一、一种粘膜免疫佐剂——大肠杆菌热不稳定肠毒素研究现况（论文文献综述）
冯启峥[1]（2020）在《产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建及其主要生物学特性研究》文中指出产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）是引起旅行者、儿童及幼龄动物腹泻的主要病原菌之一,其引起的仔猪黄痢、仔猪白痢和断奶仔猪腹泻严重影响仔猪的健康,给养猪业造成了巨大经济损失。由于耐药菌株的出现使抗生素疗效明显下降,因此,生产上迫切需要新型、高效的药物或疫苗来保障仔猪哺乳期的健康。口服疫苗具有诱导肠道局部黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫的优点,为仔猪大肠杆菌病疫苗研究提供了新思路。ETEC产生的肠毒素主要有热不稳定肠毒素（Heat-labile enterotoxin,LT）和热稳定肠毒素（Heat-stable enterotoxin,ST）,是主要致病因子。LT虽具有良好的抗原性,但自身的毒性限制了其作为抗原被直接用于动物的免疫。减毒LT突变体（Mutant heat-labile enterotoxin,mLT）的研究已有报道,但不同mLT突变菌株的构建及其生物学特性尚缺乏系统研究。本研究构建了3株产肠毒素性大肠杆菌的mLT突变菌株,旨在通过对其主要生物学特性系统地比较研究,为仔猪大肠杆菌性腹泻口服疫苗的研制筛选出较理想的候选菌株。本研究选择E.coli C83903（K88、STb、LT）为初始菌株,使用CRISPR/Cas9双质粒基因编辑系统敲除est B基因获得E.coli C83903（35）est B后,对编码LT的基因elt定点突变,分别构建了E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、和E.coli mLT-R192G。经实验检测,3株突变菌在连续50次传代后基因突变位点遗传稳定;细菌生长曲线、菌毛的生长、对IPEC-J2细胞的黏附等生物学特性与初始菌比较无明显差异;耐药性无改变;对p H>2.5的胃液环境和0.3%的胆汁环境有良好的耐受性。为检测LT和mLT,本研究构建了E.coli p ET-32a-S1-BL21、E.coli p ET-32a-S2-BL21重组菌,表达纯化了重组蛋白LTA-S1、LTA-S2,免疫家兔并制备了兔抗LTA-S1和兔抗LTA-S2血清,其中兔抗LTA-S1血清效价较高,用于后续LT和mLT的检测。兔肠袢结扎试验和兔肠组织切片观察结果显示,3种不同mLT均有一定的肠毒性,其中E.coli mLT-S63K产生的mLT肠毒性最弱,且对肠组织造成的损伤最轻。Y1细胞毒性试验结果显示,E.coli mLT-S63K产生的mLT对Y1细胞的毒性最弱,毒力效价为103.48 TCID50/0.1m L,是初始菌E.coli C83903产生的LT毒性的1/10 000(107.61 TCID50/0.1m L)。将5周龄BALB/c小鼠随机分为6组（A、B、C、D、E、F）,每组25只,连续3天分别灌胃0.3 m L无菌PBS,3×1010CFU的E.coli C83903（35）est B（35）eltⅠ、E.coli C83903（35）est B、E.coli mLT-S63K、E.coli mLT-A72R、E.coli mLT-R192G,间隔2 w共免疫3次。检测结果与对照组比较表明,突变菌对小鼠采食量、体重无影响,对回肠组织无损伤,安全性良好;用间接ELISA检测各组小鼠血清、肠黏液中特异性Ig G和s Ig A水平,结果显示,在初次免疫后的第14 d,从实验组小鼠血清和肠黏液检测到针对LTA-S1蛋白的特异性Ig G和s Ig A,抗体水平显着高于对照组（p<0.05）,其中E.coli mLT-R192G组在第35 d检测到的Ig G水平显着高于其他组（p<0.05）,而E.coli mLT-S63K组在第42 d检测到的s Ig A水平显着高于其他组（p<0.05）,在三免后的2周内仍能维持较高水平。针对K88菌毛蛋白和E.coli C83903全菌的特异性Ig G和s Ig A抗体水平检测结果表明,在首免后的第7 d可在部分免疫组的肠黏液中检出特异性s Ig A,其中E.coli mLT-A72R组产生s Ig A的速度最快,抗体水平在第21 d便显着高于其他组并能持续保持较高水平;E.coli mLT-S63K组的K88特异性Ig G自第21 d一直处于较高水平,第42 d时仍显着高于其他组（p<0.05）。针对E.coli C83903全菌所产生的特异性抗体,在第35 d E.coli mLT-S63K组的Ig G水平显着高于其他实验组（p<0.05）,同时该组与E.coli mLT-R192G组肠黏液中的s Ig A水平显着高于其他实验组（p<0.05）,并能在第42d仍维持较高水平。免疫组化试验结果显示,免疫后第35 d,E.coli mLT-S63K组和E.coli mLT-R192G组小鼠Peyer’s淋巴结组织切片可见大量Ig A阳性细胞,数量明显多于其他组。小鼠脾淋巴细胞增殖实验和流式细胞术检测结果表明,IFN-γ和IL-4阳性脾淋巴细胞数显着高于对照组,IFN-γ/IL-4的比值小于1;血清IFN-γ、IL-4和IL-17细胞因子检测结果表明,口服活菌均可有效刺激小鼠产生Th1、Th2以及Th17型细胞免疫反应,血清中IL-4的表达水平更高。结合淋巴细胞亚群的检测结果表明口服突变菌株诱导的细胞免疫以Th2型细胞为主。抗体中和试验结果表明,免疫组血清和肠黏液中的Ig G和s Ig A具有中和LT活性,三组突变株的血清中和抗体效价均为1:89.1,肠黏液的中和抗体效价均为1:44.7,但分别高于E.coli C83903（35）est B组的1:53.7与1:26.9。综上所述,本研究构建的三株mLT突变株具有良好的遗传稳定性,基因编辑操作对其主要生物学特性无显着影响。突变株的生物学特性符合口服疫苗候选菌株基本条件,口服免疫小鼠后能诱导产生局部黏膜免疫、体液免疫以及细胞免疫应答。其中E.coli mLT-S63K株毒性最小、免疫效果最好,可作为ETEC口服疫苗候选菌株进行后续研究。本研究为仔猪大肠杆菌性腹泻的新型疫苗研究提供了实验数据和候选菌株。
胡佳[2]（2020）在《FanC-FaeG共展示的ETEC菌株构建及其生物学特性研究》文中进行了进一步梳理产肠毒素性大肠杆菌ETEC作为细菌性腹泻的主要病原菌,具有传播范围广、致病性强等特点,给畜牧业带来了巨大损失。ETEC的危害性源自于自身菌毛黏附素的定植功能以及肠毒素的毒害作用,本研究以致病菌ETEC本身作为菌株构建的宿主,利用Lpp’Omp A表面展示系统,将另一种类的黏附素展示到ETEC细胞表面,实现双黏附素共展示表达,并对其生物学特性及黏附保护作用进行评估,以期构建一种双重黏附能力的肠毒性大肠杆菌,为相应的ETEC疫苗或相关黏附抗原提供菌株基础。具体研究内容及相关结果如下:本试验构建了pQE-30-GFP报告质粒,通过对不同重组菌相对荧光强度的测定及显色所需时间的对比,筛选得到了含有Fan C黏附素的良好表达宿主菌BE311。为了增加宿主菌的黏附素黏附表达活性,本试验扩增了来自于E.coli K88黏附素基因fae G,利用over-lap PCR方法构建表面展示质粒p QE-30-Lpp’Omp A-Fae G-TC,将构建的质粒转化到宿主菌BE311中,通过阳性克隆的筛选及四半胱氨酸（TC）-双砷系统对特异性标记的Fae G-TC表达产物的鉴定,证实外源的K88黏附素被成功展示在BE311菌体表面;对重组菌进行生长特性测定和诱导表达的结果表明,外源蛋白的表达未给菌株带来生长压力,fae G在经IPTG诱导后,能够稳定表达。在疏水性实验及IPEC-J2细胞黏附实验中,重组菌B311-fae G分别表现出了更好的体外疏水性和对上皮细胞的特异性黏附能力。为了进一步探讨重组菌的在动物肠道中对病原性大肠杆菌的竞争拮抗能力,本试验在实验室原有的基础上,构建了两种特异性荧光标记的ETEC菌株,分别是红色荧光的E.coli K99-m Cherry与绿色荧光的E.coli K88ab-GFP,通过这两种标记的复合病原菌的联合攻毒,发现在攻毒后第5天,能够显着地增加大鼠炎性因子相关基因和蛋白的上调表达。以该攻毒模型为基础,本试验特异性比较了单黏附素Fan C（源自于野生菌株BE311）与双黏附素FanC-FaeG（来源于重组菌株BE311-Fae G）对攻毒大鼠的病原菌拮抗作用,即发酵制备并诱导表达得到相应的大肠杆菌菌体,调整菌悬液浓度为109 CFU/m L,采用辐照的方式处死后,分别添加到大鼠饮水中预饲5天,然后利用109 CFU的复合标记菌株进行灌胃攻毒,分别测定不同处理下的大鼠生长性能及胃肠道分段和粪便中的标记的E coli数量。结果表明,FanC-FaeG组与阴性对照组的大鼠在生长性能方面无显着性差异（P>0.05）;攻毒后的12 h,在十二指肠、空肠及回肠中E coli数量:FanC-FaeG组<Fan C组<阳性对照;攻毒24 h时,粪便中FanC-FaeG组<Fan C组<阳性对照。因此,相较于单黏附素组,重组菌的双黏附特性能够更为显着地减少病原菌标记菌株在小肠内的特异性黏附,有效缓解攻毒后大鼠受到的病原菌侵袭,起到健康保护效果。综上所述,本研究构建了一株FanC-FaeG双黏附素共展示表达ETEC菌株,该菌株能够稳定高效表达外源K88黏附素,并具有强于单黏附素野生菌的黏附能力,在大鼠小肠内能够优先占据特异性结合位点,从而抑制病原菌的黏附,起到肠道保护作用,为疫苗开发或肠道保护制剂的研究提供了多抗原菌株基础。
陈东强[3]（2009）在《猪瘟疫苗经粘膜途径接种动物免疫效果分析》文中指出猪瘟病毒是通过粘膜—消化道和呼吸道途径感染动物体,因此如果通过局部粘膜接种疫苗,则可利用抗原与粘膜受体结合的占位作用,有效阻断野毒经粘膜途径感染,达到事半功倍的免疫预防效果。本研究以现有猪瘟疫苗为基础,通过与粘膜佐剂配合,探讨猪瘟疫苗经粘膜途径免疫接种的可行性。本研究通过重组菌株发酵,获得了大肠杆菌热敏性肠毒素突变体蛋白LTKG、 LTRG.利用亲和层析法纯化重组蛋白,经BCA方法定量,蛋白浓度分别为：750μg/ml和660μg/ml。猪瘟脾淋巴苗分别与LTKG、LTRG蛋白佐剂混合,采用滴鼻、灌胃/口服、肌注三种途径免疫小鼠,间隔10-15天进行二免、三免。每次免疫后,采血,收集鼻洗液和粪便。经间接ELISA检测血清抗体IgG及局部粘膜抗体IgA。结果显示,三免前滴鼻组和灌胃组之间IgG水平相当,无显着差异（P>0.05）,但都低于肌注组；三免后,LTRG滴鼻免疫组和灌胃免疫组小鼠血清抗体IgG高于其它组,且高于疫苗肌肉注射组,LTRG滴鼻免疫组与疫苗滴鼻免疫组差异显着（0.01<P<0.05）。局部粘膜抗体IgA检测结果显示,三免后灌胃途径免疫的小鼠各组IgA均高于其他各组,且疫苗+LTRG灌胃、疫苗+LTKG灌胃小鼠IgA显着高于滴鼻免疫组小鼠（P<0.01）,同时显着高于肌注疫苗组（P<0.01）,即疫苗与佐剂LTRG、LTKG共免疫组获得了最佳局部粘膜免疫效果。猪瘟脾淋巴苗分别与LTKG、LTRG蛋白佐剂混合,通过滴鼻、灌胃/口服、肌注三种途径免疫仔猪,间隔10-15天二免、三免。采血,收集鼻洗液和粪便。经间接ELISA检测血清抗体IgG及局部粘膜抗体IgA。整个免疫过程中,血清IgG一直保持较高的抗体水平。三免后14天,口服疫苗+LTKG的猪血清抗体IgG显着高于疫苗经肌注和滴鼻免疫的猪（0.01<P<0.05）；三免后28天,口服疫苗+LTKG组IgG水平最高。三免后局部粘膜抗体IgA水平,用疫苗+LTRG.疫苗+LTKG经滴鼻、口服免疫组显着高于肌注疫苗组（0.01<P<0.05）,其中滴鼻疫苗+LTKG组IgA水平最高,与疫苗滴鼻免疫组显着差异（0.01<P<0.05）。采用MTT法分析猪外周血T淋巴细胞增殖情况,各试验组均检测到一定程度的淋巴细胞增殖活化,其中疫苗+LTKG滴鼻免疫组T淋巴细胞的增殖反应强于疫苗滴鼻组；疫苗+LTKG口服组强于疫苗口服组,且对淋巴细胞增殖作用滴鼻免疫途径较口服免疫途径好。上述试验结果表明,猪瘟脾淋巴苗分别与LTRG和LTKG粘膜佐剂经粘膜免疫途径共免疫小鼠、猪,均可诱导机体产生较好的体液免疫和细胞免疫反应,以及局部粘膜免疫反应。尤其是粘膜分泌型抗体的产生,为在局部中和野毒感染提供了保护屏障,能更有效发挥机体免疫预防机能。
张秀香[4]（2009）在《表达LTB-MOMP融合蛋白转基因水稻的建立及免疫试验》文中提出为了研制一种廉价、方便的鹦鹉热衣原体口服疫苗,本研究以其主要保护性抗原基因momp基因和大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位ltb基因为研究对象,分别构建了表达MOMP蛋白和LTB-MOMP融合蛋白的原核表达载体,使其在大肠杆菌中都高效表达。通过小鼠的免疫试验,确定了LTB-MOMP融合蛋白的免疫效果要优于MOMP蛋白单独免疫效果。所以本实验通过前期试验结果,利用分子克隆、农杆菌介导和分子生物学常规检测技术等方法,构建了表达LTB-MOMP融合蛋白的转基因水稻植株,试图探索出一种利用水稻作为生物反应器生产鹦鹉热衣原体口服疫苗的免疫途径和作用模式。通过农杆菌介导法,将ltb-momp融合基因导入水稻植株中,通过抗性筛选及整合性鉴定,证明获得了表达LTB-MOMP融合蛋白的转基因水稻植株。用间接ELISA的方法测定了转基因水稻叶片中融合蛋白的平均含量可占植物总可溶性蛋白的0.0055%,而在种子中的平均含量为0.0069%。实验中以BALB/c小鼠为哺乳类实验动物模型,用获得的表达LTB-MOMP融合蛋白的转基因水稻植株种子在小鼠体内进行了口服免疫实验研究,通过对体液、细胞及粘膜免疫等相关指标的检测,结果表明:口服转基因水稻种子能够诱导小鼠机体产生体液、细胞及粘膜免疫反应,但以细胞和粘膜免疫应答为主。同时,还证明了LTB在转基因水稻口服免疫实验中具有良好的粘膜佐剂效应。通过本实验研究,将为下一步应用表达LTB-MOMP融合蛋白的转基因水稻在禽源动物体内口服免疫实验研究奠定基础,也为禽类鹦鹉热衣原体病的预防提供新思路。
罗耀玲[5]（2008）在《用双歧杆菌构建产肠毒素大肠杆菌LTB口服活疫苗及其粘膜免疫佐剂功能研究》文中提出在世界范围内,产肠毒素大肠杆菌（ETEC）感染是引起腹泻最重要的因素之一。它是发展中国家腹泻发病和婴儿死亡的主要原因,也是旅行者腹泻与国家士兵腹泻的最常见病原菌。因此,一个安全有效的抵抗ETEC腹泻的疫苗对公众健康是非常重要的。ETEC是非侵袭性的,是依靠定居因子（CFA）粘附小肠粘膜上的,进而分泌肠毒素LT和ST。CFAs是细菌细胞表面的鞭毛,可以促进对小肠上皮细胞的粘附,主要有CFA/I、CFA/II和CFA/1V家族菌毛抗原。最普遍的CFAs是CFA/I。ST是由estA基因编码的19个氨基酸组成的单体多肽,免疫原性很差。LT是由eltAB编码,结构与霍乱毒素（CT）相似。它由两个亚单位组成即有毒性的A单位（LTA）和五聚体的B单位（LTB）组成。CT和LT有很强的免疫原性和粘膜佐剂活性。LTB也和CTB一样有很强的免疫原性和佐剂活性。本研究中选用LTB作为免疫原和粘膜免疫佐剂。ETEC疫苗要求能够中和大多数ETEC菌株的毒力因子抗原,目前普遍认为一个合理的大肠杆菌疫苗应该包括三个主要的菌毛抗原即CFA/I,CFA/II,和CFA/IV以及具有免疫原性的不耐热肠毒素LT。因此在研究LTB免疫活性时选用CFA/I为参照。目前ETEC疫苗研究热点集中在三个方向:1.免疫方式由传统的肌肉、皮下等转为粘膜免疫;2.免疫途径上寻求粘膜佐剂,常用CT和LT;3.表达载体由传统的有毒转向减毒或无毒载体。根据以上三点,我们采用无毒的双歧杆菌为表达载体,通过粘膜免疫SD大鼠,检LTB的免疫原性,并与重组的双歧杆菌-CFA/I疫苗共免疫以检测其粘膜佐剂活性。双歧杆菌是人类肠道的自然宿主且可以粘附于肠道上皮细胞。因此,本研究的目的是将双歧杆菌发展成一个表达LTB蛋白的口服活疫苗的抗原表达系统。目的:构建携带ETEC LTB的双歧杆菌重组疫苗,然后将此载体疫苗免疫SD大鼠,检测其在大鼠体内诱导的体液和粘膜免疫应答,并与双歧杆菌重组的pBES-CFA/I疫苗共免疫,检测其粘膜免疫佐剂的效应。方法:（1）以pBV220为基础,构建穿梭表达载体pBES-LTB。将其电转化婴儿双歧杆菌,SDS-PAGE验证蛋白的表达,并通过家兔肠袢实验验证表达蛋白的安全性。（2）用双歧杆菌重组载体疫苗免疫SD大鼠:随机分四组分别为PBS、pBES-LTB、pBES-CFA/I和pBES-LTB+PBES-CFA/I组,每组12只,免疫三次（0,10,17天）,并于0,7,10,14,17,22和27天采血和粪便样本,ELISA检测其特异抗体水平。（3）在第27天,每组一半大鼠腹腔感染致死剂量ETEC毒株H10407,连续观察20天,计算其存活力。另一半鼻饲ETEC H10407,观察其肺部感染情况。结果:（1）LTB蛋白在双歧杆菌中成功表达,其表达蛋白经家兔肠袢实验证实是微毒的。（2）ELISA结果表明:pBES-LTB与pBES-CFA/I疫苗联合免疫组的大鼠比其它单独免疫组产生了更强烈的血清IgG和粪便IgA抗体（P<0.05）。LTB免疫组和CFA/I免疫组间差别无统计学意义（P>0.05）。（3）腹腔攻毒保护实验结果证实, pBES-LTB + pBES-CFA/I免疫组的SD大鼠保护性比单独免疫组的好,单独口服天然双歧杆菌和PBS的免疫组无保护性。（4）ETEC鼻饲实验结果表明:pBES-LTB +pBES-CFA/I免疫组及pBES-CFA/I单独免疫的SD大鼠肺部均无病理变化, pBES-LTB免疫组有一定的炎症反应,未免疫组肺部有严重的病理变化。结论:（1）双歧杆菌可以作为ETEC重组口服活疫苗的表达载体系统,该口服疫苗表达系统开辟了ETEC疫苗研究的新方向;（2）双歧杆菌表达的LTB单独接种对ETEC的粘附无免疫保护性,但肠袢试验证明它对LT具有免疫性;（3）pBES-LTB与pBES-CFA/I联合免疫,可明显提高CFA/I的抗体滴度,并使动物获得更好的保护力,即具备口服疫苗免疫佐剂的基本特性。
黄雪萍[6]（2008）在《用双歧杆菌构建产肠毒素大肠杆菌定居因子I重组载体疫苗研究》文中认为大肠杆菌感染是引起腹泻最重要的因素之一。在许多发展中国家,肠毒素大肠杆菌ETEC是导致婴幼儿腹泻致严重脱水的第二大病原菌（仅位于轮状病毒之后）,ETEC也是旅行者腹泻的最常见病原菌。因此,一个安全有效的抵抗ETEC腹泻的疫苗对公众健康是非常重要的。现已知ETEC的两种抗原—定居因子抗原（colonization factor antigens,CFAs）和肠毒素（enterotoxins）参与了腹泻过程。ETEC菌体表面的菌毛（又称定居因子抗原）是重要的致病因子,ETEC感染宿主后,正是靠定居因子粘附干宿主小肠上皮细胞,经定居、繁殖产生肠毒素而致病。迄今为止,了解得比较清楚的菌毛抗原包括定居因子抗原I （CFA/I）、定居因子抗原II （CFA/ II）和定居因子抗原IV （CFA/ IV） [1]。其中CFA/I是一种优势血清型定居因子,其相应抗体在阻止病原体在宿主小肠定居而引起腹泻方面起重要怍用,在许多地方流行腹泻区,它是许多疫苗的一个重要组成成分。肠毒素是ETEC产生的毒性分泌蛋白,有不耐热肠毒素（heat—labile entemtoxin,LT）和耐热肠毒素（heat—stable entemtoxin,sT）两种。CT和LT有很强的免疫原性和佐剂活性。LTB为无毒性的LT的B亚单位,也和CTB一样有很强的免疫原性和佐剂活性。本研究中选用LTB作为粘膜免疫佐剂。ETEC疫苗要求能够中和大多数ETEC菌株的毒力因子抗原,目前普遍认为一个合理的大肠杆菌疫苗应该包括三个主要的菌毛抗原即CFA/I,CFA/II,和CFA/IV以及具有免疫原性的不耐热肠毒素LT。目前ETEC研究热点集中在三个方向:1.免疫方式由传统的肌肉、皮下等转为粘膜免疫;2.寻求粘膜佐剂,常用CT和LT;3.表达载体由传统的有毒转向减毒或无毒载体。双歧杆菌是人类肠道的自然宿主且可以粘附于肠道上皮细胞。因此,本研究的目的是将双歧杆菌发展成一个表达CFA/I的口服活疫苗的抗原表达系统。目的:构建携带ETEC CFA/I的双歧杆菌重组疫苗（即pBEX-CFA/I）,然后将此载体疫苗免疫SD大鼠,检测其在大鼠体内诱导的体液和粘膜免疫应答,并与双歧杆菌重组LTB（即pBES-LTB）共免疫,检测其粘膜免疫佐剂的效应。方法:（1）以pGEX-5x-1为基础,构建穿梭表达载体pBEX-CFA/I。将其电转化婴儿双歧杆菌,SDS-PAGE验证蛋白的表达。通过家兔肠袢实验验证表达蛋白的安全性。（2）用双歧杆菌重组载体疫苗免疫SD大鼠:随机分四组分别为PBS、pBES-LTB、pBEX-CFA/I和pBES-LTB+pBEX-CFA/I组,每组12只,免疫三次（0,10,17天）,并于0,7,10,14,17,22和27天采血和粪便样本,ELISA检测其特异抗体水平。（3）在第27天,每组一半大鼠腹腔感染致死剂量ETEC毒株H10407,连续观察20天,计算其存活力。另一半鼻饲ETECH10407,观察其肺部感染情况。结果:（1）CFA/I蛋白在双歧杆菌中成功表达,其表达蛋白经家兔肠袢实验证实是无毒的。（2）ELISA结果表明:pBEX-CFA/I与pBES- LTB疫苗联合免疫组的大鼠比其它单独免疫组产生了更强烈的血清IgG和粪便IgA抗体（P<0.05）。CFA/I免疫组和LTB免疫组间无显着性差别（P>0.05）。（3）腹腔攻毒保护实验结果证实, pBEX-CFA/I + pBES-LTB免疫组的SD大鼠保护性比单独免疫组的好,单独口服天然双歧杆菌和PBS的未免疫组无保护性。（4）ETEC鼻饲实验结果表明:pBEX-CFA/I+pBES-LTB免疫组及pBEX-CFA/I单独免疫的SD大鼠肺部均无病理变化。结论:（1）双歧杆菌可以作为ETEC重组口服活疫苗的表达载体系统,该口服疫苗表达系统开辟了ETEC疫苗研究的新方向;（2）重组双歧杆菌表达-CFA/I单独接种对ETEC的粘附和感染有免疫保护作用;（3）双歧杆菌-CFA/I和双歧杆菌-LTB联合免疫,可明显提高CFA/I的抗体滴度,并使动物获得更好的保护力。
张国广[7]（2007）在《禽流感病毒M2重组多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究》文中提出禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）能感染几乎所有的野生及饲养禽类，引起禽类尤其是饲养禽类的死亡，AIV的流行给养禽业造成了严重的经济损失。1997年在香港发现H5N1亚型禽流感病毒突破生物屏障直接感染人，使人们认识到AIV对于人类公共卫生的重要性。疫苗接种是预防和控制AIV流行的主要措施之一，但AIV突变频率高、亚型多，给疫苗的研制带来困难。AIV的M2蛋白是病毒囊膜上的蛋白之一，具有亚型间高度的保守性，是理想的交叉保护性疫苗的候选抗原。AIV主要是经过动物呼吸道等粘膜系统传染，具有诱导机体粘膜和系统应答能力的疫苗对于禽流感的防治具有重要的意义。大肠杆菌不耐热肠毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）是目前研究较多的粘膜佐剂之一，尤其是其B亚单位不具有LT的肠毒素毒性，但仍然保持较好的粘膜佐剂活性。本研究基于M2基因及其M2e表位与大分子载体HBcAg（Heptitis B core antigen，HBcAg）构建融合基因，利用融合基因制备多肽和DNA疫苗，并对疫苗免疫效果进行了研究，同时研究了LTB亚基对多肽和DNA疫苗的佐剂效应。主要结果如下：1)利用RT-PCR从一株福建分离的AIV H5N1病毒株中克隆了其M基因，序列比对结果表明与人源分离株遗传距离较远，从M基因上扩增得到完整的M2基因，利用OE-PCR（Overlap extension PCR）得到缺失跨膜区的△M2，将△M2进行原核表达。利用OE-PCR分别将M2e表位融合到大分子载体HBcAg的N端和主要免疫优势区（Maior immunodominant region，MIR），构建融合基因M2eHBc和M2eHBc+，进行了原核表达。上述原核表达蛋白具有抗原性、亚型间交叉识别能力、M2eHBc和M2eHBc+还具有体外自主包装成VLP（Virus-like particles，VLP）颗粒的能力，肌肉注射免疫小鼠后均能诱导小鼠产生M2特异性抗体，其中M2eHBc+蛋白免疫效果显着优于其它免疫组；2)从大肠杆菌195毒株中克隆出LT基因，并对其B亚基进行了原核表达，表达的重组LTB蛋白具有抗原性和体外GM1结合活性。将LTB基因与M2eHBc+融合进行了原核表达，表达出的LBM2eHBc+蛋白能与M2蛋白抗体发生免疫识别，能自主包装成VLP颗粒，具有体外GM1结合活性；3)动物免疫试验表明，与阴性对照比M2eHBc+蛋白通过粘膜途径免疫小鼠能诱导一定的系统和粘膜应答，表达的LTB蛋白与M2eHBc+蛋白混合通过粘膜途径免疫小鼠能显着增强机体的血清IgG应答，诱导较强的粘膜IgA应答，表明所表达的LTB蛋白具有很强的粘膜佐剂活性。表达的LBM2eHBc+融合蛋白通过粘膜途径免疫小鼠引起的机体免疫系统应答水平与M2eHBc+混合LTB免疫组相似，且对粘膜IgA的诱导能力优于混合组；4)将M2eHBc+与pCDNA3载体连接构建pCDNA3-M2eHBc+DNA疫苗，转染293细胞，能表达出抗原蛋白且该蛋白具有抗原性，DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠后能诱导机体产生较强的抗原特异性抗体和T细胞增殖应答；5)LTB质粒与pCDNA3-M2eHBc+DNA疫苗等量混合，或LTB基因与pCDNA3-M2eHBc+融合构建的DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，与单独pCDNA3-M2eHBc+DNA疫苗肌肉注射组比，能显着增强DNA疫苗的细胞免疫应答，对体液IgG应答的佐剂效应不明显；通过滴鼻途径免疫时能显着刺激机体粘膜IgA分泌；6)研究了DNA疫苗和蛋白疫苗的初免／加强策略，结果表明在DNA疫苗两次免疫后用一次相同抗原的蛋白疫苗加强免疫，可以显着增强机体系统IgG应答，且对DNA疫苗诱导的T细胞应答影响不显着；7)将LBM2eHBc+融合基因构建酵母表达载体pPIC9K-LBM2eHBc+，转化GS115表达菌，筛选出能分泌表达LBM2eHBc+蛋白的转基因酵母株，WesternBlotting分析该蛋白具有抗原性。
罗维[8]（2007）在《大肠杆菌F18菌毛FedF蛋白及LTB-FedF融合蛋白的表达及免疫原性研究》文中研究指明1、产肠毒素性E．coliLT全基因的克隆与序列分析根据GenBank中收录的LT基因序列，设计并合成一对引物，以猪产肠毒素大肠杆菌临床分离株ECOH1的DNA为模板，通过PCR技术扩增出约1.3kb的片段。将此PCR产物克隆到pMD18-T载体上，构建了重组质粒pMDTLT，测序结果表明所克隆的LT基因序列全长为1334bp，与GenBank收录的序列的核苷酸同源性在97.6％-98.8％之间。2、E．coli野生株F18菌毛FedF基因的克隆表达及免疫原性研究根据Z26520中fedF序列设计1对引物，从发病仔猪的腹泻粪便分离获得的大肠杆菌中扩增得到fedF基因，经纯化、连接、转化，将其克隆到pMD18-T中，所克隆fedF基因序列与GenBank中收录的其他fedF基因序列的同源性在97.8％～99.2％。另设计1对引物，利用基因工程方法将所克隆的fedF的编码序列亚克隆到表达载体pBV220中，转化大肠杆菌BL21（DE3）LysS获得表达重组菌。SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明重组菌在诱导后可以表达特异性的FedF蛋白，该重组蛋白分子量约为30kDa。该重组蛋白的表达量占菌体总蛋白量的11.17％。将纯化的重组FedF蛋白免疫小鼠，攻毒试验表明免疫小鼠可完全抵抗致死性的E．coli的感染。3、大肠杆菌LTB-FedF融合蛋白的表达及免疫原性研究经PCR、酶切、连接和转化将LTB成熟肽基因按预定的阅读框架插入到表达质粒pET28a（+）中，获得重组质粒pETLTB，用同样的方法将fedF成熟肽基因片段插入到重组质粒pPLTB中LTB基因的3’末端，获得LTB-fedF融合基因的质粒pETLTBFedF。SDS-PAGE与Western-blotting分析表明转化该质粒的重组大肠杆菌在IPTG诱导下可以高效表达融合蛋白LTB-FedF，该重组蛋白分子量约40kDa。该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白量的23.17％。融合蛋白经纯化后免疫小鼠，攻毒保护试验表明免疫小鼠只得到部分保护。结果说明在此融合蛋白中LTB起到了免疫抑制作用，其原因有待进一步的研究。
王晓乾,万春云,姬茜茜[9]（2007）在《大肠杆菌热敏性肠毒素综述》文中认为大肠杆菌肠毒素是引起腹泻的主要致病因子,可以分为热敏性肠毒素和耐热性肠毒素两类[1]。本文就热敏性肠毒素的理化性质、分子结构和生物学功能、免疫原性、免疫佐剂作用以及国内外对其免疫原性与佐剂效应的应用研究进行了综述。
张金波[10]（2007）在《产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达》文中认为ETEC肠毒素分为不耐热性肠毒素（heat-labile,LT）和耐热性肠毒素（heat-stable,ST）两种,LT是由A、B两种亚单位组成的AB5型结构的六聚体蛋白,是目前人们发现的最强有力的黏膜免疫原和黏膜免疫佐剂之一。其中A亚单位具有ADP核糖基化酶活性, A亚单位通过其A2片段插入B亚单位五聚体“戒孔”中央,组成一个完整的LT分子。LT-B可与小肠黏膜上皮细胞GM1神经节苷脂受体结合,导致有毒性的A亚单位内在化和吸收,从而诱发全身和局部抗体反应。融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。本研究利用基因工程技术,首先克隆热稳定性肠毒素STII的抗原决定簇（CEHYRQIAKESCKKGF）与K88ac蛋白融合基因,并利用套叠PCR技术定点突变K88ac-STII内部EcoR I、Sac I酶切位点。将LT的A亚基的LTA1部分用以已克隆的抗原基因K88ac-STII替换,并将烟草病程相关蛋白PR1a基因的信号肽分别与K88ac-STII-LTA2、LTB连接,构建到pCAMBIA2300植物高效表达载体上,即构建了带有信号肽的PR1as-K88ac-STII-LTA2 /Ubquitin-PR1as-LTB双价植物表达载体。构建的重组质粒分别进行PCR检测、酶切分析及核苷酸序列分析,结果表明,插入的融合基因核苷酸序列与预期的一致,且阅读框正确。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,利用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测,证明外源基因已经整合到受体植物基因组中,同时表明融合基因在转录水平上有表达。提取转基因烟草植株总蛋白质, Western-dot免疫检测验证了转基因植株表达的重组抗原有免疫原性。本研究结果表明,K88-STII-LTA2/LTB融合基因能够在烟草中正确表达并证实该基因具有一定的免疫原性,转基因烟草的获得为下一步把LT类全毒素转入苜蓿等饲料作物进行转基因抗腹泻植物口服疫苗的研究奠定了良好的基础。
二、一种粘膜免疫佐剂——大肠杆菌热不稳定肠毒素研究现况（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种粘膜免疫佐剂——大肠杆菌热不稳定肠毒素研究现况（论文提纲范文）
（1）产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建及其主要生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 仔猪大肠杆菌性腹泻简介 |
| 1.2 ETEC主要毒力因子 |
| 1.2.1 热稳定肠毒素 |
| 1.2.2 热不稳定肠毒素 |
| 1.2.3 K88菌毛 |
| 1.2.4 其他黏附素 |
| 1.3 ETEC疫苗研究进展 |
| 1.4 黏膜免疫 |
| 1.5 口服疫苗 |
| 1.6 CRISPR/Cas9 简述 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 实验动物及细胞系 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要试剂和抗体 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 E.coli C83903△estB的构建 |
| 2.2.2 E.coli mLT-S63K/mLT-A72R/mLT-R192G的构建 |
| 2.2.3 突变菌株的部分生物学特性检测 |
| 2.2.4 mLT体内外毒性的测定 |
| 2.2.5 小鼠口服突变菌株的免疫效果评价 |
| 2.3 实验数据的统计与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 E.coli C83903△estB的构建 |
| 3.1.1 pTarget-T△estB质粒的鉴定结果 |
| 3.1.2 estB基因敲除菌株的鉴定结果 |
| 3.2 E.coli mLT-S63K/mLT-A72R/mLT-R192G的构建 |
| 3.2.1 pTarget-T-N425 质粒的构建及转化结果 |
| 3.2.2 pTarget-T-S63K/A72R/R192G质粒的构建及转化结果 |
| 3.2.3 基因编辑质粒的消除结果 |
| 3.3 突变菌株的部分生物学特性 |
| 3.3.1 遗传稳定性检测结果 |
| 3.3.2 菌毛生长能力的测定结果 |
| 3.3.3 生长曲线的测定结果 |
| 3.3.4 胃肠道环境耐受性的测定结果 |
| 3.3.5 耐药性的测定结果 |
| 3.3.6 黏附能力的测定结果 |
| 3.4 mLT体内外毒性的测定 |
| 3.4.1 LTA-S1、LTA-S2 蛋白的表达及多抗的制备结果 |
| 3.4.2 mLT体内外毒性的测定结果 |
| 3.5 小鼠口服突变菌株的免疫效果评价 |
| 3.5.1 突变菌株定植能力测定结果 |
| 3.5.2 突变菌株安全性检验结果 |
| 3.5.3 特异性抗体的测定结果 |
| 3.5.4 Peyer’s集合淋巴结免疫组化结果 |
| 3.5.5 淋巴细胞亚群的检测结果 |
| 3.5.6 淋巴细胞增殖实验结果 |
| 3.5.7 血清中细胞因子水平的测定结果 |
| 3.5.8 抗体中和活性的测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 mLT突变菌株的构建策略 |
| 4.2 mLT突变菌株的毒力分析 |
| 4.3 E.coli m LT-S63K的应用前景 |
| 4.4 本研究的局限性和后续研究的建议 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（2）FanC-FaeG共展示的ETEC菌株构建及其生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 产肠毒素性大肠杆菌的危害 |
| 1.2 ETEC的毒力因子及致病机制 |
| 1.2.1 致病机制 |
| 1.2.2 黏附素 |
| 1.2.3 肠毒素 |
| 1.3 产肠毒素性大肠杆菌的防治 |
| 1.4 大肠杆菌表面展示的研究进展 |
| 1.4.1 基于外膜蛋白的展示系统 |
| 1.4.2 基于细菌表面附属物的展示系统 |
| 1.4.3 基于自转运蛋白的展示系统 |
| 1.5 研究内容及意义 |
| 第二章 ETEC表达宿主的筛选及黏附素双展示菌株的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株和载体 |
| 2.2.2 试剂、工具酶及培养基 |
| 2.2.3 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 ETEC表达宿主的筛选 |
| 2.3.1.1 基于GFP的原核表达载体的构建 |
| 2.3.1.2 GFP转入不同大肠杆菌宿主 |
| 2.3.1.3 最佳表达宿主的菌株背景鉴定 |
| 2.3.2 应用表面展示技术构建双黏附素共表达ETEC菌株 |
| 2.3.2.1 重组质粒p QE-30-Lpp’Omp A-Fae G的构建 |
| 2.3.2.2 双黏附素重组大肠杆菌的建立 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 绿色荧光蛋白GFP的 PCR扩增结果 |
| 2.4.2 p QE-30-GFP的阳性克隆鉴定结果 |
| 2.4.3 重组质粒在ETEC及工程菌中的表达 |
| 2.4.4 不同宿主菌表达GFP的相对荧光值测定 |
| 2.4.5 BE311的菌株种属鉴定结果 |
| 2.4.6 BE311毒力因子的检测 |
| 2.4.7 表面展示体系相关基因的PCR的扩增结果 |
| 2.4.8 重组质粒的双酶切验证结果 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组菌株的黏附素表达及黏附特性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞 |
| 3.2.2 试剂及培养基 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 双砷-四半胱氨酸系统特异性检测 |
| 3.3.2 重组菌株生长特性研究 |
| 3.3.3 重组菌的诱导表达 |
| 3.3.4 重组菌表面疏水性测定 |
| 3.3.5 重组菌对猪小肠上皮细胞IPEC-J2的黏附研究 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 重组菌BE311-Fae G-TC的荧光显微镜观察 |
| 3.4.2 重组菌BE311-Fae G与野生菌BE311 的生长曲线比较 |
| 3.4.3 重组菌BE311-Fae G的黏附素诱导表达 |
| 3.4.4 重组菌BE311-Fae G与野生株的疏水性比较 |
| 3.4.5 重组菌BE311-Fae G对 IPEC-J2 细胞的黏附 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组菌株对ETEC体内拮抗模型的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株、载体及实验动物 |
| 4.2.2 试剂及培养基 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 E.coli K99-m Cherry-CRISPR/Cas的改造 |
| 4.3.2 实验设计 |
| 4.3.3 肠道的取样处理方法 |
| 4.3.4 ETEC标记菌株的检测方法 |
| 4.3.5 数据处理与统计分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 E.coli K99-m Cherry-p QE30 的抗性检测 |
| 4.4.2 E.coli K99-m Cherry-p QE30与E.coli K99-m Cherry-CRISPR/Cas的比较 |
| 4.4.3 E.coli K99-m Cherry-p QE30 的稳定性检测 |
| 4.4.4 荧光体系下E.coli K99-m Cherry-p QE30 活菌浓度检测标准曲线的建立 |
| 4.4.5 大鼠肠道内回收标记菌株的可视化区分 |
| 4.4.6 大鼠肠道内标记菌株的回收统计结果 |
| 4.4.7 ETEC攻毒后大鼠肠道内炎症因子的基因表达水平测定 |
| 4.4.8 ETEC攻毒后大鼠肠道内炎症因子的蛋白浓度测定结果 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 FanC-FaeG双展示重组ETEC菌株在大鼠体内对攻毒菌株侵染的保护性研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株和动物 |
| 5.2.2 试剂及培养基 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 菌株准备 |
| 5.3.2 动物实验方法 |
| 5.3.3 肠道和粪便的取样处理方法 |
| 5.3.4 数据处理与统计分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 攻毒后对大鼠生长性能的影响 |
| 5.4.2 攻毒后大鼠的脾脏、肝脏变化 |
| 5.4.3 攻毒后大鼠粪便中标记菌株的回收统计 |
| 5.4.4 攻毒后大鼠各肠段中标记菌株的回收统计 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）猪瘟疫苗经粘膜途径接种动物免疫效果分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 猪瘟疫苗的研究进展 |
| 1 猪瘟病毒的概述 |
| 2 猪瘟疫苗 |
| 3 猪瘟新型疫苗制剂研发的必要性 |
| 参考文献 |
| 第二章 大肠杆菌热敏性肠毒素作为粘膜佐剂的研究进展 |
| 1 LT的佐剂功能 |
| 2 LT突变体的研究 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第三章 大肠杆菌热敏性肠毒素突变体发酵表达及纯化 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第四章 猪瘟疫苗与LT突变体免疫小鼠试验 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第五章 猪瘟疫苗与LT突变体免疫猪试验 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）表达LTB-MOMP融合蛋白转基因水稻的建立及免疫试验（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 植物基因工程疫苗的研究进展 |
| 1.1 植物疫苗的表达系统 |
| 1.2 转基因植物疫苗的优点 |
| 1.3 可食性植物疫苗的作用机理 |
| 1.4 几种主要转基因植物疫苗的研究现状 |
| 1.5 转基因植物疫苗存在的问题及未来研究的展望 |
| 第2章 衣原体和鹦鹉热衣原体疾病的研究概况 |
| 2.1 衣原体 |
| 2.2 禽衣原体 |
| 第3章 粘膜免疫及其佐剂的研究进展 |
| 3.1 参与粘膜免疫诱导的抗原递呈细胞 |
| 3.2 粘膜免疫效应 |
| 3.3 粘膜免疫佐剂 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 MOMP/LTB-MOMP 融合基因原核表达载体的构建及表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 MOMP/LTB-MOMP 融合基因原核表达的小鼠免疫试验研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 表达LTB-MOMP 融合蛋白转基因水稻的构建及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 表达LTB-MOMP 融合蛋白转基因水稻的小鼠试验免疫 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（5）用双歧杆菌构建产肠毒素大肠杆菌LTB口服活疫苗及其粘膜免疫佐剂功能研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：用双歧杆菌构建产肠毒素大肠杆菌 LTB 口服活疫苗及其粘膜免疫佐剂功能研究 |
| 前言 |
| 第一部分：大肠杆菌热不稳定肠毒素 B 亚单位在婴儿双歧杆菌中的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分：双歧杆菌-LTB 重组载体疫苗免疫力及佐剂活性检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述：不同粘膜免疫途径的免疫效果 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的论文 |
（6）用双歧杆菌构建产肠毒素大肠杆菌定居因子I重组载体疫苗研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：用双歧杆菌构建产肠毒素大肠杆菌定居因子Ⅰ重组载体疫苗研究 |
| 前言 |
| 第一部分 产肠毒素大肠杆菌定居因子Ⅰ在婴儿双歧杆菌中的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 双歧杆菌重组载体疫苗免疫力检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（7）禽流感病毒M2重组多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽流感病毒研究进展 |
| 1.1 禽流感病毒的分类、命名 |
| 1.2 禽流感的发生及危害 |
| 1.3 禽流感病毒的形态结构及其理化特性 |
| 1.4 禽流感病毒分子生物学研究进展 |
| 1.4.1 禽流感病毒的基因组 |
| 1.4.2 禽流感病毒的蛋白结构 |
| 1.5 禽流感病毒的复制 |
| 1.5.1 病毒粒子的吸附、侵入与脱壳 |
| 1.5.2 基因组的转录和复制 |
| 1.5.3 AIV基因表达的调控 |
| 1.5.4 AIV的装配与释放 |
| 1.6 禽流感与人禽流感 |
| 1.7 禽流感的防治 |
| 1.7.1 综合防治 |
| 1.7.2 疫苗接种 |
| 1.7.3 疫区的控制 |
| 1.8 禽流感疫苗研究进展 |
| 1.8.1 灭活全病毒疫苗 |
| 1.8.2 纯化组分疫苗 |
| 1.8.3 减毒活疫苗 |
| 1.8.4 重组亚单位疫苗 |
| 1.8.5 重组活载体疫苗 |
| 1.8.6 合成多肽疫苗 |
| 1.8.7 核酸疫苗 |
| 1.8.8 RNAi疫苗 |
| 2 粘膜免疫研究进展 |
| 2.1 粘膜免疫系统基本组成 |
| 2.2 粘膜免疫系统的诱导与效应细胞 |
| 2.3 分泌型IgA作用 |
| 2.4 粘膜免疫的优点 |
| 2.5 粘膜疫苗佐剂 |
| 第二章 禽流感病毒M2蛋白及其膜外序列的多肽疫苗研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 基于M2蛋白及其M2e表位的疫苗研究进展 |
| 1.2 本研究的目的和内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料、载体、菌株、工具酶 |
| 2.2 主要试剂及溶液的配制 |
| 2.2.1 质粒抽提相关溶液 |
| 2.2.2 SDS-PAGE相关溶液 |
| 2.2.3 Western blotting相关溶液 |
| 2.2.4 ELISA所用试剂 |
| 2.2.5 蛋白纯化相关试剂 |
| 2.2.6 其它相关溶液 |
| 2.3 引物设计和序列分析 |
| 2.4 M基因的克隆 |
| 2.4.1 PCR引物 |
| 2.4.2 病毒RNA提取 |
| 2.4.3 RT-PCR |
| 2.4.4 M基因的TA克隆 |
| 2.4.5 序列测定及分析 |
| 2.4.6 M2基因及缺失跨膜区的M2基因的克隆 |
| 2.5 基于M2基因膜外序列的融合基因构建 |
| 2.5.1 M2e比对及密码子优化 |
| 2.5.2 PCR引物 |
| 2.5.3 M2eHBc和M2eHBc+融合基因片段的获得 |
| 2.6 原核表达载体的构建 |
| 2.6.1 pET32a-△M2原核表达载体的构建 |
| 2.6.2 pMALc2x-M2eHBc和 pMALc2x-M2eHBc+原核表达载体的构建 |
| 2.7 目的基因的诱导表达 |
| 2.7.1 缺失跨膜区的M2蛋白表达 |
| 2.7.2 M2eHBc和M2eHBc+融合蛋白表达 |
| 2.7.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.8 原核表达重组蛋白纯化及浓度测定 |
| 2.9 表达产物的抗原性分析 |
| 2.10 纯化表达蛋白的交叉抗原性检测 |
| 2.11 电镜观察原核表达的融合蛋白 |
| 2.12 免疫小鼠 |
| 2.13 抗体效价检测 |
| 2.13.1 血清收集方法 |
| 2.13.2 HBcAg抗体检测 |
| 2.13.3 M2特异性抗体效价检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 M基因RT-PCR扩增和重组载体pMD18T-M鉴定 |
| 3.2 M基因序列比对及分子进化分析 |
| 3.3 缺失跨膜区的M2基因扩增及pET32a-△M2鉴定 |
| 3.4 M2e与HBcAg融合基因的扩增及原核表达载体鉴定 |
| 3.5 融合蛋白的表达及蛋白表达形式分析 |
| 3.5.1 pET32a-OM2表达分析 |
| 3.5.2 pMALc2x-M2eHBc和pMALc2x-M2eHBc+表达分析 |
| 3.6 原核表达的融合蛋白抗原性分析 |
| 3.7 融合蛋白的交叉反应性检测 |
| 3.8 电镜观察结果 |
| 3.9 抗体效价检测 |
| 3.9.1 抗血清中HBcAg抗体 |
| 3.9.2 抗血清中M2抗体效价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 M基因的克隆与序列分析 |
| 4.2 融合基因的构建 |
| 4.3 外源基因的原核表达 |
| 4.4 病毒样颗粒 |
| 4.5 融合蛋白交叉抗原性及抗体效价 |
| 第三章 LTB的克隆与表达及其与M2eHBc+蛋白的粘膜免疫研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 LT与CT的结构与功能 |
| 1.2 LT和CT的粘膜免疫佐剂研究 |
| 1.3 LT与CT B亚单位的免疫佐剂研究 |
| 1.4 本研究的目的和内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料、载体、菌株、工具酶 |
| 2.2 LT基因的克隆 |
| 2.2.1 PCR模板制备、引物设计及PCR扩增 |
| 2.2.2 LT基因的TA克隆 |
| 2.3 LTB的原核表达载体构建 |
| 2.3.1 LTB PCR引物合成、PCR扩增 |
| 2.3.2 pET32a-LTB原核表达载体构建 |
| 2.4 LTB亚单位与M2eHBc+的融合表达载体构建 |
| 2.5 目的基因的诱导表达 |
| 2.6 表达产物抗原性分析 |
| 2.7 体外GM1-ELISA检测 |
| 2.8 电镜观察原核表达的融合蛋白LBM2eHBc+ |
| 2.9 小鼠免疫接种 |
| 2.10 抗体效价检测 |
| 2.10.1 免疫血清及肠分泌液制备 |
| 2.10.2 血清抗原特异性IgG效价检测 |
| 2.10.3 肠分泌液中抗原特异性IgA检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 LT全长基因的克隆及序列分析 |
| 3.2 pET32a-LTB原核表达载体构建 |
| 3.3 pMALc2x-LBM2eHBc+原核表达载体的构建 |
| 3.4 融合蛋白的表达及蛋白表达形式 |
| 3.4.1 pET32a-LTB的表达 |
| 3.4.2 pMALc2x-LBM2eHBc+的原核表达 |
| 3.5 重组蛋白的抗原性分析 |
| 3.6 重组蛋白的GM1-ELISA |
| 3.7 电镜观察结果 |
| 3.8 抗体效价检测 |
| 3.8.1 血清M2特异性IgG检测结果 |
| 3.8.2 肠冲洗液M2特异性IgA检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 原核表达系统中目的蛋白的可溶性表达 |
| 4.2 LTB对共免疫原的粘膜佐剂活性 |
| 第四章 M2eHBc+融合基因的DNA疫苗免疫研究 |
| 1 前言 |
| 1.1 DNA疫苗 |
| 1.1.1 DNA疫苗的发展及其优点 |
| 1.1.2 DNA疫苗诱发机体产生免疫保护的机制 |
| 1.1.3 加强DNA免疫效应的策略 |
| 1.1.4 DNA疫苗与其它疫苗的二次免疫(初免-加强)策略 |
| 1.2 DNA疫苗与粘膜免疫 |
| 1.3 禽流感病毒DNA疫苗的研究 |
| 1.4 本研究的目的与内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂及溶液的配制 |
| 2.2.1 质粒大量抽提所需试剂配制 |
| 2.2.2 细胞培养及转染相关试剂配制 |
| 2.2.3 T细胞增殖试验相关试剂配制 |
| 2.3 pcDNA3-LTB、 pcDNA3-M2eHBc+及pcDNA3-LBM2eHBc+构建 |
| 2.4 转染及免疫用质粒的制备及浓度纯度测定 |
| 2.4.1 转染及免疫用质粒的制备 |
| 2.4.2 质粒浓度及质粒纯度测定 |
| 2.5 体外转染哺乳动物细胞 |
| 2.6 免疫小鼠 |
| 2.7 IgG和IgA抗体效价检测 |
| 2.8 T细胞增殖试验 |
| 2.8.1 小鼠脾脏淋巴细胞分离 |
| 2.8.2 T细胞增殖试验(MTT法) |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DNA疫苗相关载体的构建 |
| 3.2 体外转染Western blotting分析 |
| 3.3 DNA疫苗抗体检测结果 |
| 3.3.1 血清IgG-M2检测结果 |
| 3.3.2 肠洗液IgA-M2检测结果 |
| 3.4 T细胞增殖的试验结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 毕氏酵母表达的LBM2eHBc+重组基因多肽疫苗及其抗原性分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 毕氏酵母表达所用各种试剂与溶剂的配制 |
| 2.3 LBM2eHBc+融合基因毕氏酵母表达载体的构建 |
| 2.4 LBM2eHBc+融合基因转化毕氏酵母GS115 |
| 2.4.1 GS115感受态的制备 |
| 2.4.2 重组表达载体pPIC9K-LBM2eHBc+线性化 |
| 2.4.3 表达载体pPIC9K-LBM2eHBc+转化GS115感受态细胞 |
| 2.5 LBM2eHBc+融合基因在毕氏酵母GS115中的表达 |
| 2.5.1 转化子的PCR快速鉴定 |
| 2.5.2 阳性转化子的Dot-ELISA鉴定 |
| 2.5.3 酵母整合的PCR分析 |
| 2.5.4 融合基因在酵母中的表达 |
| 2.6 表达蛋白的SDS-PAGE分析及Western-blotting分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 酵母表达载体的构建 |
| 3.2 转化GS115阳性克隆的PCR鉴定及Dot-ELISA鉴定 |
| 3.3 PCR分析外源基因在酵母中的整合 |
| 3.4 外源基因的诱导表达 |
| 3.5 表达蛋白的Western blotting分析 |
| 4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 其它研究工作 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（8）大肠杆菌F18菌毛FedF蛋白及LTB-FedF融合蛋白的表达及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一 大肠杆菌不耐热肠毒素LT研究进展 |
| 二 致病性大肠杆菌F18菌毛的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 产肠毒素性大肠杆菌LT全基因的克隆与序列分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 E.coli野生株F18菌毛蛋白粘附亚单位基因的克隆、表达及免疫原性研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 小结和讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 大肠杆菌LTB-F18融合蛋白的表达及免疫原性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 符号说明 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 抗腹泻植物疫苗的研究进展 |
| 实验研究 |
| 实验一 产肠毒素大肠杆菌 K88-STII-LTA2//LTB 融合基因双价植物表达载体的构建及根癌农杆菌的转化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 根癌农杆菌介导的烟草的转化及转基因烟草的分子生物学鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 主要结论与创新点 |
| 主要结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
| 附录 1 主要技术路线 |
| 附录 2 载体构建流程 |
| 附录3 主要培养基、溶液配制 |
| 导师评阅表 |
四、一种粘膜免疫佐剂——大肠杆菌热不稳定肠毒素研究现况（论文参考文献）
- [1]产肠毒素性大肠杆菌mLT突变株的构建及其主要生物学特性研究[D]. 冯启峥. 东北农业大学, 2020(04)
- [2]FanC-FaeG共展示的ETEC菌株构建及其生物学特性研究[D]. 胡佳. 中南民族大学, 2020(08)
- [3]猪瘟疫苗经粘膜途径接种动物免疫效果分析[D]. 陈东强. 南京农业大学, 2009(06)
- [4]表达LTB-MOMP融合蛋白转基因水稻的建立及免疫试验[D]. 张秀香. 吉林大学, 2009(09)
- [5]用双歧杆菌构建产肠毒素大肠杆菌LTB口服活疫苗及其粘膜免疫佐剂功能研究[D]. 罗耀玲. 重庆医科大学, 2008(01)
- [6]用双歧杆菌构建产肠毒素大肠杆菌定居因子I重组载体疫苗研究[D]. 黄雪萍. 重庆医科大学, 2008(01)
- [7]禽流感病毒M2重组多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究[D]. 张国广. 厦门大学, 2007(11)
- [8]大肠杆菌F18菌毛FedF蛋白及LTB-FedF融合蛋白的表达及免疫原性研究[D]. 罗维. 湖南农业大学, 2007(02)
- [9]大肠杆菌热敏性肠毒素综述[J]. 王晓乾,万春云,姬茜茜. 养殖与饲料, 2007(06)
- [10]产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达[D]. 张金波. 石河子大学, 2007(06)