一、Structure, expression, and developmental function of early divergent forms of metalloproteinases in Hydra（论文文献综述）
陈秀萍[1]（2021）在《GnRH1对鸡卵泡中MMP11/13及血管发育相关基因表达的影响及MMP11的转录调控》文中认为鸡的卵泡发育是一个非常复杂的生理过程,卵巢卵泡的发育受到多个基因调控,且卵巢卵泡的生长和成熟伴随着血管的新生和发育。下丘脑通过分泌GnRH调节性腺的发育和性激素的分泌。在鸡卵泡的生长发育过程中,伴随着基质金属蛋白酶（MMPs）和其组织抑制因子（TIMPs）相互作用对细胞间进行调节。血管内皮生长因子（VEGF）在维持卵巢卵泡的发育中起着重要的作用,它能够促进新血管的生成和提高血管的通透性。课题组前期研究发现,在鸡的卵泡细胞中GnRH1影响MMP11/13以及VEGFR2（KDR）的表达,本研究对MMP11/13以及血管发育相关基因在鸡卵巢卵泡发育过程中的表达特征以及GnRH1与这些基因之间的调控作用进行了分析。一、GnRH1、MMP11/13和VEGFA在鸡卵巢卵泡组织中的表达分析免疫组化检测结果显示,GnRH1、MMP11/13和VEGFA在卵巢基质、3-5mm卵泡（SW）、6-8mm卵泡（SY）和F6卵泡膜细胞和颗粒细胞中均检测到免疫阳性信号。实时荧光定量PCR（qPCR）结果显示GnRH1、MMP11/13基因及血管发育相关基因在海兰褐和济宁百日鸡卵巢卵泡中的表达模式存在差异。GnRH1 mRNA在海兰褐F1卵泡中的表达显着高于济宁百日鸡（P<0.05）,在卵巢基质中的表达显着低于济宁百日鸡（P<0.01）。MMP11 m RNA在济宁百日鸡卵巢基质中的表达显着高于海兰褐（P<0.001）。MMP13 mRNA在济宁百日鸡卵巢基质、F5和F1卵泡中的表达显着高于海兰褐（P<0.05）。VEGFA m RNA在海兰褐SW卵泡中的表达显着低于济宁百日鸡（P<0.01）。VEGFC mRNA在海兰褐F3和F1卵泡中的表达显着高于济宁百日鸡（P<0.001）。VEGFD mRNA在海兰褐F5卵泡中的表达显着低于济宁百日鸡（P<0.05）,在F1卵泡中的表达显着高于济宁百日鸡（P<0.05）。FLT1 mRNA在海兰褐F1卵泡中的表达显着低于济宁百日鸡（P<0.01）。KDR和FLT4 mRNA在海兰褐SY卵泡中的表达显着低于济宁百日鸡（P<0.05）。二、GnRH1、MMP11/13及血管发育相关基因在鸡卵泡细胞中的表达分析qPCR结果显示:GnRH1,VEGFC/D和FLT1 mRNA在等级卵泡的颗粒细胞中高表达（P<0.05）。FOXP1和VEGFA mRNA在等级卵泡的膜细胞中高表达（P<0.05）。MMP11/13 mRNA在等级卵泡的膜细胞中低表达（P<0.05）。FLT4 mRNA在等级前卵泡的颗粒细胞中高表达（P<0.05）。综合以上结果,说明GnRH1、MMP11/13及血管发育相关基因在不同卵泡细胞中的表达模式与卵泡发育的特定阶段相关。三、鸡卵泡细胞中GnRH1对MMP11/13和血管发育相关基因表达的影响将构建的GnRH1基因的过表达载体,转染到鸡等级前后卵泡的颗粒和膜细胞后,qPCR方法检测GnRH1、MMP11/13基因及血管发育相关基因的表达量。结果显示,在等级卵泡的颗粒细胞中,过表达GnRH1后,FOXP1,MMP11/13和VEGFA基因的mRNA表达量显着上调（P<0.05）,VEGFD,KDR,FLT4基因的mRNA表达量显着下调（P<0.05）,VEGFC,FLT1,ANGPT2/L2基因的m RNA表达量均无显着变化;在等级卵泡的膜细胞中,FOXP1基因的mRNA表达量显着上调（P<0.01）,MMP11/13,VEGFA/C/D,FLT1/4,KDR,ANGPT2/L2基因的mRNA表达量均无显着变化;在等级前卵泡的颗粒细胞中,MMP11和VEGFA基因的mRNA表达量显着上调（P<0.05）,ANGPTL2基因的mRNA表达量显着下调（P<0.01）,FOXP1,MMP13,VEGFC/D,FLT1/4,KDR,ANGPT2基因的mRNA表达量均无显着变化;在等级前膜细胞中,FOXP1,MMP11/13,VEGFA/C/D,FLT1/4,KDR,ANGPT2/L2基因的mRNA表达量均无显着变化。ELISA方法检测转染GnRH1过表达载体后VEGFA蛋白的表达变化,在等级卵泡的颗粒细胞中,VEGFA蛋白表达量显着上调（P<0.01）,在等级前卵泡的颗粒细胞中,VEGFA蛋白表达量无显着变化。综合以上结果,说明GnRH1主要在卵泡颗粒细胞中调控MMP11/13及血管发育相关基因表达。四、MMP11基因的转录调控分析生物信息学分析发现MMP11基因启动子区-1818bp至-1066bp段存在两个转录因子FOXP1结合位点,构建包含FOXP1两个结合位点的野生型载体MMP11-WT和两个位点的突变载体MMP11-MT1、MMP11-MT2,将其与FOXP1过表达载体分别在DF-1细胞系中进行共同转染,结果发现MMP11启动子区-1598bp至-1602bp的FOXP1作用位点影响MMP11基因的启动活性,MMP11启动子区-1070bp至-1074bp的FOXP1作用位点不影响MMP11基因的启动活性。进一步分析GnRH1和转录因子FOXP1对MMP11基因启动活性的影响,将构建好的GnRH1和FOXP1过表达载体分别和共同与MMP11-WT启动子区载体转染到鸡卵泡等级卵泡的颗粒细胞中,结果显示,GnRH1可以上调MMP11基因启动子区荧光素酶活性,FOXP1可以下调MMP11基因启动子区荧光素酶活性,GnRH1和FOXP1过表达载体共同转染组MMP11基因启动子区荧光素酶活性显着低于pcDNA3.1和PUSE共同转染组,GnRH1和FOXP1过表达载体共同转染组MMP11启动子区荧光素酶活性显着高于pcDNA3.1和FOXP1过表达共同转染组。综上结果表明鸡卵泡颗粒细胞中FOXP1能下调MMP11的表达。综上所述,我们目前的研究结果表明GnRH1、MMP11/13以及血管发育相关基因在高低产鸡中表达模式不同,且表达模式与卵泡细胞特定的发育阶段有关,GnRH1主要在等级卵泡的颗粒细胞中调控MMP11/13以及血管发育相关基因的表达,在鸡的卵巢和卵泡发育过程中起到重要作用。
郭庆祥[2]（2021）在《粘体动物系统发育地位与内寄生适应机制研究》文中进行了进一步梳理粘体动物（Myxozoa）是形态简单、个体微小的专性内寄生虫,宿主范围广泛,能寄生鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类。当前,关于粘体动物的研究主要集中于分类学、生活史及起源与适应性进化,其中,起源与适应性进化是研究的重点和热点。近三十余年来,粘体动物的阶元归属经历了从原生动物到后生动物,再到两侧对称生物以及刺胞动物的过程。但限于技术手段,目前无法进一步确定粘体动物在刺胞动物内部的具体归属和进化地位。同时,粘体动物目前已报道超过2,600余种,分布在河流、湖泊、深海、陆地等多种生境中,是生态适应成功的典范。但是,目前粘体动物适应内寄生过程中的驱动因素与分子机制尚不清楚。作为生命之树中较为古老、结构较为简化的后生动物寄生虫,探讨粘体动物的起源与适应性进化问题,对开展后生动物重要生命特征,进化模式、规律与机制研究有着重要意义。随着组学技术的快速发展以及各种粘体动物和刺胞动物组学数据的释放,粘体动物的起源与适应性进化研究拥有了更好的技术支持与数据基础。本研究以粘体动物最大的一科——碘泡科（Myxobolidae）中的部分代表物种为研究对象,结合已发表粘体动物、刺胞动物资料,运用系统发育基因组学、比较蛋白质组学和比较基因组学技术,对粘体动物在后生动物、刺胞动物中的系统发育地位、分化时间、特异细胞器刺丝囊对物种适应进化贡献、基因组进化、适应性进化分子机制等方面进行研究。主要结果如下:一、粘体动物系统发育地位通过对粘体动物、自由生刺胞动物和其他后生动物的主要类群进行广泛采样,本研究建立了较为全面的后生动物和刺胞动物系统发育矩阵。其中,后生动物矩阵包含103个物种,232个直系同源基因（57,930个氨基酸位点）,数据丢失率为31.1%;刺胞动物矩阵包含76种后生动物和2种鞭毛虫外群,146个直系同源基因（51,598个氨基酸位点）,数据丢失率为24.8%。基于上述两个矩阵,使用RAx ML,IQ-TREE以及Phylo Bayes软件,分别在后生动物和刺胞动物尺度下对粘体动物的系统发生地位进行了探讨。并使用近似无偏检验法对17种候选的后生动物和刺胞动物的系统发育关系开展了测试。最后,对上述两个矩阵运用了快速进化位点梯度剔除法来检测快速位点是否给系统发育关系造成了误导。结果表明粘体动物稳定地与螅型多足虫聚为一支,而后再与水母亚门呈姐妹群。AU检验显着地拒绝了大多数（粘体动物+螅型多足虫）之外的聚类方式。虽然粘体动物+栉水母的拓扑结构未能被显着拒绝,但其P值仅略大于0.05（0.0561）,进化树中的自展值也极低（0.0000）,因此作者认为该结构并非最优。快速进化位点剔除分析表明,在删除50%的快速进化位点之前,关键节点都保持了极高的自展值。在删除超过50%的位点后,关键节点的自展值才开始出现下降。（（粘体动物+螅型多足虫）+水母亚门）的拓扑结构得到了确定且稳定的支持。该研究结果克服了碱基替换饱和、长枝吸引等以往分子系统分析中的不足的问题,所构建的进化树更加稳定和准确。二、粘体动物发生年代分析选取刺胞动物冠部的最大分歧时间（741百万年前）,水母亚门的最小分歧时间（570百万年前）,六放珊瑚亚纲的最小分歧时间（540百万年前）,水螅纲的出现时间（500百万年前）作为化石校正点,使用惩罚似然法（Penalized likelihood,PL）对粘体动物的分化时间进行估算。结果显示,刺胞动物的最后共同祖先起源于拉伸纪（736百万年前）,水母亚门起源于埃迪卡拉纪（626.6百万年前）,粘体动物共同祖先发生于晚寒武纪（492.6百万年前）。目前,最早的寄生虫化石发现于寒武纪,因此本结果说明粘体动物是比较古老的后生动物寄生虫之一。三、粘孢子虫刺丝囊与壳瓣分离提纯方法的建立粘体动物的刺丝囊对其生活史的完成至关重要,是研究表型对适应性进化贡献的理想对象。为了便于后续实验的开展,本研究中开发了一种快速有效的粘体动物孢子的解剖方法,该方法可用于分离碘泡科代表物种——洪湖碘泡虫（Myxobolus honghuensis）、吴李碘泡虫（Myxobolus wulii）、吉陶单极虫（Thelohanellus kitauei）的刺丝囊和壳瓣。该方法主要通过蔗糖密度梯度对粘体动物孢子进行纯化,通过超声破碎进行孢子解离以及Percoll密度梯度离心分离刺丝囊/壳瓣。采用50%-70%-90%Percoll分离液对孢子破碎液进行密度梯度离心,在50%与70%Percoll溶液层之间以及70%Percoll分离液中部可获得纯度接近100%的完整刺丝囊。采用100%的Percoll分离液对孢子破碎液进行离心,在Percoll分离液中部可获得纯度接近100%的完整壳瓣。为进一步了解粘体动物刺丝囊的生物学,评估了温度、盐度、多种化合物以及重金属离子对洪湖碘泡虫完整孢子和离体刺丝囊释放情况的影响。结果发现,热、尿素和氨处理能够成功地触发大多数孢子和离体刺丝囊的释放,而Na Cl、乙酸、乙醇、碳酸氢钠和Ca Cl2则不能。重金属处理可显着降低刺丝囊的释放率。本研究为下游实验奠定了基础,还为其他寄生类群孢子的解离研究提供了新视角。四、粘体动物综合蛋白数据库的构建开发了“定制综合蛋白质组参考数据库（customized comprehensive proteomic reference database,CCPRD）”流程,用以提供全面、无污染的蛋白质组学参考数据库。使用洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫、吉陶单极虫刺丝囊的蛋白质组学数据评估了CCPRD的有效性。具体来说,本研究将CCPRD的质谱鉴定结果与四个对照数据库的结果进行了比较:（1）转录组的六框翻译（trans＿6＿frame）;（2）转录组+基因组的六框翻译（genome+transcriptome＿6＿frame）;（3）将人工的宿主和细菌序列添加到CCPRD（CCPRD＿contam）中而建立的污染物数据库;（4）将通过去污染过程中剔除的序列（包括基因组和转录组数据）回添到CCPRD（CCPRD＿remove）。结果表明,CCPRD＿contam比CCPRD鉴定出了更多的肽段和蛋白质,这表明组学数据中确实存在污染,证明了污染剔除的必要性。对于CCPRD＿remove,回添污染去除过程中移除的序列并没有增加鉴定肽段和蛋白质的数量,这表明本方法没有过度剔除。CCPRD在肽段和蛋白质识别数量、数据库大小和完整性方面明显优于其他方法。相较传统数据库,CCPRD能多鉴定出19.1%-43.8%的蛋白质,并最多可节省84.6%的数据库容量。此外,本研究分析了各数据库结果的疏水性指数与保留时间的拟合程度,发现CCPRD可以提高鉴定结果的可靠性。去冗余分析结果表明,即使去除了冗余,CCPRD特异性肽段的数量仍超过其他数据库。这进一步证明CCPRD确实提高了数据库整体的性能,而并非仅仅增加了假阳性或者重复序列的数量。本研究为下游比较蛋白质组学分析提供了技术保障,并为其他涉及非模式生物的蛋白质组项目提供了借鉴和参考。五、刺丝囊对物种适应进化贡献的定量评估通过分析目前已发表的刺丝囊蛋白质组和111个刺丝囊转录组/基因组（包括7个新测序的粘体动物转录组和/或基因组数据集）,研究了刺丝囊在刺胞动物适应性成功中的作用。结果发现,刺丝囊组成存在高度异质性,且蛋白质组相似度与物种亲缘关系之间的不一致,支持了刺丝囊的可塑性适应策略,暗示其在刺胞动物适应性进化中可能起着重要作用。另外,通过对刺丝囊的五种核心基因进行同源搜索,证明了刺丝囊的自发性起源,避免了下游分析时外部共生体的干扰。进一步研究了刺胞动物主要类群扩张前后核心集/非伴随集的进化平衡,发现了一种“去中心化修饰”的模式:即核心基因只经历了很少的进化事件,大量活跃的进化事件发生在非核心基因集中,可能是因为刺丝囊祖先原型的出现后,刺胞动物迅速分化,导致始祖刺丝囊未充分进化便扩张为各种形式,该发现同样支持刺丝囊在刺胞动物适应性进化中的关键作用。最后,刺丝囊蛋白（NEMs）适应超量分析以及选择富集分析发现,在NEMs中,最强的适应超量(BUSTED P值<10-5)可达60%(置换检验P值<2.2e-16,迭代次数107),并且NEMs显着富集了背景蛋白的选择压力（在0.05、0.01和0.001置信水平下,P值=0.004658、0.01117、0.007638）。综上,本研究定量地证明了刺丝囊是包括粘体动物在内的刺胞动物成功适应性进化的基石,并为今后评估特定表型创新对物种适应性进化的贡献提供了参考。六、洪湖碘泡虫基因组的马赛克进化为进一步了解粘体动物适应内寄生生活的分子机制,本研究分析了感染异育银鲫咽部的洪湖碘泡虫（M.honghuensis）的基因组。通过基因组survey及17-mer分析,预测洪湖碘泡虫基因组大小为206 Mb。三代测序的基因组最终大小为161 Mb,contig N50为1.3 Mb,预测到15,433个基因模型。进一步分析显示,由于基因保留,内含子增大,转座子插入等因素,洪湖碘泡虫拥有目前最大的粘体动物基因组,并且相较其他粘体动物呈现出了较低程度的基因组简化和紧密。作为对内寄生生活方式的适应,洪湖碘泡虫基因组中与神经系统相关的基因大幅丢失,并且拥有最简单的动物免疫基因组件。此外,为更好地适应内寄生生活,洪湖碘泡虫抗逆,侵袭,能量代谢和细胞过程相关的基因发生了显着的扩张与正选择。作者还发现洪湖碘泡虫具有相对保守的中胚层和肌原性组件,以及相对复杂的Wnt和Hedgehog信号通路。本研究揭示了洪湖碘泡虫基因组的马赛克进化模式,即不同的基因组区域表现出了不同程度发保守、分化、减弱和增强。洪湖碘泡虫的基因组非但没有表现出遗传退化,反而表现出相当数量的基因创新和扩张(主要涉及到多拷贝基因家族以及相应的调控基因。这些结果表明,粘体动物不像以前认为的那样遗传简化。至少对于粘体动物来说,转变为寄生虫的进化过程是由基因组简化和复杂化共同驱动的,并且这两种进化机制的相对贡献程度因物种而异。该研究改变或扩展了我们对粘体动物基因组复杂性和进化的传统认知,对于深入理解寄生虫进化这一进化生物学中的基本问题具有重要意义。综上,本研究基于系统发育基因组学构建了刺胞动物物种树,并分别分析和估算了粘体动物的系统发育地位与分化时间,为进一步了解粘体动物的起源提供了理论依据。在此基础上,从表型（刺丝囊）和分子（洪湖碘泡虫基因组）两个角度阐明了粘体动物适应性进化的驱动因素与进化机制,发现刺丝囊可能是刺胞动物（包括粘体动物）成功适应性进化的关键表型;并通过洪湖碘泡虫与现有粘体动物、刺胞动物的比较基因组学研究,发现粘体动物基因组进化反映了丢失冗余基因造成的基因组简化和强化寄生能力导致的基因组复杂化之间的动态权衡,从而初步解释了粘体动物内寄生适应成功的遗传机制。
李伊宁[3]（2021）在《KLF2通过TGF-β信号抑制肝癌细胞运动》文中认为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最主要的原发性肝癌类型,也是世界范围内癌症相关死亡的第三大主要原因,严重威胁人类健康。转化生长因子β（Transforming growth factor beta,TGF-β）是一条控制众多生理反应的信号通路,在肝癌致病过程中扮演复杂的角色;反馈调节在决定TGF-β信号的强度和持续时间,及其病理生理作用（包括肝脏恶性肿瘤）中起着关键作用。KLF2是Krüppel-like factor（KLF）家族转录因子的一员,与阻碍HCC发展相关。然而,其潜在的分子机制尚不完全清楚。本论文研究发现:TGF-β能在肝癌细胞系中刺激KLF2基因表达;过量表达KLF2能够在肝癌细胞中抑制TGF-β/Smad信号转导,从而形成一个新的负反馈调控环。进一步机制研究表明,KLF2通过抑制Smad蛋白的转录调控活性而减弱TGF-β诱导的靶基因表达,包括上皮细胞-间充质细胞转化（Epithelialmesenchymal transition,EMT）相关基因等,从而减弱TGF-β诱导的肝癌细胞运动。因此,本论文研究表明KLF2蛋白在肝癌中通过调控TGF-β信号而发挥肿瘤抑制作用。
陈新彤[4]（2021）在《海月水母水螅体60Co-γ射线照射模型构建及相关基因的筛选》文中研究指明一、研究背景随着核反应技术、医疗性放射技术的广泛应用以及核工业的快速发展,放射性接触导致的各种健康问题越来越受到关注。在受核污染的海洋中,海洋生物可以通过受污染的食物和水摄取放射性废物,从而使它们直接暴露在体外和体内的核辐射中,通过直接的电离作用和化学作用,以及产生的自由基?OH和?H的间接作用,攻击并破坏核酸、蛋白质以及酶等生物大分子,造成对海洋生物本身及其共生微生物的严重损害,甚至威胁生命。水母（Jellyfish）是多细胞海洋生物中最原始的类群之一,通过两代交替的变态发育完成生命周期,其中浮游的水母体在海洋中自由游动,底栖的水螅体附着在海床上生长。与水母体相比,水螅体可以以无性克隆—出芽生殖的形式维持自身数量的同时,诱导变态发育产生水母体;成熟的水母体可以排放精子,与卵子结合形成受精卵以有性繁殖的形式实现种群数量的进一步增加,因此,水螅体在水母种群数量的维持和扩张上发挥了更为重要的作用。水母这种强大的生殖可塑性赋予其对时空环境变化具有更为快速反应和适应的能力,从而使得水母能在数百万其他物种灭绝、长达5～6亿年的生物进化过程中经久不息,并成长为分布最为广泛的海洋生物之一。钵水母纲的海月水母（Aurita sp.）是世界各大海域最为常见、分布最广泛的代表性水母种类。不仅如此,海月水母还是最早实现人工饲养和繁殖、最早解析基因组以及研究最多也是最为深入的水母物种,从水螅体的出芽生殖到水母体的变态发育等都受到了科学家们的广泛关注。可以说海月水母是一种海洋低等多细胞无脊椎动物的代表,尤其是其水螅体正逐渐成长为研究海洋生物海洋环境适应性的理想模式生物。当面临核污染如沿海核泄漏事故时,由于放射性废物沉积,核电站附近海域底栖的海月水母水螅体将比浮游的水母体受到更多的辐射污染,从而可能导致其变态发育过程的异常而影响水母体种群的数量与质量。由于水母体可以自由游动,这也可能造成以水母为载体进一步的次级海洋核辐射污染。就核辐射相关的医学研究而言,以海月水母水螅体为海洋低等模式动物,分析核辐射导致水母水螅体的损伤效应并分析其与哺乳动物的差异,这将会从进化的角度对核辐射损伤的新机理阐述、新靶点发现以及新干预策略研究提供重要参考。因此,本论文以海月水母亚种Aurelia coerulea水螅体为对象,在自主构建的A.coerulea水螅体实验室饲养和观察体系的基础上,采用近年来兴起的大数据组学技术,同步研究了60Co-γ射线对海月水母水螅体及其共附生微生物的损伤效应,这将对海洋核辐射污染对海洋低等多细胞生物的影响,以及以海洋低等多细胞生物为参照,挖掘新的核辐射损伤新机理、新靶点以及新干预策略具有重要意义。二、研究内容1.A.coerulea及其水螅体的鉴定以及水螅体实验室微观饲养体系的构建。2.A.coerulea水螅体60Co-γ射线照射损伤模型构建与评价,基于转录组学分析筛选A.coerulea水螅体辐射损伤相关的关键分子与通路,A.coerulea水螅体辐射损伤相关分子对哺乳动物293T细胞辐射损伤的影响。3.60Co-γ射线对A.coerulea水螅体共生菌的影响。三、研究方法（一）A.coerulea及其水螅体的鉴定以及水螅体实验室微观饲养体系的构建1.A.coerulea及其水螅体的物种鉴定及分析从A.coerulea及其水螅体转录组测序数据中筛选所有注释结果为细胞色素C氧化酶亚基I的基因序列,并通过Blastn和Blastx与NCBI核酸数据库进行比对,找到相似性最大的物种,即为鉴定结果。使用Bio Edit对筛选出来的两条序列与相似度最高的核酸和蛋白序列进行比对分析。使用MEGA7构建进化树。2.A.coerulea水螅体微观饲养体系的建立本部分研究水螅体均使用培养皿和六孔板在盐度为3%的人工海水和20℃生化培养箱中进行恒温培养。主要包括人工海水的准备、饵料卤虫的准备、A.coerulea水螅体的转移、A.coerulea水螅体的附着、A.coerulea水螅体的喂食、更换新鲜人工海水、以及传代养殖七个步骤。（二）60Co-γ射线对A.coerulea水螅体的损伤效应及相关基因筛选1.A.coerulea水螅体60Co-γ射线照射损伤模型构建与评价通过0～1000 Gy 60Co-γ射线照射构建A.coerulea水螅体辐射损伤剂量-效应模型。进一步通过A.coerulea水螅体辐射损伤剂量效应关系统计、水螅体的触手伸展状态等生物效应观察、以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、总抗氧化能力（T-AOC）等氧化还原酶系酶活力的测定、病理学检查等对模型进行完整的评价。2.基于转录组学分析并筛选辐射损伤相关的关键分子与通路收集900 Gy 60Co-γ射线照射后和不照射的水螅体样品,提取RNA后委托杭州联川生物公司使用Illumina Hi Seq4000测序仪进行转录组测序及注释分析。基于转录组测序的结果,对照射后水螅体的差异表达基因进行NR和Swiss-prot注释、GO和KEGG通路富集分析并筛选潜在的关键差异分子。通过SWISS-MODEL、RCSB PDB和NCBI BLAST等分析网站及软件,将损伤相关基因与其人类同源序列进行比对,找出其中的差异片段,核心片段等,模拟构建这些分子的3D结构,对其进行结构分析,并初步了解其可能具有的生物学功能。3.A.coerulea水螅体辐射损伤相关分子对哺乳动物293T细胞辐射损伤的影响通过RT-q PCR验证转录组测序的准确性,PCR扩增关键分子全长后通过分子生物学方法构建包含辐射损伤相关关键分子的过表达质粒,菌液PCR以及Sanger测序检查扩增基因的正确性。经大肠杆菌扩增后,抽提目的质粒,使用脂质体转染法导入哺乳动物293T细胞中,使用绿色荧光标记、PCR、Western Blot进行表达验证。对在哺乳动物细胞中成功表达蛋白的基因进行60Co-γ辐射照射实验,使用CCK8法检测细胞活力、流式检测细胞凋亡等初步探索目标分子在哺乳动物细胞辐射损伤的影响。（三）60Co-γ射线对A.coerulea水螅体共生菌的影响收集A.coerulea四部分伞盖、触手、口腕和胃囊以及水螅体照射前和900 Gy 60Co-γ射线照射后不同时间点（照射后（2 h以内）、照射后1、3、5天）的样品（共5个组）,提取DNA,进行16S r RNA基因测序。序列数据分析主要使用QIIME和R包（v3.2.0）。基于高质量序列的PICRUSt 2（KEGG PATHWAY数据库）预测微生物功能。通过以上方法比较分析A.coerulea及其水螅体的共生菌群,以及60Co-γ辐射对水螅体菌群的影响。四、研究结果（一）海月水母及其水螅体的鉴定以及水螅体实验室微观饲养体系的构建1.海月水母、水螅体的物种鉴定及分析我们在实验室中观察了海月水母的变态发育过程,主要包括水螅体,横裂体,碟状体,和水母体四个发育阶段,这与传统的海月水母属的变态发育过程一致,并且实验室诱导的成体水母的外形特征与海月水母属一致,可初步判断我们研究使用的动物属于海月水母属。在分子层面,我们从海月水母及其水螅体的转录组中各自成功筛选到注释为水母的COI保守基因TRINITY＿DN16912＿c0＿g3和TRINITY＿DN11321＿c3＿g4。将这两条序列与在线工具Blastn和Blastx中NR数据库进行比对,结果显示与这两条序列最接近的COI基因均来自于物种A.coerulea,相似度分别为98.90%,98.95%和99.03%,99.21%。因此,我们通过变态发育、形态学和基因分子水平的分析最终明确了实验室的海月水母及其水螅体的品系为A.coerulea,为海月水母属（Aurelia sp.）的一个亚种。2.A.coerulea水螅体微观饲养体系的建立我们成功在实验室构建了A.coerulea水螅体的微观饲养体系,具体包括配制盐度为2.8～3.2%的人工海水;A.coerulea水螅体饵料准备（丰年虾卵的孵化）;将A.coerulea水螅体从波纹板转移至六孔板（每孔5～10只）或培养皿（每皿20～30只）加盖记录种植日期后放入20℃生化培养箱;一周内不喂食不换水使A.coerulea水螅体附着在板/皿底;附着后A.coerulea水螅体每2天正常喂食一次;喂食2 h后更换新鲜人工海水;以及水螅体长满后需进行传代培养七个步骤。目前该方法申请一项国内发明专利,正在实审阶段。（二）60Co-γ射线对A.coerulea水螅体的损伤效应及相关基因筛选1.A.coerulea水螅体具有明显的γ射线辐射耐受性A.coerulea水螅体在0～900 Gy 60Co-γ射线照射后,其活力呈现出明显的剂量-抑制效应关系,并且在5天内可以恢复正常;当剂量>900 Gy后,逐渐出现水螅体在一周内死亡的现象,并在>1,000 Gy后死亡率达到100%,海月水母水螅体表现出明显的辐射耐受性。选择900 Gy,剂量率为9 Gy/min,构建海月水母水螅体60Co-γ辐射剂量-损伤效应模型。HE染色结果显示,尽管900 Gy已经出现明显症状和生化变化,但其主要微观结构并未发生明显改变。氧化还原酶系活力测定则发现60Co-γ射线照射后24 h内水螅体的SOD,CAT,GSH-Px以及T-AOC都呈现先降低后升高的趋势,这可能与机体早期清除辐射产生的ROS而被大量消耗以及后期机体反馈性增高有关。2.基于转录组学分析筛选辐射损伤相关的关键分子与通路通过Illumina测序共获得52,759,915个碱基,去除接头和低质量序列后,共获得42,684,781条（96.98%）clean reads。使用Trinity软件组装得到72,678个转录本。辐射组与对照组比较发现2,748个基因上调以及3,361下调基因。另外,分析KEGG通路与GO注释发现,与哺乳动物辐射损伤常见的TLR、NF-кB以及MAPK等信号通路不同,而内吞作用、线粒体自噬、蛋白质的加工与合成、氧化磷酸化等与维持正常生命活动的重要通路在照射后的水螅体中均发生上调。核酸切除修复,转录调控,核酸结合等与DNA、RNA合成等通路下调。进一步从差异上调的分中筛选出46个辐射损伤相关分子,28个分子目前没有注释,在有注释的分子中SQSTM1和HSPA8分子在辐射后的变化最大,表达量为2,538.01和986.18,log2FC为6.52和6.11。3.A.coerulea水螅体辐射损伤相关分子对哺乳动物细胞辐射损伤的影响以筛选出来的46个辐射损伤相关上调表达的差异基因为对象,首先成功构建辐射后上调的前10个基因中的Adtrack-a1-Flag,Adtrack-SQSTM1-Flag,Adtrack-Maf A-Flag,Adtrack-a4-Flag,Adtrack-a10-Flag质粒。经大肠杆菌扩增后,抽提质粒,使用脂质体转染导入哺乳动物293T细胞中,使用绿色荧光标记、PCR、Western Blot进行表达验证后发现,其中Adtrack-a1-Flag,Adtrack-Maf A-Flag,和Adtrack-a10-Flag成功表达出了目的蛋白,进一步研究发现过表达Maf A,和a10可以在一定程度上减少辐射后293T细胞晚期凋亡的比例。（三）60Co-γ射线对A.coerulea水螅体共生菌的影响我们的结果表明,变形菌门（76.19±3.24%）、软壁菌门（12.93±3.20%）和厚壁菌门（8.33±1.06%）是A.coerulea中最丰富的菌群,而变形菌门（29.49±2.29%）、厚壁菌门（46.25±5.59%）,拟杆菌门（20.16±2.65%）居水螅体的前三位。60Co-γ射线照射后5天内,A.coerulea水螅体的变形菌门从29.49±2.29%增加到59.40±3.09%,而厚壁菌门则从46.25±5.59%下降到13.58±3.74%。在科分类等级上,γ变形菌纲在辐射后5天内持续增加,杆菌先减少,随后部分恢复,而α-变形杆菌纲和黄杆菌科几乎不变。五、结论1.成功构建了稳定的A.coerulea水螅体实验室微观饲养体系。2.A.coerulea水螅体对60Co-γ射线照射具有明显的剂量-损伤效应关系,表现出较大的60Co-γ辐射耐受性。采用900 Gy,剂量率为9 Gy/min成功构建了稳定的A.coerulea水螅体辐射损伤剂量-损伤效应模型。3.照射后24 h内A.coerulea水螅体抗氧化酶系（SOD,CAT,GSH-Px和T-AOC）先下降后自我恢复的过程表明,A.coerulea水螅体γ射线耐受性可能与体内强大的氧化防御系统有关。4.与哺乳动物辐射损伤发挥响应经典的TLR、NF-k B以及MAPK等信号通路不同,辐射后A.coerulea水螅体富集上调的GO功能注释与KEGG信号通路主要与内吞作用、线粒体自噬、蛋白质的加工与合成、氧化磷酸化等与维持正常生命活动的重要通路有关。提示A.coerulea水螅体对辐射损伤的应答反应与哺乳动物存在明显的差异,为哺乳动物辐射损伤新机理新靶点的发现提供新的参考。5.A.coerulea水螅体损伤相关的差异基因Maf A和a10等的过表达可以减少辐射后293T细胞晚期凋亡的比例,提示A.coerulea水螅体照射后的部分效应分子在一定程度上具有发挥辐射防护作用的潜力。6.60Co-γ射线辐射后A.coerulea水螅体体内共附生微生物的动态变化与再分配过程可能是A.coerulea水螅体机体对包括辐射在内的外界环境干扰适应的重要机制,有助于A.coerulea水螅体等海洋低等多细胞无脊椎动物对外界环境的耐受和适应。
柳鑫[5]（2021）在《miR-146b巨球蛋白α2M信号轴在骨关炎病理过程的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是老龄化人群中最常见的关节退行性疾病,因为软骨组织内无神经及血管所以病变初期极难被诊断发现,出现临床症状时通常病变已进入中晚期,由于缺乏有效的疾病干预手段,最终导致关节畸形活动受限而丧失劳动能力,是致残率很高的几种疾病之一。软骨组织的不可逆性损坏降解是OA的最主要病理特征,如何防止或者延缓软骨组织的损伤一直是领域研究重点。正常的软骨组织由关节软骨和软骨细胞外基质组成,其中细胞外基质占干重的绝大部分,它的代谢正常对维持关节软骨的生理功能至关重要。OA时基质金属蛋白酶广泛分泌参与细胞外基质的降解,而广谱蛋白酶抑制剂巨球蛋白α2M是否能对这一病理过程起到调控作用不得而知。本研究将通过临床标本、实验动物模型以及软骨细胞模型,深入探讨巨球蛋白α2M在OA病理过程中的具体作用及其潜在机制。研究方法通过对临床OA患者及正常关节软骨标本进行病理评估后检测巨球蛋白α2M的表达情况;通过收集6M、12M、18M、24M年龄阶段小鼠关节软骨标本,检测巨球蛋白α2M在年龄相关性软骨损伤中的表达情况;通过构建小鼠膝关节不稳DMM-OA模型检测巨球蛋白α2M在创伤性关节炎中的表达情况;通过构建巨球蛋白α2M慢病毒并进行OA小鼠膝关节腔注射,观察外源性补充巨球蛋白α2M对OA病理进程的影响;通过靶基因预测,筛选上游microRNA并检测OA中其相互作用关系。研究结果人源性标本OA患者中巨球蛋白α2M的表达下调,DMM-OA模型小鼠标本中检测结果显示巨球蛋白α2M表达量呈波动性变化,疾病发展初始阶段表达量上调,然而随着疾病的进一步发展表达量逐渐降低,不同年龄阶段小鼠的软骨组织中也得到类似结果,巨球蛋白α2M的基础表达量较低,软骨损伤初期表达量增加,到后期时表达量显着下降。外源性巨球蛋白α2M慢病毒补充能有效改善DMM-OA小鼠关节软骨磨损,预防蛋白聚糖丢失及细胞外基质降解,有助于维持软骨细胞外基质代谢平衡,并降低小鼠骨关节炎OARSI评分,能够延缓OA小鼠病理进程。研究证明巨球蛋白α2M是miR-146b直接作用靶点,miR-146b可以负向调控巨球蛋白α2M参与软骨细胞增殖凋亡以及细胞外基质的代谢平衡,且这一作用是通过PBK/AKT通路实现。体内实验显示miR-146b表达抑制能有效改善OA小鼠病理变化。研究结论巨球蛋白α2M在骨关节炎中的表达呈波动性变化先上升后下降,外源性补充巨球蛋白α2M能有效延缓小鼠骨关节炎进程,miR-146b能够负向调控巨球蛋白α2M生物学功能,miR-146b表达抑制有助于维持软骨细胞活性及细胞外基质的代谢平衡。
杜欣[6]（2021）在《牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究》文中研究指明目的:观察牛黄及其有效成分对体外脑神经血管单元的保护作用,阐明牛黄及其有效成分治疗缺血性中风的内在生物学机制。方法:1.体外脑神经血管单元模型的建立以及缺氧/复氧模型的建立（1）利用体外原代细胞培养技术,提取大脑皮质神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞,进行细胞鉴定;（2）利用transwell板将三种细胞共培养,构建体外脑神经血管单元的模型,利用TEER值,判定模型是否成功;（3）采用缺氧1h,复氧24h,构建OGD/R模型,利用TEER值、荧光素钠渗透系数判定模型是否成功。2.牛黄及其有效成分对三种细胞的毒性利用不同浓度的牛黄（Bezoar）、牛磺酸（Taurine）、牛黄熊去氧胆酸（TUDCA）和熊去氧胆酸（UDCA）,作用于神经元、星形胶质细胞和内皮细胞,分别干预24h和48 h,利用CCK8检测细胞活力,检测每种不同浓度的药物对细胞的毒性。3.牛黄及其有效成分对脑神经血管单元的保护作用（1）通过OGD/R模型,检测牛黄、牛磺酸、TUDCA和UDCA的不同剂量对细胞的作用,利用CCK8法检测细胞活力,确定每种药物的最佳剂量;（2）利用药物的最佳剂量进行干预,通过检测血脑屏障的通透性:TEER值、荧光素钠渗透系数和γ-GT;炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化应激指标SOD、NO、MDA以及神经元凋亡率。（3）牛黄对脑神经血管单元的保护机制研究加入抑制剂LY294002,检测牛黄对细胞的干预是通过PI3K/AKT通路实现的;检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶MMP2、MMP9,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT、p-AKT。4.不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用（1）利用OGD/R模型,筛选牛磺酸+牛磺熊去氧胆酸（T+T）,牛磺酸+熊去氧胆酸（T+U）的最佳剂量;（2）利用药物的最佳剂量进行干预,通过检测血脑屏障的通透性:TEER值、荧光素钠渗透系数和γ-GT;炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β;氧化应激指标SOD、NO、MDA以及神经元凋亡率。5.配伍组分牛磺酸和熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制利用T+U的最佳剂量,进行OGD/R的造模,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶 MMP2、MMP9,紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 以及 NF-κBp65,p-P65,IKBα,p-IKBα 蛋白表达。6.配伍组分牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制利用T+T的最佳剂量,进行OGD/R的造模,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3,金属蛋白酶MMP2、MMP9,紧密连接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5,CA43、AQP4以及 P38MAPK,P-P38MAPK。结果1.获得了纯度较高的神经元、星形胶质细胞和内皮细胞（1）神经元培养7d后成熟,经MAP2免疫荧光鉴定,纯度大于95%;（2）星形胶质细胞培养7d后成熟,经GFAP免疫荧光鉴定,纯度大于95%;（3）内皮细胞培养7d后成熟,经Ⅷ因子免疫荧光鉴定,纯度大于95%。2.利用transwell,建立了脑神经血管单元的模型（1）该模型的电阻值在3-5天趋于平稳;（2）三细胞共培养,三种细胞的状态和单细胞相比,更佳。3.成功复制OGD/R模型利用缺氧1h,复氧24h,能够成功复制OGD/R模型,和正常组相比,模型组电阻值降低,荧光素钠渗透系数升高,能够进行下一步的实验研究。4.筛选药物毒性利用不用浓度的牛黄、牛磺酸、牛磺熊去氧胆酸和熊去氧胆酸分别干预24h和48h,筛选药物的毒性。5.筛选药物的保护剂量利用无毒性的各种药物浓度,通过OGD/R造模方法,检测细胞活力,筛选出保护作用的最佳剂量。6.牛黄及其有效成分对体外脑神经血管单元的保护作用（1）牛黄及其有效成分降低LDH,升高γ-GT,提高TEER值和降低荧光素钠渗透系数;（2）牛黄及其有效成分减少炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1 β的水平;（3）牛黄及其有效成分降低NO、MDA的水平,升高SOD的水平;（3）牛黄及其有效成分抑制神经元的凋亡;（4）牛黄降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（5）牛黄能升高紧密连接蛋白的表达,提高ZO-1、Occludin、Claudin-5的蛋白表达;（6）牛黄通过HIF-α/VEGF,PI3K/AKT通路,发挥保护NVU的作用,牛黄降低HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平,升高PI3K、AKT的蛋白表达水平。7.不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用（1）筛选了配伍组分的最佳剂量,T+T的最佳剂量1mM Taurine和1μM TUDCA,T+U的最佳剂量1mM Taurine和1μM UDCA;（2）T+T、T+U有效保护血脑屏障,降低TEER值,降低荧光素钠渗透系数,升高γ-GT;（3）T+T、T+U有效减轻细胞损伤,降低LDH的水平;（4）T+T、T+U有效减轻炎症反正,降低TNF-α、IL-6、IL-1β的值;（5）T+T、T+U有效抑制氧化反应,降低NO、MDA的水平,升高SOD的活力;（6）T+T、T+U抑制神经元的凋亡率。8.配伍组分牛磺酸和熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制（1）T+U抑制神经元的凋亡率;（2）T+U 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表达;（3）T+U降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（4）T+U降低Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达;（5）T+U降低MyD88、P-P65、P-IKB α的蛋白表达,通过MyD88/NF-κB信号通路发挥脑保护作用。9.配伍组分牛磺酸和牛黄熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制（1）T+T抑制神经元的凋亡率;（2）T+T 提高 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的蛋白表达;（3）T+T降低MMP2、MMP9的蛋白表达;（4）T+T降低Bax、Caspase-3蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达;（5）T+U降低AQP4、P38MAPK,升高CX43的蛋白表达。结论（1）牛黄、牛磺酸、TUDCA和UDCA能够减轻炎症反应,降低氧化应激的水平,抑制神经元的凋亡发挥神经保护的作用;（2）牛黄通过HIF-1α/VEGF和PI3K/AKT通路发挥脑保护作用;（3）牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸,牛磺酸和熊去氧胆酸配伍,发挥协同作用,比单独使用牛磺酸药效更好;（4）牛磺酸和熊去氧胆酸1000:1的配伍能够抑制炎症反应,降低氧化应激的水平,保护血脑屏障,抑制神经元的凋亡,能够抑制通路MyD88/NF-κB通路发挥脑保护作用（5）牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸1000:1的配伍能够抑制炎症反应,降低氧化应激,保护血脑屏障,能够抑制P38MAPK通路,发挥脑保护作用;
谭卫星[7]（2021）在《外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制》文中进行了进一步梳理一、背景类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以对称性、侵蚀性和破坏性关节炎为特点的慢性全身性自身免疫性疾病,其中RA患者关节成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-1ike synoviocyte,FLS）的生物学特征改变及功能异常被认为与RA的发病密切相关。人们对导致RA-FLS“肿瘤样增殖”表型的分子机制目前仍知之甚少,猜测可能是细胞暴露于体内类风湿炎症环境中以某种方式的被动应答,而这一炎症环境中的效应分子包括最新研究发现的一些新的生物标志物如:外泌体,后者被认为同样具有潜在的临床诊断和治疗作用。我们既往研究显示在Wnt经典及非经典两条信号通路中扮演着交叉点角色的Dvl的一个亚型即Dvl3分子在RA血清外泌体中显着升高。推测Dvl3这一分子在RA中可能具有诱人的研究前景,因此本研究旨在探寻Dvl3在RA中的表达模式以及通过外泌体这一方式研究Dvl3 mRNA在RA中的功能及作用机制,为将来能够更深入了解RA的发病机制及发现新的可能的治疗靶点奠下基础。二、研究目的第一部分:明确Dvl3在RA患者滑膜组织和细胞以及胶原诱导关节炎小鼠模型（CIA）滑膜组织中的表达情况。第二部分:明确外泌体Dvl3 mRNA在体外对成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及炎性反应的作用。第三部分:明确外泌体Dvl3 mRNA在体内对CIA模型疾病程度、疼痛、滑膜破坏和凋亡、软骨和骨破坏以及血清炎性因子水平的影响。第四部分:探讨Dvl3 mRNA发挥上述作用的可能下游机制。三、研究方法第一部分:（1）分别收集了6例RA和创伤（Trauma）患者的膝关节滑膜组织,经固定、包埋、切片机组织HE染色对两组滑膜组织病理进行比较;（2）分别通过免疫组化（IHC）、蛋白印迹（WB）及实时定量PCR（q PCR）比较Dvl3在两组患者滑膜组织中的表达水平;（3）从滑膜组织中原代提取成纤维样滑膜细胞,比较Dvl3的表达水平;（4）通过构建胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型,比较Dvl3在疾病模型小鼠及正常小鼠膝关节中的表达水平。第二部分:（1）构建Dvl3 mRNA过表达及干扰慢病毒,鉴定摸索慢病毒感染RA-FLS条件,获得能够稳定上调或下调Dvl3 mRNA的RA-FLS;（2）进一步摸索条件通过对细胞培养上清超速离心获得能够稳定介导目标RA-FLS中Dvl3 mRNA水平改变的外泌体,并通过q PCR及WB进行验证转染效果。（3）采用Tunel及流式检测法测定不同来源外泌体转染RA-FLS后对细胞凋亡的影响;CKK8测定RA-FLS细胞活性;（4）经划痕和Transwell迁移实验比较细胞迁移能力;（5）利用Transwell侵袭实验及基质金属蛋白酶（MMPs）表达水平检测反映细胞侵袭能力;（6）提取目的细胞RNA及上清分别使用q PCR及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各细胞因子的mRNA及蛋白水平。第三部分:（1）外泌体获取同第二部分,构建CIA小鼠模型,对小鼠关节腔注射外泌体,每周一次;（2）第二次免疫次日起对小鼠疾病评分;（3）对小鼠足爪机械痛觉进行一次评分;（4）颈椎脱臼法处死小鼠获取小鼠膝关节,分别行HE染色、番红O-固绿染色及Tunel染色对小鼠膝关节病理、软骨破坏及滑膜细胞凋亡情况进行评价;（5）门静脉取血并采用ELISA法检测各细胞因子表达水平。第四部分:（1）提取不同来源外泌体处理后的RA-FLS中的RNA,q PCR检测Wnt信号通路的关键信号分子筛选Dvl3的可能下游通路;（2）进行WB验证;（3）构建Dvl3 mRNA过表达和干扰质粒并进行转染验证,上述质粒同双荧光素酶报告基因质粒进行共转染实验,验证Dvl3对TCf以及ROCK2启动子的活性。四、结果第一部分:（1）成功提取了RA和创伤患者关节滑膜的原代FLS进行培养、鉴定及传代。（2）RA组滑膜在滑膜增生、炎性细胞浸润及毛细血管增生等方面的评分明显更高。（3）Dvl3在RA患者滑膜中的表达水平明显升高。（4）Dvl3在RA-FLS中的表达同样明显高于对照创伤组。（5）Dvl3在炎性关节炎中的表达被显着上调。第二部分:（1）CKK8结果显示来自过表达外泌体组的外泌体能够显着促进细胞增殖活性,而干扰外泌体组外泌体可以起到抑制FLS增殖的作用。（2）凋亡结果显示过表达外泌体组较对照组显着下调了RA-FLS的凋亡水平。（3）迁移及侵袭实验提示了过表达Dvl3外泌体对细胞迁移及侵袭的促进作用,同时伴有上调基质金属蛋白酶表达水平的作用,在干扰外泌体组中则观察到几乎相反的作用。（4）q PCR及ELISA法检测细胞因子含量水平提示Dvl3 mRNA过表达外泌体能够显着促进TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-21的表达,干扰外泌体组则可以观察到IL-17和IL-21的显着下调。第三部分:（1）成功构建了CIA小鼠模型,小鼠疾病评分结果显示过表达外泌体注射组小鼠关节炎指数较对照组升高更快。（2）机械痛阈值测定结果显示干扰外泌体组小鼠疼痛阈值下降程度较对照组明显减缓。（3）WB及q PCR验证了外泌体注射干预效果。（4）HE染色提示过表达外泌体组病理评分明显高于对照组;而Sh-Dvl3 mRNA干扰外泌体注射组则有效缓解了小鼠的关节炎症。（5）番红O-固绿染色结果显示过表达外泌体组评分明显高于对照组,而干扰实验组则倾向表现出对关节软骨的保护性作用。（6）Tunel实验提示Sh-Dvl3 mRNA外泌体注射组表现出强烈的促凋亡结果。（7）ELISA结果显示Dvl3在膝关节的表达水平升高可以显着上调血清中TNF-α、IL-17及IL-21的水平。第四部分:（1）q PCR结果显示Dvl3 mRNA的过表达同样伴随着β-catenin及Rho A下游分子ROCK2的明显升高,而在Dvl3 mRNA干扰外泌体组则观察到β-catenin及Ro CK2较对照组的显着下降。以上结果经WB得到进一步验证。（2）双荧光素酶报告基因检测系统来明确Dvl3在Wnt通路两条通路中的作用,结果提示了Dvl3可以同时激活经典及非经典Wnt信号通路。五、结论本课题通过临床及动物组织样本表达、原代细胞培养体外实验研究、构建动物模型体内实验研究以及具体分子机制四个部分对Dvl3的表达以及外泌体Dvl3mRNA的功能进行了较为详尽的研究,发现了Dvl3在RA患者及炎性关节炎动物模型中的高表达,以及其在细胞水平可能具有促进细胞增殖抑制凋亡,促进迁移、侵袭及促炎性细胞因子的分泌等作用进而参与介导了关节炎的进展和加重,进一步的机制研究显示其发挥上述作用的下游途径可能离不开对Wnt经典及非经典通路的激活,包括β-catenin/TCF/LEF-1及Rho A/ROCK2通路的活化,同时Dvl3 mRNA干扰外泌体组获得的对炎症性关节炎的保护性结果为未来RA的干预治疗提供了理论基础和新的潜在靶点。
白清丽[8]（2021）在《AKT/mTOR/STAT3信号通路在稽留流产中的作用及机制研究》文中提出目的:通过检测病例组和对照组胚胎组织中AKT/mTOR/STAT3信号通路相关因子和滋养细胞侵袭能力相关因子MMPs与TIMPs的基因和蛋白表达水平,研究此信号通路与稽留流产的关系及其可能的作用机制。方法:在兰州市妇幼保健院和平凉市静宁县妇幼保健院收集2018年05月至2019年04月期间,确诊的稽留流产患者和同时期进行人工流产终止妊娠的正常早孕者的血清及胚胎组织建立标本库。本研究选取12名稽留流产者为病例组,12名人工流产者为对照组,两组研究者孕周相同、年龄相近,无其他疾病及不良嗜好。对两组胚胎组织进行研究分析:（1）光镜下观察12对研究对象绒毛组织的病理组织学的变化;（2）采用q RT-PCR检测AKT/mTOR/STAT3信号通路相关因子基因的相对表达水平以及滋养细胞侵袭能力相关因子基因的相对表达水平;（3）采用Wes全自动蛋白质表达定量分析系统检测两组绒毛组织中AKT/mTOR/STAT3信号通路中相关因子蛋白的表达水平以及滋养细胞侵袭能力相关因子蛋白的表达水平;（4）采用免疫组织化学法观察p-STAT3在绒毛及蜕膜组织中的分布并进行定量分析。结果:（1）组织病理观察:病例组绒毛组织结构明显紊乱,滋养层明显变薄变浅,绒毛管腔变细、极度狭窄甚至消失,细胞数量明显减少,绒毛间质不清晰。（2）AKT/mTOR/STAT3信号通路相关因子表达:病例组绒毛组织中AKT、mTOR和STAT3 m RNA表达水平与对照组比较均降低（P<0.05）;病例组绒毛组织中p-AKT、mTOR、p-mTOR、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平与对照组比较均降低（P<0.05）,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和p-STAT3/STAT3比值也均较对照组减小（P<0.05）。（3）p-STAT3定位及定量:在两组绒毛组织中的合体滋养细胞和细胞滋养细胞及蜕膜组织中均有不同程度地p-STAT3的阳性表达,其主要表达于细胞核中;p-STAT3蛋白在病例组的表达低于对照组（P<0.05）。（4）滋养细胞侵袭能力相关因子表达:病例组绒毛组织中MMP2和MMP9 m RNA的表达水平与对照组相比均降低（P<0.05）,TIMP2 m RNA表达水平与对照组相比则升高（P<0.05）;病例组绒毛组织中MMP2和MMP9蛋白表达水平与对照组相比均降低（P<0.05）,TIMP2蛋白表达水平较对照组升高（P<0.05）,MMP2/TIMP2和MMP9/TIMP3比值与对照组比较均减小（P<0.05）。结论:稽留流产绒毛膜组织中AKT/mTOR/STAT3信号通路表达下调,其下游转录因子MMP2/TIMP2和MMP9/TIMP3失衡,可能导致滋养细胞的侵袭能力降低,妊娠早期胚胎植入过浅,滋养细胞功能异常,影响胚胎的正常生长发育。AKT/mTOR/STAT3信号通路表达下调可能是稽留流产发生的重要机制之一。
黄艳[9]（2021）在《Hc-nas-33参与捻转血矛线虫蜕皮过程的功能及其分子机制初步研究》文中指出捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生于牛、羊、骆驼等反刍动物皱胃中的吸血性寄生虫,在我国呈广泛性流行,给中国的畜牧业造成重大经济损失。抗蠕虫药物对于捻转血矛线虫病有良好的治疗效果,但近年来耐药株频繁出现,增加了该病防治的难度。线虫生命调控关键基因作为新型药物靶点的筛选及抗蠕虫药物开发是目前捻转血矛线虫病防控的重要研究方向。蜕皮是线虫生长发育过程中必经的生命过程,当该过程发生障碍时,可影响虫体的正常发育,降低活动能力,甚至导致幼虫死亡,因此探明蜕皮作用机制及相关基因的生物学功能,对于该病的防控至关重要。本研究从已公布的捻转血矛线虫转录组数据库中筛选了 3种线虫虾红素样蛋白基因（Nematode astacin,NAS）,扩增获得了 Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33基因全长,并对其结构域和分子进化关系进行了预测分析;在HEK 293T细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和捻转血矛线虫中观察了 HcNASs的表达特性;利用转录特性分析和RNA干扰试验探究了Hc-nas-33在捻转血矛线虫生长发育过程中发挥的功能;构建了捻转血矛线虫酵母cDNA文库,并筛选得到Hc-NAS-33的候选互作蛋白鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 β 亚基-1（Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-1,GPB-1）,验证了两者的互作关系;并对Hc-GPB-1在蜕皮过程中的功能进行了研究。实验结果为深入研究捻转血矛线虫蜕皮机制奠定了基础,同时也为新药开发提供了潜在的药物靶点。1.捻转血矛线虫HcNASs基因特性分析通过扩增获得捻转血矛线虫3个虾红素样蛋白基因Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33的全长DNA及mRNA序列,利用生物信息学软件预测分析基因结构、蛋白功能和分子进化关系;并构建原核表达载体获得重组蛋白,制备多克隆抗体。实验结果表明,3个HcNASs均有典型的锌金属蛋白酶结构域,此外Hc-NAS-31还具有1个CUB结构域和1个SXC结构域,Hc-NAS-33具有1个EGF结构域和1个CUB结构域;Hc-NAS-5和Hc-NAS-31具有C端信号肽。利用pET原核表达系统成功表达了 HcNASs重组蛋白,通过免疫实验动物获得了特异性较好的多克隆抗体。本研究扩增得到3种HcNASs基因对其进行了生物信息学分析,制备了多克隆抗体,可用于后续蛋白表达特性分析。2.HcNASs表达特性分析为了全面分析HcNASs的表达特性,本研究首先通过构建真核表达载体,转染HEK293T细胞,分析其在真核细胞中的定位情况;构建异源表达质粒,通过显微注射获得重组转基因虫株,探究在秀丽隐杆线虫中的表达情况;利用制备的多克隆抗体,通过幼虫间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IFA）和L4及成虫免疫组织荧光（Immunohistofluorescence,IHF）分析在捻转血矛线虫中的表达特性。实验结果显示3种HcNASs均表达于HEK 293T细胞质中;在秀丽隐杆线虫中,Hc-NAS-5只表达于咽部和尾部极少数细胞中,Hc-NAS-31不能表达,Hc-NAS-33表达于咽部与肠道内;在捻转血矛线虫中,Hc-NAS-5和Hc-NAS-31定位于L3上皮合胞体,而在成虫中Hc-NAS-5和Hc-NAS-31表达模式缺乏特异性,广泛分布于多种虫体组织,Hc-NAS-33特异性表达于肠道与肌肉接触面、子宫膜和未成熟虫卵外周。本研究明确了 HcNASs的表达特性,为后续的功能研究指明了方向。3.Hc-nas-33在捻转血矛线虫蜕皮发育过程中的功能研究为了探究Hc-nas-33是否参与捻转血矛线虫蜕皮过程,本研究利用实时荧光定量 PCR（Quantitative real time PCR,qRT-PCR）分析了Hc-nas-3在不同时段内的转录特性,同时也进行了秀丽隐杆线虫同源基因的比较性研究,其次运用RNA干扰方法探究Hc-nas-33沉默后对捻转血矛线虫生长发育的影响。转录特性分析结果显示,Hc-nas-33转录水平在捻转血矛线虫L1-L2蜕皮过程中呈振荡变化,且在中后期达到峰值,Ce-nas-33基因在蜕皮过程中同样表现振荡转录特性;RNA干扰后,幼虫正常生长发育受到严重影响,虫体出现发育迟缓、活动力下降、畸形及蜕皮功能障碍等表型。上述结果证明Hc-nas-33为捻转血矛线虫蜕皮相关基因,为后续研究捻转血矛线虫蜕皮机制、开发新药物奠定了基础。4.捻转血矛线虫酵母cDNA文库构建及Hc-nas-33互作蛋白的筛选鉴定为了进一步探索Hc-nas-33参与蜕皮过程的分子机制,本研究构建了捻转血矛线虫酵母cDNA文库,并利用酵母双杂交系统筛选与Hc-NAS-33存在相互作用的候选蛋白;通过pull down、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CO-IP）与真核细胞共定位验证Hc-NAS-33与互作蛋白之间关系。酵母文库筛选发现了 6种可能与Hc-NAS-33存在相互作用的候选蛋白;利用昆虫细胞杆状病毒系统成功表达 GST-Hc-NAS-33 重组蛋白,通过 pull down 验证了 Hc-NAS-33 与 Hc-GPB-1存在相互作用,与免疫共沉淀结果相符,且Hc-NAS-33在HEK 293 T细胞中能与Hc-GPB-1共定位。本研究成功筛选得到Hc-NAS-33的互作蛋白,为后续研究其在捻转血矛线虫蜕皮过程中的功能奠定了基础,有助于更好的了解线虫蜕皮分子机制。5.Hc-NAS-33与Hc-GPB-1参与蜕皮过程的机制研究本研究借助秀丽隐杆线虫表达系统,分析Hc-NAS-33和Hc-GPB-1在线虫中的共定位情况,同时利用RNA干扰技术研究Hc-GPB-1在捻转血矛线虫生长发育过程中发挥的功能。结果表明,在秀丽隐杆线虫中异源表达的Hc-NAS-33和Hc-GPB-1存在部分共定位;Hc-gpb-1沉默后,幼虫同样出现发育迟缓、活动性下降及蜕皮功能障碍等表型,且降低Hc-gpb-1表达水平使得虫体新皮的厚度受到影响,表皮、皮下与肌肉之间的紧密连接出现缝隙,相关基因的qRT-PCR进一步验证了以上结果。本研究发现在蜕皮过程中Hc-NAS-33与Hc-GPB-1均参与了新皮的合成,这为进一步阐明捻转血矛线虫蜕皮机制提供了重要依据,同时也为捻转血矛线虫药物研发提供了新的候选药物靶标。综上所述,本研究扩增得到了 3种捻转血矛线虫HcNASs基因,并对其进行生物信息学分析,明确了其蛋白表达特性。通过转录特性分析和RNA干扰实验对Hc-nas-33进行深入研究,发现该基因参与捻转血矛线虫的蜕皮过程;利用酵母双杂交系统筛选获得6种Hc-NAS-33的候选互作蛋白,并验证了与Hc-GPB-1的互作关系;通过异源表达和RNA干扰对Hc-NAS-33及其互作蛋白Hc-GPB-1在捻转血矛线虫蜕皮过程的发挥的生物学功能进行了研究。上述结果为捻转血矛线虫蜕皮机制研究奠定了基础,同时为捻转血矛线虫病的防治提供了新的思路。
周海康[10]（2021）在《基于mTOR信号通路探究肠道菌群代谢产物丁酸钠对骨关节炎的作用及机制》文中提出目的:1)通过网络药理学分析肠道菌群代谢产物丁酸钠的药理作用靶点与骨关节炎病理过程中的共有作用基因与相互作用的机制。在体外构建骨关节炎软骨细胞模型并给予最佳剂量的丁酸钠干预探究丁酸钠对软骨细胞自噬的影响及对自噬调节关键蛋白m TOR信号通路的影响;2)进一步探究由丁酸钠诱导的软骨细胞自噬在软骨细胞及OA小鼠的关节软骨分解代谢、炎症反应、凋亡、活性氧、细胞周期及m TOR信号通路的影响;3)通过体内构建骨关节炎小鼠模型并给予不同剂量丁酸钠干预探究丁酸钠对骨关节炎软骨及软骨下骨中细胞自噬和m TOR信号通路的影响。方法:1)分离培养及鉴定C57BL/6J原代软骨细胞。通过CCK-8评估丁酸钠对正常的和IL-1β干预的软骨细胞活性影响。通过免疫印迹、免疫荧光和透射电镜观察丁酸钠对体外OA模型中软骨细胞自噬的影响。通过Western Blot和免疫组织化学染色评估丁酸钠对m TOR信号通路的影响;2)通过蛋白印迹、细胞流式、免疫荧光、免疫组织化学染色探索丁酸钠对IL-1β诱导的软骨细胞基质代谢、炎症、凋亡、活性氧损伤和细胞周期阻滞的影响;3)预实验设立6组,即假手术组,ACLT+安慰剂组,ACLT+浓度梯度的口服丁酸钠治疗组。术后60天评估软骨退变情况以确定最佳的用药剂量。后续的正式试验中设立3组,即假手术组,造模组和丁酸钠口服灌胃治疗组。通过HE和番红固绿染色评估关节软骨钙化和蛋白聚糖的情况,采用小鼠骨关节炎软骨组织评分评估软骨的退变程度。通过免疫组化分析小鼠关节软骨细胞外基质代谢和凋亡的特征性指标。通过免疫组织化学分析测定关节软骨自噬特征性指标LC3、Beclin1和p62的表达;4)通过Micro-CT分析丁酸钠对软骨下骨微观结构的改变;5)通过Micro-CT血管造影分析丁酸钠对软骨下骨血管增生的影响。免疫组织化学染色测定血管生成相关因子的表达水平。结果:1)形态学观察软骨细胞呈现出长梭形,阿力新蓝染色和免疫荧光都显示出特征性表达Collagen II,选取分离培养第二代后的软骨细胞进行实验。CCK-8结果显示,500μM以上浓度的丁酸钠对软骨细胞有毒性作用,250μM浓度的丁酸钠对IL-1β干预的软骨细胞的活性提升作用最显着。网络药理学结合生信分析结果显示丁酸钠靶向基因主要与生长因子、细胞存活以及免疫或炎症反应有关。丁酸钠靶向作用基因分别是AKT1、TP53、PTEN、GSK3B、MDM2、CDKN1A、CDKN1B、FOXO1、FOXO3、m TOR和CDK4。Western blotting、免疫荧光和透射电镜显示丁酸钠可有效激活并促进软骨细胞自噬并恢复受阻的自噬流;丁酸钠对软骨细胞自噬的增强作用主要是通过靶向调控PI3K/AKT/m TOR和MAPK/m TOR信号通路对m TOR抑制而产生的;2)丁酸钠通过促进软骨细胞的自噬而发挥抑制分解代谢与炎症因子（IL-6、TNF-α、IL-10、COX-2、Collagen II、aggrecan、MMP3、ADAMTS-5）和促凋亡因子（Bax、cleaved-caspase-3、Bcl-2）的表达。细胞流式分析显示丁酸钠可通过激活软骨细胞自噬而抑制由IL-1β诱导的软骨细胞异常活性氧生成和DNA损伤与细胞周期阻滞;3)体内构建OA模型探究丁酸钠的最佳剂量为150mg/kg。正式实验结果显示丁酸钠可抑制实验性OA关节软骨的退变。丁酸钠可促进软骨保护指标的表达（Collagen II）,抑制分解代谢指标（MMP3）。同时可抑制炎症因子的产生和软骨细胞凋亡指标的异常表达。实验性OA模型中,丁酸钠治疗同样可激活并促进软骨细胞自噬恢复通畅的自噬流;4)Micro-CT检测提示丁酸钠可有效抑制骨关节炎软骨下异常的骨吸收及骨囊肿的形成;5)Micro-CT显微血管造影成像技术显示丁酸钠可有效抑制软骨下骨异常增生的血管数量与机体。结论:1)丁酸钠通过抑制m TOR信号通路在病理状态下的磷酸化而激活并促进软骨细胞自噬;2)丁酸钠可通过增强软骨细胞的自噬作用而抑制骨关节炎软骨细胞的分解代谢、炎症反应和凋亡;3)丁酸钠可通过增强软骨细胞自噬减少ROS和缓解DNA损伤而引起的软骨细胞周期阻滞;4)丁酸钠在OA小鼠模型中可保护软骨的完整性并促进蛋白多糖的合成。抑制软骨下骨的破骨细胞的异常激活,维持软骨下骨成骨与破骨细胞正常的耦联机制;5)丁酸钠通过抑制血管生成因子的表达抑制软骨下骨血管的异常增生,从延缓骨关节炎进展。
二、Structure, expression, and developmental function of early divergent forms of metalloproteinases in Hydra（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Structure, expression, and developmental function of early divergent forms of metalloproteinases in Hydra（论文提纲范文）
（1）GnRH1对鸡卵泡中MMP11/13及血管发育相关基因表达的影响及MMP11的转录调控（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 家禽卵巢结构及发育特征 |
| 1.1.1 卵巢结构及发育特点 |
| 1.1.2 卵泡膜细胞和颗粒细胞作用 |
| 1.2 卵巢内卵泡血管的发育 |
| 1.2.1 血管发育 |
| 1.2.2 血管发育影响因素 |
| 1.3 GnRH1、MMP11/13 及血管发育相关基因在卵巢发育中的功能 |
| 1.3.1 GnRH1 基因在卵巢发育中的功能 |
| 1.3.2 MMP11/13 基因在卵巢发育中的功能 |
| 1.3.3 血管发育相关的基因在卵巢发育中的功能 |
| 1.3.4 GnRH1 基因及血管发育相关的基因的相互作用 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物及样本采集 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂及来源 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 主要分子生物学数据库及软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 卵泡膜细胞和颗粒细胞的分离培养 |
| 2.2.2 RNA的提取及检测 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4 免疫组织化学方法检测 |
| 2.2.5 载体的构建 |
| 2.2.6 细胞处理 |
| 2.2.7 双荧光素酶报告基因活性检测 |
| 2.2.8 ELISA |
| 2.3 统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GnRH1、MMP11/13 和血管发育相关基因在卵巢基质和卵泡中的表达 |
| 3.1.1 GnRH1、MMP11/13和VEGFA在卵巢基质和卵泡中的免疫定位 |
| 3.1.2 总RNA的质量检测 |
| 3.1.3 GnRH1、MMP11/13 和血管发育相关基因在不同品种鸡卵巢基质及各级卵泡中的表达 |
| 3.1.4 GnRH1、MMP11/13 和血管发育相关基因在鸡卵泡膜细胞和颗粒细胞中的表达 |
| 3.2 过表达GnRH1 基因在鸡卵泡膜细胞和颗粒细胞中的作用分析 |
| 3.2.1 GnRH1 的转染效率 |
| 3.2.2 GnRH1 基因过表达后,转录因子FOXP1及MMP11/13 基因的表达变化 |
| 3.2.3 GnRH1 基因过表达后,血管发育相关基因的表达变化 |
| 3.2.4 GnRH1 过表达对VEGFA蛋白表达变化 |
| 3.3 MMP11 基因启动子区与FOXP1 的调控关系及结合位点的鉴定与分析 |
| 3.4 GnRH1和FOXP1对MMP11 基因启动子区活性的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GnRH1对MMP11/13 基因表达的影响及MMP11 转录调控分析 |
| 4.2 GnRH1 对血管发育相关基因表达的影响分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文及专利申请情况 |
（2）粘体动物系统发育地位与内寄生适应机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 粘体动物的起源及分类地位 |
| 1.1 粘体动物起源 |
| 1.2 粘体动物的分类地位 |
| 2 粘体动物系统发育基因组学研究进展 |
| 2.1 系统发育基因组学 |
| 2.2 单拷贝核基因基本特征及应用 |
| 2.3 粘体动物系统发育基因组学展望 |
| 3 粘体动物刺丝囊生物学研究进展 |
| 3.1 刺丝囊形态结构 |
| 3.2 刺丝囊蛋白组成 |
| 3.3 驱动刺丝囊释放的能量来源 |
| 4 粘体动物适应性进化研究进展 |
| 4.1 适应性进化 |
| 4.2 比较基因组学在粘体动物适应性进化研究中的应用 |
| 4.3 碘泡科物种:粘体动物适应性进化研究的优秀材料 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基于单拷贝核基因的粘体动物系统发育地位分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 样品收集及处理 |
| 2.2 基因组、转录组二代测序及组装 |
| 2.3 直系同源基因提取 |
| 2.4 单拷贝基因选择与数据过滤 |
| 2.5 系统发育分析 |
| 2.6 分歧时间估算 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 后生动物系统发育关系 |
| 3.2 刺胞动物系统发育关系 |
| 3.3 可变拓扑结构检验 |
| 3.4 快速进化位点梯度剔除 |
| 3.5 分歧时间 |
| 4 讨论 |
| 第三章 粘孢子虫刺丝囊与壳瓣分离提纯方法的建立 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 样品收集及处理 |
| 2.2 蔗糖及Percoll密度梯度离心液配制 |
| 2.3 完整孢子的分离及纯化 |
| 2.4 孢子解离 |
| 2.5 刺丝囊提取 |
| 2.6 壳瓣提取 |
| 2.7 温度、盐度及多种化合物对孢子及离体刺丝囊释放的影响 |
| 2.8 重金属离子对孢子及离体刺丝囊释放的影响 |
| 2.9 透射电镜 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 孢子分离纯化及解离 |
| 3.2 刺丝囊分离及纯化 |
| 3.3 刺丝囊透射电镜 |
| 3.4 温度、盐度、多种化合物及重金属离子对孢子及离体刺丝囊释放的影响 |
| 3.5 壳瓣分离及纯化 |
| 4 讨论 |
| 第四章 粘体动物综合蛋白数据库的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 样品收集及处理 |
| 2.2 基因组、转录组二代测序及组装 |
| 2.3 序列污染剔除 |
| 2.4 粘体动物综合蛋白数据库及对照数据库的构建 |
| 2.5 液相色谱-串联质谱及蛋白组组学分析 |
| 2.6 数据库评估 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 粘体动物综合蛋白数据库及对照数据库特征 |
| 3.2 基于质谱鉴定肽段与蛋白数量的数据库质量评估 |
| 3.3 数据库肽段与蛋白交集 |
| 3.4 基于完整度的数据库质量评估 |
| 3.5 通过线性拟合保留时间与理论疏水性指数以验证肽段有效性 |
| 3.6 数据库特异性肽段结果验证 |
| 4 讨论 |
| 第五章 刺丝囊对粘体动物/刺胞动物适应性进化的贡献评估 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 样品收集及处理 |
| 2.2 扫描电镜 |
| 2.3 基因组、转录组二代测序及组装 |
| 2.4 蛋白质组参考数据库构建 |
| 2.5 液相色谱-串联质谱及蛋白组组学分析 |
| 2.6 比较蛋白组组学分析及毒液组学分析 |
| 2.7 系统发育分析 |
| 2.8 选择压力分析及适应定量 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 比较蛋白质组学及毒液组学 |
| 3.2 刺丝囊核心基因分析 |
| 3.3 刺丝囊核心基因的主要进化事件分析 |
| 3.4 选择压力分析及适应定量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 刺丝囊异质性及细胞器-物种进化不一致性支持强烈的物种特异适应 |
| 4.2 刺丝囊的自发性起源 |
| 4.3 刺丝囊的去中心化进化模式 |
| 4.4 刺丝囊中的高频适应 |
| 第六章 洪湖碘泡虫基因组适应性进化研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 样品收集及处理 |
| 2.2 基因组、转录组二代测序及组装 |
| 2.3 基因组大小评估 |
| 2.4 基因组测序及组装 |
| 2.5 基因组污染剔除 |
| 2.6 基因组注释 |
| 2.7 基因家族及系统发育分析 |
| 2.8 正选择分析 |
| 2.9 基因获得与缺失分析 |
| 2.10 4DTv分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 基因组组装与注释 |
| 3.2 转座及基因组加倍分析 |
| 3.3 系统发育基因组学 |
| 3.4 基因家族进化 |
| 3.5 精简的神经系统基因 |
| 3.6 先天免疫相关基因的缺失 |
| 3.7 抗逆、侵袭、能量代谢以及细胞过程的增强 |
| 3.8 保守的中胚层及肌肉发育元件 |
| 3.9 Wnt与 Hedgehog信号通路分析 |
| 4 讨论 |
| 第七章 全文总结及不足 |
| 1 全文总结 |
| 2 不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）KLF2通过TGF-β信号抑制肝癌细胞运动（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肝癌的简介 |
| 1.2 TGF-β信号通路 |
| 1.3 KLF相关因子 |
| 1.4 KLF蛋白与TGF-β信号的研究进展 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂材料 |
| 2.1.3 主要细胞及病毒 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要试剂配制 |
| 2.2.2 细胞复苏 |
| 2.2.3 细胞换液 |
| 2.2.4 细胞传代 |
| 2.2.5 细胞冻存 |
| 2.2.6 细胞计数 |
| 2.2.7 RNA提取、逆转录、实时定量PCR(q-PCR) |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.10 细胞迁移 |
| 2.2.11 基质胶侵袭 |
| 2.2.12 细胞免疫荧光 |
| 2.2.13 鬼笔环肽细胞骨架染色 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 第三章 KLF2 蛋白抑制TGF-β信号 |
| 3.1 TGF-β在肝癌细胞中诱导KLF2 基因表达 |
| 3.2 KLF2 蛋白抑制TGF-β信号传导 |
| 3.3 KLF2 拮抗Smad蛋白转录活性 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 KLF2 抑制TGF-β诱导的肝癌细胞运动 |
| 4.1 KLF2 抑制TGF-β诱导的肝癌细胞迁移和侵袭 |
| 4.2 KLF2 抑制TGF-β诱导的肝癌细胞EMT |
| 4.3 KLF2减弱TGF-β诱导的肝癌细胞MMP2表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 进一步工作方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 KLF2在肝病中的生物学作用 |
| 参考文献 |
（4）海月水母水螅体60Co-γ射线照射模型构建及相关基因的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分:海月水母及其水螅体的鉴定以及水螅体实验室微观饲养体系的构建 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、分析与讨论 |
| 第二部分:~(60)Co-γ射线对A.coerulea水螅体的损伤效应及相关基因筛选 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、分析与讨论 |
| 第三部分:~(60)Co-γ射线对A.coerulea水螅体共生菌的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 综述 海月水母属的发育、共生菌群及毒性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表和科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（5）miR-146b巨球蛋白α2M信号轴在骨关炎病理过程的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 骨关节炎 |
| 1.2 关节结构和功能 |
| 1.2.1 关节软骨 |
| 1.2.2 滑膜 |
| 1.2.3 滑膜液 |
| 1.2.4 软骨下骨 |
| 1.3 骨关节炎的病理改变 |
| 1.3.1 关节软骨退化 |
| 1.3.2 细胞凋亡 |
| 1.3.3 自噬 |
| 1.3.4 滑膜炎症 |
| 1.4 MicroRNA的作用机制 |
| 1.4.1 MicroRNA与骨关节炎 |
| 1.4.2 MicroRNA在疾病诊断中的应用 |
| 1.4.3 MicroRNA在疾病治疗中的应用 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 巨球蛋白α2M在OA病理过程中的表达变化及作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 miR146b靶向巨球蛋白α2M调控软骨细胞增殖及分解代谢 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间研究成果 |
| 致谢 |
（6）牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 上篇文献综述 |
| 综述一 缺血性中风背景下的神经血管单元 |
| 1. 缺血性中风的研究现状 |
| 2. 神经血管单元的组成 |
| 3. 在正常和低氧条件下的生理学 |
| 4. 缺血性脑卒中的实验模型 |
| 5. 基于神经血管单元的治疗策略 |
| 6. 参考文献 |
| 综述二 中药抗缺血性脑卒中的研究进展 |
| 一. 植物药 |
| 1.1 人参 |
| 1.2 栀子 |
| 1.3 姜黄 |
| 1.4 丹参 |
| 1.5 黄芪 |
| 1.6 川芎 |
| 1.7 地黄 |
| 1.8 黄连 |
| 二. 动物药 |
| 2.1 牛黄 |
| 2.2 麝香 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 下篇 实验研究 |
| 实验一 “神经血管单元”体外模型的建立以及缺氧/复氧模型的建立 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 实验二 牛黄及其有效成分对单独培养的神经元、星形胶质细胞、内皮细胞的细胞毒性 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 牛黄及其有效成分对脑神经血管单元的保护作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 不同配伍组分对脑神经血管单元的保护作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验五 牛磺酸和熊去氧胆酸对神经血管单元的作用机制 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验六 牛磺酸和牛磺熊去氧胆酸对脑神经血管单元的作用机制 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 Dvl3在RA患者以及小鼠CIA模型关节滑膜中的表达情况 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 外泌体Dvl3 mRNA对RA-FLS增殖、凋亡、迁移以及炎症因子分泌的影响 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 外泌体Dvl3 mRNA对胶原诱导关节炎小鼠模型关节炎症的影响 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 外泌体Dvl3 mRNA通过调控Wnt途径参与影响RA-FLS生物学行为 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 复杂Wnt信号通路网络中的舞者：Dvl蛋白 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表和参与科研工作情况 |
| 致谢 |
（8）AKT/mTOR/STAT3信号通路在稽留流产中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 稽留流产概述 |
| 1.2 滋养细胞侵袭能力在胚胎发育中的作用 |
| 1.3 MMPs和 TIMPs在胚胎发育中的作用 |
| 1.4 AKT/m TOR信号通路 |
| 1.5 STAT3 信号通路 |
| 1.6 MMPs和 TIMPs与 AKT/m TOR/STAT3 信号通路的关系 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验设计 |
| 2.1.1 研究对象和分组 |
| 2.1.2 技术路线图 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.2.2 主要溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 绒毛组织HE染色病理切片制备 |
| 2.3.2 qRT-PCR检测步骤 |
| 2.3.3 Wes~(TM)全自动蛋白质表达定量分析系统检测步骤 |
| 2.3.4 免疫组化染色方法 |
| 2.4 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 一般临床资料分析 |
| 3.2 绒毛组织病理形态观察 |
| 3.3 绒毛组织AKT/m TOR信号通路相关因子的基因和蛋白表达水平 |
| 3.3.1 相关基因m RNA表达水平 |
| 3.3.2 相关蛋白表达水平 |
| 3.4 绒毛组织STAT3 信号通路相关因子的基因和蛋白表达水平 |
| 3.4.1 相关基因m RNA表达水平 |
| 3.4.2 相关蛋白表达水平 |
| 3.5 两组胚胎组织中p-STAT3 蛋白的表达定位 |
| 3.5.1 绒毛组织中表达定位 |
| 3.5.2 蜕膜组织中表达定位 |
| 3.6 绒毛组织MMPs、TIMPs基因和蛋白表达水平 |
| 3.6.1 基因m RNA表达水平 |
| 3.6.2 蛋白表达水平 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 绒毛组织结构病理形态改变分析 |
| 4.2 AKT/m TOR信号通路与稽留流产的关系 |
| 4.3 STAT3 信号通路与稽留流产的关系 |
| 4.4 基质金属蛋白酶及其抑制剂与稽留流产的关系 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 研究不足与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）Hc-nas-33参与捻转血矛线虫蜕皮过程的功能及其分子机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫病简介 |
| 1 捻转血矛线虫形态与生活史 |
| 2 临床症状 |
| 3 诊断 |
| 4 药物治疗与耐药性 |
| 5 疫苗 |
| 第二章 线虫蜕皮研究进展 |
| 1 蜕皮的生物学意义 |
| 2 线虫表皮层结构特征 |
| 3 表皮、上皮及肌肉之间的连接 |
| 4 线虫蜕皮过程 |
| 5 线虫蜕皮机制研究进展 |
| 第三章 线虫虾红素样蛋白 |
| 1 虾红素蛋白 |
| 2 线虫虾红素样蛋白 |
| 3 寄生性线虫虾红素样蛋白研究进展 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第四章 捻转血矛线虫HcNASs基因特性分析、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 捻转血矛线虫HcNASs基因的获得与结构分析 |
| 2.2 捻转血矛线虫HcNASs蛋白功能预测及进化关系分析 |
| 2.3 HcNASs基因全长CDS扩增 |
| 2.4 原核蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.5 多克隆抗体特异性检测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 HcNASs表达特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HcNASs在HEK 293T细胞中的表达特性 |
| 2.2 启动子活性分析 |
| 2.3 HcNASs在秀丽隐杆线虫中的表达模式 |
| 2.4 过表达HcNASs对秀丽隐杆线虫的影响 |
| 2.5 L3幼虫间接免疫荧光定位 |
| 2.6 L4及成虫IHF分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 Hc-nas-33在捻转血矛线虫蜕皮发育过程中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-nas-33基因各时期转录情况qRT-PCR检测 |
| 2.2 Hc-nas-33基因在捻转血矛线虫蜕皮过程中的转录水平检测 |
| 2.3 秀丽隐杆线虫同源基因在蜕皮过程中发挥功能的比较研究 |
| 2.4 RNA干扰实验 |
| 3 讨论 |
| 第七章 捻转血矛线虫酵母cDNA文库构建及Hc-nas-33互作蛋白的筛选鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 捻转血矛线虫cDNA文库的建立 |
| 2.2 诱饵质粒构建 |
| 2.3 诱饵质粒毒性与自激活检测 |
| 2.4 Hc-GBP-1与Hc-NAS-33相互作用验证 |
| 3 讨论 |
| 第八章 Hc-NAS-33与Hc-GPB-1参与蜕皮过程的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pCe-gpb-1启动子活性分析 |
| 2.2 Hc-NAS-33与Hc-GPB-1在秀丽隐杆线虫中的共定位分析 |
| 2.3 Hc-nas-33与Hc-gpb-1干扰后对捻转血矛线虫的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 附录Ⅰ 常用溶液配制 |
| 附录Ⅱ 实验涉及引物序列 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（10）基于mTOR信号通路探究肠道菌群代谢产物丁酸钠对骨关节炎的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 丁酸钠对小鼠软骨细胞自噬的影响及作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 丁酸钠通过激活软骨细胞自噬缓解IL-1β诱导的软骨细胞损伤 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 丁酸钠缓解骨关节炎软骨及软骨下骨异常病理改变的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 mTOR信号通路在骨关节炎病理机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、Structure, expression, and developmental function of early divergent forms of metalloproteinases in Hydra（论文参考文献）
- [1]GnRH1对鸡卵泡中MMP11/13及血管发育相关基因表达的影响及MMP11的转录调控[D]. 陈秀萍. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]粘体动物系统发育地位与内寄生适应机制研究[D]. 郭庆祥. 华中农业大学, 2021
- [3]KLF2通过TGF-β信号抑制肝癌细胞运动[D]. 李伊宁. 南昌大学, 2021(01)
- [4]海月水母水螅体60Co-γ射线照射模型构建及相关基因的筛选[D]. 陈新彤. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [5]miR-146b巨球蛋白α2M信号轴在骨关炎病理过程的作用及机制研究[D]. 柳鑫. 南方医科大学, 2021(02)
- [6]牛黄及其有效成分对神经血管单元的保护作用研究[D]. 杜欣. 北京中医药大学, 2021(02)
- [7]外泌体Dvl3 mRNA调节Wnt通路对关节滑膜增殖、炎症的作用及其机制[D]. 谭卫星. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [8]AKT/mTOR/STAT3信号通路在稽留流产中的作用及机制研究[D]. 白清丽. 兰州大学, 2021(09)
- [9]Hc-nas-33参与捻转血矛线虫蜕皮过程的功能及其分子机制初步研究[D]. 黄艳. 浙江大学, 2021
- [10]基于mTOR信号通路探究肠道菌群代谢产物丁酸钠对骨关节炎的作用及机制[D]. 周海康. 新疆医科大学, 2021(08)