点,C、D组明显低于B组,差异有显着性（P<0.05）。4移植肝脏形态学检测:采用Banff分级对移植肝脏AR的程度进行分级,A组术后各时间点,移植肝脏组织结构正常;B、C、D组1d肝小叶结构基本完好,肝细胞基本无变性、坏死,汇管区仅有少许炎性细胞浸润,未发生排斥;B组移植术后Id排斥不明确,在术后第3、5、7 d分别发生了轻度（Ⅰ级）、中度（Ⅱ级）、重度（Ⅲ级）排斥;C、D组术后3天到10天内,有少数发生了轻度AR。B组与C,D组同期比较排斥反应更为严重（P<0.05）。B组,术后3d可有明确的急性排斥反应发生。5免疫组化检测肝脏CXCL12表达:术后第7d B组CXCL12在肝脏细胞表达最高,C组、D组肝细胞CXCL12表达少,C组、D组与B组比较有显着性差异（P<0.05）。A组正常组织也有较少量的CXCL12表达,但与B组、C组、D组比较有显着性差异（P<0.05）。6酶联免疫吸附法检测树鼩外周血浆中CXCL12蛋白的表达:肝移植后`d,B组,C组,D组血清CXCL12表达相互比较均无明显差异（P>0.05）,与A组相比有显着差异（P<0.01）。移植术后3d,B组血清中CXCL12快速上升,与术前`d的表达水平相比较,有显着差别（P<0.05）,并随时间上调。C组、D组表达水平在术后5d,7d天上升缓慢,与B组同时间点比较表达水平低（P<0.05）。CXCL12蛋白的表达变化与RAI呈正相关,相关系数（r）为0.880。7 Western蛋白印迹分析检测:术后第1d各组树鼩移植肝内CXCR4蛋白表达无明显差异（P>0.05）。而术后第3d、5d、7d各时段A组、C组、D组树鼩淋巴细胞表达CXCR4蛋白明显低于B组（P<0.05）。C组、D组术后CXCR4蛋白表达高于A组（P<0.05）,而C组、D组两组之间第3d、5d、7d 比较CXCR4蛋白表达差异不明显（P>0.05）。[结论]1树鼩与人同源性较好,可用人的相关试剂应用在树鼩实验研究上,本实验研究结果的可靠性,进一步证实树鼩肝移植模型可应用于肝移植的系列实验研究中,并具有物种的优越性和价值。2树鼩肝移植模型急性排斥反应研究证实,正常肝组织有CXCL12表达,急性排斥时,可与CXCR4协同发生淋巴细胞、炎性细胞迁移至移植物,引起移植肝功能不全或受损。3趋化因子受体抑制剂AMD3100可阻断CXCL12/CXCR4轴在肝移植排斥中的作用,抑制T淋巴细胞向移植物浸润,减轻急性排斥反应。4雷帕霉素可抑制CXCL12人重组蛋白诱导的树鼩淋巴细胞迁移。其相关可能的机制为:雷帕霉素可下调CXCL12的激活与表达,并影响CXCR4受体的表达,以调控CXCL12/CXCR4信号通路所介导的淋巴细胞的运动能力,发挥其免疫抑制作用。5肝移植后CXCL12/CXCR4的表达水平与急性排斥反应的程度密切相关,表达水平与排斥反应强度有关,可评估免疫排斥反应状态。6 CXCL12血清中持续高表达可较敏感地预示肝移植急性排斥发生。检测血清CXCL12表达可作为一种无创的、敏感的早期诊断肝移植急性排斥反应的方法,为临床监测和诊断提供参考依据。并且可通过CXCL12的表达水平在一定程度上预测排斥反应的严重程度和判断抗排斥反应的治疗效果。
李善宝,李蕾,宋方彬,岑瑾,方旭,徐军明[3]（2018）在《单人直视下改良建立大鼠原位肝移植模型的体会》文中研究说明目的:建立稳定大鼠原位肝移植模型,缩短术中无肝期时间,提高手术成功率及受体存活率。方法:在Kamada"二袖套法"的基础上改进,单人直视下建立大鼠原位肝移植模型,行60例SD大鼠原位肝移植手术。本研究简化供受体麻醉方式,供肝采用经门静脉（必要时配合腹主动脉补救方式）进行冷灌注,缩短修肝时间,提前预置牵引线,固定进针位置,改进植入肝脏肝上下腔静脉吻合、肝下下腔静脉及门静脉套管。观察并记录各组大鼠供体手术、修肝套管、无肝期、受体手术及肝移植手术总时间。术后检测1,7,30天受体大鼠肝功能（血清丙氨酸转氨酶（ALT）,天冬氨酸转氨酶（AST）及总胆红素（TB））并分析生存情况。结果:无肝期结束后,供体肝脏灌注良好,受体麻醉移除后较快苏醒。供体手术、修肝套管、无肝期、受体手术及肝移植手术总时间分别为（32.5±1.58）、（7.3±1.43）、（15.6±2.62）、（53.2±3.74）、（108.5±2.34）min。大鼠术后24 h（手术成功率）为95%,1周生存率分别为90%,1月生存率分别为86.7%。大鼠术后短时间内肝功能水平增高,24 h时ALT（228.5±54.5 IU/L）,AST（439.3±86.3 IU/L）,TB（6.2±0.7μM）,1周后逐渐恢复正常。结论:改良后的方法可以简易麻醉流程,缩短无肝期,提高手术成功率及受体的生存率。
展希[4]（2018）在《HO-1对大鼠移植肝胆道缺血再灌注损伤的保护作用研究》文中认为[背景和目的]肝脏移植已成为终末期肝病的主要治疗方式,但移植肝胆道缺血再灌注损伤引起的胆道并发症是影响肝移植远期疗效的主要原因之一。因此,减轻移植肝胆道缺血再灌注损伤是目前改善移植受者预后和存活率的首要策略。HO-1是血红素代谢的限速酶,有高度的可诱导性,具有抗氧化、抗炎、调节细胞周期和调节微循环的功能,但诱导HO-1的表达是否可以减轻移植肝胆道缺血再灌注损伤,且肝移植是将供体肝脏移植给受体,应该先处理供体还是受体才能发挥更大的保护作用仍不清楚。本研究拟通过建立大鼠原位肝移植冷缺血再灌注损伤模型,构建大鼠H0-1过表达腺病毒载体和借助RNAi技术构建靶向HO-1-shRNA腺病毒载体,转入大鼠活体内诱导或沉默HO-1基因的表达,观察HO-1对移植肝胆汁分泌、转运能力的影响,同时分析HO-1与胆管上皮细胞损害、胆管炎发生及胆管上皮周围纤维化进程的内在关系,并通过改变供体和（或）受体HO-1表达来观察其对胆道缺血再灌注损伤的影响,为临床上改善肝移植术后缺血型胆道病变提供新的思路和方法。[方法]1.构建大鼠Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,并分别转入大鼠体内,24h后取出肝脏,利用Westem-blot检测HO-1蛋白表达水平,观察体内转染效果。2.大鼠原位肝移植模型的建立:根据Kamada的“二袖套法”,建立大鼠原位肝移植模型,观察术中、术后并发症及术毕24h后存活率,并取3只作为手术组与正常组大鼠比较光镜下肝脏组织形态学变化,证实大鼠肝移植缺血再灌注模型建立成功。3.大鼠体内实验研究:将320只SD大鼠按供、受体随机选取分为5组（每组供、受体各32只）,分别为A组（空白腺病毒）、B组（供体注射Adv-HO-1,受体注射空白腺病毒）、C组（供、受体均注射Adv-HO-1）、D组（供体注射Adv-HO-1-siRNA,受体注射空白腺病毒）和E组（供、受体均注射Adv-HO-1-siRNA）。各组于术前24h尾静脉分别注射空白腺病毒、Adv-HO-1、Adv-HO-1-siRNA各lml,浓度均为3×108pfu/ml。肝移植后收集lh内胆汁检测其成分,分别于术后1d、3d、7d、14d处死受体,全自动生化分析仪检测肝功酶学（ALT、AST、ALP、GGT、TBIL）,免疫组化检测 CD3+、CD45R+T淋巴细胞的浸润程度和ki67标记胆管上皮细胞增殖情况,光镜和透射电镜下观察肝脏及胆管组织形态学变化,激光共聚焦双重免疫荧光标记Laminine和CK-18,观察大、小胆管基底膜的破坏程度和连续性,检测胆汁成分并用Western-blot 分析 HO-1、Bsep、Mrp2、Ntcp 的蛋白含量。[结果]1.腺病毒转染效果检测:成功构建Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,经测序证明扩增序列正确,转染大鼠体内显示:与空病毒组相比,诱导组HO—1的蛋白表达水平上调,抑制组HO—1的蛋白表达水平下降,差异均有统计学意义（P<0.05）。2.模型建立结果:一共行大鼠原位肝移植175例,肝移植术中各种原因死亡者及术后24h内死亡者共计12例,以术后存活24h视为手术成功,手术成功163例。各组之间死亡例数无统计学差异（p>0.05）,24h后存活率约为93%（163/175）。光镜下观察手术组与正常组大鼠组织形态学变化,发现手术组组织形态学变化符合缺血再灌注损伤,证明模型建立成功。3.体内实验结果:①肝功酶学:再灌注后1d、3d、7d和14d,与A组比较,B、C 组 ALT、AST、GGT、ALP、TBIL 明显下降,D、E组 ALT、AST、GGT、ALP、TBIL明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;②免疫组化检测:再灌注后ld,E组CD3+、CD45R+T淋巴细胞等炎性细胞在汇管区浸润较A组增多,C组的炎性细胞浸润较A组减少;7d时E组ki67抗体标记胆管上皮细胞坏死、脱落、增殖较明显,C组ki67抗体标记胆管上皮细胞坏死、增殖不明显,胆管反应轻;③光镜下病理组织学变化:A组、B组和C组肝细胞变性、水肿,有炎性细胞浸润;D组和E组肝小叶结构明显紊乱,肝细胞变性、坏死、增生,汇管区大量炎性细胞浸润;④透射电镜观察超微结构:与A组相比,B组、C组胆管上皮细胞损伤较轻,线粒体不肿胀,微绒毛丰富,排列整齐,D组和E组可见胆管柱状上皮细胞明显肿胀变形,甚至导致胆管闭塞,胆管内微绒毛消失,线粒体空泡化,内质网扩张;⑤激光共聚焦双重免疫荧光检测:B、C组胆管损伤较轻,而D、E组可见胆管基底膜部分脱落,胆管损伤较重,周围肝细胞明显变性;⑥Western-blot检测:B组和C组HO—1、Mrp2、Bsep、Ntcp蛋白水平较A组、D组和E组升高更明显,差异有统计学意义（P<0.05）。[结论]1.构建了大鼠Adv-HO-1和Adv-HO-1-siRNA,并成功转染至大鼠体内。2.成功建立“二袖套”法大鼠原位肝移植模型,并采用“支架法”重建肝动脉,使其更符合临床上肝移植的病理生理改变,保证了较高的移植大鼠术后存活率,证明我们所建立的大鼠原位肝移植模型是一种稳定、便于操作的模型,值得推广。3.在肝移植术前诱导大鼠体内HO-1高表达,能明显减轻移植肝胆道缺血再灌注损伤,抑制HO-1的表达则会加重其损伤。4.优先处理供体,诱导供体HO-1的高表达比诱导受体HO-1的高表达对减轻移植肝胆道缺血再灌注损伤的作用更明显,为临床上减轻和防治肝移植术后缺血型胆道病变提供新的思路和方法。
黄兆宇,武睿超,冉江华,刘均汉[5]（2018）在《大鼠DCD供肝原位肝移植术后早期死亡的原因分析》文中研究表明目的建立稳定的大鼠心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death,DCD）供肝原位肝移植模型,分析移植后24 h内大鼠死亡原因并探索相应的改进措施。方法所有供肝获取前经历供体心脏停跳10 min,采用改良Kamada的"二袖套"吻合法完成大鼠DCD供肝原位肝移植手术,记录各个手术阶段所用时间及术后大鼠的死亡情况。结果在40 d内完成大鼠DCD供肝原位肝移植手术100例,供体手术时间为（20±5）min,受体手术时间为（55±5）min,无肝期为（20±3）min。移植术后受体一般情况可。术中死亡9例,其中术中大出血4例、麻醉意外1例、无肝期过长1例、套管置入失败1例、空气栓塞2例;术后12 h内死亡22例,其中术后肠道坏死6例、术后吻合口渗血6例、术后肺水肿3例、术中失血量过多4例、术后血管栓塞2例、不明原因死亡1例;1224 h死亡19例,其中术后肠道坏死9例、术后吻合口渗血3例、术后肺水肿2例、术中失血量过多1例、术后血管栓塞1例、不明原因死亡3例。结论导致大鼠DCD供肝原位肝移植术后早期死亡的原因很多,其中术后肠道坏死、术中及术后出血、术后肺水肿及术后血管栓塞是主要的致死因素。针对术后死亡原因采取相应的预防及改进措施能大大提高大鼠术后存活率,从而建立稳定的大鼠DCD供肝原位肝移植模型。
范林[6]（2017）在《低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其潜在机制》文中指出第一部分大鼠原位肝移植模型手术改进目的:建立大鼠原位肝移植（Rat orthotopic liver transplantation,ROLT）模型对供肝质量的评价与研究至关重要。传统的显微缝合重建管道方法耗时较长,且对吻合技术要求过高,不利于推广。Kamada二袖套法及其改良法的出现使该模型简化并趋于稳定。笔者基于此方法,针对手术中潜在危险因素和细节问题的处理进行了探讨,并且对整个ROLT术中影响大鼠术后生存率的危险因素进行分析,对肝上下腔静脉吻合（suprahepatic inferior vena cava,SHVC）技术进行改进,以期获得稳定的大鼠术后生存率。方法:雄性SPF级SD大鼠180只,体重250±20 g。实验分为三组,第一组:ROLT模型学习阶段（60只）;第二组:ROLT模型稳定阶段（60只）;第三组:ROLT模型改良阶段（60只）。在受体手术过程中,记录各个部分操作用时,包括:无肝期,肝上下腔静脉、门静脉、肝下下腔静脉及胆管的重建时间等,同时记录手术成功率。术后每天观察受体的一般状况,对术中及术后死亡的大鼠及时进行尸检。统计并比较移植术后1天及7天生存率。结果:本研究共实施大鼠原位肝移植手术90例。三个阶段无肝期相比较,第二阶段比第一阶段缩短40%,第三阶段比第一阶段缩短64%。三个阶段肝移植术后24小时存活率分别为:20%（6/30）;86.7%（26/30）;100%（30/30）。三个阶段大鼠肝移植术后一周存活率分别为 10%（3/30）,60%（18/30）及 93%（28/30）。结论:ROLT术后生存率的提升须注意对术中各细节的处理。无肝期过程中,需快速、熟练地完成SHVC的吻合。尤其是缩短无肝期可提高手术安全性,而缩短无肝期决定于手术熟练度,技术稳定性,特别是针对大鼠无肝期内环境和血液动力学改变采取有效的处理措施,可有效减少术中危险因素,提高围手术期和术后生存率,并为进一步实验奠定坚实的基础。第二部分大鼠低温携氧机械灌注系统的建立及其参数探讨目的:本研究通过比较并评估低温携氧机械灌注（Hypothermic oxygenated machine perfusion,HOPE）过程中不同压力参数下肝脏质量的变化,建立一种稳定、安全、有效的HOPE系统,实现对肝脏的精细化灌注,以达到修复和优化肝脏质量的目的,为临床研究提供思路,从而达到扩大供肝来源的目的。方法:雄性SPF级SD大鼠（220±10g）30只,根据不同的门静脉灌注压力分随机分为 5 组（n=6）,A 组:OmmHg,B 组:2mmHg,C 组:4mmHg,D 组:6mmHg及E组:8mmHg。肝脏获取后经离体冷保存（A组）或HOPE（B组、C组、D组及E组）干预3小时后,观察并记录各组肝脏湿重变化,检测灌注液中ALT、AST及LDH的含量与肝组织中MDA、糖原、乳酸盐含量以评估肝脏质量。结果:随着肝脏门静脉灌注压力的升高,各组肝脏湿重均有不同程度增加,D组及E组增加最为明显,最高达40%。同时,灌注液中ALT、AST、LDH,肝脏组织中的MDA及乳酸盐的含量随着门静脉灌注压力的升高逐渐增加,而C组肝脏中糖原含量最低,E组含量最高。结论:严格调控HOPE期间的灌注参数,将灌注压力控制在4mmHg以内,能够保证肝脏充分灌注的同时尽可能地降低灌注性损伤,从而达到修复和优化肝脏质量的目的,为临床应用提供理论依据。第三部分大鼠脂肪供肝模型的建立目的:本研究旨在建立一种稳定的大鼠脂肪供肝模型,模拟人体发病机制,为优化边缘供肝的研究奠定基础。方法:成年SPF级SD大鼠90只,雄性,体重220±10g。随机选取10只大鼠经过适应性喂养一周后取材,检测指标作为正常对照。其余80只分为两组,A组:高脂饮食组（High-fat diet,HFD）（n=40）,采取60%高脂饮食（60%脂肪,20.6%碳水化合物,19.4%蛋白。其中脂质部分包含90%猪油及10%大豆油）饲养;B组:普通饮食组（Standard chow diet,SCD）（n=40）,采用普通低脂饮食饲养,饮食诱导持续8周。造模期间观察大鼠生命体征及一般情况,每周检测其组织学及血清学变化情况。结果:与SCD组相比,HFD组血清中ALT和AST水平均无统计学差异。HFD组血清TG水平在第1、2周上升较快,达到正常值的两倍以上,在随后的第3-8周内逐渐降至正常值。HFD组血糖、胰岛素及肝组织脂质含量与SCD组比较有明显统计学差异（P<0.05,P<0.05和P<0.01）。各组脂肪肝中MDA含量无明显差异（P>0.05）。随着造模时间延长,肝脏脂肪变性程度逐渐加重,第1-3周以小泡型脂肪变性为主,第4-8周则以大泡型脂肪变性为主。结论:选择不同造模时间来诱导实验所需程度的大鼠肝脏脂肪变性,本组脂肪供肝的模型验证了该配方的有效性及稳定性,并为进一步实验提供可靠稳定的大鼠脂肪供肝模型。第四部分低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其机制目的:器官供需严重失衡,脂肪供肝质量的优化可提高使用率,有益于扩大供体器官的来源。本研究拟分析静态冷保存（Static Cold storage,SCS）与低温携氧机械灌注（Hypothemic oxygenated machine perfusion,HOPE）对脂肪肝的作用,进一步探讨 HOPE对于脂肪供肝的质量优化作用及其潜在机制。方法:成年SPF级SD大鼠44只,雄性,体重220±10g,采用普通饲料（A组）或60%高脂饲料（B-D组）进行饲养。分为4组:A组（11只）:非脂肪变性肝脏获取后,置于UW液（0-4℃）中保存45分钟（修肝）后移植。B组（11只）:脂肪变性肝脏获取后在0-4℃的保存液中4小时后移植。C组（11只）:脂肪变性肝脏获取后经历3小时HOPE以及1小时CS后移植。D组（11只）:脂肪变性肝脏获取后经历3小时HOPE+1小时CS（灌注液中增加脱脂药）后移植。通过记录肝脏灌注过程中的参数,Western blot 检测肝脏组织中 KLF-2、eNOS、ICAM-1、HMGB1、TLR4、PRDX6、Caspase-3、PP2A、PPY、GRP78、CHOP 与 ATF-6 蛋白表达水平,Tunel 检测各组中肝细胞凋亡情况,试剂盒检测肝脏组织中ATP与肝糖原含量,比较各组移植术后生存率,综合评价肝脏质量。结果:比较门静脉开放1min后各组肝脏复灌情况,结果显示A组脂肪供肝复灌效果最佳,B组效果最差;与B组相比,C组与D组微循环相关蛋白KLF2及eNOS表达明显升高,同时D组表达最高,且差别有统计学意义（P<0.05）,而ICAM-1蛋白水平明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）;HMGB1与TLR4在C组与D组的表达水平明显下降,B组中表达量最高,而PRDX6在B组中明显降低,三者差别均有统计学意义（P<0.05）,表明经HOPE与DF干预之后的脂肪供肝炎症损伤明显减轻,抗氧化损伤能力明显增强;C组与D组内质网应激相关蛋白PPY、GRP78、CHOP、ATF-6表达较B组呈下降趋势,其中D组表达最低,反之C组与D组中PP2A表达升高,B组表达最低,三者差异有统计学意义（P<0.05）,同时Tunel结果证实:与B组相比,C组与D组肝细胞凋亡得到明显抑制。移植术后24小时肝脏组织中ATP与糖原含量结果显示,B组中ATP含量较低,而C与D组中ATP含量明显升高,反之,肝糖原含量在B组中较高,三者差异有统计学差异（P<0.05）;比较各组移植术后生存曲线发现,C组与D组移植术后生存率较B组明显升高。结论:低温携氧机械灌注通过改善脂肪供肝微循环,抑制内质网应激,稳定线粒体功能促进ATP合成,清除炎症因子等减轻缺血再灌注损伤,从而提高移植术后受者生存率,为临床应用HOPE提供了理论依据。脱脂药在低温状态下无法促进脂肪供肝的脂质分解,但可以进一步改善微循环、抑制炎症因子的释放等,从而优化肝脏质量。为脂肪肝应用于移植提供理论依据。
陈强星,李坤,孔伟浩,张剑[7]（2017）在《单人直视下改良建立大鼠原位肝移植模型》文中研究指明目的探讨简便、有效的大鼠原位肝移植模型建立方法。方法基于"二袖套法",采用单人直视下改良建立大鼠原位肝移植模型的方法对30对SD大鼠行不重建肝动脉的原位肝移植手术。对麻醉、供肝获取、供肝灌注、修肝、受体肝脏切除、受体胆道重建等重要操作步骤进行改良,无肝期受体采用小剂量肝素化方案。观察并记录肝移植手术过程中供肝灌注前供体手术时间、供肝冷缺血时间、无肝期时间、受体手术时间和肝移植手术总时间。术后对30只受体按随机数字表法随机分为A、B两组,其中A组10只,用于检测肝功能;B组20只,用于观察生存情况。生存分析采用KaplanMeier生存曲线。结果灌注后供肝良好,受体大鼠移植术后一般状况良好,手术过程中供肝灌注前供体手术时间、供肝冷缺血时间、无肝期时间、受体手术时间、肝移植手术总时间分别为（18.5±1.6）、（75.1±3.8）、（20.5±1.8）、（58.3±3.1）、（118.0±4.2）min。A组大鼠肝移植术后2周肝功能逐渐好转,B组大鼠术后1周生存率为100%,2周为90%,1个月为75%。结论单人直视下改良建立大鼠原位肝移植模型是一种简便、有效的方法。
李温凯[8]（2016）在《CaM/CaMK Ⅱ对大鼠肝移植术后肝细胞线粒体损伤、凋亡的影响》文中认为[目的]通过双向调节CaMK Ⅱ水平,探讨大鼠肝移植术后CaM/CaMK Ⅱ对肝细胞线粒体损伤、凋亡的影响。[方法]将健康雄性SD大鼠随机分为5组（A、B、C、D、E组）,每组10对,行kamada二套管法建立SD-SD大鼠原位肝移植,在供体肝脏取下后分别从从门静脉输注表达CaMK ⅡγshRNA（A组）、CaMK Ⅱγ（B组）的慢病毒载体及CaMK ⅡγshRNA慢病毒空白载体（C组）、CaMK Ⅱγ的慢病毒空白载体（D组）转染供肝,对照组（E组）输注生理盐水,术后各1d、3d、7d、14d分别用Western bolt检测CaM、CaMK Ⅱ、cytochrome C、ALF水平,QRT-PCR检测CaM、CaMK ⅡγmRNA水平,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。[结果]1、成功建立kamada“二袖套法”大鼠原位肝移植模型。2、A组各时点肝CaM、CaMK Ⅱ、Cyt C、AIF、水平低,差异有统计学意义（P<0.01）。B组各时点肝CaM、CaMK Ⅱ、Cyt C、AIF、水平高,差异有统计学意义（P<0.05）。QRT-PCR检测：A组各时点CaM mRNA水平低、CaMK ⅡmRNA水平低,差异有统计学意义（P<0.05）。B组各时点CaM mRNA水平低、CaMK ⅡmRNA水平高,差异有统计学意义（P<0.05）。C、D、E组差异无统计学意义（P>0.05）。流式细胞仪检测细胞凋亡水平：A组最低,B组最高,C、D、E组无显着差异。[结论]大鼠肝移植术后,对CaM/CaMK Ⅱ信号通路中CaMK Ⅱ的下调、可以有效减少肝细胞Cyt C、AIF蛋白的水平,降低肝脏线粒体损伤、细胞凋亡的程度。
刘驳强[9]（2016）在《CaMKⅡ表达调控对大鼠肝移植术后肝功能及细胞凋亡的变化研究》文中认为[目的]本研究分为三个部分,第一部分为大鼠原位肝移植模型的建立；第二部分为构建CaMKⅡγshRNA和CaMKⅡγ的慢病毒表达体系;第三部分为探讨Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路对大鼠肝移植术后细胞凋亡的影响。[方法]1、大鼠原位肝移植模型的建立。通过双人操作训练建立大鼠原位肝移植模型。2、探讨Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路对大鼠肝移植术后细胞凋亡的影响,将健康雄性SD大鼠随机分为5组（A、B、C、D、E组）,每组20只,行SD-SD大鼠原位肝移植,在供体肝脏取下置入保存液后从门静脉输注表达CaMKⅡγshRNA（A组）、表达CaMKⅡγ的慢病毒载体（B组）转染大鼠供肝,与CaMKⅡγshRNA慢病毒空白载体（C组）、CaMKⅡγ的慢病毒空白载体（D组）及输注生理盐水的对照组（E组）进行对比,对比术后1d、3d、7d、14d各组Ca2+、ALT、AST水平以及肝细胞凋亡情况,探讨Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路对大鼠肝移植术后细胞凋亡的影响。[结果]1、经训练成功建立SD-SD大鼠原位肝移植模型。2、通过对供肝离体局部灌注转染成功,在对CaMKⅡ选择性特异阻断（A组）后,其细胞内Ca2+水平,血清ALT, AST的水平低于其他组（B、C、D、E组）,差异有统计学意义（P<0.05）,在使CaMKⅡ选择性表达上调时（B组）,其胞质内Ca2+水平,血清ALT, AST的水平高于其他组（A、C、D、E组）,差异有统计学意义（P<0.05）。且空载体组（C、D组）与对照组（E组）其胞质内C82+的水平,血清ALT, AST的水平无明显差异（P>0.05）。[结论]1、糖皮质激素可能提高大鼠原位肝移植存活率。2、Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号通路的选择性阻断可以明显降低移植后肝细胞内的Ca2+水平从而有效减少缺血再灌注损伤及细胞凋亡的发生,为临床治疗移植后肝功能不全和防治缺血再灌注损伤提供新的研究方向。
吴莉[10]（2016）在《饱和氢气生理盐水对大鼠肝移植术后急性肾损伤的保护作用及机制研究》文中提出目的:研究饱和氢气生理盐水对大鼠原位肝移植术后急性肾损伤的保护作用,并进一步探讨自噬参与其肾脏保护效应的分子机制。方法:健康成年雄性SD大鼠56只,周龄810周,体重220250 g,采取随机数字表法随机分为4组（n=8）:假手术组、大鼠原位肝移植模型组（OLT组）、饱和氢气生理盐水处理组（HS组）及氯喹预处理组（CQ组）,其中假手术组8只,其它三组均为8对。假手术组行单纯开关腹操作,并游离相应血管和肝周韧带;大鼠原位肝移植模型组建立大鼠原位肝移植模型,并于无肝期前5 min经下腔静脉缓慢注射生理盐水6 ml/kg;饱和氢气生理盐水处理组于无肝期前5 min经下腔静脉缓慢注射饱和氢气生理盐水6 ml/kg,其它操作同大鼠原位肝移植模型组;氯喹预处理组于模型建立前1 h经腹腔注射自噬特异性抑制剂氯喹60mg/kg,其它处理同饱和氢气生理盐水处理组。再灌注后6 h抽取静脉血样和肾组织检测血清学和组织学指标,通过检测血清尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）水平评价肾功能情况,测定肾组织丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性评价肾脏氧化应激程度,通过伊红-美蓝（HE）染色于光学显微镜下观察肾组织形态学改变,并行肾小管损伤评分;采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）染色法定量检测肾小管上皮细胞凋亡情况,计算凋亡指数;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测活化的caspase-3、细胞色素c（Cyt c）等凋亡相关m RNA的表达水平;通过蛋白免疫印迹法（western blot）检测磷酸化p53（p-53）、微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、Beclin-1、活化的caspase-3和细胞色素c（Cyt c）等自噬及凋亡相关蛋白的表达水平;并且通过透射电子显微镜观察自噬小体和自噬溶酶体的形成情况以及肾小管上皮细胞超微结构改变。结果:与假手术组比较,OLT组肾功能显着降低,肾小管上皮细胞出现空泡及管型,肾小管损伤评分增加,肾脏氧化应激水平升高,细胞凋亡明显增加,凋亡指数升高,活化的caspase-3和Cyt c的表达水平显着上调,p53磷酸化、LC3Ⅱ及Beclin-1的表达水平差异无统计学意义;与OLT组比较,HS组大鼠肾功能明显改善,肾组织空泡样改变减少,肾小管损伤评分降低,肾脏氧化应激损伤减轻,细胞凋亡明显减少,凋亡指数降低,并且活化的caspase-3和Cyt c的表达水平显着降低,与此同时,p53磷酸化、LC3Ⅱ及Beclin-1的表达明显上调,透射电镜下可见自噬小体和自噬溶酶体的形成增加;与HS组比较,CQ组大鼠肾功能降低,肾组织病理学损伤严重,肾小管损伤评分和凋亡指数升高,肾脏氧化应激水平升高,细胞凋亡增加,活化的caspase-3和Cyt c的表达水平上调,LC3Ⅱ及Beclin-1的表达下调,p53磷酸化的表达水平差异无统计学意义,应用氯喹抑制自噬后部分抵消了饱和氢气生理盐水的肾脏保护效应。结论:饱和氢气生理盐水可通过调控p53磷酸化的表达,诱导细胞自噬的激活,并且自噬激活通过抑制肾小管上皮细胞凋亡、减轻肾脏氧化应激损伤等途径缓解大鼠原位肝移植术后急性肾损伤。
二、改良Kamada法大鼠原位肝移植模型的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、改良Kamada法大鼠原位肝移植模型的建立（论文提纲范文）
（1）CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠CaMKⅡγ基因慢病毒的构建及鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 建立SD大鼠DCD原位肝移植模型 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CaMKⅡγ在不同热缺血时间与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 慢病毒介导CaMKⅡγ与大鼠DCD原位肝移植缺血-再灌注损伤的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 树鼩原位肝移植模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 树鼩淋巴细胞CXCL12/CXCR4基因迁移和表达的体外实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4表达的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）单人直视下改良建立大鼠原位肝移植模型的体会（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物 |
| 1.1.2 器械耗材 |
| 1.1.3 麻醉及其他试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 术前准备 |
| 1.2.2 手术过程 |
| 1.2.3 主要观测指标 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（4）HO-1对大鼠移植肝胆道缺血再灌注损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分: 大鼠HO-1和HO-1-siRNA腺病毒载体的构建及转染效果检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 大鼠肝移植缺血再灌注损伤模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 诱导和siRNA沉默供、受体大鼠HO-1的表达对大鼠移植肝胆道缺血再灌注损伤的保护作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）大鼠DCD供肝原位肝移植术后早期死亡的原因分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 手术方法 |
| 1.3.1 术前准备 |
| 1.3.2 供体手术 |
| 1.3.3 受体手术 |
| 1.3.4 术后处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 术中大鼠死亡的主要原因及改进措施 |
| 3.1.1 术中出血 |
| 3.1.2 麻醉意外 |
| 3.1.3 缩短无肝期、减少套管失败导致的出血及空气栓塞 |
| 3.2 术后24 h内主要死亡原因及改进措施 |
| 3.2.1 肠道坏死 |
| 3.2.2 肺水肿 |
| 3.2.3 血管栓塞 |
（6）低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其潜在机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 大鼠原位肝移植模型手术改进 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 附图 |
| 第二部分 大鼠低温携氧机械灌注系统的建立及其参数探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 附图 |
| 第三部分 大鼠脂肪供肝模型的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 附图 |
| 第四部分 低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其潜在机制 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 附图 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 攻博期间发表的科研成果目录 |
| 致谢 |
（7）单人直视下改良建立大鼠原位肝移植模型（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、手术方法 |
| (一)术前准备 |
| (二)手术模拟训练及预实验 |
| (三)手术过程 |
| (四)术后处理 |
| 三、观察指标 |
| 四、统计学方法 |
| 结果 |
| 一、手术模拟训练及预实验情况 |
| 二、围手术期情况 |
| 三、生存分析 |
| 讨论 |
（8）CaM/CaMK Ⅱ对大鼠肝移植术后肝细胞线粒体损伤、凋亡的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 大鼠原位肝移植模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CaM/CaMK Ⅱ水平对大鼠肝移植术后肝细胞线粒体损伤、凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献论着 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）CaMKⅡ表达调控对大鼠肝移植术后肝功能及细胞凋亡的变化研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠原位肝移植模型的建立 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 表达CaMKⅡγ/CaMKlI γsbRNA的慢病毒表达体系对大鼠原位肝移植术后肝功能及细胞凋亡影响的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论着 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）饱和氢气生理盐水对大鼠肝移植术后急性肾损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 1 对象和方法 |
| 1.1 对象 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 饱和氢气生理盐水的制备 |
| 1.2 实验动物分组和模型建立 |
| 1.2.1 实验动物分组 |
| 1.2.2 大鼠原位肝移植模型的建立 |
| 1.2.3 大鼠原位肝移植术中平均动脉血压的监测 |
| 1.3 标本采集 |
| 1.3.1 血液标本的采集 |
| 1.3.2 肾组织标本的采集 |
| 1.4 项目检测与方法 |
| 1.4.1 血清尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）的检测 |
| 1.4.2 肾组织丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的检测 |
| 1.4.3 肾组织病理学检测 |
| 1.4.4 TUNEL检测肾小管上皮细胞凋亡情况 |
| 1.4.5 凋亡相关mRNA的检测 |
| 1.4.6 肾小管上皮细胞超微结构的检测 |
| 1.4.7 自噬及凋亡相关蛋白的检测 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 大鼠肝移植术中平均动脉血压的改变 |
| 2.2 各组大鼠肾功能和氧化应激水平比较 |
| 2.3 各组大鼠肾组织病理学改变 |
| 2.4 各组大鼠凋亡情况比较 |
| 2.5 肾小管上皮细胞超微结构改变 |
| 2.6 各组大鼠自噬相关蛋白的比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 动物模型的建立 |
| 3.1.1 实验动物的选择 |
| 3.1.2 大鼠原位肝移植模型的建立 |
| 3.2 肝移植术后急性肾损伤的机制 |
| 3.3 氢气与急性肾损伤 |
| 3.4 自噬与急性肾损伤 |
| 3.4.1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制自噬 |
| 3.4.2 急性肾损伤诱导自噬 |
| 3.4.3 自噬调控的分子机制 |
| 3.4.4 自噬参与肾损伤保护的机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 含氢液/氢气用于器官功能保护的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、改良Kamada法大鼠原位肝移植模型的建立（论文参考文献）
- [1]CaMKⅡγ在大鼠DCD肝移植缺血-再灌注损伤作用的研究[D]. 张黎. 昆明医科大学, 2019(05)
- [2]树鼩肝移植急性排斥反应中CXCL12/CXCR4作用的实验研究[D]. 唐波. 昆明医科大学, 2018(05)
- [3]单人直视下改良建立大鼠原位肝移植模型的体会[J]. 李善宝,李蕾,宋方彬,岑瑾,方旭,徐军明. 现代生物医学进展, 2018(14)
- [4]HO-1对大鼠移植肝胆道缺血再灌注损伤的保护作用研究[D]. 展希. 昆明医科大学, 2018(01)
- [5]大鼠DCD供肝原位肝移植术后早期死亡的原因分析[J]. 黄兆宇,武睿超,冉江华,刘均汉. 中国普外基础与临床杂志, 2018(03)
- [6]低温携氧机械灌注对大鼠脂肪供肝的修复作用及其潜在机制[D]. 范林. 武汉大学, 2017(06)
- [7]单人直视下改良建立大鼠原位肝移植模型[J]. 陈强星,李坤,孔伟浩,张剑. 中华肝脏外科手术学电子杂志, 2017(02)
- [8]CaM/CaMK Ⅱ对大鼠肝移植术后肝细胞线粒体损伤、凋亡的影响[D]. 李温凯. 昆明医科大学, 2016(02)
- [9]CaMKⅡ表达调控对大鼠肝移植术后肝功能及细胞凋亡的变化研究[D]. 刘驳强. 昆明医科大学, 2016(02)
- [10]饱和氢气生理盐水对大鼠肝移植术后急性肾损伤的保护作用及机制研究[D]. 吴莉. 天津医科大学, 2016(03)