一、THE CORRELATION BETWEEN THE EXPRESSION OF MULTIDRUG RESISTANCE RELATED GENE AND CELL APOPTOSIS AND CLINICAL SIGNIFICANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER（论文文献综述）
方世旭[1]（2021）在《PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究》文中研究说明目的:通过生物信息学及细胞实验验证PAQR3在非小细胞肺癌顺铂敏感株及顺铂耐药株的表达差异。通过实验探索PAQR3对非小细胞肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞增殖,迁移,凋亡及顺铂耐药的影响,并初步探讨该影响机制是否与Ras/Raf/MEK/ERK信号通路有关。方法:1.在GEO数据库中搜索基因芯片,筛选A549细胞及A549/DDP细胞中的差异表达基因,并选出存在差异表达的基因PAQR3进行研究。2.在Kaplan-Meier Plotter数据库中检索PAQR3在肺癌中的表达水平与患者预后的相关性。3.通过蛋白印迹（Western Blot,WB）及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-q PCR）检测A549及A549/DDP细胞中PAQR3的表达水平。其次,用带有PAQR3高表达及低表达的慢病毒转染A549/DDP细胞,构建A549/DDP细胞的PAQR3高表达稳定转染细胞株（oe-PAQR3）、高表达对照组（oe-NC）、低表达稳定转染细胞株（Si-PAQR3）、低表达对照组（Si-PAQR3）。与A549/DDP细胞对比,MTT实验检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,克隆形成实验检测单个细胞的增殖能力,MTT实验检测细胞的顺铂耐药,流式细胞检测术检测细胞的周期及凋亡情况。4.WB实验检测Ras/Raf/MEK/ERK信号级联中相关信号蛋白改变情况,探索该信号通路在PAQR3逆转顺铂耐药所发挥的作用,检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3。同时,检测MDR1、MRP1、γ-H2A.X及LRP1等DNA损伤修复相关蛋白的表达水平。结果:1.在GEO数据库中筛选得到A549及A549/DDP差异表达的芯片数据集（GSE108214）,通过GEO2R在线分析软件,与A549细胞对比,PAQR3基因在A549/DDP中呈低表达（Log FC=-0.955）,差异有统计学意义（P<0.001）。2.在Kaplan-Meier Plotter数据库中,检测到965例患者为PAQR3低表达患者,960例患者为PAQR3高表达患者,生存预后的值分别为:总生存期（Overall Survival,OS）的危险比（Hazard Ratio,HR）为0.87,95%置信区间（Confidence Interval,CI）为0.76-0.98,P<0.05;首次疾病进展期（First Progression,FP）的HR为0.81,95%CI:0.67-0.98,P<0.05,后进展生存期（Post Progression Survival,PPS）的HR为0.85,95%CI:0.66-1.1,P=0.22。提示低表达PAQR3与不良的癌症预后显着相关。3.WB及RT-qPCR结果显示,与A549细胞相比,PAQR3在A549/DDP细胞的表达量显着下调（P<0.05）。4.细胞功能实验结果显示,高表达PAQR3可抑制A549/DDP细胞的增殖、迁移和克隆形成,促进A549/DDP细胞凋亡,阻滞细胞从G1期向S期转变。相反,低表达PAQR3可促进A549/DDP细胞增殖、迁移和克隆形成,阻止细胞凋亡,促进细胞由G1向S期转变。5.MTT实验结果显示,A549细胞顺铂药物半数抑制浓度（50%of Inhibiting Concentration,IC50）为6.314μg/m L,A549/DDP细胞的IC50为21.49μg/m L,耐药指数为3.403。与A549/DDP细胞相比,构建了过表达的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性显着增加,oe-NC的IC50为21.84μg/m L,oe-PAQR3组的IC50为5.257μg/m L,耐药指数为4.1544,差距有统计学意义。与Si-NC组相比,Si-PAQR3组的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性下降,Si-NC的IC50为23.5μg/m L,Si-PAQR3组的IC50为47.56μg/m L,耐药指数为0.4941,差异有统计学意义（P<0.01）。6.WB实验结果显示,高表达PAQR3可下调b-Raf、P-b-Raf、P-MEK1/2、P-ERK1/2的表达,抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路而提高A549/DDP细胞对顺铂敏感性,低表达的PAQR3可上调b-Raf、P-b-Raf、P-MEK1/2、P-ERK1/2的表达,激活Ras/Raf/MEK/ERK信号通路,降低A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。同时,高表达PAQR3可上调Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达,下调Bcl-2的表达,促进细胞凋亡达到逆转顺铂耐药的效果。低表达PAQR3可下调Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达,上调Bcl-2的表达,使细胞凋亡受阻,增强细胞对顺铂的耐药性。高表达PAQR3可上调MDR1、MRP1、γ-H2A.X,提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,低表达PAQR3可下调MDR1、MRP1,降低A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。结论:1.与A549细胞相比,PAQR3在A549/DDP细胞显着低表达,PAQR3高表达可增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,低表达的PAQR3可增加A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。2.PAQR3可能通过阻滞Ras/Raf/MEK/ERK通路及下调MDR1,MRP1,γ-H2A.X蛋白等逆转A549/DDP对顺铂的耐药。可能通过激活Bax/Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3信号通路阻止A549/DDP细胞的增殖,迁移及克隆形成,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡。
张志莹[2]（2021）在《西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:肺癌是临床常见的恶性肿瘤,在世界范围内,发病率在恶性肿瘤中居第二位,死亡率居第一位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要类型,发展新的治疗手段和方法,一直是NSCLC临床需要解决的一大难题。NSCLC的中医研究也在不断发展,西黄丸作为具有确切临床疗效的经典抗癌中药名方,对NSCLC的治疗也发挥了作用。既往的基础研究发现西黄丸可通过诱导肿瘤细胞凋亡、逆转上皮间质转化、调节免疫微环境等多种作用机制发挥抗肿瘤作用,但研究多围绕乳腺癌、胃癌,对于治疗肺癌的机制,仅涉及有效率、体内实验抑瘤率等,较为局限,因此,西黄丸治疗NSCLC的研究还存在较大空间,值得进一步深入。研究目的:本研究结合系统综述、网络药理学、体外实验、体内实验、转录组学等多种方法,研究西黄丸治疗NSCLC的相关机制,为西黄丸在临床治疗NSCLC提供更多的数据支持和科学依据。研究方法:1.首先通过系统综述和meta分析,评价西黄丸在临床随机对照试验中治疗NSCLC的效果,评价指标包括:近期客观有效率、临床症状改善、生活质量、不良反应等。2.通过网络药理学,对西黄丸抗NSCLC的活性成分和主要作用靶点进行预测。首先通过中药数据库BATMAN-TCM检索西黄丸中所有的活性成分及对应靶点,然后通过疾病数据库DisGeNET、GeneCards、OMIM检索NSCLC相关基因,将西黄丸的作用靶点和NSCLC疾病靶点两个数据集进行映射,筛选重复靶点,构建“西黄丸-NSCLC-靶点”数据集。将数据集导入String数据库进行蛋白质蛋白质互作网络,将获得的网络导入Cytoscape3.8.0软件中进行拓扑参数分析,获得“西黄丸-NSCLC-靶点”的核心作用靶点。然后使用Metascape工具对核心靶点进行生物功能注释,分析西黄丸抗NSCLC的主要信号通路和生物过程等。3.通过细胞实验和动物实验,进行西黄丸抗NSCLC的药效学验证。在细胞实验中,通过CCK-8实验、流式细胞术、Transwell实验检测西黄丸对小鼠Lewis肺癌细胞株LL/2增殖、凋亡、细胞周期、迁移能力和侵袭能力的影响。在动物实验中,以C57/BL6小鼠Lewis肺癌皮下瘤为模型,将小鼠分为对照组、西黄丸低剂量组（0.617g/kg,每日灌胃两次）、西黄丸中剂量组（1.233g/kg,每日灌胃两次）、西黄丸高剂量组（2.466g/kg,每日灌胃两次）、顺铂组（3 mg/kg,每周腹腔注射一次）,并另设无瘤的空白组。药物干预15天,观察小鼠的一般状态、皮下移植瘤体积及重量、体重及内脏系数,并通过HE染色观察肿瘤和肝脏的组织病理变化和皮下瘤的肺转移,通过Ki-67免疫组化染色观察对肿瘤增殖的影响,并通过流式细胞数检测小鼠脾脏淋巴细胞的 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和 CD3+CD4+/CD3+CD8+免疫分型。4.通过转录组学方法,对西黄丸高剂量组和对照组的肿瘤组织进行RNA测序,进行mRNA差异分析和基因功能注释,分析西黄丸抗小鼠Lewis肺癌的主要信号通路和生物过程等。5.通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）,对网络药理学和转录组学筛选出的目标分子变化进行检测,包括热休克蛋白（heatshockprotein,HSP）家族、雌激素受体（estrogenreceptor,ER）、维甲酸X受体（Retinoid X receptor,RXR）、过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator activated receptor,PPAR）等。研究结果:1.Meta分析结果显示,西黄丸辅助治疗NSCLC能够提高近期客观有效率,改善患者的临床症状,提高患者的生活质量。但在改善肝肾功能异常、改善消化道症状和血液系统抑制方面,西黄丸辅助治疗并未有明显获益。2.网络药理学分析显示,西黄丸共检索到74个靶点可预测的活性成分,“西黄丸-NSCLC-靶点”的核心作用靶点共230个,包括HSP90AA1、HSP90AB1、HSPA1A、ESR1、ESR2、RXRA、RXRB、RXRG、PPARG、PPARA 等。西黄丸抗 NSCLC 的相关KEGG通路有癌症通路、PI3K-Akt信号通路、内分泌抵抗、foxo信号通路、雌激素信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、HIF-1信号通路、T细胞受体信号通路、催乳素信号通路、Ras信号通路、黏着斑和非小细胞肺癌等。GO富集分析显示,西黄丸抗NSCLC涉及的主要生物过程有细胞对有机环状化合物的反应、细胞对激素刺激的反应、细胞对脂质的反应、凋亡信号通路、对类固醇激素的反应、细胞迁移的正调控、细胞死亡的正调控、细胞运动的正调控等。3.药效学实验显示,西黄丸含药血清在体外对Lewis肺癌细胞株LL/2并无显着的增殖抑制作用,西黄丸浸提液对LL/2有浓度依赖的抑制作用,作用24 h时,西黄丸浸提液对LL/2细胞的IC50为1.830 mg/mL。流式结果显示,作用24 h时,西黄丸浸提液对LL/2细胞有明显的促凋亡作用,能够促进LL/2细胞株向G2/M期转化。Transwell实验结果显示,作用24h时,西黄丸浸提液能够降低LL/2细胞株的迁移能力和侵袭能力,且这种作用呈浓度依赖性。在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型中,西黄丸对皮下肿瘤的生长抑制作用具有浓度依赖性,其中西黄丸高剂量组能够抑制小鼠皮下瘤的生长,其剂量为临床等效剂量的2倍。肿瘤的病理结果显示,西黄丸高剂量组和顺铂组有大片的细胞坏死区。Ki-67免疫组化染色结果显示,西黄丸和顺铂均能降低Ki-67阳性肿瘤细胞的个数,西黄丸的这种作用与浓度关系不大。肝脏的病理结果显示,各组的肝组织均为正常的肝实质,无明显异常。脾细胞流式分型结果显示,各组小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD4+/CD3+CD8+未见显着统计学差异。4.对西黄丸高剂量组和对照组的皮下瘤进行转录组学测序,结果筛选出406个差异基因,其中130个基因表达上调,276个基因表达下调,差异基因包括:Hspb7、Hspb1、Hspb6等。对差异基因进行KEGG通路富集分析,结果显示,显着性改变明显的信号通路有:肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF）信号通路、雌激素信号通路、胰岛素分泌、环鸟苷酸依赖性蛋白激酶（cyclic guanosine monophosphate-dependent protein kinase,cGMP-PKG）信号通路、脂肪细胞中的脂肪分解调节、脂肪细胞因子信号通路、催产素信号通路、过氧化物酶体增殖激活受体信号通路等。5.PCR和WB结果显示,西黄丸能够降低小鼠Lewis肺癌肿瘤组织中Hspb6、Hspb7、Hspb1、Hspb2、Hspa1a、Hspa8、Hsph1 和的 mRNA 表达水平,且能够降低 HSPB7、HSP27、HSP70、HSPH1蛋白的表达水平,升高HSC70的蛋白质表达水平,而不影响HSP20、HSP90的蛋白质水平。西黄丸能够降低小鼠Lewis肺癌肿瘤组织中Esr1、Rxra、Krt19、Ppara、Ppard和Pparg的mRNA表达水平,并降低ER、RXRα蛋白的表达,升高PPARδ和PPARγ的蛋白表达,对KRT19和PPARα的表达水平无明显影响。研究结论:1.西黄丸辅助治疗NSCLC能够提高近期客观有效率,改善患者的临床症状,提高患者的生存质量。2.网络药理学实验和转录组学实验显示,西黄丸通过多靶点、多通路作用于NSCLC,核心作用靶点包括HSP家族、ER等。3.西黄丸在体外实验和体内实验中,均表现出抗小鼠Lewis肺癌的作用,在体内实验中无明显毒性,其有效剂量为临床等效剂量的2倍。其抗小鼠Lewis肺癌的机制可能与降低HSP27、HSP70、HSPH1、ER的mRNA和蛋白质表达水平,升高PPARγ的蛋白质表达水平相关。
蔡晓燕[3]（2021）在《MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性研究》文中指出背景肺腺癌是多发于支气管黏膜上皮或大支气管黏液腺的恶性肿瘤。肺腺癌易发于年龄偏小、无吸烟史的女性中,且临床症状不明显。肺腺癌虽然肿瘤组织生长缓慢,但多在早期就出现多发转移,因此化疗是目前临床治疗肺腺癌的主要方法之一,但大约三分之一的肺腺癌患者化疗后会产生多药耐药,导致化疗失败。多药耐药是肿瘤细胞对多种化疗药物产生的交叉耐药现象。当今国内外多项研究表明,多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）、结肠癌转移相关基因1（MACC1）与肺腺癌的多药耐药相关。顺铂是临床化学治疗肺腺癌的基本药物,肺腺癌患者对顺铂及顺铂类药物表现出的耐药性,是临床化疗肺腺癌疗效较差的直接原因,因此研发更有效的新型化疗药物已迫在眉睫。目的1.考察肺腺癌组织细胞对顺铂的耐药性。2.探究MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性,为临床采用更为高效的顺铂化疗方案治疗肺腺癌提供实验室参考。方法1.取材及分组:收集手术切除的肺腺癌新鲜标本75例,所有患者进行手术前均未进行放化疗。每份标本均分为2份:1份进行原代细胞的体外培养,以噻唑蓝比色法（MTT法）检测肺腺癌细胞对含顺铂的药敏试验;1份标本处理后以免疫组化法检测腺癌组织细胞中MACC1、MRP、LRP的表达。2.药敏实验:采用MTT法检测肺腺癌细胞对顺铂的总体耐药性,考察不同分化程度、不同TNM分期肺腺癌细胞对顺铂的耐药性。3.MACC1表达与肺腺癌顺铂耐药之间的相关性:采用免疫组织化学实验考察肺腺癌组织细胞MACC1蛋白表达的情况,分析其表达情况与顺铂耐药之间的相关性。4.MRP表达与肺腺癌顺铂耐药之间的相关性:采用免疫组织化学实验考察肺腺癌组织细胞MRP蛋白表达的情况,分析其表达情况与顺铂耐药之间的相关性。5.LRP表达与肺腺癌顺铂耐药之间的相关性:采用免疫组织化学实验考察肺腺癌组织细胞LRP蛋白表达的情况,分析其表达情况与顺铂耐药之间的相关性。6.统计学方法:所有实验数据均带入SPSS17.0统计学软件系统处理。采用t检验进行组间比较,方差分析考察分化程度、TNM分期与肺腺癌对顺铂耐药的相关性,Spearman相关分析考察MACC1、MRP、LRP与肺腺癌对顺铂耐药性的相关性。检验水准α=0.05。结果1.在选取的75例肺腺癌组织中,采用MTT法检测肺腺癌细胞顺铂的耐药性可知:32例（42.67%）对8.0μg.ml-1的顺铂耐药,33例（44.00%）对6.0μg.ml-1的顺铂耐药,31例（41.33%）对4.0μg.ml-1的顺铂耐药,23例（30.67%）对2.0μg.ml-1的顺铂耐药,且对4.0μg.ml-1顺铂的耐药程度高于对2.0μg.ml-1顺铂的耐药程度（P<0.05）,对4.0μg.ml-1和6.0μg.ml-1顺铂的耐药性程度无差异,对6.0μg.ml-1和8.0μg.ml-1顺铂的耐药性程度无差异。肺腺癌细胞对顺铂的耐药性与分化程度和TNM分期无关（P>0.05）。2.MACC1在75例肺腺癌组织中的表达情况为16例（21.33%）-、21例（28.00%）+、27例（36.00%）++、11例（14.67）+++,MACC1的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关（P<0.05）。3.MRP在75例肺腺癌组织中的表达情况为11例（14.66%）-、23例（30.67%）+、32例（42.67%）++、9例（12.00%）+++,MRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关（P<0.05）。4.LRP在75例肺腺癌组织中的表达情况为0例（0.00%）-、25例（33.33%）+、31例（41.33%）++、19例（25.34%）+++,LRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关（P<0.05）。结论1.肺腺癌存在对顺铂的化疗耐药性。2.MACC1的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关,参与介导肺腺癌对顺铂的耐药。3.MRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关,参与介导肺腺癌对顺铂的耐药。4.LRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关,参与介导肺腺癌对顺铂的耐药。
余世龙[4]（2020）在《锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景肺癌目前仍然是位居全球肿瘤发病率和死亡率首位的恶性肿瘤。组织类型上肺癌分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）,其中,NSCLC占肺癌总类型的80-85%,肺腺癌是NSCLC的主要病理类型。近年来尽管以EGFR-TKIs为代表的靶向治疗和以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗将具有相应驱动基因的晚期NSCLC患者生存期提高到了25-30月,远远超越了传统化疗的8-10月,但因获益人群的局限性,以铂类抗癌药物为主的联合化疗仍然是大部分NSCLC患者首选的一线治疗方案,特别是不适合分子靶向治疗或免疫治疗的NSCLC患者、分子靶向治疗或免疫治疗失败的NSCLC患者以及术后需要辅助化疗的I-IIIa期NSCLC患者。顺铂（DDP）是铂类药物中最常用的化疗药物。顺铂对早期肺癌的抑制作用显着,但在短期缓解之后,几乎对顺铂治疗有效的患者都会相继出现多药耐药、复发和进一步转移等恶性进展,导致化疗失败,成为提高临床肺癌治疗效果的一大瓶颈。三十多年来,研究者对肺癌的顺铂耐药进行了大量研究并获得了重要成果,但顺铂诱导的肿瘤耐药表现出极其复杂的多因素性,其中一个严峻的现实是,针对目前已知的顺铂耐药机制研发的小分子药物并没有达到预期的临床抑癌效果。因此,进一步深入挖掘顺铂诱发的肺癌耐药机制是当前亟待解决的重要课题。为了进一步探讨NSCLC获得性耐药机制,本研究在前期成功建立人NSCLC耐药细胞A549/DDP的基础上开展相关研究,具体研究内容如下:1)NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定;2)耐药相关基因的筛选和鉴定;3)ZNF300与NSCLC恶性进展;4)ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制;5)淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制。本研究将为寻找肿瘤耐药新靶点,逆转NSCLC耐药提供理论和实验依据。方法1)DDP处理A549和A549/DDP细胞后,采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位（MMP）,ATP试剂盒测定细胞内ATP含量以及DCFH-DA探针标记法检测细胞内氧自由基（ROS）,以比较DDP对两种细胞线粒体功能的影响,并用流式细胞术检测DDP诱导的细胞凋亡。采用CCK8药敏实验检测五种化疗药物对两组细胞的IC50值,鉴定NSCLC耐药细胞的多药耐药性。2)以差异倍数|FC|≥3为标准筛选基因表达谱芯片（A549/DDP vs.A549）中差异表达基因,并把该数据和DNA甲基化芯片数据进行整合,筛选候选基因,尔后采用RT-PCR验证潜在侯选基因表达情况。RT-PCR和WB进一步验证候选基因在五种肺癌细胞株及其耐药株中的表达水平。BSP法检测三株NSCLC细胞及其耐药株中ZNF300启动子甲基化水平,WB检测5-Azacitidine和Belinostat处理后各细胞中ZNF300水平。3)重组慢病毒过表达或沉默相应细胞中靶基因表达后,CCK-8试剂检测五种化疗药物对各种细胞IC50。流式细胞术检测不同浓度DDP诱导下各组细胞的凋亡情况。建立免疫缺陷鼠移植瘤模型,体内验证靶基因对NSCLC肿瘤细胞耐药性的影响。4)Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力,划痕愈合试验检测各组细胞迁移能力,失巢凋亡实验评估各组细胞集落形成能力和抗失巢凋亡能力,Ed U染色检测各组细胞增殖率,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期,鬼笔环肽染色激光共聚焦观察细胞骨架形态。从Oncomine、Betastasis和Biogps等生物信息数据平台下载靶基因表达数据,分析靶基因与NSCLC临床特征之间的相关性。免疫组化法检测靶基因在肺癌标本中的表达水平,并分析其临床特点相关性。5)GO、KEGG和GSEA确定表达谱芯片中与耐药细胞表型改变相关的信号通路（A549-ZNF300 vs.A549-ZNF300-NC）,WB验证相关通路核心蛋白表达。使用通路抑制剂和激动剂体外验证靶基因调控NSCLC耐药和恶性进展的分子机制。6)ICA、ATRA和DDP处理时,高内涵系统动态观察共培养细胞。WB检测药物处理后各组细胞的CD235a和CD61表达水平,SA-β-GAL染色检测药物处理后各组细胞衰老情况。RT-PCR检测DDP对衰老基因和SASP相关基因表达影响。结果1)DDP处理后,A549/DDP细胞MMP改变、ROS水平显着低于A549细胞（p<0.05）,而ATP含量显着高于A549细胞（p<0.05）。DDP诱导A549/DDP细胞的凋亡显着低于A549细胞（p<0.05）。顺铂、吉西他滨、紫杉醇、多西他赛、培美曲塞对A549/DDP细胞的IC50显着高于A549细胞（p<0.05）。2)A549/DDP和A549细胞的表达谱芯片数据和甲基化数据整合后,初步筛选出140个候选基因,其中包括77个启动子低甲基化上调表达基因和63个启动子高甲基化下调表达基因。RT-PCR结果显示,15个启动子低甲基化基因的表达上调,25个启动子高甲基化基因的表达下调。候选基因ZNF300在A549/DDP、H520/DDP和H1650/DDP细胞中的水平显着高于相应亲代细胞。5-Azacitidine处理后ZNF300在上述三种耐药细胞的亲代细胞中表达显着性升高。3)成功建立ZNF300过表达细胞（A549-ZNF300）和低表达细胞（A549/DDP-sh ZNF300）。五种化疗药物对ZNF300高表达细胞的IC50显着高于ZNF300低表达细胞（p<0.05）。顺铂诱导ZNF300高表达细胞的凋亡显着性低于ZNF300低表达细胞（p<0.01）。DDP处理后,ZNF300低表达细胞形成的皮下移植瘤比ZNF300高表达细胞的重量和体积显着缩小,证明ZNF300促进NSCLC肿瘤细胞耐药形成。4)体外实验表明,耐药细胞的侵袭、迁移、集落形成和抗失巢凋亡能力均显着强于药敏细胞（p<0.05）,耐药细胞的细胞增殖率显着低于药敏细胞（p<0.05）。相比药敏细胞,耐药细胞出现细胞周期阻滞（p<0.05）,且具有更明显的细胞伪足。生物学信息分析结果表明,ZNF300与NSCLC恶性进展有关。免疫组化结果提示,ZNF300高表达与NSCLC患者病理分级、临床分期、术前淋巴结转移、区域性转移和复发呈正相关,与患者OS呈负相关。5)与A549-ZNF300-NC细胞相比,A549-ZNF300细胞中大部分与生长分化因子和MAPK/ERK通路相关的基因（CD61,CD235a,p-ERK1/2,p-p38 MAPK）表达下调,而大部分与细胞周期和癌症干性相关的基因（PCNA,p15,Nanog,Oct-4）表达上调。AZD6244处理ZNF300低表达细胞后,p-ERK1/2、p-p38 MAPK和CD61下降,而p15和Nanog增加,细胞迁移、侵袭、抗凋亡和顺铂耐受性显着增强,细胞增殖减弱。而Hesperetin对ZNF300高表达细胞的作用相反。6)与药敏细胞相比,ICA和ATRA能上调耐药细胞中CD235a和CD61水平。细胞共培养发现,耐药细胞对顺铂联合ATRA或ICA的反应比药敏细胞更明显。ICA和ATRA作用下,耐药细胞被药敏细胞吞噬的比例显着高于药敏细胞被耐药细胞吞噬的比例。DDP、ICA和ATRA药物处理后,耐药细胞中SA-β-GAL阳染率明显高于药敏细胞,并且,耐药细胞中衰老相关基因和SASP相关基因的表达显着性高于药敏细胞。结论1)ZNF300是NSCLC耐药相关基因。2)ZNF300可促进肿瘤细胞恶性生长,其高表达预示NSCLC患者预后不良。3)ZNF300通过抑制MAPK/ERK信号通路调控耐药细胞缓慢周期表型和细胞分化。4)ZNF300通过抑制WEE1/MYT1和调控MYC/AURKA/BORA/PLK1信号轴激活CDK1从而调节耐药细胞的细胞周期。5)ICA和ATRA通过诱导细胞分化提高DDP对耐药细胞抑癌作用。
赵晓龙[5]（2020）在《外泌体在非小细胞肺癌铂类耐药中的作用和机制研究》文中研究表明研究背景目前,非小细胞肺癌铂类耐药仍然是造成大部分非小细胞肺癌患者疗效差的的主要原因,然而非小细胞肺癌铂类耐药的具体机制尚未完全明了。铂类耐药是由多种因素造成的,其中外泌体和免疫调控介导的耐药可能发挥重要作用。首先,外泌体是细胞分泌的携带生物活性物质的纳米级囊泡,根据前期研究基础,我们提出外泌体可能通过其携带的碱基切除修复关键基因APE1或某些micro RNA传递耐药性。其次,位于肿瘤细胞上的免疫检查点关键分子程序性细胞死亡受体配体1（PD-L1）和程序性细胞死亡受体（PD-1）结合可以抑制免疫反应,而机体的免疫状态与化疗疗效密切相关,由此我们推测,PD-L1单核苷酸多态性也可能对铂类化疗疗效产生影响。本研究将从以上两个层面对非小细胞肺癌铂类耐药机制进行探索研究,为综合评估非小细胞肺癌患者铂类化疗的有效性,采取相应措施改善治疗效果和预后提供理论依据。研究方法1.采用高速离心和外泌体提取试剂盒收集外泌体。用PKH26对外泌体染色后,激光共聚焦观察其进入细胞内的情况。将带GST标签的APE1纯化蛋白（GST-APE1）与A549细胞共同孵育后,观察细胞内GST-APE1的定位情况。采用CCK-8实验和流式细胞术检测不同处理组细胞在不同浓度顺铂下的存活能力和凋亡率。采用Transwell实验评估细胞侵袭和迁移能力。采用APE1的功能抑制剂处理与不同分组外泌体共同孵育后的A549细胞,观察处理后A549细胞在顺铂中的存活率以及-H2AX蛋白变化情况。选取接受铂类化疗方案治疗的NSCLC患者共136例,对血浆外泌体进行提取和鉴定。采用Western blot和ELISA法检测血浆外泌体APE1表达,采用免疫组化检测组织APE1表达。根据实体肿瘤疗效评价标准,分为铂类化疗应答组（CR+PR）和铂类化疗无应答组（SD+PD）,观察APE1表达水平与患者治疗敏感性的关系。2.采用micro RNA芯片检测顺铂（CDDP）处理后外泌体micro RNA的变化情况。采用mi R-1273a mimic、inhibitor或阴性对照转染A549细胞以构建不同mi R-1273a表达水平的细胞。用CCK-8实验和流式细胞术凋亡分析检测不同表达水平的mi R-1273a对细胞在顺铂中存活能力和凋亡率的影响。将A549细胞与高表达mi R-1273a的外泌体共同孵育,研究高表达mi R-1273a外泌体对细胞在顺铂中存活能力的影响。通过生物信息学方法预测mi R-1273a的靶基因,并用Western blot和q PCR进行验证。选择行铂类化疗方案的非小细胞肺癌患者共85例（其中36例用于国际合作研究）,用于临床疗效评价。RT-q PCR用于检测血浆外泌体micro RNA水平;ELSIA用于检测血浆SDCBP或APE1水平。3.收集281例行铂类化疗方案治疗的非小细胞肺癌患者的血液样本,并提取DNA。251名同期接受健康体检的志愿者作为对照组。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术进行基因型分型。用卡方检验比较不同分组个体的基因型分布情况。用Kaplan-Meier分析和Cox单因素和多因素生存分析评价不同基因型患者的预后情况。研究结果1.成功收集到NSCLC源性外泌体,PKH26染色后可观察到着色的外泌体进入受体细胞内。A549细胞与外泌体共同孵育后,细胞对顺铂的敏感性下降,凋亡率降低,同时细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有所增强。顺铂处理A549细胞后,细胞和外泌体内的APE1表达增高。与高表达APE1的外泌体共同孵育后,细胞对顺铂的敏感性下降,凋亡率降低,细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有所增强。APE1的碱基切除修复功能在外泌体APE1介导的细胞对顺铂敏感性变化中发挥主要作用。在临床样本中,外泌体中的APE1是外周血中APE1存在的主要方式。与健康对照者相比,非小细胞肺癌患者外泌体APE1高表达。对铂类化疗无应答组的患者血浆外泌体APE1的水平明显高于对铂类化疗应答组的患者。2.基因芯片结果显示,与对照组相比,共有276个mi RNAs在顺铂刺激下产生的外泌体(EXOCDDP)中变化>2倍,其中mi R-1273a在这些mi RNAs中的表达差异最为显着。过表达mi R-1273a增强了A549细胞对顺铂的敏感性,外泌体传递mi R-1273a同样可以增强受体细胞对顺铂的敏感性。SDCBP（Syndecan binding protein）可能是mi R-1273a发挥作用的靶点之一。对铂类化疗无应答组的患者血浆外泌体mi R-1273a的水平明显低于对铂类化疗应答组的患者。合作项目结果显示,敲低A549细胞APE1后,外泌体中61个mi RNAs发生显着性变化,其中mi R-130b和mi R-200c的变化可能与NSCLC铂类化疗的疗效有关。3.对9个常见位点的PD-L1 SNP进行检测后,发现PD-L1 rs7866740在非小细胞肺癌患者中G等位基因频率明显高于对照组G等位基因频率（P=0.001）。携带G等位基因的个体患NSCLC的风险显着高于携带C等位基因的个体（OR=3.532,95%CI=1.232-10.129）。Kaplan-Meier分析表明,PD-L1 rs2890658 CA+AA基因型的PFS和OS明显低于CC型（P<0.05）;PD-L1 rs822336 GC+CC的OS明显低于GG型（P<0.05）。Cox生存分析显示,携带PD-L1 rs2890658 CA+AA基因型的患者化疗疗效和预后较差（PFS:校正后HR=1.367,95%CI=1.0-1.8,P=0.038;OS:校正后HR=1.402,95%CI=1.0-1.9,P=0.026）。携带PD-L1 rs822336 GC+CC基因型的患者预后较差（校正后HR=1.393,95%CI=1.1-1.8,P=0.021）,但与疗效无显着相关性。研究结论1.铂类药物刺激下NSCLC外泌体APE1增高,高表达APE1的外泌体可以降低受体细胞对铂类药物的敏感性。2.APE1的碱基切除修复功能可能在外泌体APE1介导的铂类化疗耐药中发挥关键作用。3.非小细胞肺癌患者血浆外泌体APE1水平与非小细胞肺癌铂类化疗疗效相关。4.外泌体mi R-1273a的下降与受体细胞铂类敏感性下降有关。5.非小细胞肺癌患者血浆外泌体mi R-1273a水平与铂类化疗的疗效有关。6.APE1可能通过调控外泌体mi R-130b和mi R-200c水平促进NSCLC铂类耐药。7.PD-L1基因的rs7866740位点与NSCLC易感性有关。PD-L1基因的rs2890658和rs822336位点与NSCLC的预后有关。
程丽芳[6]（2020）在《GBP1通过PGK1激活EMT通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的功能和机制研究》文中研究说明研究背景肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤,虽然治疗方法多样,但其死亡率仍然居高不下。非小细胞肺癌是肺癌的主要病理类型。厄洛替尼是一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epithelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）,它作为一个晚期EGFR驱动基因阳性非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者一线治疗的首选药物,其使用明显提升此类患者的临床结局。但经历约10月的中位无进展生存期（progression-free survival,PFS）后,EGFR-TKI耐药不可避免成为临床常见的难题之一。至今,已提出MET扩增、ERBB2扩增、K-RAS突变或PTEN缺失等多种机制参与EGFR-TKI耐药,但仍有一些机制不明。因此,进一步探讨厄洛替尼耐药是需要解决的重要问题。本研究通过Gene expression omnibus（GEO）数据库预测了鸟苷酸结合蛋白1（guanylate binding proteinl,GBP1）可能是一个与厄洛替尼耐药相关的癌基因。通过单因素和多因素回归分析确认GBP1与NSCLC患者预后差相关。接着我们通过逐级增加厄洛替尼浓度增加而建立厄洛替尼耐药株,并使用这些细胞分析沉默或过表达GBP1和厄洛替尼耐药的关系,从而确认GBP1参与厄洛替尼耐药。为了探索GBP1在厄洛替尼耐药中具体作用机制,我们进行免疫共沉淀实验和免疫荧光共定位实验分析GBP1和磷酸甘油激酶1（phosphoglycerol kinase 1,PGK1）是否存在互作关系。最后,我们探索PGK1参与厄洛替尼耐药的下游信号通路,通过回复和免疫组化（IHC）实验证实GBP1通过PGK1激活上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药。研究目的1,体内、体外实验探讨GBP1是否参与非小细胞肺癌厄洛替尼耐药。2,探讨GBP1参与调控非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的分子机制。3,探讨GBP1表达与非小细胞肺癌患者生存、临床特征的关系。研究方法第一部分体外研究1 GBP1参与厄洛替尼耐药的实验1.1细胞毒性实验（CCK-8）比较EGFR-TKI耐药细胞和敏感细胞的半数抑菌浓度（IC50）。1.2荧光定量PCR实验（qRT-PCR）比较EGFR-TKI耐药细胞和敏感细胞GBP1基因的mRNA水平。1.3 Mann-Whitney检测GBP1的mRNA水平与厄洛替尼耐药的相关性。1.4 T790M位点突变检测试剂盒检测耐药细胞是否存在T790M位点突变。1.5利用单因素和多因素Cox回归分析非小细胞肺癌总生存时间和临床特征的关系。2体外研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药的实验2.1 CCK-8实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的IC50值。2.2蛋白质免疫印迹实验（WB）比较沉默或过表达GBP1与对照组间GBP1的蛋白表达2.3 qRT-PCR实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间GBP1的mRNA水平。2.4 免疫荧光试验探讨与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,PC9ER-shGBP1+erlotinib组GBP1、PCNA荧光值变化。2.5 CCK-8实验分析不同浓度厄洛替尼作用下,PC9ER-shGBP1+erlotinib组与PC9ER--NC+erlotinib 组间的 IC50值。2.6流式凋亡实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的晚期凋亡细胞占比。2.7WB实验检测与对照组比较,沉默或过表达GBP1组凋亡标志物Bax、Bcl-2和cleaved PARP1蛋白表达变化。2.8流式细胞周期实验比较沉默或过表达GBP1与对照组间的G1期占比。2.9 WB实验检测与对照组比较,沉默或过表达GBP1组细胞周期标志物P21、Cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达变化。第二部分体内研究1体内研究过表达GBP1实验1.1 裸鼠成瘤实验比较 PC9ER-NC+erlotinib 组和 PC9ER-shGBP1+erlotinib 组间的移植瘤大小、重量。1.2 裸鼠成瘤实验比较 PC9-NC+PBS 组、PC9-NC+erlotinib 组、PC9-GBP1+PBS组、PC9-GBP1+erlotinib组的移植瘤大小、重量。1.3 IHC实验检测小鼠肿块GBP 1、PCNA以及凋亡蛋白的表达。2体内研究过表达GBP1组GBP1的WB和qRT-PCR实验2.1 qRT-PCR 实验检测小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间GBP1的mRNA水平。2.2 WB 实验检测小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间 GBP 1蛋白表达变化。2.3 IHC实验检测小鼠肿块PC9-NC+erlotinib组与 PC9-GBP1+erlotinib组间 P21、Cyclin D1蛋白的蛋白表达变化。第三部分 机制探讨1 GBP1和PGK1互作的实验1.1 质谱分析预测GBP1可能互作的蛋白。1.2 免疫共沉淀实验分析GBP1和PGK1的互作关系。1.3 免疫荧光实验检测GBP1和PGK1共定位关系。1.4 WB实验分析GBP1和PGK1的蛋白调控关系。2 GBP1通过PGK1诱导的EMT通路参与厄洛替尼耐药的实验2.1 WB实验检测与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组、耐药细胞沉默GBP1同时过表达GBP1组EMT相关蛋白的表达变化。2.2 CCK-8实验检测耐药细胞沉默PGK1组与对照组间的IC50值。2.3 qRT-PCR实验检测耐药细胞与敏感细胞间E-cadherin的mRNA水平。2.4 CCK-8实验检测耐药细胞沉默E-cadherin组与对照组间的IC50值。2.5 WB实验分析PGK1和Twist的关系。2.6 IHC 实验分析了小鼠肿块 PC9-NC+erlotinib 组与 PC9-GBP1+erlotinib 组间的EMT相关蛋白的表达变化。第四部分 临床意义非小细胞肺癌中高表达GBP1与预后、临床数据的关系分析1 Kaplan-Meier生存分析GBP1和PGK1表达水平与总生存时间的关系。2 cBioportal数据库分析GBP1的mRNA水平与PGK1的mRNA水平的相关性。3 Oncomine数据分析非小细胞肺癌GBP1表达与临床数据的相关性。研究结果第一部分GBP1在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞中的表达及意义1 GBP1参与厄洛替尼耐药1.1与敏感细胞株相比,厄洛替尼在耐药细胞株PC9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975 的 IC50值升高。1.2 与敏感细胞株相比,PC9ER、PC9ER1、PC9ER2、HCC827ER、NCIH1650、NCIH1975中GBP1的mRNA水平升高。1.3 Mann-Whitney检验发现高表达的GBP1与厄洛替尼耐药性增强相关。1.4 PC9ER 及 HCC827ER 中未发现 T790M 突变。1.5单因素分析与多因素分析结果表明,与总生存时间相关的因素是治疗后肿瘤情况、GBP1表达水平。2体外研究表明GBP1调控厄洛替尼耐药2.1与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组GBP1蛋白表达减低。2.2与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组GBP1的mRNA水平减低。2.3与对照组相比,耐药细胞沉默GBP1组的IC50值减低。2.4 与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,GBP1、PCNA 在 PC9ER-shGBP1+erlotinib组有弱的荧光值。2.5在相同浓度的厄洛替尼作用下,与PC9ER-NC+erlotinib组比较,PC9ER-shGBP 1+erlotinib组的细胞存活率减低。2.6与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的晚期凋亡细胞占比增高。2.7与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1时Bcl-2和PCNA的蛋白表达减低,Bax和cleaved PARP1的蛋白表达增高。2.8与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的G1期占比增高。2.9与对照组比较,耐药细胞沉默GBP1组的P21蛋白表达增高,Cycilin D1、CDK4和CDK6的蛋白表达减低。以上结果表明GBP1在厄洛替尼耐药细胞高表达,且提升的GBP1通过促进凋亡,增加细胞G1期比例调控厄洛替尼耐药。第二部分体内研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药1过表达GBP1促进厄洛替尼耐药性1.1 与 PC9ER-NC+erlotinib 组比较,PC9ER-shGBP1+erlotinib 组的裸鼠移植瘤体积及重量均减少。1.2与PC9-NC+erlotinib组比较,PC9-GBP1+erlotinib组的裸鼠移植瘤体积及重量均减少。1.3 与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组的 GBP1、PCNA 和 Bcl-2蛋白表达升高,而cleaved PARP1蛋白表达减低。2过表达GBP1减少细胞周期G1期占比2.1 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 GBP1 的mRNA水平升高。2.2 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 GBP1 蛋白表达升高。2.3 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 P21 蛋白表达减低,Cyclin D1蛋白表达增高。以上结果表明在体内研究中,过表达GBP1增加厄洛替尼耐药性,减少细胞G1期比例。第三部分GBP1和PGK1互作促进厄洛替尼耐药1 GBP1和PGK1之间存在互作1.1质谱分析预测GBP1可能互作的蛋白有MYL9、ANXA2、ALDOA、PGK1等。1.2免疫共沉淀实验（CoIP）确认GBP1和PGK1的互作关系。1.3免疫荧光实验确认GBP1和PGK1的共定位关系。1.4 GBP1在蛋白水平调控PGK1蛋白表达。2 GBP1通过PGK1诱导的EMT通路参与厄洛替尼耐药2.1耐药细胞沉默GBP1同时过表达GBP1,能回复耐药细胞沉默GBP1对EMT相关蛋白的影响。2.2耐药细胞沉默PGK1组与对照组比较,IC50值减低。2.3耐药细胞与敏感细胞相比,E-cadherin的mRNA水平减低。2.4耐药细胞沉默E-cadherin组与对照组比较,IC50值增高。2.5 PGK1促进Twist蛋白表达。2.6 裸鼠肿块中与 PC9-NC+erlotinib 组比较,PC9-GBP1+erlotinib 组 PGK1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达增高,而E-cadherin蛋白表达减低。以上结果表明GBP1通过PGK1激活的EMT通路调控厄洛替尼耐药。第四部分GBP1表达与患者预后、病理分级的关系非小细胞肺癌中高表达GBP1与差的预后、高的肿瘤分级相关1高表达GBP1、PGK1的患者总生存时间和首次进展时间缩短。2 GBP1的mRNA水平与PGK1的mRNA水平呈正相关。3非小细胞肺癌患者的病理分级与GBP1表达呈显着正相关。以上结果表明GBP1的高表达提示非小细胞肺癌患者差的预后、高的病理分级。研究结论本研究发现在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞株中,GBP1无论蛋白表达还是mRNA水平均明显提高。而且GBP1水平提高使厄洛替尼敏感细胞在体内及体外获得对厄洛替尼的耐药性。同时上调的GBP1能减少凋亡相关蛋白的表达,并诱导细胞G1期向S期转换。GBP1和PGK1互作且通过EMT信号通路参与厄洛替尼耐药调控。利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库发现高表达GBP1提示总生存时间和首次进展时间缩短。总之,我们利用细胞株、动物模型和临床样本证明GBP1表达变化调控厄洛替尼耐药,提示在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药中靶向GBP1可能是一个潜在的治疗干预靶点。
孟子琦[7]（2020）在《基于整合生物信息学的复方苦参注射液治疗三种常见肿瘤作用机制研究》文中研究表明研究背景在世界范围内,肝癌、胰腺癌、肺癌高居恶性肿瘤发病率和死亡率的前列,严重威胁着人们的生命健康,也给家庭和社会带来了沉重的负担。中药注射剂在肿瘤治疗中具有独特的优势,广泛应用于临床。但由于中药具有多成分、多途径、多靶点、多功能的特点,导致药效物质基础不明确、作用机制不清楚,增加了研究的难度,严重影响了国际化的进程。复方苦参注射液具有清热利湿,凉血解毒,散结止痛的作用,临床上广泛用于恶性肿瘤的治疗,然而其作用机制尚未完全阐明。近年来伴随着生物信息学的迅猛发展,新理念、新思路不断涌现,网络药理学与生物信息学的结合成为提高中医药研究水平的重要路径。基于此,本研究运用整合生物信息学方法,分析探究复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的作用机制。研究目的通过生物信息学方法确认肝癌、胰腺癌中的关键基因。通过网络药理学方法预测、筛选复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的化学成分、作用靶点和信号通路并进行网络构建,从系统层面揭示复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的多成分、多靶点、多通路复杂机制。研究方法1.生物信息学分析在肝癌关键基因研究中,从GEO数据库下载基因芯片数据集,使用limma包进行差异表达分析,之后采用RobustRankAggreg包对数据集进行整合分析,筛选出共同被确认为差异表达的基因。通过STRING获取差异基因的蛋白互作信息,导入Cytoscape构建蛋白互作网络,并使用MCODE进行模块分析。通过DAVID进行GO和KEGG富集分析。利用KM plotter、GEPIA进行生存分析、表达水平分析和关联性分析。在胰腺癌关键基因研究中,从TCGA数据库下载转录组测序数据和患者的临床信息,利用WGCNA包构建共表达网络、识别基因模块并与临床信息相关联。通过Cytoscape对模块进行可视化,并使用CytoHubba确定关键基因。通过clusterProfiler包进行GO富集分析,并通过DAVID进行KGEE通路富集分析。采用survival包进行单因素Cox回归分析,随后根据单因素的P值筛选基因进行多因素Cox回归分析,构建生存相关的线性风险评估模型,通过Kaplan-Meier生存曲线评估高、低风险组样本的总体生存率差异情况。采用survivalROC包绘制ROC曲线,评价预后模型的预测准确性。2.网络药理学分析在复方苦参注射液治疗肝癌作用机制研究中,通过文献检索获得复方苦参注射液的化学成分,通过 STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction、TCMSP 获取化学成分的靶点。通过TTD、GEO、TCGA获得肝细胞癌相关基因。使用Cytoscape构建“化合物-潜在靶点网络”、“化合物-肝细胞癌靶点网络”、“药物-化合物-靶点-通路网络”,对网络的关键拓扑参数进行分析。通过DAVID进行GO和KEGG富集分析。使用KM plotter、GEPIA进行生存分析和关联性分析。利用AutoDock进行分子对接模拟。在复方苦参注射液治疗胰腺癌作用机制研究中,通过文献检索获得复方苦参注射液的化学成分,通过 STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction、TCMSP 获取化学成分的靶点。通过合并TTD、TCGA以及WGCNA筛选出的关键基因得到胰腺癌相关基因。随后通过STRING获取蛋白互作信息。使用Cytoscape构建“化合物-潜在靶点网络”、“化合物靶点-胰腺癌靶点蛋白互作网络”、“药物-化合物-蛋白互作靶点-通路网络”,并使用MCODE对网络进行模块分析。通过DAVID进行GO和KEGG富集分析。利用AutoDock+进行分子对接模拟。在复方苦参注射液治疗肺癌作用机制研究中,通过文献检索获得复方苦参注射液的化学成分,通过STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction获取化学成分的靶点,通过TTD、OMIM获得肺癌相关基因。随后通过STRING获取蛋白互作信息。使用Cytoscape构建“化合物-潜在靶点网络”、“肺癌靶点蛋白互作网络”、“化合物-肺癌靶点网络”、“药物-化合物-靶点-通路网络”,对网络的关键拓扑参数进行分析。通过DAVID进行GO和KEGG富集分析并通过systemsDock进行分子对接模拟。研究结果1.生物信息学分析结果对13个肝细胞癌基因芯片数据集进行整合分析,得到380个差异基因,包括293个下调基因和87个上调基因。通过蛋白互作网络与模块分析得到1 1个关键基因（CDK1、CCNB2、CDC20、CCNB1、TOP2A、CCNA2、MELK、PBK、TPX2、KIF20A、AURKA）和2个重要模块。富集分析表明,差异基因主要与代谢相关通路有关,关键基因和模块1与细胞周期密切相关。生存分析发现关键基因均与肝细胞癌患者生存时间呈负相关。表达水平分析表明关键基因均在肝细胞癌中高表达,关联性分析表明CDK1的表达与其他关键基因的表达呈正相关。对TCGA胰腺癌转录组测序数据进行筛选,共得到177个样本和5000个基因用于WGCNA分析,并得到11个基因模块。通过肿瘤分级、肿瘤分期和患者的生存状态最终筛选出黑色模块和蓝色模块作进一步研究。GO富集分析显示黑色模块与肿瘤的发生发展密切相关,蓝色模块与肿瘤的分化、侵袭和转移密切相关。KEGG通路富集分析显示,黑色模块中的基因主要富集在细胞周期、p53信号通路等通路上。蓝色模块中的基因主要富集在粘蛋白型O-聚糖的生物合成、花生四烯酸代谢、ECM-受体相互作用、紧密连接等通路上。通过网络分析,分别筛选出黑色模块和蓝色模块中的5个关键基因（NCAPG、BUB1、CDK1、TPX2、DLGAP5;INAVA、MST1R、TMPRSS4、TMEM92、SFN）,且这些基因均在胰腺癌中高表达。生存分析得到5个基因构建预后模型,其中TSPOAP1与胰腺癌患者生存时间呈正相关,ADGRG6、GPR87、FAM111B、MMP28与胰腺癌患者生存时间呈负相关。2.网络药理学分析结果在复方苦参注射液治疗肝癌作用机制研究中,通过网络分析,筛选出6个关键靶点（BCHE、SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A、CDK1）,其中 CDK1 在肝细胞癌中高表达,其余5个均为低表达。GO富集分析显示,复方苦参注射液调控的与肝细胞癌有关的靶点主要富集在细胞周期、凋亡过程调控、代谢过程等生物过程中。KEGG通路富集分析表明,这些靶点主要与药物代谢-细胞色素P450、花生四烯酸代谢等通路有关。此外,关联性分析结果表明SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A的表达与CDK1的表达有很强的负相关关系。生存分析结果表明,CDK1与肝细胞癌患者生存时间呈负相关,SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A与肝细胞癌患者生存时间呈正相关。在复方苦参注射液治疗胰腺癌作用机制研究中,通过网络分析与模块分析,筛选出6个关键靶点（AKT1、MAPK1、MAPK3、EGFR、CDK1、JAK1）和3个重要模块。GO富集分析显示,3个重要模块主要与细胞周期、细胞增殖、JAK-STAT级联、MAPK级联、磷酸化,凋亡过程调控有关。KEGG通路富集分析表明,3个重要模块显着富集在细胞周期、ErbB信号通路、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路等通路上。在复方苦参注射液治疗肺癌作用机制研究中,通过网络分析,筛选出8个关键靶点（CHRNA3、DRD2、PRKCA、CDK1、CDK2、CHRNA5、MMP1、MMP9）。GO 富集分析显示,复方苦参注射液调控的与肺癌有关的靶点显着富集在有丝分裂细胞周期G1/S转换、蛋白质磷酸化、ERK1和ERK2级联的调控、激酶活性等生物过程和分子功能中。KEGG通路富集分析表明,这些靶点主要参与癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、非小细胞肺癌和小细胞肺癌等通路。研究结论本研究综合运用网络药理学和生物信息学方法,在系统层面揭示了复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的化学成分、作用靶点和信号通路。初步阐释了复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的作用机制可能与协同调控多个关键靶点和通路有关。本研究可为中药注射剂治疗不同类型恶性肿瘤的作用机制研究提供线索和思路,为进一步开展复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的基础实验研究以及促进治疗肝癌、胰腺癌、肺癌中药的临床合理应用提供参考和借鉴。
郭红军[8]（2020）在《经典的Wnt/β-catenin信号通路与宫颈癌顺铂耐药的关系研究》文中研究指明研究目的和意义宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,严重危害女性健康和生命安全。化疗是宫颈癌重要的辅助治疗手段,其效果对于降低患者死亡率,延长生存期和改善生活质量十分关键。铂类是宫颈癌治疗的一线化疗药物,尤其是顺铂在宫颈癌治疗中显示出良好的效果。然而由于肿瘤异质性、个体差异等因素,化疗效果具有不确定性,肿瘤耐药是导致宫颈癌化疗失败的最主要原因。目前关于宫颈癌耐药的详细机制尚未完全察明,探索耐药产生的原因、寻找解决耐药性的方法是当前肿瘤研究的热点和难点。Wnt/β-catenin是最经典的信号通路之一,与肿瘤的发生发展密切相关,多项研究发现在卵巢癌、肾癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等人类肿瘤中均存在Wnt通路过度激活,认为Wnt/β-catenin途径可能是众多肿瘤发生的共同通路。化疗耐药是宫颈癌患者治疗失败和预后不良的最主要原因,查明宫颈癌的化疗耐药机制,加深对宫颈癌耐药过程中复杂信号通路网络调控的认识,能为宫颈癌耐药研究提供新的视角。本研究欲探讨Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌顺铂耐药中所发挥的作用及其作用机制。研究结果对于寻找宫颈癌耐药相关的潜在分子靶点,寻找解决耐药性的方法具有重要价值,未来可能给宫颈癌的临床治疗带来重大突破和进展。研究方法第一部分:以原发性宫颈癌患者组织和复发性顺铂耐药宫颈癌组织为研究对象,通过RNA-seq测序分析两组中的基因表达差异,通过免疫组化、qPCR以及Western blot等分子生物学手段做进一步的验证,通过TCGA数据库分析差异表达基因与病人预后的关系。第二部分:采用大剂量冲击诱导法,用终浓度为10 μ g/ml的顺铂溶液诱导人宫颈癌SiHa、HeLa、C33A和CaSki细胞系,建立相应的宫颈癌顺铂耐药细胞模型,比较宫颈癌细胞和耐药细胞在形态、耐药性及其他生物学特性方面的差异。第三部分:用β-catenin真核表达载体和Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939单独或联合处理宫颈癌顺铂耐药细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot检测不同处理后宫颈癌顺铂耐药细胞中β-catenin及Wnt/β-catenin通路上Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测顺铂诱导下各组细胞的凋亡率,MTT法检测各组细胞的增殖情况。第四部分:用皮下注射法诱导建立宫颈癌顺铂SiHa耐药细胞裸鼠皮下移植瘤模型,将裸鼠随机分为对照组、顺铂组、β-catenin+顺铂组和XAV939+顺铂组,给予相应干预后,观察裸鼠一般情况和移植瘤生长情况,测量瘤体积,绘制移植瘤生长曲线,21天后处死动物,取肿瘤组织,Tunel检测移植瘤凋亡,免疫组化检测核蛋白K i-67表达,Western Blot检测Wnt/β-catenin通路上Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled 蛋白的表达。研究结果第一部分:RNA-seq分析发现在3例复发性顺铂耐药患者宫颈癌组织中存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活。应用免疫组化、qPCR和Western blot等实验方法进一步验证发现,与正常宫颈组织相比,β-catenin在原发性宫颈癌组织中表达增高,而在复发性顺铂耐药的宫颈癌组织中β-catenin的表达较上述2组异常增高（P<0.05）,Western blot结果还表明Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白Survivin在复发性顺铂耐药的宫颈癌组织中的表达显着上调（P<0.05）。通过分析TCGA数据库分析宫颈癌组织中β-catenin和Survivin表达与病人生存曲线的关系,结果发现宫颈癌组织中β-catenin和Survivin的表达与患者生存时间呈负相关,β-catenin和Survivin的表达越高,病人生存时间越短。第二部分:1.经诱导建立的宫颈癌SiHa/DDP、HeLa/DDP、C33A/DDP和CaSki/DDP细胞系的RI分别为12.34,7.92,7.13和17.65,表现出对顺铂中到重度耐药。2.SiHa/DDP、HeLa/DDP、C33A/DDP 和 CaSki/DDP 细胞和各自亲本细胞在顺铂诱导下的凋亡率分别为（3.3±0.64）%vs.（36.9±2.56）%,（8.56±1.27）%s.（47.55±3.78）%,（22.71±4.19）%vs.（47.44±6.97）%和（12.38±3.56）%vs.（58.44±5.63）%,耐药细胞凋亡率均显着低于其相应的亲本细胞（P<0.01）。3.SiHa、HeLa、C33A和CaSki细胞系中β-catenin mRNA和蛋白水平均较正常宫颈鳞状上皮细胞（Ect1/E6E7）显着升高（P<0.05）,SiHa、HeLa、C33A和CaSki顺铂耐药细胞系中β-catenin mRNA和蛋白水平均较其亲本细胞进一步升高（P<0.05）。第三部分:1.在SiHa、HeLa、C33A和CaSki顺铂耐药细胞中过表达β-catenin,其下游信号因子 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled mRNA和蛋白水平均显着升高（P均<0.05）,Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939处理后,4 种耐药细胞系中 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled 的 mRNA和蛋白水平均呈现下降趋势。2.细胞增殖和凋亡结果显示,随着时间的延长,4种宫颈癌顺铂耐药细胞中β-catenin组细胞增殖能力最强,凋亡不明显,而β-catenin+XAV939组,增殖减弱,凋亡明显,XAV939明显抑制了细胞增殖,并诱导细胞凋亡。第四部分:1.动物实验结果显示,成功构建了宫颈癌顺铂耐药SiHa细胞裸鼠皮下移植瘤模型,与对照组相比,顺铂组和XAV939+顺铂组裸鼠移植瘤体积较对照组和β-catenin+顺铂组明显下降,XAV939+顺铂组移植瘤体积较顺铂组明显下降;对照组和β-catenin+顺铂组无明显差异,移植瘤体积整体变化从大到小依次为对照组/β-catenin+顺铂组>顺铂组>XAV939+顺铂组。2.顺铂组、β-catenin+顺铂组、XAV939+顺铂组和对照组的凋亡指数分别为（16.26±1.34）%,（7.96±0.53）%、（27.33±1.78）%和（6.54±0.32）%。XAV939+顺铂组凋亡指数高于顺铂组（P<0.05）,且两者均高于对照组（P<0.05）;β-catenin+顺铂组凋亡指数与对照组无显着差异（P>0.05）。3.免疫组化结果显示顺铂组移植瘤中Ki-67蛋白表达的平均光密度为（0.038+0.0120）,较对照组降低（P<0.05）,XAV939+顺铂组Ki-67蛋白表达的平均光密度为（0.024±0.008）,较对照组和顺铂组降低（P均<0.05）。4.对照组和 β-catenin+顺铂组中 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled的蛋白表达水平无显着差异（P>0.05）,β-catenin+顺铂组β-catenin、Survivin、c-myc和MMP-2的蛋白水平较顺铂组显着升高（P<0.05）;XAV939+顺铂组β-catenin、Survivin、c-myc蛋白水平较顺铂组则显着降低（P<0.05）。研究结论1.在复发性顺铂耐药的宫颈癌组织中存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活,而该通路在正常宫颈组织和原发性宫颈癌组织中的表达则比较弱,提示Wnt/β-catenin与宫颈癌顺铂耐药有密切关系。临床大数据研究显示Wnt/β-catenin激活与生存期存在负相关。2.Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌顺铂耐药细胞中异常活化,且其通路上关键因子Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled转录水平和蛋白表达上调。3.Wnt/β-catenin信号通路过度激活能提高宫颈癌顺铂耐药性,增强细胞的增殖活力,降低细胞凋亡,促进肿瘤的生长;抑制Wnt/β-catenin信号通路后能降低宫颈癌细胞对顺铂的耐药性,促进细胞凋亡,抑制裸鼠移植瘤的生长。4.动物实验表明Wnt/β-catenin信号通路活化降低宫颈癌耐药细胞对顺铂的敏感性;抑制Wnt/β-catenin信号通路能提高宫颈癌对顺铂的敏感性,促进顺铂的抗癌效果,Wnt/β-catenin抑制剂和顺铂两者联用能促进顺铂的抗癌效果。
童琴[9]（2020）在《MYCN调控HES1通过凋亡途径参与小细胞肺癌化疗耐药的研究》文中指出研究背景肺癌是当今世界严重危害人类健康的恶性肿瘤,已成为我国癌症相关死亡的首要原因。小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）约占所有肺癌的13%-15%,具有高度侵袭性,生存期短,预后极差。尽管小细胞肺癌最初对化疗敏感,但大多数患者会迅速产生耐药性,从而导致化疗失败。因此,充分阐明小细胞肺癌耐药性的分子机制对于提高一线化疗疗效和延长患者的生存有至关重要的意义。研究目的课题组前期利用基因表达谱芯片比较分析小细胞肺癌耐药细胞（H69AR）和敏感细胞（H69）间基因表达差异,发现耐药细胞株中MYCN的表达显着高于敏感细胞株（2.3倍）,提示MYCN可能参与了 SCLC化疗耐药。本课题通过体外细胞和体内动物实验进一步明确MYCN在SCLC化疗耐药中的作用;通过转录组测序和生物信息分析寻找MYCN的下游信号分子,探讨MYCN参与SCLC化疗耐药的分子机制,为下一步开展逆转SCLC化疗耐药的研究提供实验依据。研究方法及结果1.MYCN与小细胞肺癌多药耐药相关（1）siRNA下调细胞中的MYCN,CCK8结果显示在MYCN下调的细胞中,化疗药物的IC50值明显降低,药物的敏感性显着增加。（2）转染过表达质粒上调细胞中的MYCN,CCK8结果显示在MYCN上调的细胞中,化疗药物的IC50值明显增加,药物的敏感性显着降低。（3）构建慢病毒稳转细胞株后,进行裸鼠皮下成瘤实验:下调MYCN可以减缓瘤体的增长速度,抑制瘤体的体积,增加化疗敏感性;上调MYCN可以促进瘤体的增长速度,增加瘤体的体积,减弱化疗敏感性。2.MYCN通过影响细胞凋亡参与小细胞肺癌化疗耐药（1）在MYCN下调的细胞株中加入化疗药物,流式检测提示小细胞肺癌细胞早期凋亡率明显增加;Western Blot显示BAX表达增加,Bcl-2表达减少。（2）在MYCN上调的细胞株中加入化疗药物,流式检测提示小细胞肺癌细胞早期凋亡率明显下降;Western Blot显示BAX表达减少,Bcl-2表达增加。3.MYCN直接结合于HES1启动子区,激活Notch通路（1）经转录组测序和生物信息分析,发现Notch通路可能受MYCN的调控。经Western Blot验证,该通路上的NOTCH1,JAG2,HES1与MYCN的表达呈正相关。（2）CHIP-qPCR实验和荧光素酶实验证实MYCN可结合在HES1的启动子区域,并促进其转录。4.HES1参与MYCN介导的小细胞肺癌多药耐药（1）用siRNA干扰HES1的表达,CCK8结果显示化疗药物的IC50值明显下降,药物敏感性显着增高。（2）在MYCN上调的细胞株中用Notch通路抑制剂FLI-06抑制HES1活性,可以挽救MYCN上调导致的耐药性升高。（3）裸鼠皮下成瘤实验:FLI-06联合化疗组皮下成瘤的体积较化疗组及FLI-06组小,增长速率较化疗组及FLI-06组慢。5.MYCN与小细胞肺癌患者的耐药和生存相关（1）免疫组化技术分析小细胞肺癌患者肿瘤组织标本,化疗耐药组中MYCN的阳性表达率明显高于化疗敏感组,且MYCN和HES1表达呈正相关。（2）生存分析提示MYCN高表达患者的生存时间较低表达患者短。结论1.MYCN与小细胞肺癌化疗耐药呈正相关。2.MYCN通过影响凋亡参与小细胞肺癌化疗耐药。3.MYCN调控Notch通路,并可直接结合在HES1启动子区域,促进其转录。4.HES1与MYCN介导的小细胞肺癌化疗耐药相关。5.化疗耐药组中MYCN的阳性表达率明显高于化疗敏感组,MYCN高表达患者的生存时间短,临床预后差。
张振华[10]（2020）在《肺瘤平膏通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬影响肺癌顺铂耐药的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景肺癌是全球癌症死亡的主要原因,非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）约占肺癌病例的75%-80%,所有分期的5年生存率约为10%-15%。化疗是治疗肿瘤和防止肿瘤术后复发转移不可替代的常用的治疗手段之一,但是在治疗过程中出现肿瘤细胞的耐药常常导致化疗的失败,最终导致患者的死亡。近年来研究发现,自噬可以用来帮助肿瘤细胞逃避放化疗或者其他治疗介导的细胞死亡,最终导致耐药的产生。肿瘤形成后,在营养和能量不足时,肿瘤细胞可以利用自噬清除受损的细胞器和循环利用正常细胞中的降解产物为自己供能,使肿瘤细胞在肿瘤微环境的压力下生存,同时自噬可以作为一种适应性反应使肿瘤细胞耐受放疗化疗等治疗手段产生耐药。肺瘤平膏（FLP）是具有益气养阴、清热解毒、化痰止咳功效的中药复方,前期研究表明肺瘤平膏能够通过调控自噬抑制肺腺癌小鼠的生长和增殖,临床上我们发现肺瘤平膏与化疗药联用能够增加患者对化疗药物的敏感性,但是其作用机制尚无研究。研究目的通过观察FLP对肺癌化疗耐药荷瘤动物模型中肿瘤组织及A549/cis肺腺癌耐药细胞株中耐药蛋白表达的影响,从自噬的角度揭示FLP逆转化疗耐药的分子机制,旨在阐释FLP逆转耐药的科学内涵,同时为进一步应用中医药治疗NSCLC提供科学依据。研究方法（1）采用A549/cis肺腺癌耐药细胞株,接种到BALB/c裸鼠的右侧腋下,建立A549/cis肺癌化疗耐药荷瘤动物模型,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、自噬抑制剂氯喹（chloroquine,CQ）、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预21天后,取材,测量瘤重,计算抑瘤率。用免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测肿瘤组织中Ki-67的表达水平;（2）建立A549/cis肺癌化疗耐药荷瘤动物模型,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预21天后,用Western Blotting（WB）和IHC检测肿瘤组织中耐药相关蛋白MDR1和MRP1的表达水平;（3）建立A549/cis肺癌化疗耐药荷瘤动物模型,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预21天后,用WB和IHC检测肿瘤组织中自噬相关蛋白LC3、p62、Beclin1、Atg3、Atg5和Atg7的表达水平,用免疫荧光检测LC3的表达水平;（4）建立A549/cis肺癌化疗耐药荷瘤动物模型,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预21天后,用WB法检测肿瘤组织中信号通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表达水平;（5）体外采用A549/cis肺腺癌耐药细胞株,CCK-8法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株增殖的影响,Annexin V/PI法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株凋亡的影响:（6）体外采用A549/cis肺腺癌耐药细胞株,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预48h后,WB法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株耐药蛋白MDR1和MRP1表达的影响;（7）构建双荧光mRFP-GFP-LC3体系A549/cis肺腺癌耐药细胞株,用生理盐水、FLP、DDP、FLP 联合 DDP、CQ、DDP 联合 CQ 及 FLP 联合 DDP 和 CQ 干预 48h 后,高内涵检测A549/cis细胞株自噬蛋白LC3的表达,WB法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株自噬蛋白LC3、p62、Beclin1、Atg3和Atg7的表达水平;（8）体外采用A549/cis肺腺癌耐药细胞株,用生理盐水、FLP、DDP、FLP联合DDP、CQ、DDP联合CQ及FLP联合DDP和CQ干预48h后,WB法检测肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株信号通路相关蛋白AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表达水平。研究结果（1）F+D组、D+C组和F+D+C组均能有效地抑制肿瘤,其抑瘤率分别为49.33%、47.43%和53.78%,其中F+D+C组的抑瘤效果最好。IHC检测不同药物干预21天后肿瘤组织中Ki-67的表达发现:FLP组、F+D组、D+C组和F+D+C组均能有效抑制Ki-67的表达,其中D+C组与F+D+C组抑制Ki-67的表达最明显。（2）DDP可以一定程度增加耐药相关蛋白MDR1和MRP1的表达;而FLP与DDP联用、DDP与CQ联用及FLP与DDP与CQ联用均能明显降低MDR1的表达,差异具有统计学意义,IHC也表明这3组能明显降低MRP1的表达,差异具有统计学意义,综上所述,FLP与DDP联用能增加DDP的敏感性,其作用与DDP联合CQ相当。（3）间接免疫荧光法检测LC3的表达发现:经DDP干预后特异性点状分布增加,且结合WB和IHC的结果DDP能一定程度增加Atg3、Atg5和Atg7的表达,同时能降低p62的表达,表明DDP能一定程度诱导自噬。结合WB、IHC和免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达发现:FLP联合DDP能够抑制自噬的标志物LC3的表达,增强P62的表达,同时不同程度地抑制自噬相关蛋白Atg3、Atg7及Beclin1的表达,DDP联合CQ组亦能够有效抑制自噬的标志物LC3的表达,增强P62的表达,同时不同程度地抑制自噬相关蛋白Atg3、Atg5、Atg7及Beclin1的表达,可见DDP能一定程度诱导自噬相关蛋白的表达;FLP与DDP联用能够抑制自噬相关蛋白的表达,其效果接近于DDP联用自噬抑制剂。（4）用WB检测AMPK及mTOR相关蛋白的表达发现:AMPK及mTOR总蛋白表达量未见明显异常,FLP联合DDP可以降低p-AMPK的表达,增加p-mTOR的表达。（5）FLP联合化疗药DDP在体外能够有效地抑制A549/cis耐药株地增长,作用效果呈现时间依赖性,且与化疗药DDP联合自噬抑制剂CQ作用相当,其中就某一时间点而言,FLP联合化疗药联合CQ对细胞株地抑制效果最佳;用流式细胞术检测细胞凋亡实验发现:FLP联合化疗药DDP在体外能够有效地促进A549/cis耐药株的凋亡。（6）FLP联合化疗药DDP、DDP联合CQ及三药联合在体外均能够有效抑制MDR1的表达,但对MRP1表达的影响不明显。（7）双荧光mRFP-GFP-LC3体系检测FLP、DDP及CQ单独或者联合应用干预A549/cis人肺腺癌耐药细胞株48h后发现:FLP与DDP联用及与CQ三药联用能够明显地阻断自噬流,抑制自噬,同时WB显示:FLP联合DDP和DDP联合CQ均能够抑制自噬的标志物LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ的表达,增强P62的表达,同时不同程度地抑制自噬相关蛋白Atg3和Atg7的表达,三药联合除了能降低LC3、Atg3和Atg7的表达,增强P62的表达,还能降低Beclin1的表达。（8）FLP含药血清与DDP联用、DDP与自噬抑制剂CQ及三药联用能够明显抑制信号通路相关蛋白p-AMPK/AMPK的相对光密度值,同时提高p-mTOR/mTOR的相对光密度值。研究结论1、FLP与DDP联用能够有效地抑制A549/cis耐药荷瘤小鼠肿瘤的生长和增殖,能有效地抑制A549/cis耐药细胞株的增长,并促进其凋亡。2、FLP与DDP联用可以通过抑制自噬降低耐药相关蛋白的表达,增加DDP的敏感性,逆转耐药。3、FLP与DDP联用抑制自噬逆转耐药可能跟AMPK/mTOR信号通路有关。
二、THE CORRELATION BETWEEN THE EXPRESSION OF MULTIDRUG RESISTANCE RELATED GENE AND CELL APOPTOSIS AND CLINICAL SIGNIFICANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、THE CORRELATION BETWEEN THE EXPRESSION OF MULTIDRUG RESISTANCE RELATED GENE AND CELL APOPTOSIS AND CLINICAL SIGNIFICANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER（论文提纲范文）
（1）PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分:PAQR3在A549细胞中的表达与A549细胞顺铂耐药的相关性 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肺癌多药耐药研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 非小细胞肺癌的西医研究进展 |
| 综述二 西黄丸抗肿瘤的实验研究进展 |
| 综述三 热休克蛋白与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 西黄丸治疗非小细胞肺癌的疗效：系统综述和Meta分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 西黄丸抗非小细胞肺癌的网络药理学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 西黄丸抗小鼠Lewis肺癌的药效学研究 |
| 实验一 西黄丸含药血清和浸提液对LL/2细胞株增殖的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 西黄丸浸提液对LL/2细胞株凋亡和细胞周期的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 西黄丸浸提液对LL/2细胞株迁移及侵袭能力的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 西黄丸抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤生长的作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的转录组学的影响 |
| 实验五 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤转录组学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤热休克蛋白家族的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七 西黄丸对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的ER/RXRα/PPAR的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述:MACC1、MRP、LRP的相关研究 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 NSCLC获得性多药耐药细胞A549/DDP鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 NSCLC耐药相关基因的筛选及鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ZNF300与NSCLC恶性进展 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ZNF300促进NSCLC耐药和恶性进展的分子机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 淫羊藿苷和全反式维甲酸增强顺铂对NSCLC肿瘤耐药细胞杀伤作用的机制探讨 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料和方法 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 肿瘤化疗耐药机制的研究现况 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 锌指蛋白家族的结构与功能以及ZNF300的研究现况 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的成果 |
| 致谢 |
（5）外泌体在非小细胞肺癌铂类耐药中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 外泌体APE1对非小细胞肺癌铂类化疗敏感性的影响 |
| 第一节 非小细胞肺癌细胞外泌体APE1对细胞铂类敏感性的影响 |
| 2.1.1 引言 |
| 2.1.2 材料与方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 第二节 血浆外泌体APE1与非小细胞肺癌铂类化疗敏感性的关系 |
| 2.2.1 引言 |
| 2.2.2 材料与方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 第三章 外泌体micro RNA对非小细胞肺癌铂类敏感性的影响 |
| 第一节 铂类刺激下外泌体micro RNA对非小细胞肺癌铂类敏感性的影响 |
| 3.1.1 引言 |
| 3.1.2 材料方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 第二节 APE1 相关外泌体micro RNA与非小细胞肺癌铂类化疗疗效的关系 |
| 3.2.1 引言 |
| 3.2.2 材料方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 第四章 PD-L1单核苷酸多态性与非小细胞肺癌易感性和预后的关系 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 外泌体在DNA损伤修复过程中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 非小细胞肺癌铂类耐药机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）GBP1通过PGK1激活EMT通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 GBP1在非小细胞肺癌厄洛替尼耐药细胞中的表达及意义 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 结论与讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 体内研究表明GBP1参与厄洛替尼耐药 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 结论与讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 GBP1和PGK1互作促进厄洛替尼耐药 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 结论与讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 临床研究表明高表达GBP1患者预后差 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 资料与方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.4 结论与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）基于整合生物信息学的复方苦参注射液治疗三种常见肿瘤作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 复方苦参注射液抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 综述二 复方苦参注射液临床应用进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 基于整合生物信息学的复方苦参注射液治疗三种常见肿瘤作用机制研究 |
| 一、基于生物信息学的肝癌关键基因研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 二、基于网络药理学的复方苦参注射液治疗肝癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 三、基于生物信息学的胰腺癌关键基因研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 四、基于网络药理学的复方苦参注射液治疗胰腺癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 五、基于网络药理学的复方苦参注射液治疗肺癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 结语 |
| 1 研究成果 |
| 2 研究的创新与特色 |
| 3 研究的展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）经典的Wnt/β-catenin信号通路与宫颈癌顺铂耐药的关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| Wnt通路与宫颈癌 |
| 第一部分 Wnt/β-catenin信号通路在对顺铂化疗耐药宫颈癌组织中的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 体外建立并鉴定顺铂耐药的宫颈癌细胞株 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 Wntβ-catenin信号通路对宫颈癌细胞顺铂耐药的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 Wnt/β-catenin信号通路在对宫颈癌顺铂耐药细胞裸鼠皮下移植瘤的作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Wnt传导通路与人类肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的论文和研究成果 |
| 致谢 |
（9）MYCN调控HES1通过凋亡途径参与小细胞肺癌化疗耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 MYCN调控凋亡途径影响小细胞肺癌的化疗耐药 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第二章 MYCN调控Notch通路,靶向作用HES1影响小细胞肺癌的化疗耐药 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第三部分 MYCN及HES1在小细胞肺癌组织中的表达及临床意义 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（10）肺瘤平膏通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬影响肺癌顺铂耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 自噬对肿瘤耐药的调控作用 |
| 1. 自噬 |
| 2. 自噬与肿瘤耐药 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗肿瘤耐药的概述 |
| 1. 耐药的分类 |
| 2. 肿瘤耐药性产生的分子机制 |
| 3. 中药逆转肿瘤耐药的研究 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 第一部分 体内实验 |
| 实验一: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药荷瘤小鼠肿瘤生长和增殖的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验二: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药荷瘤小鼠耐药蛋白的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验三: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药荷瘤小鼠自噬蛋白的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验四: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药荷瘤小鼠AMPK信号通路的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 第二部分 体外实验 |
| 实验五: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株增殖和凋亡的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验六: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株耐药蛋白表达的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验七: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株自噬蛋白表达的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 实验八: 肺瘤平膏对A549/cis肺腺癌耐药细胞株AMPK信号通路的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 小结 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
四、THE CORRELATION BETWEEN THE EXPRESSION OF MULTIDRUG RESISTANCE RELATED GENE AND CELL APOPTOSIS AND CLINICAL SIGNIFICANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER（论文参考文献）
- [1]PAQR3逆转非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药机制研究[D]. 方世旭. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]西黄丸治疗非小细胞肺癌疗效的系统评价及作用机制研究[D]. 张志莹. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性研究[D]. 蔡晓燕. 新乡医学院, 2021(01)
- [4]锌指蛋白300（ZNF300）参与非小细胞肺癌获得性多药耐药和恶性进展的作用及机制研究[D]. 余世龙. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [5]外泌体在非小细胞肺癌铂类耐药中的作用和机制研究[D]. 赵晓龙. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [6]GBP1通过PGK1激活EMT通路进而促进非小细胞肺癌厄洛替尼耐药的功能和机制研究[D]. 程丽芳. 南方医科大学, 2020(06)
- [7]基于整合生物信息学的复方苦参注射液治疗三种常见肿瘤作用机制研究[D]. 孟子琦. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]经典的Wnt/β-catenin信号通路与宫颈癌顺铂耐药的关系研究[D]. 郭红军. 郑州大学, 2020(02)
- [9]MYCN调控HES1通过凋亡途径参与小细胞肺癌化疗耐药的研究[D]. 童琴. 南方医科大学, 2020(01)
- [10]肺瘤平膏通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬影响肺癌顺铂耐药的机制研究[D]. 张振华. 北京中医药大学, 2020(04)