一、血小板源生长因子在肝星状细胞内的信号转导机制（论文文献综述）
李昕宇[1]（2021）在《小鼠Kupffer细胞的转分化研究》文中提出研究背景及目的:KCs是肝脏长期驻留的巨噬细胞,在慢性肝损伤期间KCs被激活并分泌促炎症和促纤维化细胞因子,作用于HSCs转分化形成肌成纤维细胞,最终产生胶原沉积,学术界广泛认可,HSCs是肝脏中胶原沉积的主要来源,也是肝纤维化病理过程的核心环节,而KCs除了能辅助HSCs参与纤维化以外,是否有其他途径产生胶原沉积尚未阐明。HSCs转分化成为肌成纤维细胞是肝纤维化的关键步骤,除了HSCs转分化以外,肝脏中还存在大量其他细胞转分化的现象,例如有实验研究证明了动物模型中肝细胞和胆管细胞相互转化。在肝外组织中的巨噬细胞,例如皮肤、心肌、肾脏等组织中巨噬细胞可更进一步转分化为纤维细胞并分泌胶原蛋白,和伤口损伤愈合修复密切相关。通过上述类比,提出KCs可以发生转分化的猜想,KCs转分化为类成纤维细胞后可能产生胶原沉积,甚至有可能参与肝组织损伤修复乃至肝纤维化形成。KCs的转分化理论提供了不同于传统纤维化理论着眼于HSCs的不同视角,把肝硬化的过程视为河流,HSCs的转分化可视作主干道,而KCs则可作为支流,提供了未来肝纤维化治疗的新思路和新靶点,同时给成纤维细胞提供了新的来源,完善了对肝纤维化的认识。材料和方法:首先本研究在两个不同的体外实验模型中进行平行实验:体外肝脏非实质细胞培养和精密肝切片培养。具体步骤如下:（1）构建特异性追踪KCs谱系的动物模型Emr1Cre+/-::Ribo Tag+/-的小鼠追踪KCs谱系。（2）分离KCs后进行体外培养。（3）使用精密肝切片培养技术进行精密肝片培养。（4）使用免疫荧光成像分析培养后的KCs表达的蛋白。（5）利用多聚体免疫共沉淀富集KCs,提取RNA,合成c DNA。（6）实时定量PCR（Fludigm）。其次在小鼠肝切片中进行胶原沉积研究,使用氯膦酸盐脂质体耗竭KCs,进行精密肝切片培养,对肝切片进行Masson三色染色和RT-PCR基因表达分析。最后使用IL1r敲除小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠,使用精密肝切片培养技,实时定量PCR分析基因表达,使用LDH检测套盒定量分析肝片中细胞死亡情况。结果:（1）随着体外培养时间的推移,体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均发生:KCs的特征基因以及调控其表达的转录因子表达下调。（2）随着体外培养时间的推移,体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均发生:KCs中纤维化相关的基因以及调控其表达的转录因子表达上调。上述效应在非实质细胞培养和肝组织切片培养之间是高度一致的。（3）清除KCs后肝切片中胶原沉积减少。（4）Il-1r敲除小鼠的肝片中细胞死亡相关基因表达与对照组没有显着差异。（5）Nlrp3敲除小鼠肝片中细胞死亡相关基因表达与对照组没有显着差异。结论:KCs转分化在体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均有发生。KCs的转分化在体外培养中相对保守反应,转分化为类似成纤维细胞样的细胞,可以分泌胶原沉积相关蛋白。
张强[2]（2021）在《基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制》文中研究指明肝纤维化（Hverfibrosis,LF）是肝胆系统疾病中的常见病,并且是大多数慢性肝病发展的必然阶段。目前医学界普遍认为早期肝纤维化能够逆转,但如何进行逆转,目前尚未形成普遍的共识。肝纤维化早期产生的诸多病理变化中,人们对肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells,SECs）的病理变化给予的关注逐渐增多,其特征性的细胞学行为改变包括“窗口”尺寸与数量的变化以及连续性基底膜的形成,一旦SECs发生去窗口化后,则肝纤维化的进程难以逆转,目前这已是不争的事实。目前针对肝纤维化的治疗,现代医学尚且只能给予病因治疗,针对肝纤维化本身而言,目前还没有疗效肯定的药物或治疗手段问世。中医药学在治疗肝纤维化方面的经验历史较长,并对其发病机制形成了完整的认识,尤其是在治未病思想指导下,针对慢性肝病给予早期干预,这在一定程度上能够降低患者未来发生肝纤维化、肝硬化的风险。芪术颗粒是姚乃礼教授经过多年的临床经验总结,结合目前中医药学界对肝纤维化的普遍认识基础上创制的治疗肝纤维化常用方,本课题在国家自然基金“基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制”（NO:81774282）的资助下,结合课题组前期的研究成果探讨益气活血方芪术颗粒治疗肝纤维化的机制。1.基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析目的:以Meta分析的方法评价益气活血法治疗肝纤维化的临床疗效。方法:1.以PubMed、中国知识基础设施工程数据库、万方数据知识服务平台为检索资料库,检索时间跨度为自建库到2020年12月31日;以检索词“liver fibrosis”、“hepatic fibrosis”为检索词,然后以“effect”或者“efficacy”作为关键词逐篇进行排除;以“肝纤维化”作为检索词进行检索,然后以“临床观察”、“疗效分析”作为关键词逐篇进行排除。以上数据库没有语言限制。2.纳入随机对照临床研究类文献,以肝纤维化四项、肝脏瞬时弹性成像、肝脾脏的形态、门脾静脉的宽度、不良反应、安全性等结局指标作为考核指标。结果:本次研究共纳入合格文献共93篇,其中有86篇文献以肝纤维化四项作为临床评价指标,两组对比显示中药组的临床疗效比对照组更好,结果对比具有统计学差异[MD=51.15,95%CI（56.95,45.35）,P<0.00001]。15篇文献以肝硬度值作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善肝硬度值方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=3.52,95%CI（4.78,2.26）,P<0.00001]。33 篇文献研究以门静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善门静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.20,95%CI（2.14,0.26）,P=0.01]。31篇文献研究以脾脏厚度作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾脏厚度方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=6.83,95%CI（9.54,4.12）,P<0.00001]。13篇文献研究以脾静脉直径作为临床考核指标,两组对比显示中药组在改善脾静脉直径方面具有更好的疗效,比较结果具有统计学差异[MD=1.77,95%CI（3.04,0.49）,P=0.007]。结论:以益气活血为主要功效的中药组方在治疗肝纤维化方面相较于西药而言具有更好的临床疗效。2.基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制目的:（1）研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠肝脏炎症因子、肝纤维化指标以及病理组织学的调控作用。（2）通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法明确芪术颗粒对肝窦内皮细胞eNOSmRNA、eNOS、NO表达的影响。（3）基于多相多级次多孔介质理论,明确芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学特征。方法:（1）以四氯化碳作为肝纤维化的诱导剂,构建肝纤维化大鼠模型,造模同时给予芪术颗粒进行干预,通过Elisa法、HE以及Masson染色研究芪术颗粒对肝纤维化大鼠的生化、病理组织学的影响。（2）原位胶原酶灌注+离体消化+梯度密度分离法分离提取肝窦内皮细胞。（3）以10%肝纤维化大鼠血清+5%的胎牛血清作为外在损伤因素作用于体外培养状态的肝窦内皮细胞,模拟体内生化环境,构建肝窦内皮细胞损伤模型。将细胞按照正常对照组、损伤组、正常大鼠血清损伤组、芪术颗粒含药血清低、中、高浓度进行分组。（4）采用 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内eNOSmRNA、eNOS、NO的表达情况。（5）基于多相多级次多孔介质理论,采用原子力显微镜表征芪术颗粒干预下肝窦内皮细胞的力学属性。结果:（1）芪术颗粒能够改善肝纤维化大鼠生化指标,改善肝脏病理组织形态。（2）经过细胞形态以及免疫荧光鉴定可知,我们所提取的细胞为大鼠肝窦内皮细胞,且纯度较高。（3）经 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测胞内 eNOSmRNA、eNOS、NO显示芪术颗粒含药血清能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达。（4）经过芪术颗粒含药血清干预后,肝窦内皮细胞的骨架模量、粘度均有所提高,使肝窦内皮细胞向正常力学状态转变,而其扩散系数无明显变化。结论:（1）芪术颗粒能够抑制肝脏炎症状态,恢复肝脏正常组织形态。（2）芪术颗粒能够上调eNOSmRNA、eNOS、NO的表达,从而改善肝窦内皮细胞的病理状态,这可能是其抗肝纤维化的重要机制之一。（3）芪术颗粒能够改善肝窦内皮细胞的力学状态,促进肝窦内皮细胞向正常力学状态恢复,这可能是其发挥抗肝纤维化的另一重要机制。
周怡驰[3]（2021）在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中研究表明中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值（LSM）、纤维化-4指数（FIB-4）、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数（APRI）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量;次要指标:谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,总胆红素（TBiL）,谷氨酰转酞酶（GGT）,白蛋白（ALB）,将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组（CTL）、肝纤维化模型组（Model）、柴芪益肝方低剂量组（CQYG-L）、柴芪益肝方高剂量组（CQYG-H）和水飞蓟素治疗组（Silymarin）,共5组。四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄（41.34±0.90）岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄（43.13±0.78）岁,两组年龄无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。（1）无创肝纤维化指标（LSM、FIB-4、APRI）在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异（P>0.05）,但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。（2）两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）治疗前和后均无显着性差异（P>0.05）;CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低（P<0.05）,CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。（3）两组患者自身治疗前后血清肝功能指标（ALT、AST、GGT、TBiL、ALB）均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异（P>0.05）。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低（P<0.01）;CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组（P<0.05）,SOD和GSH-Px含量显着高于模型组（P<0.05）;免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低（P<0.05）;与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。
刘皎皎[4]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中研究说明目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
蒋云霞[5]（2021）在《荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究》文中认为目的:以大鼠肝星状细胞T6细胞株（HSC-T6）为受试对象,探讨并完善荔枝核总黄酮（total flavonoids from Litchi Seed,TFL）拮抗肝纤维化的作用靶点与作用机制。方法:常规培养HSC-T6,分别观察TFL在不同时间和不同浓度对HSC生长增殖率的影响,从中选择最佳的TFL药物浓度进行后续实验;将HSC-T6分为细胞对照组和TFL实验组,细胞对照组的HSC-T6常规培养,TFL实验组采用上述最佳的TFL药物浓度干预HSC-T6,分别使用透射电子显微镜和ELISA方法检测各组HSC-T6的超微结构和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）含量的变化。制备肝纤维化模型大鼠,在大鼠腹部皮下注射40%四氯化碳橄榄油混悬液0.3 ml/100 g,2次/周,共8周。造模完成后,行肝组织病理染色检测,证实造模成功。将肝纤维化造模完成的大鼠分为模型对照组和TFL实验组,模型对照组大鼠在肝纤维化造模完成后常规饲养,TFL实验组大鼠予灌胃TFL 100 mg/（kg·d）,4周后收集模型对照组和TFL实验组的大鼠血清。检测各组血清对HSC-T6的最大无毒浓度,以最大无毒浓度为最佳诱导剂量孵育HSC-T6,诱导分化14天后提取全蛋白,通过DDA/DIA技术筛选出模型对照组和TFL实验组血清干预后的差异表达蛋白,并对差异蛋白进行GO、KOG、PPI、PATHWAY和亚细胞定位等生物信息学分析。结果:1.透射电镜结果显示TFL干预后HSC-T6的超微结构发生变化,细胞间隙变大,胞膜四周纤毛脱落,多角伪足减少,膜表面不平整,细胞浆内线粒体明显变形,线粒体嵴断裂或消失,粗面内质网扁池扩张,核糖体脱落,核内染色质浓缩或边聚,核膜皱缩,可见凋亡小体形成。2.ELISA 结果显示,TFL 干预后 HSC-T6 的 MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量下降。3.生物信息学分析结果显示,模型对照组和TFL实验组的差异蛋白共177个,其中上调蛋白84个,下调蛋白93个。GO分析显示,差异蛋白参与分子功能共10个条目,主要为分子结合和催化活性;细胞组分共18个条目,主要为细胞质和细胞器;生物过程共24个条目,主要为细胞过程、代谢过程、生物调节等。4.KOG注释分析显示,差异蛋白比对到KOG数据库共有23个子类和192条蛋白注释信息,其中细胞过程和信号传递是获得注释信息最多的分类,其次为信息存储与处理、新陈代谢作用和缺乏注释的蛋白等。5.PPI分析结果显示,存在互作关系的上调蛋白28个:SELENOH、C1QC、C1QB、APOE、ANGPTL4、NF1、GPX3、CLU、DMAP1、VTN、MYH14、SELENOM、HRG、PF4、HMOX1、IGH1A、IGG2A、IGHG、PGK2、PLIN2、KDM4C、ITIH4、BAZ2A、C9、ADH7、MGST1、GSTA1、ATP9B等。存在互作关系的下调蛋白42个:RAD51、HELZ2、PBK/TOPK、HMGCS1、UBE2T、UBE2C、DLGAP5、LOC100911660、PTEN、BLM、CYP51A1、MDC1、LRRK1、MVD、NSDHL、IDI1、SPC24、CDCA8、KNSTRN、CCNB2、FAM83D、HMGXB4、STARD4、HLTF、LIPG、UHRF1、KAT8、PCSK9、UBE2S、AMMECR1L、WDR76、ZNRD2、DDX10、MAP3K3、PIMREG、SMAD1、MCL1、MPRIP、FIGNL1、RPAP1、STMN1、SPP1 等。6.PATHWAY富集分析结果显示,KEGG代谢通路分为6个分支,共注释38项条目,分支包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和有机系统等,其中差异蛋白占比前三的分支为人类疾病、新陈代谢和有机系统。代谢通路主要包括原发性免疫缺陷、金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联、系统性红斑狼疮、哮喘产生IgA的肠道免疫网络、免疫系统、萜类骨架的生物合成、自身免疫性甲状腺疾病、同种异体移植排斥、范可尼贫血途径、造血细胞谱系、非洲锥虫病、胆固醇代谢、类风湿关节炎、矿物质吸收、细胞色素P450对异生物的代谢、病毒性心肌炎、利什曼病、阿米巴病、癌症中的转录失调、扩张型心肌病、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、FcεRI信号通路、B细胞受体信号通路、磷脂酶D信号通路、NF-κB信号通路、酮体的合成与降解、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌、药物代谢-细胞色素P450等。7.亚细胞定位结果发现这些差异蛋白主要位于细胞核、细胞质或细胞外,其余则较平均散布于胞质内膜、线粒体、过氧化物酶体、内质网、胞质网丝以及细胞骨架上。结论:1.荔枝核总黄酮（TFL）可下调HSC-T6的MMP-2、ColⅠ和ColⅢ的表达水平,对HSC-T6的生长增殖具有抑制作用。2.本实验基于DDA/DIA模式并通过GO、KOG、PPI、PATHWAY以及亚细胞定位等生物信息学技术分析后发现C1QC、C1QB、C9、SELENOH、SELENOM、GPX3、APOE、CLU、ANGPTL4、NF1、HRG、PF4、ITIH4、ADH7、RAD51、BLM、FIGNL1、MDC1、SPC24、KNSTRN、CDCA8、HELZ2、HMGCS1、MVD、IDI1、CYP51A1、NSDHL、LIPG、PBK/TOPK、FAM83D、DLGAP5、UBE2T、UBE2C、UBE2S、UHRF1、MAP3K3、LRRK1、SMAD、、MCL、等差异蛋白与肝纤维化疾病具有密切相关性;PI3K/Akt通路、NF-κB信号通路、胆固醇代谢、补体和凝血级联、细胞色素P450可能是TFL抑制HSC-T6生长增殖并诱导HSC-T6死亡的主要信号转导途径。3.TFL可能通过调控多个蛋白和参与多种信号传导通路抑制ECM的形成和诱导HSC-T6死亡,发挥拮抗肝纤维化的生物学效应。
毕意辉[6]（2021）在《肝星状细胞来源的旁分泌信号分子IL-11促进肝细胞癌进展的机制研究》文中进行了进一步梳理大约90%的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是由慢性肝脏纤维性病变发展而来。在肝纤维化发展为肝癌之前,肝内微环境主要表现为炎症和纤维化这两个特点,我们称之为癌前微环境（premalignant microenvironment,PME）。在PME中,炎症主要由肝损伤导致的大量免疫细胞浸润引起,其中单核细胞分化为M1型巨噬细胞后通过分泌TGF-β,IL-1β,TNF-α,IL-6等促炎因子导致炎症快速扩大。肝内炎症的一个重要的效应细胞为肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells,HSCs）,其受到TGF-β等细胞因子刺激后活化,进而转分化为肌成纤维母细胞样细胞,这种细胞的特征是通过大量分泌多种胶原蛋白、非胶原糖蛋白,蛋白聚糖等重塑细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,最终导致肝纤维化形成。近年来,研究发现在HCC中PME通常与肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）共存。PME中的ECM包含大量的多功能细胞因子,这些细胞因子与TME中的肿瘤细胞相关作用,促进肿瘤增殖和转移。活化的HSCs作为PME中ECM的主要来源细胞,被认为是驱动HCC发生发展的关键因素,然而具体调控机制仍不明确。因此本论文重点探究活化的HSCs是如何调控HCC进展的。将肝癌细胞与活化的HSCs共同培养后进行转录组测序（RNA-seq）,我们发现肝癌细胞内大量基因的表达水平发生显着变化。对其中发生表达上调的基因进行基因功能富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）,结果表明这些基因主要与上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition,EMT）及细胞增殖（E2F target）等功能相关。进一步将肝癌细胞与活化的HSCs混合（10:90）植入裸鼠皮下,结果发现皮下瘤增殖迅速且出现大量肝癌细胞肝转移的现象,这与RNA-seq结果相一致。活化的HSCs以大量分泌多种细胞因子和细胞外基质成分为特点,因此我们猜测上述现象是由肝星状细胞通过旁分泌途径所产生的。旁分泌途径一般通过激活靶细胞内磷酸化信号转导来发挥功能,因此,我们将活化的HSCs来源的条件培养基（Condition Medium,CM）与肝癌细胞孵育10分钟,随后进行高通量蛋白磷酸化质谱实验。结果发现CM刺激导致肝癌细胞内促进肿瘤增殖和转移的JAKSTAT、MAPK和PI3K-Akt等信号通路被显着激活,且Western Blotting实验进一步证实了这一结果,这提示活化的HSCs可以通过旁分泌途径促进肝癌细胞增殖和转移。为了进一步探究HSCs的CM中发挥促肿瘤增殖和转移功能的关键旁分泌信号分子,并同时排除肝癌细胞自分泌的影响,我们利用RNA-seq分析了HSCs活化前后的转录水平变化,并分别对肝癌细胞和活化的HSCs来源的CM进行分泌蛋白质质谱分析。结果发现白介素-11（IL-11）在活化后的肝星状细胞内高表达且仅由肝星状细胞特异性分泌而肝癌细胞几乎不分泌,因此推测其可能是我们正在寻找的关键旁分泌信号分子。进一步通过Western Blotting实验证实肝癌细胞在介绍接受IL-11刺激后,肝癌细胞内的JAK-STAT、MAPK和PI3K-Akt信号通路显着激活。利用RNA干扰技术敲低肝癌细胞表面的IL-11受体（IL-11RA）后,由CM刺激引起的肝癌细胞内信号通路激活的现象被显着抑制。因此,上述结果均提示肝星状细胞可能通过旁分泌IL-11来促进肝癌细胞的增殖和转移。为了进一步在体内研究IL-11对肝癌细胞的影响,通过慢病毒感染,我们赋予了肝癌细胞自分泌IL11的能力。将获得分泌IL-11能力的肝癌细胞重新植入裸鼠皮下,观察发现该组裸鼠皮下肿瘤生长异常迅速,且在肿瘤长到一定体积后,裸鼠出现体重下降、腹部膨隆的恶病质现象。不仅如此,该组裸鼠肝脏内出现大量转移的肝癌细胞,而不能分泌IL11的肝癌细胞并不能发生肝转移。在探究IL11促进肝癌细胞转移的研究过程中我们发现IL-11不仅可以在活体内诱导小鼠血管渗透性增加,其还是一种非经典的中性粒细胞趋化因子,可以诱导中性粒细胞强烈的释放细胞外诱捕网（Neutrophils extracellular traps,NETs）。NETs中包含大量的蛋白酶,这些蛋白酶可以切割肿瘤外围的基底膜,导致基底膜结构被破坏,进而帮助肿瘤细胞发生远处转移。同时,在临床肝癌病人的组织内发现癌巢周围存在大量的IL-11,IL-11富集的区域中性粒细胞浸润明显,且伴随着大量NETs的释放。以上研究提示活化的肝星状细胞可以通过特异性旁分泌IL-11促进肝癌细胞增殖,同时诱导血管渗漏性增加并诱导中性粒细胞浸润,浸润的中性粒细胞在IL-11的作用下以释放NETs的方式破坏基底膜结构,促进肝癌细胞的远处转移。IL-11的这些功能都将促进肝癌的快速进展以及肝癌病人的生存率极大降低。因此由肝星状细胞特异性分泌的IL-11可能成为肝细胞癌精准治疗的新靶点。
辛鹏飞[7]（2021）在《高脂微环境活化肝星状细胞的作用及机制研究》文中研究说明背景和目的非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）可进展为肝纤维化,最终导致肝硬化和肝癌。其进展机制尚不明确,但已有证据表明肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSCs）活化在肝纤维化中具有关键作用。在NAFLD时HSCs可能和正常肝细胞一样暴露于来自循环脂质的高浓度游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）中。然而,高脂微环境在激活HSCs中的作用尚不清楚。研究表明,Rho/ROCK信号通路通在HSCs的活化增值、迁移等方面具有重要的调控作用。本研究旨在探讨高脂微环境对HSCs的影响及对Rho/ROCK信号通路的调节作用。方法1.取成年雄性SD大鼠（体重300.0 g-400.0 g）,用Percoll密度梯度离心法分离大鼠原代HSCs,加入完全培养基培养;328nm紫外光及倒置相差显微镜观察原代HSCs自发荧光和细胞形态;使用台盼蓝染色法检测细胞活力;油红O染色观察原代HSCs核周脂滴着色;免疫细胞化学染色（immunocytochemistry,ICC）检测Desmin与α-SMA的表达,最终鉴定原代HSCs。2.雄性SD大鼠（体重350.0 g-400.0 g）,禁食48 h（8:00 am-8:00 am）,再饲喂高脂饲料（high fat die,能量5.58 kcal/g）,于0 h、2 h、3 h、4h采集门静脉血液,分离获得饥饿再饲喂（re-feeding）大鼠门静脉高脂血清;将棕榈酸（palmitic acid,PA）粉末加入配制的10%牛血清白蛋白（BSA,bovine serum albumin）溶液中,于50°C搅拌24h使其充分溶解,配制成8m M的PA溶液。分别使用PA溶液和门静脉高脂血清构建体外高脂微环境模型,不同浓度的PA溶液（0、100、200、300、500、1000μmol/L）和不同浓度高脂血清（低、中、高浓度）分别培养大鼠原代HSCs和人肝星状细胞系（LX-2）。流式细胞术和CCK法检测细胞增殖,Western Blotting和实时荧光定量PCR（real time PCR）检测细胞中PDGF、TGF-β、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ的蛋白和mRNA表达水平;细胞划痕实验检测HSCs的迁移能力变化。3.Real time PCR检测Rho和ROCK mRNA表达水平,研究高脂微环境对HSCs增殖活化及迁移的作用机制。结果1.用Percoll密度梯度离心法分离大鼠原代HSCs,台盼蓝拒染率>95%,在328 nm紫外光下可观察到自发荧光;倒置相差显微镜可以观察到典型的肝星状细胞形态变化:由透亮的小圆形细胞逐渐增大呈多边形、小星芒状,最后细胞融合成片,胞体宽大,胞浆轴突完全伸展,细胞骨架明显;油红O染色可见原代HSCs核周脂滴着色;ICC显示静止的原代HSCs中Desmin（+）、α-SMA（-）,活化的原代HSCs中Desmin（+）、α-SMA（+）。2.与正常对照大鼠门静脉血清中TG（0.87±0.18 mmol/L）和FFA（0.77±0.05mmol/L）相比,饥饿再饲喂大鼠2h、3h、4h门静脉血清中TG的含量分别为1.64±0.28、2.48±0.23、3.12±0.18 mmol/L（P<0.05）,FFA的含量分别为0.91±0.03、1.50±0.11、1.79±0.28 mmol/L（P<0.05）。将LX-2细胞暴露于不同浓度的PA和大鼠门静脉高脂血清均显着促进细胞中脂质的蓄积,且呈剂量依赖性（P<0.05）,表明成功建立了体外高脂微环境细胞学模型。3.PA与门静脉高脂血清对HSCs产生不同的效应。（1）使用不同浓度的PA和高脂血清分别处理LX-2细胞和原代HSCs,PA抑制LX-2细胞的增殖,而高脂血清却促进LX-2增殖,且呈时间、剂量反应关系。（2）较高浓度的PA使LX-2细胞中α-SMA表达上调,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达降低,低浓度的PA（100μM）促进Ⅲ型胶原的表达;Real time PCR及Western Blotting结果显示,高脂血清促进LX-2细胞α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。（3）各浓度的PA作用大鼠原代HSCs 12h后,细胞中的α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA表达水平均出现了不同程度的升高,而高脂血清处理后仅有高浓度高脂血清组促进α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原表达升高;（4）划痕实验发现较高浓度的PA和高脂血清都能促进LX-2细胞迁移。4.1000μM的PA促进LX-2细胞中TGF-β和PDGF mRNA的表达,高浓度高脂血清组促进LX-2细胞中PDGF mRNA的表达,但抑制TGF-βmRNA的表达;所有浓度的PA和高浓度高脂血清组均促进了原代HSCs中TGF-β和PDGF mRNA的表达;1000μM的PA和高浓度高脂血清组促进了LX-2细胞中Rho和ROCK mRNA的表达,且与TGF-β和PDGF的表达基本一致。结论1.采用肝脏原位灌注、离体消化及Percoll密度梯度离心法成功分离大鼠原代HSCs,并鉴定了静止与活化状态的HSCs。2.成功建立了高脂微环境模型,模拟了不同高脂条件下细胞的培养,发现PA能够导致LX-2细胞内脂质积累,高脂微环境可促进HSCs中α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达,从而影响HSCs的活化、增殖及迁移。3.高脂微环境可能通过调节HSCs中TGF-β和PDGF的分泌来上调Rho/ROCK信号通路的表达,促进HSCs活化,导致肝纤维化的发展。
张艳培,梁健,邓鑫,梁明坤,张冰冰,徐粤娟[8]（2021）在《浅析肝纤维化发生机制》文中进行了进一步梳理肝纤维化是各种原因肝损伤后引起的肝脏复杂病理变化,国内外近年来研究表明,如果积极干预,尤其是在早期介入阻断肝纤维化的进展,甚至可以在一定程度上逆转肝纤维化,因此明确肝纤维化的诱发因素、发展机制及其可逆指标的检测对治疗慢性肝病肝纤维化即预防肝纤维化进展为肝硬化有一定的意义。但是目前肝纤维化的发生进展的机制仍未有较为明确的定论。文章通过研究近年来阐述肝纤维化发生、发展机制相关的文献,并对文献中有证据支持的肝纤维化发展过程中的相关机制做总结归纳,为肝纤维化的治疗及验证肝纤维化相关实验设计提供思路及理论支持。
徐莹[9]（2019）在《虫草菌丝活性成分C02通过调控巨噬细胞影响肝星状细胞活化的抗肝纤维化机制研究》文中研究表明1.背景及目的:在我国,无论相对发病率还是绝对病例数,肝纤维化患者均居世界首位,其主要病因为:病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病或药物性肝病等,肝纤维化不仅是肝脏损伤的病理修复反应,还会进一步发展为肝硬化、肝癌、肝衰竭[1],是严重危害人民健康和消耗社会资源的难治性疾病。因此,抗肝纤维化是慢性肝病的重要治疗环节。西医学已有较多的临床试验报道,对于慢性病毒性（乙型、丙型）肝炎抗病毒治疗可有效逆转肝纤维化[2],但迄今临床上仍缺乏直接针对纤维结缔组织增生的有效治疗肝纤维化的生物或化学药物,而中药及其复方具有多组分、多途径与多环节的综合作用特点,近年来发现在抗肝纤维化治疗方面有明显优势,已经取得了较好的临床疗效,如扶正化瘀胶囊（片）、复方鳖甲软肝片等[3-5]。虫草菌丝作为中医药抗肝纤维化药物扶正化瘀胶囊/片中最重要的扶正药物,课题组前期大量研究证实以虫草菌丝为主药的扶正药物在促进肝纤维化逆转中发挥主要作用,为了解析其发挥抗肝纤维化作用的主要活性成分,课题组前期开展系列活性导向研究,并在近两年取得了可喜的进展,成功从虫草菌丝主要活性部位中分离并证实了一种脂溶性成分C02是虫草菌丝抗肝纤维化主要活性成分,课题组目前已经申请国家发明专利,但由于C02成分抗肝纤维化的作用机制仍不明确,制约了其进一步的新药开发与应用。因此本研究拟开展C02体内外抗肝纤维化研究,试图解析其抗肝纤维化机制,为其新药开发与应用提供参考。2.方法:（1）C02体内抗肝纤维化作用与机制研究:建立CCl4小鼠肝纤维化模型及DMN大鼠肝纤维化模型,给予C02干预治疗后,收集血清及肝组织。通过肝组织HE及天狼猩红胶原染色、羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）含量、血清肝功能指标、纤维化相关指标因子的免疫组化及蛋白、基因水平变化等检测,探讨虫草菌丝活性成分C02潜在抗纤维化的作用机制。（2）C02对肝星状细胞（HSCs）与巨噬细胞活化、增殖的影响:体外采用不同浓度的C02对激活的JS-1（小鼠肝星状细胞）进行干预,观察HSCs活化、增殖相关基因及蛋白的变化;采用不同浓度的C02对LPS激活的巨噬细胞（RAW264.7小鼠巨噬细胞）进行干预,检测巨噬细胞活化、增殖相关指标基因及蛋白的变化。（3）C02通过调控巨噬细胞表型抑制HSCs活化的研究:体外采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞活化模型,给予C02及STAT1抑制剂干预24 h,去药后与正常JS-1细胞共培养24 h,分别收取RAW264.7巨噬细胞及JS-1细胞,检测巨噬细胞及肝星状细胞活化、增殖相关指标基因及蛋白的变化。观察活化的巨噬细胞对肝星状细胞活化的影响以及C02的干预作用;3.结果:（1）C02对CCl4诱导肝纤维化小鼠的干预作用:C02对CCl4诱导的纤维化小鼠肝功能有明显的改善作用,C02中、高剂量组可有效降低血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）含量,且高剂量组药效优于低剂量组（P<0.05）;小鼠肝组织天狼猩红染色、胶原半定量及肝组织HE染色结果显示,C02高剂量组可有效减少胶原沉积及肝脏炎性细胞浸润,肝组织羟脯氨酸结果与胶原半定量结果基本一致（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02用药组α-SMA、COL-I表达较模型组显着减少,且C02高剂量组药效优于低剂量组,荧光定量RT-PCR和Western-blot结果表达与免疫组化结果基本一致（P<0.01或P<0.05）。Western-blot蛋白免疫印迹结果显示,C02高剂量组p-ERK/ERK、PDGF、TNF-α蛋白水平较模型组显着下降（P<0.05）;较模型组相比,C02高剂量组M1型巨噬细胞表型相关蛋白STAT1及IRF5表达下调（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02高剂量组小鼠M1型巨噬细胞标记物CD11b阳性表达较模型组明显减少,M2型巨噬细胞标记物CD206阳性表达较模型组有所增加。（2）C02对DMN诱导肝纤维化大鼠的干预作用:C02对DMN诱导的纤维化大鼠肝功能有改善作用,C02中、高剂量组可有效降低AST、ALT含量,且高剂量组药效优于低剂量组（P<0.05）;大鼠天狼猩红染色、胶原半定量及肝组织HE染色结果显示,C02高剂量组可有效减少胶原沉积及肝脏炎性细胞浸润,肝组织羟脯氨酸结果与胶原半定量结果基本一致（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02用药组α-SMA、COL-I表达较模型组显着减少,且C02高剂量组药效优于低剂量组（P<0.05）,荧光定量PCR及Western-blot结果与免疫组化的结果表达基本一致。Western-blot结果显示,C02高剂量组p-ERK/ERK、PDGF、TNF-α蛋白水平较模型组显着下降（P<0.05）;较模型组相比,C02高剂量组M1型巨噬细胞表型相关蛋白STAT1及IRF5表达下调（P<0.05）;免疫组化结果显示,C02高剂量组大鼠M1型巨噬细胞标记物CD68阳性表达较模型组明显减少,M2型巨噬细胞标记物CD163阳性表达较模型组有所增加。（3）C02对肝星状细胞（HSCs）及巨噬细胞活化、增殖的影响:C02能够呈剂量依赖性的抑制小鼠肝星状细胞（JS-1）及原代肝星状细胞的增殖（P<0.05）;JS-1细胞经5 ng/m L TGF-β1处理激活造模,采取不同浓度C02干预,较模型组相比,40μM C02可显着降低JS-1细胞α-SMA和COL-I基因及蛋白的水平（P<0.05）;F-actin细胞染色结果显示,C02在20μM、40μM浓度时可成不同程度降低JS-1细胞F-actin的表达;原代小鼠肝星状细胞的油红染色实验结果显示,C02可显着增加原代肝星状细胞胞质内脂滴含量。RAW264.7巨噬细胞经100 ng/m L LPS处理激活造模,采取不同浓度C02干预,荧光定量PCR结果显示,较模型做相比,C02在10μM浓度时TGF-β1、IL-1、PDGF等相关炎性因子较模型组m RNA表达下降（P<0.01或P<0.05）;Elisa结果显示,5μM和10μM C02可在2 h-36 h内持续降低巨噬细胞分泌PDGF-BB的含量（P<0.05）,2.5μM、5μM和10μM C02可在8 h-36 h内持续降低巨噬细胞i NOS分泌量（P<0.05）;C02对巨噬细胞的起效浓度较对HSCs的起效浓度低2-16倍。（4）C02通过调控巨噬细胞表型抑制HSCs活化的研究:RAW264.7巨噬细胞与JS-1细胞共培养:LPS激活的RAW264.7巨噬细胞给予C02及STAT1抑制剂干预24h,去药后与JS-1细胞共培养24 h,模型组JS-1细胞α-SMA m RNA表达水平明显升高（P<0.05）,C02干预后,高剂量组α-SMA m RNA表达下调（P<0.05）,细胞爬片免疫荧光α-SMA检测也得到同样的结果;Western-blot蛋白免疫印迹结果显示,C02高剂量组可抑制JS-1细胞p-ERK/ERK的蛋白表达（P<0.01或P<0.05）。STAT1抑制剂组可抑制JS-1细胞α-SMA、COL-I m RNA的表达水平,STAT1抑制剂联合C02高剂量组药效优于STAT1或C02高剂量组单用组（P<0.05）;STAT1抑制剂及C02可抑制M1型巨噬细胞标志物CD11b及PDGF m RNA表达水平,且STAT1抑制剂联合C02高剂量组药效优于STAT1或C02高剂量组单用组（P<0.05）。4.结论:（1）体内药效学研究表明C02可有效改善CCl4小鼠肝纤维化模型及DMN大鼠肝纤维化模型的肝功能及纤维化程度,C02可以抑制M1型巨噬细胞及HSCs活化,同时发现C02在体内的作用机制与PDGF/ERK信号通路有关。（2）体外实验研究表明C02可能通过抑制STAT1进而抑制M1型巨噬细胞活化,从而减少PDGF-BB、TNF-α等因子释放,进而抑制HSCs的活化,其抑制HSCs活化的作用机制与PDGF/ERK信号通路有关。
韦淇元[10]（2019）在《相思藤总黄酮对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的保护作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的:研究相思藤总黄酮（XIANGSITENG Flavonoid,XSTF）对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的保护作用及作用机制。方法:雄性SD大鼠80只,随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组（0.2mg/kg）、相思藤总黄酮高、中、低剂量组（800、400、200mg/kg）,除正常对照组外,其余各组大鼠灌胃给予剂量为0.1ml/kg 50%-四氯化碳花生油混合液制造肝纤维化模型,每周两次。确定大鼠形成肝纤维化后连续四周每日给予大鼠秋水仙碱和相思藤总黄酮相应剂量药物,正常对照组和模型组给予相应体积的生理盐水。在给药期间,除正常对照组外,其余各组同时继续造模处理。末次给药24h后,收集血清及肝组织,称量肝脏、脾脏、胸腺重量,分别计算脏器指数;检测大鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）活性、透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PC-Ⅲ）、层粘蛋白（LN）、Ⅳ型胶原（C-Ⅳ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平;制备肝脏匀浆,检测肝组织中羟脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）含量;取大鼠肝组织固定于10%甲醛中用于苏木素-伊红（HE）染色,MASSON染色观察病理变化及胶原堆积情况;免疫组化法检测肝组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、PI3K、Akt蛋白表达水平;荧光定量PCR检测肝组织fak、pi3k、akt m RNA表达情况。结果:与正常对照组大鼠相比,模型组大鼠肝脾指数显着升高（P<0.01）;HE染色和Masson染色结果显示肝组织损伤程度明显,纤维大量增生;血清中ALT、AST、HA、PC-Ⅲ、LN、C-Ⅳ、TNF-α、IL-6含量显着升高（P<0.01）;肝组织中Hyp与MDA含量升高,SOD、GSH-px的活性降低（P<0.01）;免疫组化结果显示TGF-β1,α-SMA、PI3K、Akt蛋白表达水平明显上升（P<0.01）;荧光定量PCR结果fak、pi3k、akt的m RNA表达水平提升（P<0.01）;与模型组大鼠相比,相思藤总黄酮高、中剂量能显着降低大鼠肝脾指数（P<0.01或P<0.05）,胸腺指数无统计学意义;相思藤总黄酮各剂量均能显着降低四氯化碳诱导的大鼠血清ALT、AST水平（P<0.01）,改善肝脏的病理形态并减轻纤维增生情况;相思藤总黄酮高、中剂量可降低大鼠血清中HA、PC-Ⅲ、LN、C-Ⅳ与肝组织Hyp含量,同时减少TGF-β1,α-SMA的蛋白表达（P<0.01或P<0.05）。相思藤总黄酮干预后可明显抑制四氯化碳诱导的肝脏氧化应激反应,与模型组相比,相思藤总黄酮高、中剂量组肝组织中SOD、GSH-px活性升高,MAD含量下降,血清中TNF-α、IL-6含量明显降低（P<0.01或P<0.05）;相思藤总黄酮低剂量可升高SOD活性,降低血清TNF-α、IL-6含量水平（P<0.05）。与模型组比较,相思藤总黄酮高、中剂量均能下调FAK-PI3K-Akt信号通路中fak、pi3k、akt m RNA和PI3K、Akt蛋白的表达（P<0.01或P<0.05）;相思藤总黄酮低剂量组能下调fak m RNA及Akt蛋白的表达（P<0.05）。结论:相思藤总黄酮对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化具有明显改善作用,可以明显减小肝组织损伤,其保护机制可能与抑制致纤因子TGF-β1、α-SMA蛋白表达,清除自由基、抑制脂质过氧化与减轻炎症反应,以及抑制FAK/PI3K/Akt信号传导通路有关。
二、血小板源生长因子在肝星状细胞内的信号转导机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血小板源生长因子在肝星状细胞内的信号转导机制（论文提纲范文）
（1）小鼠Kupffer细胞的转分化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 前言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏概述 |
| 1.2 肝脏纤维化 |
| 1.2.1 肝细胞的死亡与凋亡 |
| 1.2.2 肝纤维化发展 |
| 1.2.3 肝纤维化中肌成纤维细胞的组成 |
| 1.3 KCs在肝脏学中的研究进展 |
| 1.3.1 KCs的起源 |
| 1.3.2 KCs在肝脏结构中的定位 |
| 1.3.3 KCs的免疫作用 |
| 1.3.4 KCs的异质性 |
| 1.3.5 KCs的可塑性 |
| 1.3.6 KCs与肝脏疾病 |
| 1.4 细胞谱系追踪技术 |
| 1.4.1 细胞谱系追踪技术的基本原理 |
| 1.4.2 细胞谱系追踪的标记方法 |
| 1.4.3 细胞谱系追踪在肝脏研究中的应用 |
| 1.4.4 细胞谱系追踪的未来 |
| 1.6 细胞的转分化 |
| 1.6.1 细胞转分化概述 |
| 1.6.2 自然发生的转分化 |
| 1.6.3 实验性转分化 |
| 1.6.4 肝脏中的转分化 |
| 1.6.5 转分化应用于再生医学的优点和局限性 |
| 第2章 KCs在体外非实质细胞培养过程中的形态和表型变化研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 2.2.4 主要实验试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 非实质细胞分离 |
| 2.3.2 收集培养的非实质细胞 |
| 2.3.3 多聚体免疫共沉淀 |
| 2.3.4 RNA提取 |
| 2.3.5 基因表达分析 |
| 2.3.6 免疫荧光成像 |
| 2.3.7 统计学方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 精密肝切片培养实验过程中,KCs特征性基因表达下调 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 3.2.4 主要实验试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在精密肝切片培养和体外非实质细胞培养实验中,KCs中纤维化相关基因表达分析研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 KCs在培养过程中转录因子基因表达研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 KCs与肝片中胶原沉积的初步探索研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 主要实验耗材与设备 |
| 6.1.4 主要实验试剂配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 KCs耗竭 |
| 6.2.2 肝片培养、基因分析等方法同前所述 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 本实验创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药学治疗肝纤维化的研究进展 |
| 综述二 现代医学对肝纤维化的研究进展 |
| 综述三 益气活血法对肝窦内皮细胞细胞生物学影响的研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于益气活血法治疗肝纤维化临床疗效的Meta分析 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 芪术颗粒对肝纤维化模型大鼠的影响研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 结论 |
| 实验二 大鼠肝窦内皮细胞的原代分离与提取 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞胞内一氧化氮合成酶、一氧化氮的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 芪术颗粒含药血清对肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 创新性 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
| 中医药科技查新报告书 |
（3）柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 中西医治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第一节 西医诊断和治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二章 柴芪益肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化的临床回顾性研究 |
| 前言 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 分组与治疗 |
| 第三节 结果分析 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的作用机制 |
| 前言 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第四章 柴芪益肝方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 材料与研究方法 |
| 第二节 指标检测 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（5）荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养及传代 |
| 2.2 检测TFL药物对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.3 透射电子显微镜观察HSC-T6的超微结构 |
| 2.4 ELISA检测MMP-2、ColⅠ、ColⅢ的含量变化 |
| 2.5 肝纤维化动物造模分组及含药血清的制备 |
| 2.6 检测含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.7 含药血清干预后蛋白质的收集与提取 |
| 2.8 DDA检测 |
| 2.9 DIA检测 |
| 2.10 主要数据库和数据指标 |
| 2.10.1 NR数据库和UniProt蛋白数据库 |
| 2.10.2 STRING蛋白互作数据库 |
| 2.10.3 GO数据库 |
| 2.10.4 KOG数据库 |
| 2.10.5 KEGG数据库 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TFL药物对HSC-T6生长抑制率的影响 |
| 3.2 TFL药物对HSC-T6超微结构的影响 |
| 3.3 TFL药物对HSC-T6的MMP-2、ColⅠ、ColⅢ含量的影响 |
| 3.4 肝纤维化动物造模结果 |
| 3.5 不同浓度的含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 3.6 肽段与蛋白的定量质控分析 |
| 3.7 DDA/DIA检测结果 |
| 3.8 GO富集分析 |
| 3.9 KOG注释分析 |
| 3.10 PPI分析 |
| 3.11 PATHWAY富集分析 |
| 3.12 亚细胞定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 理论基础 |
| 4.1.1 肝纤维化与肝星状细胞的理论基础 |
| 4.1.2 差异蛋白质组学的理论基础 |
| 4.1.3 中医药对肝纤维化认识的理论基础 |
| 4.1.4 荔枝核总黄酮(TFL)治疗肝纤维化的理论基础 |
| 4.2 TFL对HSC-T6生长增殖的影响 |
| 4.3 TFL对HSC-T6的ECM形成相关因子的影响 |
| 4.3.1 基质金属蛋白酶2(MMP-2) |
| 4.3.2 Ⅰ型胶原(ColⅠ) |
| 4.3.3 Ⅲ型胶原(ColⅢ) |
| 4.4 TFL对HSC-T6部分差异蛋白功能的讨论 |
| 4.4.1 上调蛋白 |
| 4.4.2 下调蛋白 |
| 4.5 TFL对HSC-T6差异蛋白部分信号通路的分析 |
| 4.5.1 PI3K/Akt通路 |
| 4.5.2 NF-κB信号通路 |
| 4.5.3 胆固醇代谢与合成 |
| 4.5.4 补体和凝血级联 |
| 4.5.5 细胞色素P450 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 荔枝核总黄酮防治肝纤维化相关细胞因子及信号通路的进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
（6）肝星状细胞来源的旁分泌信号分子IL-11促进肝细胞癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验细胞 |
| 2.3 构建的质粒及细胞株 |
| 2.4 药品与试剂 |
| 2.4.1 抗体 |
| 2.4.2 细胞培养相关试剂 |
| 2.4.3 细胞处理相关试剂 |
| 2.4.4 分子生物学相关试剂 |
| 2.4.5 生化实验相关试剂 |
| 2.4.6 动物实验相关试剂 |
| 2.5 主要仪器与设备 |
| 2.6 qPCR引物序列 |
| 2.7 本文所使用的专业数据处理软件 |
| 2.8 本文所使用的统计方法 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 分子克隆实验 |
| 3.1.1 感受态细胞的制备 |
| 3.1.2 质粒构建过程 |
| 3.1.3 从cDNA文库钓取基因 |
| 3.2 细胞实验 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞冻存和复苏 |
| 3.2.3 人外周血中性粒细胞的提取和纯化 |
| 3.2.4 过表达细胞株的构建 |
| 3.2.5 Knock out细胞株的构建 |
| 3.2.6 siRNA敲低实验 |
| 3.2.7 LX2 细胞条件培养基的制备 |
| 3.2.8 肝癌细胞磷酸化实验 |
| 3.2.9 免疫印迹Western Blot(WB)实验 |
| 3.2.10 荧光定量PCR实验(RT-qPCR) |
| 3.2.11 中性粒细胞Transwell实验 |
| 3.2.12 中性粒细胞NETs释放实验 |
| 3.3 小鼠IL11(m IL11)重组蛋白体外纯化实验 |
| 3.4 动物实验 |
| 3.4.1 裸鼠皮下瘤实验 |
| 3.4.2 小鼠肝纤维化模型的建立 |
| 3.4.3 Hepa1-6 细胞肝脏原位移植瘤模型的建立 |
| 3.4.4 IL-11 小鼠单克隆中和抗体的制备 |
| 3.4.5 石蜡切片免疫组织化学染色 |
| 3.4.6 石蜡切片RNA-FISH实验 |
| 4 结果 |
| 4.1 活化的HSCs促进HCCs增殖和转移 |
| 4.1.1 EGFP-HCCLM3和m Cherry-LX2 细胞系共培养及分选后进行RNA-seq测序 |
| 4.1.2 RNA-seq结果的分析 |
| 4.1.3 Luciferase-HCCLM3和LX2 细胞共培养后的裸鼠皮下瘤实验 |
| 4.2 活化的肝星状细胞通过旁分泌IL11 促进肝癌细胞增殖和转移 |
| 4.2.1 肝星状细胞来源的条件培养基(Condition medium,CM)引起肝癌细胞内磷酸化水平变化的实验 |
| 4.2.2 RNA-seq检测肝星状细胞激活前后的基因转录水平的变化 |
| 4.2.3 肝星状细胞LX2 来源的条件培养基CM的蛋白质质谱分析 |
| 4.2.4 体外实验验证IL11 在肝星状细胞内特异性表达及其对肝癌细胞的影响 |
| 4.2.5 体内实验验证IL11 对肝癌细胞生长和转移的影响 |
| 4.3 IL11 促进中性粒细胞趋化并诱导其释放NETs |
| 4.3.1 IL11 引起裸鼠血液内嗜中性粒细胞增多 |
| 4.3.2 IL11 可以诱导中性粒细胞趋化 |
| 4.3.3 重组小鼠IL11(rm IL11)的表达与纯化及在体内诱导中性粒细胞趋化 |
| 4.3.4 IL11 是一种强中性粒细胞NETs释放的诱导剂 |
| 4.3.5 人肝癌组织标本内可以检测到大量IL11 在癌巢周围分布 |
| 4.3.6 RNA-FISH实验验证IL11 在人肝癌组织内由肝星状细胞特异性分泌 |
| 4.3.7 IL11 高表达的肝癌组织内存在大量中性粒细胞浸润,且这些中性粒细胞大量释放NETs |
| 4.4 靶向IL11 和中性粒细胞干预肝细胞癌进展 |
| 4.4.1 IL11 在小鼠肝纤维化时期开始表达升高,并特异性由肝星状细胞分泌 |
| 4.4.2 小鼠肝癌细胞He Pa1-6 的皮下及原位肝癌移植瘤实验 |
| 4.4.3 IL11 中和抗体的制备与功能验证 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 关于靶向肝星状细胞治疗肝细胞癌的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）高脂微环境活化肝星状细胞的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 大鼠原代HSCs的分离、鉴定与培养 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论和结论 |
| 第二章 高脂微环境对HSCs活化、增殖和迁移的影响及机制 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论和结论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 Rho/ROCK信号通路调控肝星状细胞活化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）浅析肝纤维化发生机制（论文提纲范文）
| 引言 |
| 1 肝纤维化的发生与病理基础 |
| 1.1 肝纤维化的发生 |
| 1.2 肝纤维化的病理基础 |
| 2 炎症因子在肝纤维化发生发展中的作用 |
| 2.1 部分炎性细胞因子 |
| 2.2 干扰素与肝纤维化 |
| 2.3 IGFBP（胰岛素样生长因子结合蛋白） |
| 2.4 MicroRNA |
| 2.5 成纤维细胞生长因子21(FGF-21) |
| 2.6 凝血因子 |
| 2.7 瘦素在肝纤维化中的作用 |
| 3 信号转导通路对肝纤维化发生发展过程中的作用 |
| 3.1 血小板源性生长因子（PDGF）通路在肝纤维化中的作用 |
| 3.2 Hedgehog(Hh）信号通路 |
| 3.3 TGFβ1/Smad（转化生长因子β1/Smad蛋白家族）信号转导通路 |
| 3.4 ROS/NF-κB信号传导通路 |
| 3.5 血管紧张素（AngⅡ）信号转导通路 |
| 3.6 MAPK信号转导通路 |
| 3.7 Notch信号通路 |
| 4 结束语 |
（9）虫草菌丝活性成分C02通过调控巨噬细胞影响肝星状细胞活化的抗肝纤维化机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 C02对CCl_4诱导肝纤维化小鼠的干预作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物模型制备方法 |
| 2.2 血清肝功能检测 |
| 2.3 蛋白免疫印迹 |
| 2.4 肝组织HE染色 |
| 2.5 肝组织天狼猩红染色及胶原半定量 |
| 2.6 肝组织羟脯氨酸含量 |
| 2.7 肝组织和细胞总RNA抽提 |
| 2.8 Real time PCR |
| 2.9 免疫组织化学染色 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组小鼠基本情况 |
| 3.2 小鼠体重、肝重、脾重、肝体比及脾体比的变化情况 |
| 3.3 C02对CCl_4 肝纤维化小鼠血清ALT、AST的影响 |
| 3.4 C02对CCl_4肝纤维化小鼠肝组织病理学及羟脯氨酸含量的影响 |
| 3.5 C02对CCl_4 肝纤维化小鼠肝脏α-SMA、COL-I表达的影响 |
| 3.6 C02对CCl_4诱导肝纤维化小鼠肝内巨噬细胞表型的影响 |
| 3.7 C02 对促纤维化相关因子PDGF-BB、TNF-α表达的影响 |
| 3.8 C02对JNK/ERK/P38 信号通路的影响 |
| 3.9 C02 对巨噬细胞活化相关蛋白IRF5、STAT1 的影响 |
| 4 本章小结 |
| 第二章 C02对DMN诱导肝纤维化大鼠的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物模型制备方法 |
| 2.2 血清肝功能检测 |
| 2.3 蛋白免疫印迹 |
| 2.4 肝组织HE染色 |
| 2.5 肝组织羟脯氨酸含量 |
| 2.6 肝组织和细胞总RNA抽提 |
| 2.7 Real time PCR |
| 2.8 免疫组织化学染色 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 各组大鼠基本情况 |
| 3.2 大鼠体重、肝重、脾重、肝体比及脾体比的变化情况 |
| 3.3 C02对DMN肝纤维化大鼠血清ALT、AST含量的影响 |
| 3.4 C02对DMN纤维化大鼠肝组织病理及羟脯氨酸含量的影响 |
| 3.5 C02对DMN肝纤维化大鼠肝脏α-SMA、COL-I表达的影响 |
| 3.6 C02对DMN诱导肝纤维化大鼠肝内巨噬细胞表型的调控作用 |
| 3.7 C02对DMN诱导肝纤维化大鼠肝脏促纤维化因子PDGF-BB、TNF-α表达的影响 |
| 3.8 C02对DMN诱导肝纤维化大鼠肝脏JNK/ERK/P38 信号通路的影响 |
| 3.9 C02对巨噬细胞活化相关蛋白的影响 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 C02对肝星状细胞及巨噬细胞的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 分离原代小鼠肝星状细胞 |
| 2.3 原代肝星状细胞存活率鉴定 |
| 2.4 原代肝星状细胞的纯度鉴定 |
| 2.5 细胞免疫荧光检测 |
| 2.6 CCK8法检测细胞增殖 |
| 2.7 Real Time PCR |
| 2.8 蛋白免疫印迹 |
| 2.9 ELISA检测 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 C02对JS-1细胞活力及增殖的影响 |
| 3.2 C02对JS-1 细胞α-SMA、COL-I表达的影响 |
| 3.3 C02 对小鼠原代肝星状细胞α-SMA、COL-I表达的影响 |
| 3.4 C02对巨噬细胞的增殖及活力的影响 |
| 3.5 C02 对巨噬细胞分泌相关炎性因子PDGF-BB、TNF-α、TGF-β1、IL-1 mRNA的影响 |
| 3.6 C02 对巨噬细胞分泌PDGF-BB、TNF-α、iNOS的影响 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 C02通过巨噬细胞影响肝星状细胞的活化 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 Transwell细胞共培养 |
| 2.3 细胞免疫荧光检测 |
| 2.4 CCK8法检测细胞增殖 |
| 2.5 Real Time PCR |
| 2.6 蛋白免疫印迹 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 共培养不同时间点巨噬细胞对肝星状细胞的活化影响 |
| 3.2 共培养24h巨噬细胞CD11b、CD206 表达变化 |
| 3.3 共培养24h巨噬细胞PDGF-BB、TNF-α、TGF-β1、IL-1 mRNA的变化 |
| 3.4 共培养24h培养上清中PDGF-BB、TNF-α蛋白含量变化 |
| 3.5 共培养24h巨噬细胞IRF-5、STAT1 mRNA表达变化 |
| 3.6 共培养24h巨噬细胞对肝星状细胞的活化影响 |
| 3.7 共培养24h对 JS-1 细胞ERK、P-ERK的影响 |
| 3.8 STAT1 抑制剂及C02 干预后巨噬细胞STAT1 mRNA变化情况 |
| 3.9 STAT1 抑制剂及C02 干预后巨噬细胞CD11b、CD206 mRNA的表达变化 |
| 3.10 STAT1 抑制剂及C02 干预后巨噬细胞分泌促炎因子PDGF-BB、TNF-α变化情况 |
| 3.11 STAT1抑制剂干预后肝星状细胞的活化情况 |
| 4 本章小结 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 本文的创新点 |
| 附录1 :文献综述 肝脏微环境中各种细胞对肝星状细胞活化的影响 |
| 参考文献 |
| 附录2:在校期间发表的学术论文 |
（10）相思藤总黄酮对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 相思藤总黄酮对四氯化碳诱大鼠肝纤维化的保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 相思藤总黄酮对肝纤维化大鼠的氧化应激及炎症因子水平影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 相思藤总黄酮对肝纤维化大鼠FAK/PI3K/Akt信号通路相关基因转录及蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 主要中英文缩略词表 |
| 综述 中草药中含黄酮类化合物治疗肝纤维化分子信号通路的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
四、血小板源生长因子在肝星状细胞内的信号转导机制（论文参考文献）
- [1]小鼠Kupffer细胞的转分化研究[D]. 李昕宇. 吉林大学, 2021(01)
- [2]基于肝窦内皮细胞微尺度生物力学性质研究芪术颗粒抗肝纤维化机制[D]. 张强. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
- [5]荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究[D]. 蒋云霞. 广西中医药大学, 2021(01)
- [6]肝星状细胞来源的旁分泌信号分子IL-11促进肝细胞癌进展的机制研究[D]. 毕意辉. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]高脂微环境活化肝星状细胞的作用及机制研究[D]. 辛鹏飞. 兰州大学, 2021(12)
- [8]浅析肝纤维化发生机制[J]. 张艳培,梁健,邓鑫,梁明坤,张冰冰,徐粤娟. 大众科技, 2021(02)
- [9]虫草菌丝活性成分C02通过调控巨噬细胞影响肝星状细胞活化的抗肝纤维化机制研究[D]. 徐莹. 上海中医药大学, 2019(03)
- [10]相思藤总黄酮对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的保护作用及其机制研究[D]. 韦淇元. 广西中医药大学, 2019(02)