一、阿尔茨海默病核酸疫苗的构建及诱导体液免疫反应的初步研究（论文文献综述）
张洪亮[1]（2021）在《伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析》文中研究说明伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）,是一种可感染猪、牛、羊等家畜,犬猫等宠物,家兔、狐、貉、水貂等毛皮动物和野生动物,以引起发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎等主要临床症状的疱疹病毒。该病毒可感染各年龄段的猪群,主要造成种猪繁殖障碍、仔猪发生神经系统和呼吸道症状。自2011年PRV变异株出现以来,导致Bartha-K61等传统疫苗的保护力有所降低,我国多个地区已免疫PRV疫苗的猪场发生伪狂犬病疫情,严重威胁了我国生猪养殖业的健康可持续发展。因此,本研究开展了PRV变异株的病原学、快速鉴别诊断技术、新型基因工程疫苗、转录组和蛋白质组学的研究,为该病有效防控奠定技术和理论基础。取得的主要研究成果有:1.本研究对山东某Bartha-K61疫苗免疫猪场感染的PRV野毒株进行了分离鉴定,成功分离鉴定到PRV SD-2017株,并完成了生物学特性分析。基于g E、TK和g B等毒力基因的遗传进化分析,确定该毒株为我国当前流行的PRV变异毒株。透射电镜观察病毒粒子直径大约在140～180 nm,有厚囊膜,囊膜表面有放射状纤突,粒子核心致密,呈现出疱疹病毒典型的病毒粒子形态结构。该毒株在PK-15细胞上的病毒滴度可达到109.0TCID50/m L,对家兔的半数致死量(LD50)为3.2×102.0TCID50/m L。2.针对PRV疫苗株与野毒株的鉴别诊断,筛选到特异性引物和探针,成功建立了PRV g B和g E基因的酶促重组等温扩增（ERA）荧光检测方法。g B和g E基因的ERA检测方法的敏感性分别为10copies/μL、103copies/μL,与荧光定量PCR方法比对,g B和g E基因检测结果符合率分别为100%和92.31%。该方法在38℃恒温反应25 min,能够实现对PRV g B和g E基因的特异性鉴别检测,将反应体系进行预冻干后,可组装成检测试剂盒进行现场应用,可有效应用于PRV野毒和疫苗毒的临床快速诊断。3.以PRV变异毒株SD-2017株作为亲本毒株,利用同源重组技术对g E/g I/TK毒力基因进行了缺失,分别构建了PRV SD-2017Δg E/g I株和SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株,并分析了其一步生长曲线、致病性等生物学特性,基因缺失株的病毒含量在PK-15细胞上仍能达到108.0TCID50/m L,SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株对家兔的LD50>1.0×106.0TCID50/m L,为针对PRV变异株开发基因缺失灭活疫苗和减毒活疫苗提供了理想的候选疫苗种毒。4.将树突状细胞靶向诱导肽DCpep作为分子内佐剂,脑膜炎奈瑟氏球菌Por B蛋白作为疫苗佐剂,分别构建了含有蛋白分泌信号肽gp67的重组杆状病毒Ac-g B-DCpep和Ac-Por B,利用昆虫细胞真核表达系统进行了PRV g B-DCpep蛋白融合表达和Por B蛋白真核表达,基于前期研究构建的PRV毒力基因缺失株,分别制备了PRV SD2017株Δg E/g I/TK三基因缺失活疫苗和Δg E/g I双基因缺失灭活疫苗,与g B-DCpep基因工程亚单位疫苗、Bartha K61活疫苗一同在家兔上进行了对PRV变异株感染的免疫保护效果评价。构建的SD2017Δg E/g I/TK减毒活疫苗、PRV-g B+Por B亚单位疫苗和SD2017Δg E/g I+Por B灭活疫苗,在家兔上显示了对变异株SD-2017良好的免疫保护作用。结果说明DCpep可作为潜在的分子佐剂,Por B蛋白可以作为新型疫苗佐剂,对体液免疫和细胞免疫均具有显着的诱导刺激作用,后续可应用于新型基因工程疫苗的制备,为PRV新型疫苗开发提供了新的策略。5.基于Illumina转录组测序技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的转录组差异进行了全面分析,发现差异上调的基因多集中在细胞周期、m TOR信号通路、自噬-动物、PI3K-Akt信号通路、细胞衰老、癌症的途径、胞吞作用、HTLV-I感染、ap1信号通路、MAPK等信号通路。差异下调的基因多集中在有氧化磷酸化、RNA转运、碳代谢、HTLV-I感染、人乳头瘤病毒感染和MAPK等信号通路。差异表达下调的基因富集最多的通路是核糖体、氧化磷酸化RNA转运、m RNA监测途径、卵母细胞减数分裂、内质网中的蛋白质加工、丙酸酯代谢、基因复制、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、生热等信号通路。相关基因的其生物学意义需要进一步研究揭示。6.利用TMT标记定量蛋白质组学技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的蛋白质组学差异进行了全面分析,解析了差异蛋白参与不同毒力PRV感染细胞中的生物学过程、分子功能及细胞定位。差异蛋白涉及的主要信号通路有抗原处理和展示、初级胆汁酸合成、醚脂质代谢、矿物质吸收、过氧化物酶体、HTLV-I感染、催产素信号通路、单纯疱疹感染、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染、细胞衰老、趋化因子信号通路、Notch信号通路等。PRV病毒-宿主细胞相互作用的机制值得进一步研究,尤其是蛋白质组差异中涉及的关键基因如何调节PRV感染方面,将有助于更好地了解PRV的特定感染机制。另外,本研究通过PRV感染PK15细胞的转录组和蛋白质组GO功能富集关联性分析发现,两者在细胞部分、细胞、细胞器部分大分子复合物、催化活性、结合、细胞过程、代谢过程等方面的显着差异相关联,为后续深入研究不同PRV毒株的致病机理提供了有利条件。
张霞[2]（2020）在《基于酵母的疱疹病毒疫苗的设计和制备》文中研究表明阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种神经退行性疾病,它的发生、发展过程与遗传、表观修饰、环境等因素有关,关于阿尔茨海默病的学说有很多种,主要包括“胆碱功能障碍假说”、“淀粉样蛋白级联假说”、“tau蛋白假说”、“病毒感染假说”等。一直以来,对于AD药物的研发重点都放在消除Aβ的沉积,以期望改善患者的认知功能障碍,但有关药物研发的相继失败证明此途径行不通。近两年提出的“病毒感染假说”是指AD是由1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus 1,HSV-1）感染引起的,而这一假说的提出使得HSV重新进入人们的视野中。单纯疱疹病毒可以引起Aβ的沉积和tau蛋白的过度磷酸化,而这两者是AD的主要神经病理学特征。一直以来,人们普遍认为Aβ沉积所形成的老年斑是AD的罪魁祸首,因此Aβ一度成为众矢之的,但是Aβ也是抗菌肽,具有抗细菌、抗真菌以及抗病毒的作用。研究表明Aβ可以包裹疱疹病毒,以保护神经元不受损伤。目前,对于HSV-1的治疗是使用一些抗病毒药物,如阿昔洛韦等,但这些抗病毒药物也只是缓解患者的疼痛程度及降低发生频率,并不能达到治愈的目的。所以对于HSV-1的感染,最有效的方法就是预防,也就是接种疫苗。实验室的前期研究结果表明,蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase,PDI）可以增加外源蛋白在毕赤酵母中的表达量,所以本研究采用过表达PDI的毕赤酵母X-33-PDI作为外源蛋白的表达菌株,以增加外源蛋白的表达量。从疫苗的角度出发,考虑到目前疫苗主要是注射型疫苗,而这种疫苗研发过程中需要蛋白纯化,成本高,而且运输过程中必须保证全程冷链,使用时也需要专业的医护人员才可以操作,所以我们采用酵母表面展示技术构建酵母口服疫苗,酵母展示体系包含三部分:M细胞特异性配体,起到靶向性作用;HSV-1包膜糖蛋白D,病原体蛋白,即抗原;α凝集素,锚定蛋白。酵母表面展示菌株构建成功后,我们利用荧光显微镜观察了目的蛋白在酵母表面的定位情况,发现与对照组相比,实验组菌株的表面可以观察到绿色荧光,而对照组菌株无绿色荧光,证明目的蛋白已经被成功诱导表达,且被展示在酵母表面上;同时利用免疫印迹实验验证了目的蛋白的表达情况,提取酵母细胞壁蛋白做western blot实验,结果发现在实验组的细胞壁中检测到目的蛋白,而胞外产物中不含有目的蛋白,这再次验证了目的蛋白已被表达且定位在酵母细胞壁上,并未出现泄漏的情况,同时对照组的细胞壁蛋白及胞外产物中均未检测到目的蛋白。以上验证成功的菌株经过目的蛋白的诱导表达后,给BALB/c鼠口服饲喂使用,饲喂时间分别为第1、3、5、7、9、11周,每周饲喂5天,然后定期收集小鼠血液样本及粪便样本,血样样本经离心后获得血清,粪便样本处理成匀浆后离心获得上清,采用ELISA的方法验证特异性抗体浓度,结果表明,血液样本中的特异性抗体IgG,粪便样本中的特异性抗体IgA随着时间的延长逐渐增多,与对照组小鼠相比,实验组小鼠具有显着性差异,证明可以有效引起体液免疫应答及粘膜免疫应答,这为HSV-1的疫苗研发奠定了实验基础,有望用于单纯疱疹病毒感染的预防,同时也可能为AD的干预打开一扇新的大门。
赵冠宇[3]（2019）在《表达高致病性猪蓝耳病GP3、GP5基因DNA疫苗构建及实验免疫研究》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起猪繁殖与呼吸综合征,其特征是易感猪生殖健康状况变差,死亡率升高,特别是在幼龄动物和呼吸系统疾病中。它是世界范围内猪肉生产国的重要疾病,导致母猪繁殖失败和仔猪呼吸道疾病,这会导致区域性疾病的发生和慢性经济损失。GP5蛋白分子量约为25kDa,含有中和抗原表位,通常认为中和抗体的产生与它密切相关。GP3是分子量约为28kDa的高度糖基化结构蛋白,通常认为它对可能影响蛋白的中和活性。该病毒具有已知最高的RNA病毒突变率之一,是开发保护性疫苗的主要障碍,DNA疫苗在疫苗生产中显示了较好的应用前景,可引起宿主产生体液免疫及细胞免疫的免疫应答反应,以达到预防和治疗疾病的目的。本试验以美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD株GP3、GP5基因为研究对象,以pVAX1为载体,构建重组核酸疫苗质粒pVAX-N35HP,并对构建的质粒进行鉴定。将鉴定正确的核酸疫苗质粒pVAX-N35HP与佐剂A1、A2、A3、A4、A8联合使用,免疫分组为pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2、pVAX-N35HP+A3、pVAX-N35HP+A4和pVAX-N35HP+A8,对小鼠及健康仔猪的免疫效果进行评价。实验期间小鼠每周采血分离血清,检测中和性抗体、GP3和GP5抗体、IL-4及IFN-γ水平;处死后分离脾淋巴细胞进行T淋巴细胞亚群数量的检测。结果表明,pVAX-N35HP+A3组中和性抗体滴度最高,达到1:16,与商品化灭活疫苗抗体滴度相同;pVAX-N35HP+A3组IL-4水平达到165.74 pg/μl,高于商品化灭活疫苗组;IFN-γ水平达到342.67 pg/μl,高于商品化灭活疫苗组;淋巴细胞亚群检测结果显示,pVAX-N35HP+A1组具有最高CD3+CD4+T淋巴细胞百分数,为24.37%,略低于商品化灭活疫苗组;pVAX-N35HP组具有最高CD3+CD8+T淋巴细胞百分数,达到45.21%,高于商品化灭活疫苗组T细胞百分数。表明pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3可引起小鼠较强的细胞免疫和体液免疫,具有良好的免疫效果。选择小鼠免疫效果较好的pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3免疫仔猪,进行猪体免疫效果评价。免疫后仔猪每周前腔静脉采血,分离血清进行中和性抗体和细胞因子等检测,35天时无菌分离外周血淋巴细胞进行T细胞亚类鉴定,同时准备攻毒保护试验,攻毒毒株为PRRSV GD株,攻毒剂量2×105TCID50。攻毒后每天检测仔猪直肠体温,观察仔猪健康状态,14天后剖杀猪只,采集心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结进行病毒载量检测,制作肺部组织病理切片。结果显示,pVAX-N35HP+A1组和pVAX-N35HP+A3组具有最高的中和抗体滴度,达到1:18,低于商品化灭活疫苗组,但统计差异不显着（p>0.05）;pVAX-N35HP+A1具有最高的IFN-γ水平,达到227.37 pg/μl,是pVAX-N35HP组1.22倍,但统计学差异不显着（p>0.05）,高于商品化灭活疫苗组,统计学差异显着（p<0.05）;pVAX-N35HP+A3组IL-4水平最高,为136.77 pg/μl,高于商品化灭活疫苗组,且统计学差异极显着（p<0.01）;pVAX-N35HP+A1组CD3+CD4+T淋巴细胞百分数为36.16%与商品化灭活疫苗组统计学无差异（p>0.05）;pVAX-N35HP+A3组CD3+CD8+T淋巴细胞百分数达到62.37%,略高于商品化灭活疫苗组,统计学无差异（p>0.05）;攻毒后每日观察仔猪状态,各免疫组体温及健康状态均好于阴性对照组;攻毒后14天,检测组织内病毒载量,肺部检测结果显示pVAX-N35HP+A1组最低,为2.14×103 copies/g,低于商品化灭活疫苗组,pVAX-N35HP组、pVAX-N35HP+A2组和pVAX-N35HP+A3组高于商品化灭活疫苗组但处于相同数量级。颌下淋巴结检测结果显示pVAX-N35HP+A1组最低,为7.25×103 copies/g,低于商品化灭活疫苗组。腹股沟淋巴结检测结果显示pVAX-N35HP+A1组最低,为8.70×103 copies/g,低于商品化灭活疫苗组。肺部病理切片结果显示各免疫组肺部结构均好于阴性对照组。pVAX-N35HP+A3可显着提高仔猪体内细胞免疫和体液免疫水平,强毒攻击时显示良好的保护效果,可作为预防和保护仔猪免受高致病性猪繁殖与呼吸综合征的候选疫苗,为未来的疫苗研制提供参考。
李高[4]（2019）在《N端截短与修饰的β-淀粉样蛋白的疫苗及抑制剂研究》文中研究表明β-淀粉样蛋白（Aβ蛋白）在患者大脑内的异常聚集和沉积被认为是导致阿尔茨海默病（AD）的重要原因之一。淀粉样沉积级联假说认为:Aβ蛋白聚集过程中形成的寡聚体和纤维等对神经元有很强的毒性,会导致神经元死亡,从而出现记忆力衰退等症状。在AD患者大脑内存在各种不同长度、不同修饰类型的Aβ蛋白,而目前研究得比较广泛和深入的是Aβ1-40和Aβ1-42,即全长无修饰的Aβ蛋白。研究者们针对这类Aβ开发了多种策略,希望能通过降低Aβ蛋白的含量或者抑制Aβ蛋白的聚集来实现对AD病理过程的缓解。遗憾的是,虽然上述策略在AD模型小鼠上取得了一定的效果,但目前这些策略在临床上尚无正面有效的结果。一方面可能是Aβ蛋白对神经元细胞的损伤已经不可逆转,这提示我们需要开发预防性的策略。另一方面有研究表明患者大脑内存在的N端截短或修饰的Aβ蛋白聚集更快、毒性更大,而之前的策略可能没有靶向这些形式的Aβ蛋白。研究表明,3位焦谷氨酸化的Aβ蛋白(p EAβ3-X)可以诱导无修饰的Aβ蛋白形成毒性寡聚体,而针对无修饰Aβ蛋白N端的抗体无法结合p EAβ3-X。基于此,本论文设计合成了针对焦谷氨酸Aβ的疫苗,经过对B表位和辅助T辅助细胞表位的筛选,得到了能诱导产生较高抗体滴度的多肽疫苗p EAβ3-15-P2。对AD模型小鼠的预防性免疫结果表明,该疫苗可以很好缓解小鼠的认知障碍症状并降低小鼠脑内的Aβ斑块沉积。目前除了抗体之外,尚无其他分子可以特异性的识别/区分N端截短与修饰的Aβ,这阻碍了对它们的功能研究。本论文通过等温滴定量热法、质谱等实验,证明了葫芦[7]脲和葫芦[8]脲对N端截短的Aβ4-X有更强的结合(相比Aβ1-X)。进一步的Th T聚集动力学、透射电子显微镜实验和细胞毒性实验表明,葫芦[7]脲和葫芦[8]脲能更好的抑制Aβ4-40的聚集和毒性(相比Aβ1-40)。本论文利用化学动力学模拟研究了色氨酸-糖缀合物与中药提取物分子的抑制机理,并通过联合应用这两者实现了对Aβ蛋白聚集更强的抑制。这些结果为开发AD的治疗策略提供了新的思路。
彭颜梅[5]（2018）在《基于药用酶的自聚化Aβ表位疫苗制备及免疫药理学研究》文中认为疫苗是预防与治疗人类重大疾病的重要策略,也是现代生物技术药物的主要组成。抗原纯度高、针对性强、副反应少、制备简单的表位疫苗已成为现代疫苗发展的主流方向。然而,表位分子量小、结构简单、应答机制单一的生物学性质极大程度地限制了其免疫原性,并影响了该类疫苗的临床开发与应用。阿尔茨海默氏症（Alzheimer disease,AD）是一种致死的神经退行性疾病,其病理机制复杂,尚无法有效防治。近来,以β淀粉样蛋白（Amyloid β,Aβ）为靶标的免疫策略为AD的有效防治带来了希望,基于A β功能B细胞表位（Aβ1-15）开发的表位疫苗和抗体药物分布于临床前和临床研究的各个阶段。研究揭示;如何在保证免疫安全性的基础上有效提高表位多肽的免疫原性和保护功能仍是Aβ表位疫苗研发中急需解决的关键问题,也是表位疫苗开发的普遍需求。为此,本论文基于课题组前期工作基础,对以大肠杆菌左旋门冬酰胺酶Ⅱ（L-asparaginase B,AnsB）及通用型辅助 T 细胞表位（pan HLA-DR reactive epitope,PADRE）融合蛋白为载体设计和开发的新型Aβ表位疫苗进行了表达制备和初步免疫药理学研究。首先,论文对课题组前期设计并构建的新型表位疫苗抗原蛋白AnsB-PADRE-A β 1-15（简称APA）重组表达工程菌进行了复苏、培养和表达载体鉴定;进而,添加IPTG诱导抗原蛋白高效可溶性表达,并通过生物酶消化、超声波破碎、盐析沉淀、亲和柱层析和凝胶过滤等蛋白质工程技术手段对抗原蛋白进行了提取与分离纯化制备;再次,采用SDS-PAGE电泳分离、BCA法、凝胶柱层析、酶联免疫吸附检测（Enzyme-linked immunosorhent assay,ELISA）和 Western-Blot 等技术方法对抗原蛋白的相对分子量、蛋白纯度、含量、同源自聚形式、抗原性以及表位可及性进行了系统鉴定;在此基础上,以野生型C57BL/6小鼠为实验对象,通过对抗血清中A β特异性抗体水平、抗体亲合力和IgG亚型等进行测定评价,进而比较性研究抗原蛋白与乳化佐剂（如弗氏佐剂）、颗粒性佐剂（如氢氧化铝佐剂）和核酸佐剂（如CpG寡核苷酸佐剂）等不同佐剂形式的组合效能,并从中甄选出最适疫苗组合方式。最后,以B6/J-Tg（APPswe,PSENdE9）/Nju（简称APP/PSN）转基因小鼠为AD病理模型,采用动物免疫、体液免疫检测以及基于水迷宫（Morris water maze,MWM）的学习记忆评价,对新型疫苗的免疫药理学效应进行初步研究。结果表明:通过工程菌的培养与诱导,论文实现了抗原蛋白在原核系统中的高效表达,并且主要以可溶性形式表达于细菌胞质中,利于抗原蛋白的正确折叠和纯化制备;经论文建立并优化的蛋白质纯化工艺,获得了纯度大于95%的目的抗原蛋白,证实了抗原蛋白单亚基相对分子量约为42 kDa,表观分子量约为164 kDa,并维持了融合表位A β 1-15的可及性和抗原性,揭示了抗原蛋白通过AnsB的自聚化过程形成了能够四价呈现A β1-15表位的同源四聚体分子;进一步基于野生型C57BL/6小鼠的体内研究显示制备获得的抗原蛋白与不同类型佐剂配伍时表现出不同的免疫应答强度和机制,其中与弗氏佐剂的组合在免疫原性和体液免疫偏向性等方面具有显着优势,能够诱导具有Aβ神经毒性中和作用和Aβ淀粉样斑块靶向识别的特异性体液免疫;在此基础上,本论文将抗原蛋白与弗氏佐剂的优化组合接种AD转基因模型小鼠APP/PSN,发现新型抗原在能够内源性表达Aβ的病理模型中表现出相对的免疫耐受,而具有神经保护作用的中药提取物TCME-1701能够克服耐受,在病理模型中诱导更为强烈的Th2型抗A β体液免疫,减轻病理小鼠的脑内淀粉样沉积,并在一定程度上改善模型小鼠的认知、学习及记忆能力。总之,本论文在课题组前期工作基础上,成功制备了以自聚化药用酶AnsB和通用型辅助T细胞表位PADRE融合蛋白为载体的新型四价Aβ表位疫苗抗原蛋白,证明了该抗原蛋白能够在野生型小鼠和AD转基因模型中诱导产生更为安全有效的Th2型抗Aβ特异性免疫应答,体现出有效防治AD的潜力,并揭示了自聚化药用酶AnsB和通用型辅助T细胞表位PADRE融合蛋白载体作为Th2型表位疫苗载体的可行性和实用性,为提升表位疫苗的免疫原性提供了一种新型的载体补充和技术方案,为AD的有效安全防治提供了一个候选抗原,并为基于相同免疫机制设计和开发的Aβ疫苗提供了一种潜在的辅助强化策略。
王文斌[6]（2011）在《阿尔茨海默病重组B细胞表位Aβ1-15融合抗原疫苗研究》文中研究说明阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病,其主要特征是记忆减退、认知障碍。主要的病理表现包括细胞外淀粉样蛋白的堆积形成老年斑,细胞内Tau蛋白的磷酸化形成神经纤维缠结,并最终导致神经元的失营养坏死。淀粉样蛋白级联假说认为,患者大脑内堆积过多的Aβ42/Aβ40是导致阿尔茨海默病产生的主要原因。因此,以Aβ作为靶标治疗老年痴呆症的各种主动免疫和被动免疫治疗方法不断涌现。本研究针对免疫治疗阿尔茨海默病过程中出现的免疫原性和安全性问题,提出优化的策略设计新型疫苗。采用人源Aβ42的B细胞表位Aβ1-15多拷贝串联重复后,融合含有13aa的辅助T细胞表位PADRE构建了重组融合基因Aβ（1-15）6-T,加入A型肉毒毒素Hc片段后构建重组基因Aβ（1-15）6-T-AHc及Aβ（1-15）6-T-AHc-C。将以上基因分别克隆入原核表达载体和真核表达载体中,表达重组蛋白及构建DNA表位疫苗。同时研究白细胞介素4及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF等细胞因子作为分子佐剂对于阿尔茨海默病DNA疫苗的免疫调节作用和免疫效果的影响。将重组融合基因克隆入原核表达载体pTIG-Trx中,优化表达条件后实现了重组蛋白的可溶性表达,His亲和纯化后得到可用于下一步免疫实验的重组蛋白。其中,重组蛋白6Aβ及6Aβ-T经过分子量测定和肽谱分析表明具有特殊的二聚体结构,其功能结构尚需进一步研究确定。将四种重组蛋白6Aβ,6Aβ-T,6Aβ-T-AHc-C及AHc-5Aβ-T联合Al（OH）3佐剂免疫Balb/C小鼠,四次免疫后,小鼠体内产生了较高的抗Aβ42抗体,最高抗体滴度可以达到1:25000左右。添加了辅助T细胞表位和载体分子的重组蛋白免疫组抗体水平明显提高。抗体亚型分析结果显示,重组蛋白免疫后主要产生IgG1及IgG2b亚型抗体,表明免疫反应主要是Th2型。淋巴细胞增殖实验表明重组蛋白免疫组未引起明显的Th1型免疫炎症反应。免疫组脾细胞经PADRE刺激后产生了大量IL-4细胞因子,表明疫苗主要引起了Th2型免疫应答。研究表明,可溶性寡聚体的Aβ是大脑内毒性Aβ的主要形式,Dot-blot结果显示重组蛋白免疫后血清抗体特异性强结合Aβ寡聚体,弱结合单体,少或无结合纤维化状态的Aβ,提示我们重组蛋白免疫后产生的抗体可能能够特异性的清除或中和体内的Aβ42寡聚体,在AD免疫治疗中具有重大意义。重组蛋白6Aβ-T及6Aβ-T-AHc-C对转基因PDAPP小鼠进行免疫。实验结果表明,免疫组产生了针对Aβ42较高的抗体水平。抗体亚型分析结果说明其主要引起的Th2型免疫反应。细胞免疫水平测定结果与普通Balb/C小鼠相似,没有引起明显的针对Aβ42的淋巴细胞增殖。通过自发行为实验和Morris水迷宫实验证实,相比对照组,免疫组小鼠一定程度上提高了自主活动和空间学习记忆能力。免疫组化结果表明,重组蛋白免疫组小鼠大脑内海马区和皮质区的淀粉样斑块数量明显减少,斑块面积比例明显降低。重组融合基因导入真核表达载体pVAX1中,构建DNA表位疫苗。DNA质粒免疫Balb/C小鼠后产生了明显的抗体反应,融合了全长AHc片段的DNA表位疫苗pVAX1-S-Aβ（1-15）6-T-AHc产生的抗体水平最高,可以达到1:6400左右。抗体亚型分析其主要产生的是IgG1及IgG2b亚型抗体,表明免疫反应以Th2型为主。Dot-blot结果说明,DNA疫苗免疫后的血清抗体主要与寡聚体Aβ结合,与单体结合较弱,很少结合纤维状Aβ,提示这可能与我们设计的B细胞表位串联重复基因有关。将IL-4及GM-CSF基因克隆入含有信号肽序列的真核表达载体pVAX1-S中,构建分子佐剂载体pVAX1-S-IL-4和pVAX1-S-GM-CSF。与DNA表位疫苗共同免疫Balb/C小鼠。结果显示,两种分子佐剂对DNA疫苗免疫后的抗体水平都有一定提高作用,GM-CSF的作用效果更好,抗体滴度可以提高4倍左右。抗体亚型结果分析也表明,联合免疫组主要产生的是IgG1型抗体,说明分子佐剂的加入并未改变DNA疫苗的免疫应答途径。GM-CSF分子佐剂对于提高重组阿尔茨海默病DNA表位疫苗的效果具有一定作用,能够提高DNA表位疫苗的免疫原性。总结以上结果,我们设计了Aβ1-15重组融合基因,获得四种重组融合蛋白,其中两种融合了辅助T细胞表位和载体分子的重组蛋白免疫Balb/C小鼠和PDAPP小鼠后证明其具有良好的免疫原性。免疫反应偏向于Th2型,没有出现明显的针对Aβ的Th1型免疫应答。重组蛋白6Aβ-T和6Aβ-T-AHc-C能够明显减少转基因小鼠大脑内的淀粉样斑块含量以及改善自主活动和空间记忆能力,表明其可用于AD的免疫预防研究,具有十分重要的研究意义和应用前景。另外,我们设计的DNA疫苗具有良好的免疫原性,细胞因子类分子佐剂可以提高AD DNA表位疫苗的免疫效果。
陈鳌[7]（2011）在《破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位疫苗研究》文中认为阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）作为一种中枢退行性疾病,是老年痴呆的最主要形式。依据最新的统计结果,世界上大约有2700万人口受到该病的影响。目前,淀粉样蛋白级联假说（Amyloid Cascade Hypothesis）是一种主流的关于AD发病机制的推测。该假说认为患者脑内堆积过多的p淀粉样多肽是造成AD的最根本原因。1999年,Schenk等首先开展了以Aβ为靶点的AD主动免疫治疗研究,将人纤维化的Aβ1-42（简称Aβ42）多肽联合弗氏佐剂免疫APP转基因小鼠Tg2576后,小鼠体内产生了针对Aβ42的抗体,减少了大脑内的淀粉样斑块,改善了认知能力。随后,动物模型上的其他相关研究表明AD的主动免疫治疗策略是有效的,但之后的AN-1792临床试验结果表明Aβ42中存在的2个T细胞表位（17-21,29-42）诱导产生的T细胞免疫反应使得受试者出现了急性脑膜炎症状。目前关于AD主动免疫的研究更倾向于使用Aβ42的B细胞表位（1-15）并去除有害的T细胞表位,既让疫苗达到促进抗体生成的目的,又从根本上避免之前临床试验所产生的不良反应。因此,我们在此理论基础上进行了破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位重组亚单位疫苗和核酸疫苗的研究工作。首先进行了破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位重组亚单位疫苗的研究,设计了3种融合多个Aβ1-15（简称Aβ15）串联基因、PADRE基因和破伤风毒素重链C端（简称TTC）基因的重组蛋白原核表达载体,实现了重组融合蛋白在大肠杆菌中可溶性表达并成功地纯化得到了电泳级纯度的重组蛋白。然后将纯化获得的重组蛋白免疫普通Balb/C小鼠,测定的抗Aβ特异性抗体水平结果显示重组蛋白免疫动物后能够诱导小鼠产生高水平的Aβ特异性抗体,并且通过血清抗体的亚型分析和脾细胞增殖实验结果提示免疫反应完全偏向于Th2型。斑点杂交实验结果表明产生的抗Aβ抗体倾向于与Aβ寡聚体结合,与纤维状Aβ结合能力较弱。进一步将其中一种重组蛋白免疫APP转基因AD模型小鼠,实验结果显示重组蛋白在模型小鼠中仍然具有良好的免疫原性,免疫特性与普通Balb/C小鼠相似。行为学实验评价结果显示免疫后小鼠认知能力得到了一定改善。小鼠大脑组织免疫组化实验结果表明免疫组小鼠Aβ斑块明显减少。以上实验结果提示重组蛋白作为预防或治疗AD的候选亚单位疫苗具有良好的应用前景。在重组蛋白亚单位疫苗研究的基础上,进行了破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位核酸疫苗的研究。设计了2种融合6个Aβ1-15串联基因、PADRE基因和破伤风毒素重链C端基因的DNA真核表达载体作为DNA疫苗。经IFA检测表明得到的2种真核表达载体均能使Aβ15和TTC基因在真核细胞中得到有效地表达。DNA疫苗免疫普通小鼠诱导生成了较高水平的抗Aβ抗体,并且免疫反应完全偏向于Th2型。斑点杂交实验结果仍然提示设计的DNA疫苗产生的抗体倾向与Aβ可溶性寡聚体结合。DNA疫苗免疫APP转基因AD模型小鼠后,也产生了良好的免疫反应,并且免疫组小鼠大脑组织内的Aβ斑块明显少于未免疫组小鼠,提示该DNA疫苗可能拥有较好的免疫预防效果,可作为AD疫苗的一种新发展方向。综上,本研究设计和制备了3种重组蛋白亚单位疫苗和2种重组核酸疫苗,实验结果表明各疫苗在普通Balb/C小鼠体内产生了高水平的针对Aβ42的特异性抗体,并且有效地避免了Th1型免疫反应,免疫反应完全偏向于Th2型。斑点杂交实验表明产生的抗体倾向于与Aβ寡聚体结合,提示抗体可能针对毒性较大的Aβ寡聚体拥有更好的清除或中和能力,这一免疫特性对疫苗的下一步深入研究具有重要意义。疫苗免疫AD转基因小鼠以后,产生了同普通Balb/C小鼠的相当的免疫效果,并且小鼠认知能力得到了改善,脑组织内的Aβ斑块明显少于未免疫组转基因小鼠。本研究首次证实了破伤风毒素片段作载体分子介导阿尔茨海默病B细胞表位疫苗能够提高其免疫原性反应的可行性。以上结果表明本研究设计和制备的这种新型重组Aβ15表位疫苗拥有良好的免疫效果,具备了新型AD疫苗的发展方向,具有良好的应用前景。
赵臣勇[8]（2011）在《核酸疫苗预防接种对急性帕金森病小鼠黑质炎症反应的影响》文中研究表明目的1.探讨小鼠在遭受急性神经毒素损害时,预防接种优化hα-syn核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B对小鼠中脑黑质部多巴胺能神经元的神经保护作用。2.观察小鼠在遭受急性神经毒素损害时,预防接种优化hα-syn核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B对多巴胺能神经元COX-2和iNOS表达的影响。方法用去内毒素质粒大量抽提试剂盒大量抽提质粒和空载体,制备hα-syn核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B质粒、pVAX1空载体。在C57BL小鼠双侧后肢胫骨前肌同一部位、同一深度地分别预防注射pVAX1-IL-4/SYN-B质粒（优化核酸疫苗组）、pVAX1空载体（空载体组）或PBS（PBS组）各50μl,共3次。末次注射2周后,各组小鼠均经腹腔注射MPTP（20mg/kg）,间隔2h注射1次,共4次。在免疫接种与模型制备过程中,观察小鼠行为学变化,评价模型是否制备成功。于末次MPTP注射后1、3、7d处死小鼠（n=6）。采用HE染色法和DAB免疫组织化学法观察黑质部多巴胺能神经元形态的改变和COX-2、CD11b、iNOS阳性神经元数目的表达情况;采用RT-PCR法检测不同时间点小鼠中脑黑质COX-2和iNOS的mRNA表达变化。结果1.行为学观察结果:在免疫接种过程中,各组小鼠于预防注射pVAX1-IL-4/SYN-B质粒、pVAX1空载体和PBS前后其行为学均无明显变化。在模型制备过程中,优化核酸疫苗组第1次注射MPTP 1030 min后,小鼠均出现震颤抖动、少动、竖毛、蜷缩、分泌物明显增多、烦躁等症状。第2次注射后,症状加重,并且易激惹。第3次注射后症状进一步加重。第4次注射10min后,出现尾巴成弓形隆起、僵硬、细颤、活动变慢、前后肢运动协调性差等类PD样症状。空载体组和PBS组于每次注射MPTP后也出现上述类似症状,各组行为学表现均符合急性PD小鼠模型标准。2.形态学观察结果:HE染色法染色后,优化核酸疫苗组与空载体组和PBS组相比,黑质部残存神经元数目较多,小胶质细胞的激活较轻。3. SP免疫组化法结果显示:与空载体组和PBS组相比,优化核酸疫苗组小鼠中脑黑质部TH阳性神经元平均积分光密度值MOD较大（0.39±0.10）TH阳性细胞染色较深,有显着差异性（p<0.05）;CD11b、COX-2和iNOS阳性神经元数目相对较少,平均积分光密度值MOD较小,阳性细胞染色较浅,差异有统计学意义（p<0.05）。后两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。4. RT-PCR结果显示:在MPTP末次注射后1、3、7d,COX-2在各组均有表达,1d表达量微弱,3d表达量达高峰,7d各组表达均降低。同一时间点,优化核酸疫苗组与空载体组和PBS组相比显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）,;iNOS在各组也均有表达,且在1d时表达最高,随着时间的推移,表达量依次降低。同一时间点,优化核酸疫苗组与空载体组和PBS组相比有所降低,差异具有统计学意义（P<0.01）。后两组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论1.优化核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B具有较好的免疫原性,诱导产生的抗体能对抗MPTP神经毒素的脑损害;在预防接种小鼠后产生的免疫效果对多巴胺能神经元具有神经保护作用。2.优化核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B具有较好的对抗炎症因子表达作用,能够在一定程度上保护多巴胺能神经元免于炎症反应对其所造成的损害。
王法祥[9]（2009）在《优化人α-突触核蛋白核酸疫苗免疫MPTP帕金森病小鼠的神经保护作用及其机制研究》文中研究表明研究背景帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是第二个最常见的神经系统变性疾病, 65岁以上人口中的患病率超过1%以上。关注占全国人口10%的60岁以上老年人的健康是个不容忽视的问题。帕金森病的主要病理性标志物是黑质区出现异常聚集的α-突触核蛋白（alpha-synuclein,α-syn）为主要成分的Lewy小体。α-syn异常聚集参与了PD多巴胺能神经元的变性过程。在家族性和散发性PD的发病机制中,α-syn的异常聚集起到了重要的作用。帕金森病目前尚无根本治疗方法,针对α-syn的疫苗是治疗PD的新方法。近年来,核酸疫苗在退行性病变的防治中显示出诱人的前景。我们课题组前期实验成功地构建了人α-syn（hα-syn）核酸疫苗,并在哺乳动物体内表达,观察到hα-syn核酸疫苗治疗MPTP慢性帕金森病模型小鼠取得了较好的疗效。为了提高核酸疫苗的免疫效果,并对核酸疫苗的神经保护作用机制进行探讨,我们欲对该疫苗作进一步的优化,以期为帕金森病的临床防治提供实验基础和理论依据。α-syn由大量无序的异构体组成,呈现为非紧密的混合体。自然状态下,α-syn是一种富含疏水区域的天然伸展的蛋白质。其氨基端（160）包含四个不完全重复序列,易形成两性螺旋。NAC区（6195）为中心区,是α-syn序列中疏水性最强的一段。羧基端（96140）富含酸性氨基酸,如脯氨酸,带有大量负电荷,与正常状态下α-syn保持无规则卷曲状态有关。a-syn蛋白中的这三种结构域是否具有不同的免疫效价?对疫苗的神经免疫防护效果是否有不同的影响?因此对α-syn蛋白结构和功能的了解,会对核酸疫苗的优化构建,以及疫苗的免疫效果造成重要的影响。我们初期研究中,尽管发现核酸疫苗免疫治疗MPTP慢性帕金森病模型小鼠取得了一定的效果。但是,由于α-syn分子量仅14kD,只有140个氨基酸残基组成的小分子蛋白质。因α-syn分子量小,免疫活性弱,需要较大剂量才能诱导足够的免疫效应。Ig Kappa链信号肽（Ig ksp）可使细胞内hα-syn向细胞外移动,增加hα-syn的分泌能力,必将会有助于抗体效价的提高,促使更多的异常聚集的α-syn蛋白被降解和清除。因此,在hα-syn基础之上增加小鼠Ig ksp基因序列,构建高效分泌型hα-syn真核表达载体,增强免疫治疗效果,提升疫苗的安全性,成为了我们深入研究的重点内容。异常聚集的α-syn可以通过泛素蛋白酶体系统和溶酶体途径降解和清除。在PD发病中,α-syn的降解通路受损可引起α-syn的异常聚集,形成Lewy小体。若使用蛋白酶体抑制剂抑制酶的活性,可产生剂量依赖性选择性多巴胺（Dopamine,DA）神经元死亡。在清除α-syn的积聚和降解过程中,溶酶体也发挥了重要作用。对于α-syn寡聚体介导的毒性,溶酶体降解通路是一个重要的保护机制。Masliah等发现,使用重组hα-syn接种hα-syn转基因小鼠,产生的抗体可通过溶酶体途径清除α-syn,减少α-syn在DA能神经元胞体和突触的聚集。优化构建的hα-syn核酸疫苗是否也可通过增加异常聚集的α-syn降解清除来发挥神经保护作用?抗原与抗体结合后,是否必定要通过溶酶体或/和蛋白酶体途径代谢分解?它们的分解代谢特点是什么?需要作进一步的研究。免疫炎症反应与PD的发病机理有着密切的关系,帕金森病可以说是一个动态的炎症变化过程。小胶质细胞（microglia,MI）被激活,大量增殖是中枢神经系统疾病炎症反应的一个最重要表现。黑质内MI被激活,特别是吞噬了异常聚集的α-syn之后可被持续激活,引起DA能神经元变性,导致帕金森病发生。MI被激活、增殖,可产生炎症细胞因子,如α-肿瘤坏死因子、活性氧簇、白细胞介素-1β、白细胞介素-6等。炎症细胞因子反过来又可加剧MI的激活,共同参与脑局部炎症过程。因此在PD的病理生理过程中,炎症发挥了重要作用。优化核酸疫苗对神经细胞起到保护作用,那么核酸疫苗对PD病理过程中的炎症反应会产生哪些影响?在优化核酸疫苗免疫治疗过程中,对MI活性和炎症反应的调节情况如何?对这些问题的深入了解,将有助于我们对核酸疫苗的治疗作用和神经保护机制的理解。研究目的根据α-syn结构中折叠的特点,构建三种高分泌表达型hα-syn蛋白的优化核酸疫苗;通过接种MPTP慢性PD模型小鼠,观察核酸疫苗的防治效果和神经保护作用,并对其作用机制进行探讨。本实验的主要内容包括:①将扩增出的人α-syn（1-140）基因、α-syn（84-140）基因、α-syn（34-140）基因与Ig ksp基因克隆到质粒pVAX1上,优化构建成三种重组质粒。在哺乳动物细胞中表达并鉴定其生物学活性;②观察三组疫苗诱导体液免疫的效果、不同特点和免疫特异性;③大量制备三种优化核酸疫苗接种PD小鼠模型,观察三种疫苗的神经保护作用以及对溶酶体功能的影响,炎症反应的影响和调控等;④将微量溶酶体抑制剂与蛋白酶体抑制剂,通过脑立体定向技术注射中脑黑质区以阻断α-syn的降解通路,观察溶酶体抑制剂不同剂量、不同时间段对DA神经元功能的影响和小鼠行为学改变特点;⑤溶酶体和蛋白酶体通路阻滞对核酸疫苗免疫保护作用的影响,运用免疫组化等技术,了解hα-syn核酸疫苗诱导特异性神经保护性免疫所产生的抗体,降解清除过表达α-syn,阻抑PD的病理进程的机制。方法1.三种重组质粒的优化构建和表达从重组质粒中扩增人α-syn1-140、84-140、34-140基因,根据已知序列合成Ig ksp基因;将上述融合基因序列克隆到质粒pVAX1上,构建成三组重组质粒:A组（pVAX1-Igk-hαS1-140）重组质粒;B组pVAX1-Igk-hαS84-140)重组质粒;C组pVAX1-Igk-hαS34-140)重组质粒。进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。转化大肠杆菌DH5α,抽提质粒后转染COS-7细胞,用Western Blot法检测其生物学活性。2.重组质粒对体液免疫的诱导分别用A、B、C三种优化核酸疫苗、空质粒pVAX1免疫正常的C57/BL小鼠。采用股四头肌肉注射,100μg/只/次,每三周加强免疫一次,共免疫5次。在每次免疫后二周各采血一次,分离血清用于抗体测定。并用免疫后的小鼠血清和能表达α-syn的小鼠脑组织行免疫组化反应及中和反应,观察免疫血清抗体的特异性。3.观察优化核酸疫苗免疫防治的神经保护作用正常C57/BL小鼠注射MPTP 25mg/kg·d,每周2次,共10次,建立MPTP慢性PD小鼠动物模型。建模成功后分别接种三种优化核酸疫苗。观察免疫治疗小鼠模型行为学改变特点,DA细胞酪氨酸羟化酶（TH）和α-syn蛋白表达水平;并且检测免疫保护作用后的炎性反应,以及了解对溶酶体组织蛋白酶D （Cathepsin D,Cath D）活性的影响。4.观察溶酶体和蛋白酶体抑制剂对正常小鼠DA神经元作用特点于小鼠右侧中脑黑质（SN）区,分别立体定向微量注射不同剂量溶酶体抑制剂磷酸氯喹溶剂,或者蛋白酶体抑制剂。观察阿朴吗啡（apomorphine,APO）诱导的小鼠旋转行为改变以及行为学变化;于溶酶体抑制剂注射后不同时间段,检测小鼠黑质区TH阳性细胞数、α-syn和Cath D表达水平。5.探讨溶酶体和蛋白酶体通道阻滞后,核酸疫苗对α-syn降解和清除的影响同上方法建立慢性模型成功后接种优化核酸疫苗pVAX1-Igk-hαS1-140,共3次。于第三次接种的前三天,小鼠右侧SN区,分别立体定向微量注射溶酶体抑制剂或蛋白酶体抑制剂。检测通道阻滞后,小鼠SN区TH和细胞核形态学的变化,了解对细胞凋亡的影响。结果1.重组质粒pVAX1-Igk-hαS1-140、pVAX1-Igk-hαS84-140、pVAX1-Igk-hαS34-140的成功优化构建和表达成功扩增了hα-syn1-140、84-140、34-140基因,并合成了Ig ksp基因。分别将两者的融合基因克隆到表达载体pVAX1上,经酶切分析和DNA测序证明三组重组质粒的大小、方向和序列完全正确,成功构建了三种重组质粒。经Western blot检测具有较好的生物学活性。2.重组质粒诱导的体液免疫大量制备A、B、C三种重组质粒和空质粒pVAX1。重组质粒免疫动物后产生了较高的抗体滴度,pVAX1-Igk-hαS1-140为（3.76±0.33）×103、pVAX1-Igk-hαS84-140为（3.87±0.12）×103、pVAX1-Igk-hαS34-140为（3.79±.022）×103,三组之间差异没有显着性意义（p>0.05）,与空质粒pVAX1（0.09±0.01）×103组相比,差异有显着意义（p<0.05）。重组质粒免疫小鼠的血清能与α-syn过表达小鼠的脑组织发生特异性免疫组化反应,被α-syn蛋白中和的血清则不发生反应。3.核酸疫苗免疫保护作用的观察与空质粒pVAX1组比较,三种优化核酸疫苗均可以提高小鼠的爬杆能力,提高TH细胞数目达60-65%,减少α-syn表达量44-47%,增加Cath D表达量46-50%,差异均有显着性（P<0.05）,但三组疫苗之间上述检测指标差异没有显着性（P>0.O5）。三组核酸疫苗与PBS对照组相比,TNF-α表达量减少27-55%（P<0.05）。B组、C组与A组相比,差异亦有有显着性（p<0.05）,显示B组、C组安全性更高。4.溶酶体和蛋白酶体抑制剂对正常小鼠多巴胺神经元的作用特点①溶酶体抑制剂只有在400μmol/L浓度时才可出现较明显的由药物诱发的旋转行为,7-8次/分。而蛋白酶体抑制剂组小鼠清醒后即出现明显的旋转行为,甚至不需要药物就可自发出现旋转症状;②毁损侧与黑质区内TH阳性细胞数目正常相比有明显的不同程度减少。脑立体定向注射后的第三周内可以观察到,随着溶酶体剂量25μmol/L400μmol/L增加,DA神经元的损害程度呈正比例上升。从溶酶体100μmol/L立体定向注射一周到四周可以观察到,多巴胺的数量随时间逐渐恢复。③毁损侧与正常黑质区比较,Cath D阳性细胞数目存在不同程度的明显减少。注射溶酶体25μmol/L400μmol/L的第三周内,Cath D阳性数量随剂量的增加而明显减少,同时TH损害程度也增加。而且Cath D阳性细胞数与TH阳性细胞数成正比,Cath D阳性表达量与TH损害程度呈正比例关系。5.α-syn降解通道阻滞后,核酸疫苗的作用特点当α-syn降解通道阻滞后,与未注射侧相比,溶酶体抑制剂损害较轻,蛋白酶体抑制剂损害略重,溶酶体加蛋白酶体抑制剂相对损害较重,但是在注射局部仍然有TH阳性数目的表达。TH与Hoechst荧光染色显示,抑制剂组小鼠脑黑质部位有大量阳性细胞核固缩呈不规则形,核碎裂,部分裂解为多个凋亡小体。各组小鼠中脑黑质核形态中可以看出,与未注射侧的核形态,PBS组与它没有明显区别。与未注射侧相比,溶酶体抑制剂损害较轻,蛋白酶体抑制剂损害略重,溶酶体加蛋白酶体抑制剂相对损害较重。结论1.成功优化构建了三组真核表达质粒并具有较好的生物学活性。2.三组核酸疫苗免疫小鼠均产生了较高的抗体滴度,并且具有抗α-syn特异性。3.三组核酸疫苗免疫均可减少慢性PD小鼠模型脑内异常聚积的α-syn表达,改善溶酶体的功能,阻扰MI激活所致前炎症因子的释放,从而减轻神经毒素对神经细胞的损害作用。并且pVAX1-Igk-hαS84-140与pVAX1-Igk-hαS34-140核酸疫苗可能具有更安全的免疫效果。4.溶酶体和蛋白酶体抑制剂对正常小鼠DA神经元有损害作用,但两种抑制剂的损害具有不同的作用特点。溶酶体抑制剂对DA神经元的损害具有剂量和时间依赖性。DA神经元损害程度与Cath D的活性呈正相关。单侧溶酶体抑制剂损伤小鼠,注射APO可以诱导出旋转行为,但是没有蛋白酶体明显。5.核酸疫苗可能通过其它的降解清除途径,具有一定的拮抗溶酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂对多巴胺神经元损害的作用,可减少细胞凋亡,对神经元起到保护作用。
何颖[10]（2008）在《核酸疫苗免疫机制的研究》文中研究指明DNA疫苗又称核酸疫苗、基因疫苗,是近年来随着基因治疗技术的发展而产生的一种新型疫苗。由于DNA疫苗本身既有类似减毒活疫苗的优点,又有灭活疫苗或亚单位疫苗的安全性,不仅具有预防疾病的作用,同时还具有治疗疾病的作用。所以治疗性核酸疫苗成为近些年研究的重点,并迅速地从治疗传染性疾病的研究扩展到非传染性疾病的研究。感染疾病预防性和肿瘤治疗性DNA疫苗的研究发展很快,而且有相当数量的临床实验正在进行。尽管DNA疫苗得到了快速而广泛的发展,但其总的免疫效果还不尽如人意。有的DNA疫苗在小动物实验中免疫效果很好,在大动物实验中效果欠佳;有的DNA疫苗在动物实验中能起到很好的免疫保护作用,但在临床试验中却不能保护受试者抵抗病原体的攻击。为了能解决DNA疫苗应用中的这些问题,新的用于增强DNA疫苗的研究策略层出不穷,但任何策略都是建立在对疫苗作用机制深刻认识的基础上,而关于DNA疫苗的免疫机制目前尚不十分清楚。为了深入研究DNA疫苗的免疫机制,我们选择了两种疾病展开研究,一种是阿尔茨海默氏病（AD）,另一种是乙肝病毒（HBV）相关的原发性肝细胞癌（HCC）。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种神经元退行性变疾病,是引起老年期痴呆最主要的原因。众所周知β淀粉样蛋白（Aβ）在脑内沉积形成的老年斑（senile plaque,SP）是引起AD发病最主要的因素,减少Aβ淀粉样蛋白沉积的形成,是预防和治疗AD的一种新措施。继Schenk等人成功的用Aβ疫苗对PDAPP小鼠进行免疫治疗之后,一些动物实验均发现该疫苗可以诱导产生有效治疗浓度的抗Aβ抗体,使Aβ沉淀减少,并改善动物的认知行为学表现。但在临床Ⅱ期试验中出现了中枢神经系统炎症反应和卒中,这些不良反应促使人们对Aβ疫苗的应用和机制更深入地去研究。也使我们研制具有Aβ免疫原性而又不具有其毒副作用的AβDNA疫苗势在必行。我们前期工作中采用Aβ表位疫苗和Aβ全长DNA疫苗免疫小鼠,不与任何佐剂联用时,Aβ全长DNA疫苗与其中一组Aβ表位疫苗能诱发有效的体液免疫,但抗体滴度不理想。考虑到DNA疫苗所诱导的免疫反应强度与基因表达效率（即每个被转染的细胞内抗原基因的表达量）呈正相关,可以尝试通过改变胞内定位,使之分泌到胞外来改变目的蛋白的免疫原性。本实验选用了TPA信号肽序列与Aβ42融合表达,体内实验证明,含有TPA信号肽序列与Aβ42融合基因的DNA疫苗组所诱发的特异性抗Aβ抗体滴度高于仅含Aβ42全长基因DNA疫苗组。在细胞内表达Aβ/GFP和TPA-Aβ/GFP融合蛋白,发现TPA-Aβ在细胞质和胞核中均匀表达并于72h少量集中分布于细胞膜上,提示我们目的蛋白正处于分泌表达状态。进一步实验证实了在融合基因TPA-Aβ/GFP转染细胞的培养上清液中发现存在目的蛋白。上述实验结果提示我们,利用TPA信号肽成功地将Aβ引导穿过细胞膜,达到分泌表达,从而增强抗原递呈细胞的摄取,提高机体免疫系统免疫活性,产生较高滴度的抗体水平。为我们下一步改造Aβ表位疫苗,使之具有更强的免疫原性,诱导机体产生更强的体液免疫,进一步探讨利用DNA疫苗主动免疫清除老年斑的作用机制奠定了基础。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染和原发性肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）相关率高达80%,HBV感染者发生HCC的危险性是无感染者的200余倍。HBV是HCC的重要诱因这一结论已被科学界广泛接受,但其具体机制尚不明确。近年来,随着对HBx生物学功能研究的深入,人们发现HBx在此过程中发挥了重要作用。X基因是HBV基因组最小的开放读码框,它编码的X蛋白含154个氨基酸,分子量约为16.5 kD。HBx是一种多功能的病毒调节因子,大量研究资料显示HBx参与基因转录,DNA修复,活化多种信号传导通路。这些效应以及它们在细胞凋亡和增殖中综合作用的结果,可以初步解释HBV导致HCC的机制。但HBx促癌变的确切机制至今尚未阐明,可能通过多种途径起作用,十分复杂,一些研究结果又互相矛盾,因此,有必要对其分子机制进行深入研究,在此基础上才有可能构建相应的治疗性DNA疫苗防治这种与病毒相关的肿瘤。X蛋白不能同双链DNA直接结合,而是通过细胞内蛋白间的相互作用启动一系列磷酸化和去磷酸化过程,从而上调众多基因的表达。为了寻找并鉴定X蛋白直接或间接作用的蛋白,进一步阐明其机理,本实验以成人肝癌细胞HepG2为研究对象,将重组质粒pEGFP-N1-X瞬时转染入细胞中,利用蛋白质组学的核心技术寻找并鉴定了实验组和对照组的8个差异表达蛋白。其中,上调表达的蛋白STRAP、nm23-H1和下调表达蛋白PIMT与PI3K信号通路相关。通过我们进一步的实验发现HBx下调PIMT表达是通过上调STRAP、nm23-H1激活PI3K信号通路实现的。这些结果为我们进一步了解受HBx影响的纷繁复杂的信号通路网络提供一定的帮助,而HBx介导的PIMT低水平表达将为阐明HCC发生发展分子机制提供线索,并为进一步治疗HCC提供靶点。
二、阿尔茨海默病核酸疫苗的构建及诱导体液免疫反应的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、阿尔茨海默病核酸疫苗的构建及诱导体液免疫反应的初步研究（论文提纲范文）
（1）伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 伪狂犬病病毒概述 |
| 1.2 病原学研究 |
| 1.2.1 分子结构 |
| 1.2.2 基因组特征 |
| 1.2.3 主要蛋白功能 |
| 1.2.4 遗传变异分析 |
| 1.3 诊断技术研究 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.4 新型疫苗研究 |
| 1.4.1 基因缺失疫苗 |
| 1.4.2 重组载体疫苗 |
| 1.4.3 亚单位疫苗 |
| 1.4.4 核酸疫苗 |
| 1.5 生物信息学研究 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 猪源PRV SD-2017 株的分离鉴定及其遗传变异分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.3.1 细胞培养 |
| 2.1.3.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3.3 基因组DNA提取及目的基因扩增 |
| 2.1.3.4 病毒分离培养 |
| 2.1.3.5 病毒传代纯化 |
| 2.1.3.6 病毒形态观察 |
| 2.1.3.7 病毒滴度测定 |
| 2.1.3.8 动物感染试验(LD50 测定) |
| 2.1.3.9 主要毒力基因遗传变异分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 目的基因的扩增和克隆 |
| 2.2.2 病毒的分离培养及纯化 |
| 2.2.3 病毒的形态观察 |
| 2.2.4 PRV SD-2017 株病毒滴度的测定 |
| 2.2.5 PRV SD-2017 株家兔感染试验 |
| 2.2.6 PRV SD-2017 株遗传变异分析 |
| 2.2.6.1 gE基因的序列分析 |
| 2.2.6.2 gB基因的序列分析 |
| 2.2.6.3 gC基因的序列分析 |
| 2.2.6.4 gD基因的序列分析 |
| 2.2.6.5 TK基因的序列分析 |
| 2.2.6.6 gI基因的序列分析 |
| 2.2.6.7 gM基因的序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 PRV gB和 gE基因酶促重组等温扩增(ERA)检测方法的建立及应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.1.3.1 核酸提取 |
| 3.1.3.2 引物和探针设计 |
| 3.1.3.3 PRV gB和 gE基因标准质粒的构建及其鉴定 |
| 3.1.3.4 ERA反应体系的优化 |
| 3.1.3.5 特异性试验 |
| 3.1.3.6 敏感性试验 |
| 3.1.3.7 重复性试验 |
| 3.1.3.8 临床样本检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PRV gB和 gE基因重组质粒的构建 |
| 3.2.2 ERA反应体系的建立 |
| 3.2.3 特异性试验 |
| 3.2.4 敏感性试验 |
| 3.2.5 重复性试验 |
| 3.2.6 临床样品的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 PRV SD-2017 基因缺失株的构建及其生物学特性分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.1.3.1 引物和质粒 |
| 4.1.3.2 gE/gI和 TK转移载体的构建 |
| 4.1.3.3 PRV2017 基因缺失株的构建和纯化 |
| 4.1.3.4 PRV一步生长曲线和噬斑大小测定 |
| 4.1.3.5 动物接种试验(LD50 测定) |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP的构建与纯化 |
| 4.2.2 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP报告基因的敲除 |
| 4.2.3 rPRV SD-2017ΔgE/gI/TK-EGFP的构建和纯化 |
| 4.2.4 rPRV一步生长曲线和噬斑大小测定 |
| 4.2.5 动物接种试验(LD50 测定) |
| 4.2.6 病理组织学观察 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 基于PRV SD-2017 株三种基因工程新型疫苗的构建及其免疫原性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验仪器 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.1.3.1 重组蛋白序列的优化与合成 |
| 5.1.3.2 重组杆状病毒穿梭质粒的构建与鉴定 |
| 5.1.3.3 重组杆状病毒的转染和蛋白表达纯化 |
| 5.1.3.4 家兔的疫苗接种和攻毒保护试验 |
| 5.1.3.5 血清PRV特异性抗体测定 |
| 5.1.3.6 血清PRV中和抗体测定 |
| 5.1.3.7 外周血淋巴细胞增殖测定 |
| 5.1.3.8 外周血细胞因子检测 |
| 5.1.3.9 剖检和病理病变观察 |
| 5.1.3.10 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组杆状病毒穿梭质粒的构建与鉴定 |
| 5.2.2 重组蛋白PRV gB-DCpep和 PorB的表达和纯化 |
| 5.2.3 PRV疫苗体液免疫反应的测定 |
| 5.2.4 PRV疫苗细胞免疫反应的测定 |
| 5.2.5 PRV疫苗血清中和抗体滴度的测定 |
| 5.2.6 PRV疫苗的攻毒保护试验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 PRV变异株基因缺失疫苗的构建 |
| 5.3.2 PRV变异株基因工程亚单位疫苗的构建 |
| 5.4 小结 |
| 6 PRV感染引起PK-15 细胞的转录组变化及差异表达基因分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 细胞及毒株 |
| 6.1.2 试剂与耗材 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 主要数据库、网站和软件 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 PRV感染PK-15 细胞 |
| 6.2.2 细胞总RNA的提取 |
| 6.2.3 RNA样本测序 |
| 6.2.3.1 样本检测 |
| 6.2.3.2 文库构建与质检 |
| 6.2.3.3 上机测序 |
| 6.2.4 RNA-Seq数据处理及分析 |
| 6.2.4.1 数据输出与质控 |
| 6.2.4.2 序列比对到参考基因组 |
| 6.2.4.3 新转录本预测 |
| 6.2.4.4 基因表达水平定量 |
| 6.2.4.5 基因表达差异分析 |
| 6.2.4.6 差异基因的GO功能富集及KEGG信号通路分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 PRV毒株感染PK-15 细胞的时间与剂量效应 |
| 6.3.2 RNA-seq测序样本检测结果 |
| 6.3.3 RNA-seq测序数据评估及质控 |
| 6.3.4 PRV感染PK-15 细胞差异表达基因分析 |
| 6.3.4.1 差异基因统计 |
| 6.3.4.2 差异表达基因可视化分析 |
| 6.3.4.3 差异表达基因叠加关系分析 |
| 6.3.4.4 差异表达基因聚类分析 |
| 6.3.5 PRV毒株感染PK-15 细胞差异表达基因富集分析 |
| 6.3.5.1 GO功能富集分析 |
| 6.3.5.2 KEGG通路富集分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 伪狂犬病病毒感染引起PK-15 细胞的蛋白质组学变化分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试剂与耗材 |
| 7.1.2 仪器设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 PRV感染PK-15 细胞 |
| 7.2.2 蛋白质组学分析的细胞样品制备 |
| 7.2.3 细胞总蛋白的提取 |
| 7.2.4 蛋白质检 |
| 7.2.5 TMT标记 |
| 7.2.6 馏分分离 |
| 7.2.7 液质检测 |
| 7.2.8 生物信息学分析 |
| 7.2.9 蛋白质组与转录组的关联性分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 提取蛋白质检结果 |
| 7.3.2 数据质控与蛋白鉴定结果 |
| 7.3.2.1 鉴定到的蛋白总体情况 |
| 7.3.2.2 肽段长度分布 |
| 7.3.2.3 母离子质量容差分布 |
| 7.3.2.4 Unique肽段数分布 |
| 7.3.2.5 蛋白覆盖度分布 |
| 7.3.2.6 蛋白分子量分布 |
| 7.3.2.7 蛋白重复性分析 |
| 7.3.3 蛋白差异分析结果 |
| 7.3.3.1 差异蛋白统计 |
| 7.3.3.2 差异蛋白可视化分析 |
| 7.3.4 差异蛋白GO功能注释分析 |
| 7.3.5 差异蛋白KEGG分析 |
| 7.3.6 差异蛋白亚细胞定位分析 |
| 7.3.7 转录组和蛋白组表达调控关联分析 |
| 7.3.8 转录组和蛋白质组表达量关联分析 |
| 7.3.9 转录组和蛋白质组GO功能富集关联分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 结论 |
| 9 创新点 |
| 10 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）基于酵母的疱疹病毒疫苗的设计和制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 0.1 阿尔茨海默病 |
| 0.2 单纯疱疹病毒与AD |
| 0.3 病毒疫苗 |
| 0.4 粘膜免疫 |
| 0.5 酵母表面展示技术 |
| 0.6 研究目的及意义 |
| 第一章 构建毕赤酵母表面展示重组菌株 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒、引物及菌株 |
| 1.1.2 化学药品、试剂及仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 试剂的配置 |
| 1.2.2 构建过表达PDI的毕赤酵母重组菌株 |
| 1.2.3 构建HSV-1酵母表面展示菌株 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 构建过表达PDI的重组菌株的酵母直接PCR结果 |
| 1.3.2 构建过表达PDI的重组菌株的酵母基因组PCR结果 |
| 1.3.3 构建表面展示重组菌株的酵母直接PCR结果 |
| 1.3.4 构建表面展示重组菌株的酵母基因组PCR结果 |
| 1.3.5 空白对照菌株的酵母直接PCR结果 |
| 1.4 本章小结 |
| 第二章 诱导并验证酵母表面展示菌株中的蛋白 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验相关试剂 |
| 2.1.2 实验相关仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验试剂的配置 |
| 2.2.2 诱导外源蛋白表达 |
| 2.2.3 荧光显微镜观察蛋白表达情况 |
| 2.2.4 提取酵母细胞壁蛋白 |
| 2.2.5 western blot验证蛋白表达情况 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 荧光显微镜观察蛋白表达结果 |
| 2.3.2 western blot验证蛋白表达情况 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 动物实验并评估小鼠免疫应答反应 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 口服免疫小鼠 |
| 3.2.2 ELISA检测体液免疫应答及粘膜免疫应答 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 体液免疫应答结果 |
| 3.3.2 粘膜免疫应答结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
（3）表达高致病性猪蓝耳病GP3、GP5基因DNA疫苗构建及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 猪繁殖与呼吸综合征概况 |
| 1.1 PRRSV结构 |
| 1.2 PRRSV流行谱系 |
| 1.3 PRRSV与抗体 |
| 第2章 PRRSV DNA疫苗研究进展 |
| 2.1 减毒(MLV)疫苗 |
| 2.2 灭活的PRRSV疫苗 |
| 2.3 DNA疫苗及亚单位疫苗 |
| 2.4 疫苗与中和抗体 |
| 第3章 DNA疫苗佐剂的研究进展 |
| 3.1 脂质体佐剂 |
| 3.2 DNA疫苗的分子佐剂 |
| 3.2.1 基于PRR激动剂的分子佐剂 |
| 3.2.2 基因趋化因子佐剂 |
| 3.2.3 共刺激分子的遗传佐剂 |
| 3.2.4 基于免疫信号分子的佐剂 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 高致病性猪蓝耳病核酸疫苗构建及鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 高致病性猪蓝耳病DNA疫苗小鼠免疫及佐剂效果评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 高致病性猪蓝耳病DNA疫苗猪体免疫效果及佐剂效果评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）N端截短与修饰的β-淀粉样蛋白的疫苗及抑制剂研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 阿尔茨海默病概述 |
| 1.2 淀粉样沉积级联假说 |
| 1.3 Aβ的产生、聚集、清除与毒性 |
| 1.3.1 Aβ的产生与聚集 |
| 1.3.2 Aβ的清除 |
| 1.3.3 Aβ的毒性 |
| 1.4 靶向Aβ的各类治疗策略 |
| 1.4.1 抑制Aβ的产生 |
| 1.4.2 清除已有的Aβ |
| 1.4.3 抑制Aβ蛋白聚集 |
| 1.5 大脑内多种形式的Aβ蛋白 |
| 1.6 本论文研究内容 |
| 第2章 针对焦谷氨酸Aβ的疫苗研究 |
| 2.1 本章引言 |
| 2.2 疫苗的设计、合成与表征 |
| 2.2.1 疫苗的初步设计 |
| 2.2.2 疫苗的合成 |
| 2.3 疫苗的初步评价与筛选 |
| 2.3.1 筛选辅助T细胞表位 |
| 2.3.2 筛选B细胞表位 |
| 2.3.3 抗体分型的测定 |
| 2.4 疫苗对AD模型小鼠的作用评价 |
| 2.4.1 免疫AD模型小鼠 |
| 2.4.2 使用Morris水迷宫评价小鼠认知能力 |
| 2.4.3 测定小鼠脑内Aβ斑块沉积的含量 |
| 2.5 实验部分 |
| 2.5.1 试剂、仪器与小鼠 |
| 2.5.2 多肽合成与表征数据 |
| 2.5.3 BSA偶联的疫苗合成 |
| 2.5.4 实验方法 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 针对Aβ_(4-X)的抑制剂研究 |
| 3.1 本章引言 |
| 3.2 探究葫芦脲与Aβ_(1-X)和 Aβ_(4-X)的结合能力 |
| 3.2.1 使用等温滴定量热法测定葫芦脲与Aβ的结合模式 |
| 3.2.2 使用质谱验证葫芦脲与Aβ的结合模式 |
| 3.3 探究葫芦脲对Aβ_(1-40)和Aβ_(4-40)聚集的调控能力 |
| 3.3.1 使用ThT聚集动力学评价葫芦脲对Aβ聚集的影响 |
| 3.3.2 使用透射电子显微镜验证葫芦脲对Aβ聚集的影响 |
| 3.4 探究葫芦脲对Aβ_(1-40)和Aβ_(4-40)毒性的影响 |
| 3.5 探究葫芦脲抑制Aβ_(1-40)和Aβ_(4-40)聚集的机理 |
| 3.5.1 构建Aβ聚集的动力学模型 |
| 3.5.2 葫芦脲抑制Aβ聚集的动力学模型 |
| 3.6 实验部分 |
| 3.6.1 试剂与仪器 |
| 3.6.2 多肽合成与表征数据 |
| 3.6.3 实验方法 |
| 3.7 本章小结 |
| 第4章 抑制剂联用的研究 |
| 4.1 本章引言 |
| 4.2 糖-色基酸缀合物对Aβ聚集的抑制 |
| 4.3 联合应用糖-色氨酸缀合物与中药提取物分子 |
| 4.4 透射电子显微镜验证抑制剂联用的效果 |
| 4.5 实验部分 |
| 4.5.1 试剂与仪器 |
| 4.5.2 实验方法 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）基于药用酶的自聚化Aβ表位疫苗制备及免疫药理学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 传统疫苗的简介 |
| 1.1.1.1 减毒疫苗 |
| 1.1.1.2 灭活疫苗 |
| 1.1.2 新型疫苗的简介 |
| 1.1.2.1 亚单位疫苗 |
| 1.1.2.2 活载体疫苗 |
| 1.1.2.3 表位疫苗 |
| 1.2 提高表位疫苗免疫原性的策略 |
| 1.2.1 表位与载体偶联 |
| 1.2.2 表位与佐剂联合 |
| 1.3 以Aβ为靶点防治阿尔茨海默氏症 |
| 1.3.1 A β与阿尔茨海默氏症的发生 |
| 1.3.2 以Aβ为靶点的治疗药物 |
| 1.3.3 疫苗在AD中存在的问题 |
| 1.4 本研究的创新点及意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 工程化细菌 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 多肽、CpG的合成 |
| 2.2.2 工程化细菌的复苏 |
| 2.2.3 工程化细菌的鉴定 |
| 2.2.3.1 工程菌基因准确性的鉴定 |
| 2.2.4 抗原蛋白的诱导表达 |
| 2.2.5 抗原蛋白的提取和分离纯化 |
| 2.2.5.1 细菌破碎与抗原蛋白的提取 |
| 2.2.5.2 抗原蛋白的硫酸铵分级沉淀 |
| 2.2.5.3 抗原蛋白的亲和柱层析分离 |
| 2.2.5.4 抗原蛋白的脱盐、冻干与保存 |
| 2.2.6 抗原蛋白的性质鉴定 |
| 2.2.6.1 蛋白质含量的测定 |
| 2.2.6.2 分子量的检测 |
| 2.2.6.3 抗原蛋白聚集形式的鉴定 |
| 2.2.6.4 免疫印迹的检测 |
| 2.2.6.5 抗原蛋白组件完整性的检测 |
| 2.2.6.6 抗原表位的表面呈现性鉴定 |
| 2.2.7 免疫佐剂与抗原蛋白的配伍和筛选 |
| 2.2.7.1 实验动物的饲养与分组 |
| 2.2.7.2 动物免疫 |
| 2.2.7.3 血清的采集与保存 |
| 2.2.7.4 抗Aβ_(42)特异性抗体的浓度检测 |
| 2.2.7.5 抗Aβ_(42)特异性抗体的亲合力检测 |
| 2.2.7.6 抗Aβ_(42)特异性抗体的抗体亚型检测 |
| 2.2.7.7 PC12细胞毒性实验 |
| 2.2.7.8 抗血清中的抗体对Aβ斑块的特异性靶向研究 |
| 2.2.8 新型疫苗的免疫药理学研究 |
| 2.2.8.1 模式动物的分子鉴定 |
| 2.2.8.2 实验动物的饲养与分组 |
| 2.2.8.3 模式动物的免疫 |
| 2.2.8.4 新型疫苗的免疫效应研究 |
| 2.2.8.4.1 抗Aβ_(42)特异性抗体的浓度检测 |
| 2.2.8.4.2 抗Aβ_(42)特异性抗体的亲合力检测 |
| 2.2.8.4.3 抗Aβ_(42)特异性抗体的抗体亚型检测 |
| 2.2.8.5 新型疫苗的药理效应研究 |
| 2.2.8.5.1 模型动物空间认知和记忆能力的研究与评价 |
| 2.2.8.5.2 模型动物脑内病理性淀粉样斑块的检测与评价 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 工程化细菌能够可溶性高效表达目的抗原蛋白 |
| 3.1.1 重组质粒序列正确性的鉴定 |
| 3.1.2 抗原蛋白的诱导表达 |
| 3.1.3 抗原蛋白的提取和分离纯化 |
| 3.1.3.1 抗原蛋白能够被可溶性表达 |
| 3.1.3.2 抗原蛋白的硫酸铵分级沉淀 |
| 3.1.3.3 抗原蛋白的亲和柱层析分离 |
| 3.1.3.4 抗原蛋白的脱盐 |
| 3.1.4 抗原蛋白的性质鉴定 |
| 3.1.4.1 分子量检测 |
| 3.1.4.2 抗原蛋白聚集形式的鉴定 |
| 3.1.4.3 抗原蛋白组分完整性的鉴定 |
| 3.1.4.4 抗原蛋白含有Aβ_(1-15)表位 |
| 3.1.4.5 Aβ表位疫苗能够有效呈现于四聚化抗原分子的表面 |
| 3.2 抗原蛋白与乳化佐剂配伍的新型疫苗能够激发有效的抗Aβ体液免疫 |
| 3.2.1 乳化佐剂能够有效提高抗Aβ_(42)特异性抗体的浓度 |
| 3.2.2 铝佐剂能够提高Aβ_(42)特异性抗体的亲和力 |
| 3.2.3 乳化佐剂能够促进免疫反应偏向Th2 |
| 3.2.4 抗血清能够靶向性结合Aβ病理性斑块 |
| 3.2.5 抗血清能够中和Aβ_(42)低聚物对PC12细胞的神经毒性 |
| 3.3 转基因动物能够模拟Aβ导致的AD病理改变 |
| 3.4 新型疫苗能够激发病理模型产生针对Aβ_(42)的特异性免疫应答 |
| 3.4.1 新型疫苗能够刺激机体产生高浓度的抗Aβ_(42)特异性抗体 |
| 3.4.2 抗原蛋白APA与乳化佐剂组合能够提高抗Aβ_(42)特异性抗体的亲合力 |
| 3.5 新型疫苗能够激发病理模型产生以Th2为主的体液免疫反应 |
| 3.6 新型疫苗能够降低病理模型脑内的淀粉样斑块 |
| 3.7 新型疫苗能够改善病理模型的空间认知能力 |
| 3.7.1 潜伏期检测 |
| 3.7.2 超越平台次数测定 |
| 3.7.3 首次超越平台耗时测定 |
| 3.7.4 水迷宫运动轨迹分析 |
| 第四章 讨论与总结 |
| 第五章 结果与展望 |
| 附录1: 缩略语 |
| 附录2: Aβ_(1-42)合成报告 |
| 附录3: 硫酸铵溶液饱和度计算表(0℃) |
| 附录4: APA正向测序结果 |
| 附录5: APA反向测序结果 |
| 附录6: 以oIMR1597及oIMR1598为引物鉴定APP/PSN转基因小鼠基因型结果 |
| 附录7: 以PS1-F2及PS1-R1为引物鉴定APP/PSN转基因小鼠基因型结果 |
| 附录8: 以42及43为引物鉴定转基因小鼠内参基因的结果 |
| 附录9: APP/PSN转基因小鼠基因型鉴定参考汇总 |
| 参考文献 |
| 发表论文及科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）阿尔茨海默病重组B细胞表位Aβ1-15融合抗原疫苗研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 阿尔茨海默病重组B细胞表位Aβ1-15融合蛋白疫苗研究 |
| 1 阿尔茨海默病重组B细胞表位Aβ1-15融合蛋白疫苗在Balb |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 2 阿尔茨海默病重组B 细胞表位Aβ1-15 融合蛋白疫苗在PDAPP 小鼠免疫原性研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 阿尔茨海默病重组B 细胞表位Aβ1-15 融合DNA 疫苗研究 |
| 1 阿尔茨海默病重组B 细胞表位Aβ1-15 融合DNA 疫苗在Balb |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2 分子佐剂对重组B 细胞表位Aβ1-15 融合DNA 疫苗免疫原性影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 研究总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 阿尔茨海默病及其免疫治疗机制简述 |
| 1.2 阿尔茨海默病主动免疫治疗现状 |
| 1.3 本研究AD疫苗研究策略及主要研究内容 |
| 2 破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病重组Aβ1-15嵌合疫苗研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 引物的设计 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 抗体、蛋白、多肽 |
| 2.1.6 动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.2.3 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.4 Western Blot免疫印迹试验 |
| 2.2.5 蛋白质的定量分析 |
| 2.2.6 动物免疫实验 |
| 2.2.7 血清抗体测定 |
| 2.2.8 细胞免疫水平检测 |
| 2.2.9 斑点杂交实验(Dot-blot) |
| 2.2.10 APP转基因AD模型动物免疫实验 |
| 2.2.11 血清抗体测定(转基因小鼠部分) |
| 2.2.12 小鼠行为学实验 |
| 2.2.13 免疫组化检测小鼠大脑组织Aβ斑块 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 3种原核表达载体的构建 |
| 2.3.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达,纯化及鉴定 |
| 2.3.3 免疫小鼠血清特异性抗体水平 |
| 2.3.4 T细胞免疫应答反应 |
| 2.3.5 斑点杂交实验结果 |
| 2.3.6 ELISA法测定各免疫阶段抗Aβ的抗体水平(转基因小鼠部分) |
| 2.3.7 免疫后小鼠血清抗体滴度以及抗体亚型分析(转基因小鼠部分) |
| 2.3.8 免疫后小鼠行为学实验 |
| 2.3.9 免疫组化检测小鼠脑组织(海马区和皮质区)Aβ斑块含量 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 重组蛋白具有良好的免疫原性,免疫反应偏向于Th2型 |
| 2.4.2 产生的Aβ特异性抗体更倾向与Aβ寡聚体结合 |
| 2.4.3 重组蛋白的二价疫苗潜力 |
| 2.4.4 使用AD模型小鼠评价重组蛋白的免疫预防效果 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病Aβ1-15表位核酸疫苗研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 引物的设计 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 抗体 |
| 3.1.6 动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 质粒的大量提取 |
| 3.2.3 质粒的转染 |
| 3.2.4 间接免疫荧光鉴定蛋白的表达 |
| 3.2.5 动物免疫实验 |
| 3.2.6 血清抗体测定 |
| 3.2.7 细胞免疫水平检测 |
| 3.2.8 斑点杂交实验 |
| 3.2.9 AD转基因动物免疫实验 |
| 3.2.10 血清抗体测定(转基因小鼠部分) |
| 3.2.11 细胞免疫水平检测(转基因小鼠部分) |
| 3.2.12 小鼠大脑组织的免疫组化 |
| 3.2.13 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 2种真核表达载体的构建 |
| 3.3.2 真核表达载体在BHK21细胞中的表达及鉴定 |
| 3.3.3 免疫小鼠血清特异性抗体水平 |
| 3.3.4 T细胞免疫应答反应 |
| 3.3.5 斑点杂交实验 |
| 3.3.6 ELISA法测定各免疫阶段抗Aβ的抗体水平(转基因小鼠部分) |
| 3.3.7 免疫后小鼠血清抗体滴度以及抗体亚型分析(转基因小鼠部分) |
| 3.3.8 T细胞免疫应答反应(转基因小鼠部分) |
| 3.3.9 免疫组化检测小鼠脑组织Aβ斑块 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 重组Aβ表位DNA疫苗具有良好的免疫原性 |
| 3.4.2 DNA疫苗同重组亚单位疫苗之间的比较 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附A. 英文缩略词表 |
| 附B. 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）核酸疫苗预防接种对急性帕金森病小鼠黑质炎症反应的影响（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 优化核酸疫苗 pVAX1-IL-4/SYN-B 预防接种帕金森病小鼠的免疫效果 |
| 1 材料与方法 |
| 2 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 优化核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B 预防接种对帕金森病小鼠黑质免疫炎症反应的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）优化人α-突触核蛋白核酸疫苗免疫MPTP帕金森病小鼠的神经保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：优化人α-突触核蛋白核酸疫苗免疫 MPTP 帕金森病小鼠神经保护作用及其机制研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 三种防治帕金森病核酸疫苗的优化构建与鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 三种优化核酸疫苗的体液免疫效果 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 优化核酸疫苗治疗 MPTP 帕金森病小鼠神经保护作用及机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第四部分 溶酶体和蛋白酶体抑制剂对正常小鼠多巴胺神经元的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第五部分 溶酶体和蛋白酶体阻滞剂影响核酸疫苗免疫作用的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的文章和学术活动 |
（10）核酸疫苗免疫机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 阿尔茨海默氏病治疗性核酸疫苗免疫机制的研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 六、小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒X基因在原发性肝细胞癌发生发展中的分子机制研究 |
| 第一章 乙型肝炎病毒X基因转染人肝癌细胞比较蛋白组学 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 六、小结 |
| 第二章 乙型肝炎病毒X基因通过上调STRAP,nm23-H1激活PI3K信号通路调控PIMT蛋白表达 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、参考文献 |
| 六、小结 |
| 附录 |
| 文献综述(一) |
| 参考文献 |
| 文献综述(二) |
| 参考文献 |
| 在读期间撰写、发表的论文 |
| 致谢 |
四、阿尔茨海默病核酸疫苗的构建及诱导体液免疫反应的初步研究（论文参考文献）
- [1]伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析[D]. 张洪亮. 内蒙古农业大学, 2021
- [2]基于酵母的疱疹病毒疫苗的设计和制备[D]. 张霞. 辽宁大学, 2020(01)
- [3]表达高致病性猪蓝耳病GP3、GP5基因DNA疫苗构建及实验免疫研究[D]. 赵冠宇. 吉林大学, 2019(11)
- [4]N端截短与修饰的β-淀粉样蛋白的疫苗及抑制剂研究[D]. 李高. 清华大学, 2019(02)
- [5]基于药用酶的自聚化Aβ表位疫苗制备及免疫药理学研究[D]. 彭颜梅. 云南大学, 2018(04)
- [6]阿尔茨海默病重组B细胞表位Aβ1-15融合抗原疫苗研究[D]. 王文斌. 中国人民解放军军事医学科学院, 2011(07)
- [7]破伤风毒素片段作载体分子介导的阿尔茨海默病B细胞表位疫苗研究[D]. 陈鳌. 河南大学, 2011(08)
- [8]核酸疫苗预防接种对急性帕金森病小鼠黑质炎症反应的影响[D]. 赵臣勇. 重庆医科大学, 2011(11)
- [9]优化人α-突触核蛋白核酸疫苗免疫MPTP帕金森病小鼠的神经保护作用及其机制研究[D]. 王法祥. 重庆医科大学, 2009(04)
- [10]核酸疫苗免疫机制的研究[D]. 何颖. 第二军医大学, 2008(02)