一、烟草丛顶病穴TBTV雪传毒特性及寄主范围研究（论文文献综述）
窦宝存[1]（2020）在《烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译中的远距离RNA-RNA互作》文中指出RNA病毒的不依赖帽子翻译调控元件主要包括两类:位于基因组5’端的核糖体内部进入位点（Internal Ribosome Entry Site,IRES）和位于基因组3’端的不依赖帽子翻译调控元件（3’Cap-Independent Translation Element,3’CITE）。其中3’CITE结合的翻译起始复合物,大多是由远距离RNA-RNA互作呈递到基因组5’端起始翻译。参与远距离RNA-RNA互作的5’端区域是否受到临近RNA序列或结构的影响,这方面的研究很少。烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）基因组5’端没有帽子结构（m7GPPPN）,3’端也没有poly（A）尾,依赖其3’非翻译区（Untranslated Region,UTR）的不依赖帽子翻译调控元件BTE招募翻译起始因子进行不依赖帽子翻译,需要远距离RNA-RNA互作的协同调控。前期研究表明,基因组5’末端区域（RI区）是造成多个TBTV分离物翻译效率差异的主要区域之一。在此基础上,通过嵌合突变体的突变和体外翻译实验分析基因组5’端区域的RNA序列对远距离RNA-RNA互作的影响,发现调控TBTV不依赖帽子翻译的远距离RNA-RNA互作受到“精妙的开关”调控。具体结果如下:1.嵌合突变体TB-MDI（1-511）的p35蛋白表达量相对于野生型明显下降,而嵌合突变体拥有与野生型TBTV一样的BTE结构;以远距离互作可能受影响为研究切入点,在嵌合突变体TB-MDI（1-511）的5’末端增加额外的5’UTR序列（AGGTTACGAT）。新增加1个拷贝的5’UTR序列,p35蛋白的表达量并没有变化;新增加2个拷贝的5’UTR序列,p35蛋白表达量恢复到野生型水平。说明弱毒分离物TB-MDI的RI区（1-511nt）可能存在特有的突变,该突变限制了嵌合突变体TB-MDI（1-511）的远距离RNA-RNA互作;而额外2个拷贝的5’UTR序列插入则可以恢复远距离RNA-RNA互作。2.以TB-MDI（1-511）+2*5U为基础,突变不同位置的5’UTR序列中参与远距离互作的碱基（AGGTTACGAT,下划线标出参与互作的碱基）,分析3个5’UTR序列恢复翻译效率的机制。突变3’端的5’UTR,突变体翻译水平降低至TB-MDI（1-511）+2*5U的30%。在此基础上继续突变中间的5’UTR,翻译水平提高至野生型水平;突变5’端的5’UTR,突变体翻译水平降低至50%。同样在此基础上继续突变中间的5’UTR,翻译水平略有降低,但变化并不明显。而5’UTR突变体的BTE区域内的潜在回复突变体无法回复翻译水平。说明3个5’UTR序列对于翻译效率的恢复既有数量效应又有位置效应。3.比较TBTV不同分离物的1-511的序列,翻译效率较低的弱毒分离物（TB-MDI、TB-MDII、TB-JC）与野生型相比,存在9个共有突变位点,分别是第1位的A突变为G、147位的A突变为C、291位的U突变为C、299位的A突变为U、300位的U突变为C、340位的U突变为C、405位的A突变为U、407位的U突变为C和464位的G突变为C。其中三处造成了明显的RNA结构变化,分别是第299-300位碱基处、第405/407位碱基处和第464位碱基处。针对这些突变位点构建两种类型的突变体:以TBTV-Ch为基础将这些位置的碱基分别突变为弱毒分离物的对应位置碱基,翻译水平变化不明显;以嵌合突变体TB-MDI（1-511）为基础,将这些位置的碱基分别突变为TBTV-Ch的对应位置碱基,翻译水平有一定的上升。以TBTV-Ch为基础组合突变两处碱基及以上,翻译水平明显降低;以TB-MDI（1-511）为基础组合突变,翻译水平明显上升。说明第299-300位、第405/407位和第464位碱基的共有突变,通过限制远距离的RNA-RNA互作而降低了不依赖帽子的翻译效率,且同步突变对翻译的抑制效应强于单处突变的抑制效应。以上结果说明,在p35蛋白低水平表达的TBTV分离物的1-511 nt范围内存在特定的突变位点限制不依赖帽子翻译所需的远距离RNA-RNA互作,即TBTV不依赖帽子翻译相关的远距离RNA-RNA互作存在精细的调控开关。
张未[2]（2019）在《烟草丛顶病病原病毒复合体各组分传播特性的研究》文中研究表明烟草丛顶病（Tobacco bushy top disease,TBTD）是一种毁灭性很大的烟草病害,在我国云南省多个烟区流行并造成了严重的经济损失。烟草丛顶病也是我国目前发现的仅此一例由黄症病毒科（Luteoviridae）和幽影病毒属（Umbravirus）病毒复合侵染引起的病害,并且是植物病毒病害。该病害的病毒复合体成分复杂,包含了 5种RNA成分,除了一个尚未定性的病毒RNA之外,其他4种分别是烟草脉扭病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）、烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）这两者为主要致病病毒,以及烟草丛顶病毒卫星RNA（Tobacco bushy top virus satellite RNA,TBTV SatRNA）和烟草脉扭病毒伴随 RNA（Tobacco vein distorting virus associate RNA,TVDVaRNA）。为了研究该病害病原病毒复合体各组分的传播特性,增加对该植物病毒的各个RNA组分相互作用关系的进一步理解,本文从以下几方面进行了深入的研究:首次明确了 TVDV、TBTV、TBTVSatRNA和TVDVaRNA三者之间的相互作用关系。通过已构建的TVDV、TBTV、TBTV SatRNA和TVDVaRNA农杆菌介导的病毒侵染性克隆对其相互作用关系进行了深入研究。被单独接种TVDV的植株没有表现出明显症状,但TVDV可以单独进行复制并系统感染,还可以通过蚜虫进行传播;同时接种TVDV和TBTV SatRNA的植株也没有明显症状,并且检测不到TBTVSatRNA,TBTVSatRNA单独无法进行复制和系统感染,并且不能通过蚜虫进行传播;同时接种TVDV及TBTV的植株症状轻微,两者RNA可以复制和系统感染,通过蚜虫可以从本氏烟传播到烤烟上;同时接种TVDV、TBTV和TBTVSatRNA,植株黄化症状较重,侧枝较多,但仍比接种已知4种的植株症状轻,三种病毒RNA均可以复制和系统感染,并且均可以通过蚜虫传播。但TVDV与TBTV共同侵染的烤烟,在通过蚜虫传向其他烤烟时,并未成功,而卫星RNA存在时三者都可以传到其他烤烟上。为了获得烟草丛顶病病原病毒复合体中尚未定性的病毒RNA序列,我们建立了一种应用基于转录组深度测序技术的针对植物病毒鉴定的方法。通过提纯烟草丛顶病病原病毒粒子,利用深度测序的技术对其中的病毒总RNA的成分进行了研究。在深度测序获得序列的基础上,应用生物信息学对测序得到的序列进行注释筛选,提取候选序列,应用RT-PCR技术对候选序列进行验证。在样品中获得了多个新的呼肠孤病毒科（Reoviridae）病毒的RNA序列片段,并在部分烟草丛顶病侵染的植株内检测到上述序列,同时对上述病毒的来源进行了探讨。本次研究帮助我们加深对烟草丛顶病的病原病毒复合体的了解认识,也加深了对植物病毒相互作用机制及传播特性的理解,为防治和研究黄症病毒/幽影病毒复合体引起植物病害提供思路。
王德亚[3]（2017）在《烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础与分子进化》文中进行了进一步梳理烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）属于番茄丛矮病毒科幽影病毒属,基因组由一条正义单链RNA（+ssRNA）组成,全长约4,152 nt。5’端缺乏帽子结构（m7GPPPN）,3’末端也不带poly（A）尾,编码4个ORF,包括复制酶组分p35蛋白及其-1位移码产物p98蛋白（RNA依赖RNA聚合酶,RdRp）,运动蛋白p26和p27。前人研究表明,TBTV基因组的3’UTR含有不依赖帽子翻译元件BTE,可以调控报告基因的表达。本文分析了BTE在全长TBTV中对p35蛋白翻译的调控作用以及对TBTV在BY-2原生质体中的RNA积累的作用。另外从中国云南地区克隆了3个新的TBTV弱毒分离物,发现其p35表达量相对于野生型（TBTV-Ch）明显降低,且p35表达量降低与BTE元件的结构变异相关。利用体外翻译系统WGE,以TBTV基因组全长RNA为材料全面分析其不依赖帽子翻译,发现TBTV基因组中除BTE外还存在至少1种类型的不依赖帽子翻译元件。具体结果如下:（1）TBTV全基因组克隆及分子进化:通过5’RACE和3’RACE结合一步RT-PCR的方法,克隆得到3个新的弱毒分离物TBTV-JC（KM016224）、TBTV-MD-I（KM016225）和TBTV-MD-II（KM067277）。基因组全长均为4,152 nt;与之前报道的TBTV分离物不同,第一个碱基是鸟嘌呤（G）而不是腺嘌呤（A）。序列一致性比对发现ORF1编码区是TBTV基因组中变化最大的区域（75.0%-99.2%）;系统进化树显示各基因独立进化;在已报道的7个TBTV分离物中共发现32个疑似的重组事件。（2）BTE元件对于TBTV翻译和复制的影响:通过萤火虫荧光素酶（Fluc）载体和TBTV全长RNA的体外翻译分析,发现BTE元件发挥调控不依赖帽子翻译作用的核心分子特征包括3方面:SL-I的17 nt保守序列;与5’UTR形成远距离RNA-RNA互作的SL-III A;BTE本身的结构稳定性。BTE的突变也影响TBTV在BY-2原生质体中的RNA积累,说明BTE通过调控蛋白翻译从而影响病毒的致病性。（3）TBTV不同分离物体内RNA积累量分析:3个TBTV弱毒分离物在烟草原生质体中的RNA积累量是野生型的30%-40%。而其p35蛋白的表达量是野生型的25%,38%和20%,表明p35表达量降低可能与其弱致病力相关。（4）TBTV不同分离物p35蛋白表达差异的分子机制:嵌合病毒的体外翻译表明,造成弱毒分离物p35蛋白表达量降低的主要调控区域是RI区（基因组5’端的500 nt）和包含BTE的RV区（3’端的3,138 nt到3,885 nt区间）。对于RV区而言,弱毒分离物中BTE内的点突变几乎不影响p35表达,而BTE区域外则存在降低p35表达的突变U3580→A3580。进一步的RNA结构预测,在p35表达量低的TBTV分离物和嵌合病毒中均发现含有典型BTE结构的比例很低;而p35表达量高的TBTV分离物则含有高比例的典型BTE结构特征。利用SHAPE技术分析TBTV不同分离物和嵌合病毒的BTE区域的结构,发现TBTV弱毒分离物以及RV嵌合病毒的BTE区域均发生了明显结构变化。说明BTE的结构变异是导致TBTV弱毒分离物p35蛋白表达降低的分子基础,且此BTE结构变异由BTE区域外的突变造成。这是首次关于不依赖帽子翻译元件在特定RNA病毒不同分离物间结构进化的报道。对于RI区而言,其降低p35蛋白表达的机制在于突变造成5’端的局部结构变化,进而抑制了5’UTR与BTE的SL-III A形成远距离RNA-RNA互作。因此,TBTV弱毒分离物的p35低表达的分子基础是BTE元件的结构变异以及远距离RNA-RNA互作的抑制。（5）TBTV中新的不依赖帽子翻译元件:通过对TBTV 3’UTR区域的系列缺失实验,发现TB-D9（4040-4099）和TB-D10（4093-4152）的缺失会明显降低p35蛋白的表达,通过Mflod预测发现4003-4152形成独立结构域,并且利用SHAPE技术分析发现D9和D10的缺失突变并没有影响BTE元件的活性结构。反式竞争实验也证明了4003-4152区对于p35不依赖帽子翻译的调控作用。因此,在TBTV的3’UTR还存在除BTE之外的不依赖帽子翻译调控元件。利用In line-proing技术分析4003-4152的结构,包含5个发夹结构和3个假节点。此结构与TCV的3’UTR的结构类似,也可能存在TSS结构。
于成明[4]（2017）在《烟草丛顶病毒RNA依赖RNA聚合酶的-1型移码翻译机制研究》文中认为烟草丛顶病是由番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）幽影病毒属（Umbravirus）成员烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）和黄症病毒科（Luteoviridae）成员烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus,TVDV）复合侵染引起的一种系统性侵染病害。TBTV基因组为一条正义单链RNA,全长4,152个核苷酸,5’端没有帽子,3’端没有poly（A）尾,共有4个开放阅读框（ORF）。ORF1编码35 KDa蛋白,ORF1的C末端与ORF2的N端有8个密码子的重叠区,ORF2编码63 KDa蛋白。ORF1通过-1位的移码翻译机制表达产生TBTV RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）,其分子量约等于ORF1和ORF2的分子量之和。本研究在已经完成TBTV RdRp-1位移码翻译表达的定性分析基础上,主要对TBTV RdRp的-1位移码翻译机制的多层次调控元件进行定位和结构特征分析。首先通过序列分析,初步定位了-1型移码必需的七核苷酸滑动序列（特征为:XXx YYY Z,X为任何碱基、Y通常为A或U、Z是除G外的任何碱基,X和x可以是形同碱基也可以是不同碱基）是946GGAUUUU。G946A、U950C、U952G的突变可导致移码效率降低到野生型的20%40%,说明946GGAUUUU为TBTV RdRp的-1位移码所需的七核苷酸滑动序列。在定位了七核苷酸滑动序列的前提下,在其下游构建3个不同类型的突变体:缺失三个碱基(952UGC-De)、插入3个碱基(955CAU-In)、插入6个碱基(955CAUCAC-In),分析七核苷酸滑动序列与其下游潜在的局部RNA结构的距离对移码效率的影响。突变试验表明,七核苷酸滑动序列与下游潜在RNA结构元件之间的距离为69个碱基时,可保证正常的移码效率。在Mfold分析预测TBTV RNA结构的基础上,通过RNA结构体外分析技术---SHAPE分析七核苷酸滑动序列下游的RNA结构,分析表明七核苷酸滑动序列下游存在3个大小不等的茎环结构,并且存在一个假结点。突变分析表明,这3个茎环均参与TBTV RdRp的-1位移码,并且假结点的存在对于-1位移码至关重要。通过构建覆盖TBTV全基因组的18个亚克隆RNA片段,结合凝胶阻滞实验（EMSA）定位了远距离RNA-RNA互作的区域,位于亚克隆S5和亚克隆S18。其中S5（880-1120）包含-1位移码所需的七核苷酸滑动序列和下游RNA结构;而S18是TBTV的3’末端区域。利用线性化切割结构分析（In-lineprobing）技术分析了S5区域的结构以及与S18发生远距离互作后的结构,初步定位了远距离互作的2个潜在位点,分别位于七核苷酸滑动序列的第一个茎环和第三个茎环;利用线性化切割结构分析（In-lineprobing）技术分析了TBTV 3’末端区域的结构以及与S5发生远距离互作后的结构,发现远距离互作位点位于茎环结构Pr的Loop区域。通过突变分析确认了茎环Pr中参与远距离互作的位点是4137ACU,其突变降低移码效率至野生型的20%左右。本研究定位了TBTV RdRp-1位移码机制的多层次调控元件:七核苷酸滑动序列946GGAUUUU,以及位于下游69 nt处的3个茎环结构和1个假结点,同时TBTV 3’末端茎环结构Pr的Loop区域与移码位点下游的茎环结构形成2处远距离RNA-RNA互作。该研究对于正单链RNA病毒-1位移码翻译调控机制提出了新的调控模型,提供了新的研究数据,同时为烟草病毒病的防治提供了新的靶标和数据支持。
马普权,刘芳,谭冠林,田芝花,李凡[5]（2015）在《云南烟草丛顶病复合病原物的寄主范围》文中指出云南烟草丛顶病是由烟草丛顶病毒（TBTV）、烟草扭脉病毒（TVDV）、烟草丛顶病毒类似卫星RNA（Sat-TBTV）以及烟草扭脉病毒相关RNA（TVDVaRNA）复合侵染引起的一种危险性烟草病害。利用带毒烟蚜（Myzus persicae）对12种植物进行蚜虫传毒接种试验,传毒时间为15 d。结果发现:接种的辣椒、酸浆等茄科植物表现褪绿、黄化和皱缩等症状,而黄瓜、菜豆等非茄科植物未表现明显症状。利用RT-PCR技术检测接种植物中云南烟草丛顶病病原物的种类,发现酸浆、假酸浆、曼陀罗、番茄、矮牵牛和辣椒6种茄科作物均能感染云南烟草丛顶病中的4种病原物,而黄瓜、西葫芦、昆诺藜、豇豆、菜豆和油菜等6种植物只能感染云南烟草丛顶病中的部分病原物。其中,烟草扭脉病毒（TVDV）的检出率最高,为83.3%,表明TVDV在病害的发生及流行中起了重要作用,通过蚜虫传毒方式可以将云南烟草丛顶病中的部分病原物分开,有利于研究不同病原物在症状的形成及流行中的作用,同时为其他多种病毒复合侵染引起植物病害的研究提供参考。
王国鲁[6]（2014）在《烟草丛顶病毒复制酶的移码翻译调控和基因组复制的定量研究系统的初创》文中研究说明烟草丛顶病由幽影病毒属（Umbravirus）成员烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus, TBTV）及黄症病毒科（Luteoviridae）的烟草扭脉病毒（Tobacco vein distorting virus, TVDV）复合侵染引起。TBTV的基因组是一条（+）ssRNA,由4152个核苷酸组成；推测编码4个蛋白。ORF1编码35kD的蛋白,ORF1的C端与ORF2的N端有8个密码子的重叠,ORF2编码63kD的蛋白。通过同源比对推测ORF2蛋白可能是通过-1位的移码翻译机制得到表达,存在形式为ORF1/ORF2的融合蛋白。本论文首先完成了ORF2移码翻译表达机制的定性。PCR扩增TBTV的ORF1序列并克隆到原核表达载体pEHISTEV中,转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1蛋白。利用切胶纯化的ORF1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得高效价的抗血清（1：243000）。经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的ORF1多克隆抗体。Western blot分析显示,TBTV ORF1多克隆抗体既可用于检测田问发病的烟草丛顶病叶样品,也可检测在体内和体外翻译体系中的TBTV ORF1蛋白的表达。其中,在体外翻译系统中,利用所制备的ORF1多克隆抗体,还检测到以ORF1/ORF2融合蛋白形式存在的的表达产物,完成了对ORF2移码翻译机制的定性,移码效率约为1%。然后,尝试创建ORF2移码翻译机制的定量研究体系。将海肾荧光素酶的ORF融合进TBTV的ORF2中,构建了移码机制定量研究的基础载体。以此载体为基础,构建了一系列的突变体（点突变、缺失突变等）,对在体外翻译体系和体内翻译体系中移码机制的定量研究进行了初步探索。同时为解释该定量体系中出现的问题,制备了海肾荧光素酶（Rluc）的多克隆抗体,并进行了抗原亲和纯化；目前基本完成ORF2移码翻译机制的定量研究体系的创建,利用ORF1和Rluc的抗体分别检测ORF1和ORF2-Rluc的表达,其比值为移码的效率。为建立基因组复制的定量研究体系,首先通过重叠PCR扩增到ORF1/ORF2融合蛋白序列并克隆到原核表达载体pMAL-C2X中,转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1/ORF2蛋白,经过亲和层析纯化得到可溶性的目的蛋白。体外实验表明,该融合蛋白的酶活力较低,基因组复制的定量研究体系的条件有待优化。另外,原核表达并纯化了TBTV的ORF3和ORF4蛋白,为后期研究TBTV编码的蛋白间互作以及蛋白与基因组RNA的互作储备实验材料。
李晓静[7]（2014）在《三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析》文中指出三七是我国中药材中的一颗明珠，具有非常重要的药用和医疗保健价值。但因其特殊的生长、管理条件，很容易造成病毒病的发生，该病害的发生严重影响三七的生活力，降低三七的产量和质量，对生产构成严重的威胁。但到目前为止，有关三七病毒病的研究很少，而且现有的研究也仅仅停留在三七病毒病原物的鉴定层面上。植物病毒病被称作是“植物的癌症”，防治植物病毒病最重要的工作首先就是要明确病毒病原物，然后才能通过分析各个病原物的传播方式、寄主范围及发生规律等方面防控病毒病的发生。鉴于此，本文旨在通过对三七病毒病病原物开展进一步的鉴定研究，探明三七病毒中除三七Y病毒（Panax virus Y，PnVY）外的其他种类及优势种，明确其寄主范围，确定病毒分离物/复合体与症状类型的相关性，为进一步深入开展相关病毒的致病性分子机理、病害的监测和预报以及有效防控提供坚实的理论基础和技术指导，并对国内外该领域的相关研究工作起到一定的借鉴和推动作用。本文以三七病叶为材料提取dsRNA及提纯病毒，并尝试以dsRNA为模板构建cDNA文库得到可能的病毒种类，以三七病毒提纯产物为材料通过电镜技术和SDS-PAGE、质谱分析技术分别进行病毒粒子形态观察及可能的病毒种类初步鉴定。结果经dsRNA、提纯病毒及电镜技术等再次验证三七病样除了PnVY之外还存在不止一种病毒病原物。而由于提取的dsRNA浓度过低，致使没能成功完成对cDNA文库的构建。质谱分析的结果显示三七病样中可能存在大豆矮缩病毒（Soybean dwarf virus，SbDV），但经SbDV特异性引物检测及序列分析，并未在该批三七病样中检测到SbDV。应用双生病毒（geminiviruses）的基因组DNA及卫星（betasatellite）的DNA检测通用引物和中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV）的特异性引物，在三七病样YWSh03中检测到了的TYLCCNV和TYLCCNB，并获得了TYLCCNV和TYLCCNB的全长基因组序列。然后将含有TYLCCNV及TYLCCNB侵染性克隆的农杆菌菌悬液、菌落接种至三七叶片上，并且通过获毒的粉虱对三七进行传毒试验。结果农杆菌接种的三七苗都表现为黄化症状，而粉虱传毒的三七苗症状不明显，但通过PCR检测均能检测到TYLCCNV和TYLCCB。通过分子生物学和生物学的方法证实了TYLCCNV及TYLCCNB对三七的侵染，完成了柯赫氏法则的验证，这是TYLCCNV及TYLCCNB侵染人参属植物的首次报道。以三七病叶、dsRNA和病毒提纯产物为接种材料，将其摩擦接种于供试植株中，接种一月之久，大部分寄主表现出褪绿黄化的症状，但经RT-PCR检测后，PnVY的寄主只有有茄科的黄烟、辣椒和豆科的豇豆。对文山、红河、昆明、曲靖等地的三七种植园进行了病害调查和相关病毒的检测。发现三七病毒病的症状类型多样，发病率逐年增加，且田间表现复合症状的居多。初步建立了PnVY和TYLCCNV的双重PCR检测体系，该体系能够快速及时准确的对三七田间这两种病毒的发生开展检测及分析。运用双重PCR检测体系对不同地区三七病样的PnVY和TYLCCNV的带毒率进行检测，发现由两种病毒复合侵染的现象较多，复合侵染率在38.7%50.0%之间，且从整体来讲，PnVY对三七的侵染率最高。获得了5个PnVY分离物的全基因组序列、6个TYLCCNV分离物基因组全序列及4个TYLCCNB的基因组全序列，并对其进行基因组结构分析及系统进化分析，推测三七病毒病复杂多样的症状类型可能与TYLCCNV及TYLCCNB无太大相关性，但可能与PnVY的基因组结构相关，尤其是PnVY的P1蛋白可能与三七症状多样性相关。
李夏莲[8]（2012）在《侵染烟草、萝卜的芜菁花叶病毒CP基因序列差异及烟蚜传毒能力研究》文中研究表明烟草是我国重要的经济作物。在烟草生产中烟草花叶病发生普遍,对烟叶产量和烤烟质量造成巨大损失,严重制约烟区烟叶生产。烟草花叶病可由烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）,马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）以及近年来新发现的芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）侵染引起。田间主要由烟蚜（Myzus persicae Sulzer）进行非持久性传播。目前,TuMV在烟田发生已呈现出逐年扩散的趋势。田间症状表现更加复杂并已造成严重危害,已成为烟草作物上的一种新的病毒病害。TuMV主要侵染十字花科作物,田间侵染烟草的TuMV是否发生变异,介体蚜虫传毒能力有何变化,目前尚无研究和报道。本论文以侵染烟草的芜菁花叶病毒和介体烟蚜为对象,应用媒介昆虫学及分子生物学的相关技术手段,比较研究了重庆地区烟草花叶病病原种类、烟田有翅蚜发生动态与烟草花叶病发生的关系、影响蚜虫传毒能力的侵染烟草和萝卜的TuMV外壳蛋白CP基因序列差异,烟蚜不同实验种群传播烟草TuMV的能力,为蚜传非持久性病毒传毒机制研究以及烟草TuMV的综合治理提供依据。本论文主要研究结果如下：1武隆烟区有翅蚜发生动态与烟草花叶病发生的关系通过对武隆烟区烟田黄板诱蚜及鉴定发现,诱集的有翅蚜主要有4种,即烟蚜、萝卜蚜、大豆蚜,棉蚜。其中烟蚜数量最多,所占比例最大。但仅有烟蚜能够在烟株上定殖。田间烟草花叶病的发生与有翅蚜的迁入动态紧密相关。2011年武隆烟区烟草花叶病在7月上旬始发,到7月中下旬盛发,至7月底8月初烟草花叶病的发生趋于平稳。而有翅蚜迁入烟田的高峰期为7月中旬,加上烟草花叶病的潜育期,结果表明烟草花叶病的发生和有翅蚜迁入数量的增加在时间上相吻合。2烟草花叶病病原的检测鉴定从武隆烟区采集的100多个烟草花叶病样品中随机选取24个待测样品进行间接ELISA检测。结果表明,24个检测样品均感染了TMV、CMV、PVY、TuMV,4种病毒100%复合侵染,但各病毒含量有显着的差异。其中PVY含量最高,TuMV次之,CMV最低。结果表明武隆烟区田间烟草花叶病病毒复合侵染现象严重,PVY、TuMV己成为武隆烟区的优势毒原。3侵染烟草和萝卜TuMV CP基因的克隆及序列分析克隆了侵染烟草和萝卜上的TuMV的CP基因,其核苷酸序列长度分别是986bp和984bp,分别编码326个和307个氨基酸。对二者CP核苷酸序列、氨基酸序列进行比较,发现在TuMV的CP核苷酸序列上有14个位点发生变化,在氨基酸序列上有8个位点发生突变,但是二者CP基因编码的氨基酸均含有蚜虫传播TuMV所必需的DAG基序。相似性比较结果表明,本研究克隆的两个CP基因序列的核苷酸相似性为98.6%,氨基酸相似性为96.4%。4烟蚜传播TuMV的传毒效率研究取食不同寄主的烟蚜传播TuMV的效率不同。在每健株接获毒无翅成蚜10头的条件下,取食烟草的烟蚜传毒效率最高,发病率为85%,取食萝卜的次之,发病率为65%,取食甘蓝的烟蚜最低,发病率为40%；同时,取食烟草的烟蚜导致供试烟株发病时间最早,取食甘蓝的最晚,萝卜次之。不同虫口密度下烟蚜传毒效率差异显着。5个处理按照供试烟株发病率高低顺序依次排列是：20头=15头>10头>5头>1头,其中,虫口密度是15,20头时,烟蚜传毒效率最高,供试烟株发病率达到100%,发病时间出现最早；而虫口密度为1头时,烟蚜传毒效率最低,供试烟株的发病率为25%,发病时间也较晚。
龙亚芹,王万东,左瑞娟,李凡,尹朝先,陈海如[9]（2011）在《烟草丛顶病毒（TBTV）ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用》文中研究说明为制备烟草丛顶病毒（TBTV）ORF3和ORF4多克隆抗体,采用RT-PCR方法克隆了TBTV保山龙陵分离物（TBTV-BSLLi）的ORF3和ORF4,亚克隆至pMD18-T载体中,经测序正确后,将该基因插入原核表达载体pET28a（+）中,通过热击转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（plysS）,以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达,并经Ni2+亲和柱层析纯化,成功地克隆了TBTV的ORF3和ORF4,建立了其原核表达和表达产物的纯化体系,获得了高纯度的ORF3、ORF4蛋白。用纯化的蛋白免疫大白兔,获得高效价的特异性抗血清。DAS-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间烟草（Nicotiana tabacumL.）样品及传播介体的检测。本研究为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件。
李华[10]（2008）在《烟草马铃薯Y病毒（PVY）病株及温度对烟蚜生长发育的影响》文中指出烟蚜Myzus persicae（Sulzer）又名桃蚜,是我国各烟区烟草上的主要害虫之一,也是传播马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）的主要媒介昆虫。近几年来的调查研究表明,马铃薯Y病毒（PVY）在我国烟区为害成逐年上升的趋势。本文对重庆烟区烟草上的PVY病原进行了分离和鉴定,测定了烟蚜传播马铃薯Y病毒（PVY）的能力,并从烟草PVY病株、温度对烟蚜种群生命表参数的影响三方面研究了烟草PVY病株、温度对烟蚜种群系统的作用。本文主要研究结果如下:1烟草马铃薯Y病毒（PVY）病原的分离与鉴定利用PVY的鉴别寄主三生烟和枯斑寄主苋色藜对PVY进行了分离,并用鉴别寄主谱和间接EUSA对分离的PVY进行了生物学和血清学鉴定,建立了PVY实验室毒源。在进行病毒鉴定时,待测病毒在云烟85、云烟87、普通烟、心叶烟和三生烟上呈现系统花叶症状,叶片上有斑驳,稍微扭曲畸形;在苋色藜上呈现局部枯斑症状;在千日红上不侵染。待测病毒样品OD＞0.5,样品OD/阴性对照OD≥2,这表明待测病毒为马铃薯Y病毒（PVY）。2烟蚜传播马铃薯Y病毒（PVY）的研究利用毒源植物饲毒法研究了烟蚜传播马铃薯Y病毒的获毒时间、传毒时间、传毒蚜量以及不同虫态对传毒效应的影响。结果表明:烟蚜在0.5min时间就能获毒或传毒,而且发病率随着获毒时间与传毒时间的增加而提高。当获毒时间和传毒时间超过3min时,发病率提高幅度减缓。每株烟株1头烟蚜成虫便可传毒,传毒烟蚜数量在1头/株到3头/株时,随着烟蚜数量增加,发病率提高得比较明显,当烟蚜数量大于等于5头/株时,发病率提高的趋势就减缓了。若蚜（2-3龄）、无翅成蚜与有翅成蚜均可传毒,无翅成蚜与有翅成蚜比若蚜（2-3龄）的传毒能力强。3烟草PVY病株及温度对烟蚜生长发育的影响在19℃、22℃、25℃、28℃和31℃恒温条件下,研究了在健康烟株上和PVY病株上烟蚜生长发育和产仔量的情况。研究表明,随着温度的升高,在健康烟株上烟蚜的繁殖期、繁殖后期和成虫寿命都显着缩短,产仔量也明显减少。19℃时烟蚜的繁殖期（20.705d）、成虫寿命（24.589d）、产仔量（47.10头）都达到最大值,31℃时繁殖期（4.061d）、成虫寿命（7.242d）、产仔量（6.06头）都降到最小值。净增值率R0和世代平均周期T在19℃时最大,在31℃时最小;周限增长率λ与内禀增长率rm在25℃时最大,在31℃时最小;种群加倍时间t在25℃时最小,31℃时最大。总体看来25℃为烟蚜最适温度。随着温度的升高,在PVY病株上烟蚜的繁殖期、成虫寿命和产仔量也都呈现下降趋势。19℃时烟蚜的繁殖期（19.013d）、成虫寿命（21.191d）、产仔量（38.347头）最大。31℃时繁殖期（2.694d）和成虫寿命（5.611d）最短,产仔量最少（2.722头）。净增值率R0和世代平均周期T在19℃时最大,在31℃时最小;周限增长率λ与内禀增长率rm在19℃和25℃时差异不大,内禀增长率rm在31℃时出现了最小的负值。在同一温度下,在健康烟株上的烟蚜与PVY病株上的烟蚜相比,在发育历期、产仔量以及生命表参数上都有显着的差异,表现在烟蚜取食烟草PVY病株后其若虫期呈现延长趋势,而繁殖期、成虫寿命都显着缩短,产仔量也大大的减少。这说明健康烟株比PVY病株适合烟蚜的生长。因此,25℃的健康烟株最适合烟蚜的生长。
二、烟草丛顶病穴TBTV雪传毒特性及寄主范围研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、烟草丛顶病穴TBTV雪传毒特性及寄主范围研究（论文提纲范文）
（1）烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译中的远距离RNA-RNA互作（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 RNA病毒的不依赖帽子翻译机制 |
| 1.1.1 RNA病毒的5’端核糖体内部进入位点(5’IRES) |
| 1.1.2 RNA病毒的3’端不依赖帽子翻译调控元件(3’CITE) |
| 1.2 烟草丛顶病及烟草丛顶病毒 |
| 1.2.1 烟草丛顶病 |
| 1.2.2 烟草丛顶病毒 |
| 1.2.3 烟草丛顶病毒的不依赖帽子翻译 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、抗体 |
| 2.1.2 所用分子生物学试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 引物合成和测序 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 碱裂解法小量提质粒 |
| 2.2.2 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.2.3 重叠PCR反应 |
| 2.2.4 酶切反应 |
| 2.2.5 连接反应 |
| 2.2.6 核酸的沉淀和浓缩 |
| 2.2.7 PCR产物或酶切产物的胶回收 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.10 菌落PCR筛选突变体质粒 |
| 2.2.11 体外转录 |
| 2.2.12 小麦胚芽提取物(WGE)中的体外翻译 |
| 2.2.13 考马斯亮蓝染色 |
| 2.2.14 Western Blot分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TBTV RI区嵌合突变体通过影响远距离RNA-RNA互作调控翻译 |
| 3.2 TBTV RI区调控远距离互作的分子开关定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 3 ’CITE介导的翻译增强机制 |
| 4.2 TBTV不依赖帽子翻译中的3’CITE元件 |
| 4.3 TBTV不依赖帽子翻译中的远距离RNA-RNA互作 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附表1引物列表 |
| 附表2质粒列表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）烟草丛顶病病原病毒复合体各组分传播特性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、前言 |
| 1.1 烟草丛顶病研究概况 |
| 1.1.1 烟草丛顶病的发生与分布 |
| 1.1.2 烟草丛顶病的病原物 |
| 1.1.3 烟草丛顶病的分子生物学特性 |
| 1.2 烟草丛顶病症状和传播途径 |
| 1.2.1 烟草丛顶病症状 |
| 1.2.2 烟草丛顶病的寄主范围 |
| 1.2.3 烟草丛顶病的传播特性 |
| 1.3 幽影病毒属相关研究进展 |
| 1.3.1 幽影病毒属的基本特性 |
| 1.3.2 幽影病毒属代表病害及基因组特性 |
| 1.3.2.1 花生丛簇病 |
| 1.3.2.2 胡萝卜斑驳病毒 |
| 1.4 黄症病毒科研究进展 |
| 1.4.1 马铃薯卷叶病毒属代表病毒及生物学特性 |
| 1.4.2 马铃薯卷叶病毒 |
| 1.4.3 大麦黄矮病毒 |
| 1.5 植物病毒互作机制的研究 |
| 1.5.1 植物病毒传播特性 |
| 1.5.2 黄症病毒科与幽影病毒属病毒及其卫星RNA在传播中的关系 |
| 1.6 农杆菌介导的病毒侵染性克隆 |
| 1.6.1 农杆菌 |
| 1.6.2 农杆菌渗滤 |
| 1.7 目的与意义 |
| 二、材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 相关试剂及仪器 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.2 病毒复合体组分互作研究 |
| 2.2.1 农杆菌浸润实验 |
| 2.2.1.1 质粒提取 |
| 2.2.1.2 GV3101感受态细胞制备 |
| 2.2.1.3 电击转化GV3101感受态细胞 |
| 2.3 TVDV、TBTV、TBTV SatRNA、TVDVaRNA不同组合接种实验 |
| 2.3.1 单菌落培养 |
| 2.3.2 扩大培养 |
| 2.3.3 渗滤Buffer液重悬浮 |
| 2.3.4 农杆菌渗滤接种病毒方法 |
| 2.3.5 植物总RNA的提取 |
| 2.3.6 去除基因组DNA |
| 2.3.7 RT-PCR检测 |
| 2.3.8 蚜虫传播实验 |
| 2.3.9 提取蚜传烟样总RNA |
| 2.3.10 RT-PCR检测 |
| 2.4 未定性病毒RNA组分序列鉴定 |
| 2.4.1 制备烟草丛顶病侵染的烟草样品 |
| 2.4.2 病毒粒体的提纯方法: |
| 2.4.3 未定性病毒RNA组分测序鉴定 |
| 2.4.3.1 RNA质检、定量及纯化 |
| 2.4.3.2 建库 |
| 三 结果与分析 |
| 3.1 烟草丛顶病病原病毒复合体各个RNA组分的蚜虫传播关系 |
| 3.1.1 农杆菌渗滤接种侵染实验 |
| 3.1.1.1 各种不同侵染组合总RNA RT-PCR验证 |
| 3.1.1.2 不同侵染组合在本氏烟上的症状 |
| 3.1.2 蚜虫传播实验 |
| 3.1.2.1 本氏烟蚜传烤烟总RNA RT-PCR验证 |
| 3.1.2.2 不同病毒组合经蚜虫从本氏烟向其他烤烟传播后植株症状 |
| 3.1.2.3 不同病毒组合经蚜虫从烤烟向烤烟传播 |
| 3.2 病毒组分RNA5序列鉴定 |
| 3.2.1 病毒提纯 |
| 3.2.2 RNA质检、定量及纯化 |
| 四 结论和讨论 |
| 4.1 烟草丛顶病病原病毒复合体各组分不同组合在植物上引起的症状 |
| 4.2 烟草丛顶病病原病毒复合体中各组分的不同组合的蚜虫传播特征 |
| 4.3 在烟草上发现的一种新的呼肠孤病毒 |
| 附录一、英文缩略表 |
| 附录二、候选序列 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础与分子进化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 真核细胞典型的依赖帽子翻译起始 |
| 1.2 植物RNA病毒不依赖帽子翻译机制的研究进展 |
| 1.2.1 植物RNA病毒的5’IRES元件 |
| 1.2.2 植物RNA病毒的3’CITE元件 |
| 1.3 植物RNA病毒的分子进化 |
| 1.4 RNA结构分析方法 |
| 1.5 烟草丛顶病毒的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、抗体、悬浮细胞 |
| 2.1.2 烟草丛顶病样品 |
| 2.1.3 所用载体及试剂 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.1.5 引物合成和测序 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取 |
| 2.2.2 RT-PCR检测 |
| 2.2.3 重叠PCR |
| 2.2.4 cDNA末端快速扩增(RACE) |
| 2.2.4.1 cDNA5’末端快速扩增(5’RACE) |
| 2.2.4.2 cDNA3’末端快速扩增(3’RACE) |
| 2.2.5 核酸的沉淀和浓缩 |
| 2.2.6 PCR产物或酶切产物的胶回收 |
| 2.2.7 连接反应 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.2.10 菌落PCR筛选重组质粒 |
| 2.2.11 Cracking快速鉴定 |
| 2.2.12 酶切鉴定法 |
| 2.2.13 酶切反应 |
| 2.2.14 碱裂解法小量提质粒 |
| 2.2.15 体外转录 |
| 2.2.16 5 ’加帽体外转录反应体系 |
| 2.2.17 在麦胚提取物(WheatGermExtract)中的体外翻译 |
| 2.2.18 拟南芥原生质体的制备与侵染 |
| 2.2.18.1 拟南芥愈伤组织的培养 |
| 2.2.18.2 原生质体的制备 |
| 2.2.18.3 原生质体的侵染 |
| 2.2.19 WesternBlot分析 |
| 2.2.20 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.2.21 RNA体外结构分析技术---In-lineprobing |
| 2.2.22 RNA体外结构分析技术-SHAPE(selective2-hydroxyl acylation analyzed by primer extension,SHAPE) |
| 2.2.22.1 RNA的处理 |
| 2.2.22.2 引物标记 |
| 2.2.22.3 SHAPE反应 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TBTV新分离物全基因组克隆与序列进化分析 |
| 3.1.1 TBTV新分离物的全基因组克隆 |
| 3.1.2 TBTV的分子变异与进化分析 |
| 3.1.2.1 TBTV的分子变异 |
| 3.1.2.2 TBTV系统进化树 |
| 3.1.2.3 TBTVRNA重组分析 |
| 3.2 TBTV不依赖帽子翻译元件BTE元件的结构特征 |
| 3.2.1 BTE元件对Fluc报告基因的调控作用验证 |
| 3.2.2 BTE元件对TBTV病毒全长p35蛋白的翻译调控作用 |
| 3.3 TBTV不依赖帽子翻译元件BTE元件的分子进化 |
| 3.3.1 TBTV不同分离物的复制效率与p35蛋白表达分析 |
| 3.3.2 TBTVp35蛋白差异表达的调控区域定位 |
| 3.3.3 RV区调控p35蛋白差异表达的分子基础 |
| 3.3.3.1 RV区中造成p35降低的突变位点定位 |
| 3.3.3.2 TBTV不同分离物中BTE的结构变异与p35蛋白表达的关系 |
| 3.3.3.3 TBTV弱毒分离物的BTE结构变异导致p35蛋白表达量的降低 |
| 3.3.4 RI区调控p35蛋白差异表达的内在机理 |
| 3.4 TBTV不依赖帽子翻译元件类TSS元件的定位与结构特征分析 |
| 3.4.1 TBTV中新的不依赖帽子翻译元件定位 |
| 3.4.1.1 缺失定位 |
| 3.4.1.2 缺失突变体元件的结构分析 |
| 3.4.1.3 类TSS元件与BTE元件的翻译活性分析 |
| 3.4.1.4 类TSS元件的结构特征 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TBTV分子进化 |
| 4.2 TBTV中的不依赖帽子翻译元件 |
| 4.3 类BTE元件在TBTV不同分离物的结构进化分析 |
| 4.4 CITE的分子进化 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 附录 |
（4）烟草丛顶病毒RNA依赖RNA聚合酶的-1型移码翻译机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 RNA病毒基因组的表达策略 |
| 1.2 真核生物常规性蛋白表达机制 |
| 1.2.1 翻译的起始 |
| 1.2.2 翻译的延伸 |
| 1.2.3 翻译的终止 |
| 1.2.4 核糖体的再循环 |
| 1.3 RNA病毒采用的非典型蛋白翻译表达机制 |
| 1.3.1 核糖体内部进入位点（Internal Ribosome Entry Site，IRES）策略 |
| 1.3.2 渗漏扫描（Leaky scanning）策略 |
| 1.3.3 非AUG起始（Non-AUG initiation）策略 |
| 1.3.4 核糖体分流（Ribosome shunting）策略 |
| 1.3.5 翻译的重起始（Reinitiation）策略 |
| 1.3.6 核糖体跳跃(Stop-Carry on/Ribosomal skipping)策略 |
| 1.3.7 通读(Readthrough)策略 |
| 1.3.8 移码（Frameshifting）策略 |
| 1.3.9 移码与通读的异同点 |
| 1.4 烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus, TBTV） |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株 |
| 2.1.2 分子生物学试剂 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 聚合酶链式反应（PCR） |
| 2.2.2 重叠延伸PCR |
| 2.2.3 核酸的沉淀及浓缩 |
| 2.2.4 质粒或片段的酶切 |
| 2.2.5 PCR产物或酶切产物的切胶回收 |
| 2.2.6 连接反应 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞DH5α 的转化 |
| 2.2.8 质粒小量提取（碱裂解法） |
| 2.2.9 体外转录制备RNA |
| 2.2.10 RNA沉淀浓缩 |
| 2.2.11 体外翻译（在WGE中）及检测 |
| 2.2.12 Western Blot分析 |
| 2.2.13 核酸 5’末端的同位素标记及后处理 |
| 2.2.13.1 RNA的脱磷酸化反应 |
| 2.2.13.2 RNA的 5'末端标记反应 |
| 2.2.13.3 RNA片段的同位素标记反应的后处理 |
| 2.2.14 EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 凝胶迁移 |
| 2.2.14.1 RNA的变性---自然复性（Slow-cool down）处理 |
| 2.2.14.2 RNA-RNA结合试验 |
| 2.2.15 线性化切割结构分析（In-line probing） |
| 2.2.15.1 碱水解marker反应 |
| 2.2.15.2 Rnase T1酶解反应 |
| 2.2.15.3 线性化切割反应 |
| 2.2.16 SHAPE |
| 2.2.16.1 RNA folding反应 |
| 2.2.16.2 RNA modification反应 |
| 2.2.16.3 Primer extension and RNA sequencing反应 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TBTV Rd Rp -1 型移码相关的七核苷酸滑动序列 |
| 3.1.1 TBTV Rd Rp -1 型移码的七核苷酸滑动序列预测 |
| 3.1.2 TBTV -1 型移码的七核苷酸滑动序列的突变分析 |
| 3.2 七核苷酸滑动序列与下游二级结构元件之间的距离效应 |
| 3.3 调控TBTV Rd Rp -1 型移码的局部RNA元件 |
| 3.3.1 TBTV -1 型移码位点附近的调控区域突变分析 |
| 3.3.2 移码区二级结构的解析 |
| 3.3.3 移码区茎环结构突变体对移码效率的影响 |
| 3.4 影响TBTV -1 型移码的远距离互作元件 |
| 3.4.1 TBTV基因组中远距离RNA-RNA互作区域的确定 |
| 3.4.2 TBTV 3’末端区域结构分析以及远距离互作位点的定位 |
| 3.4.3 远距离RNA-RNA互作位点的突变验证 |
| 3.4.4 与下游结构元件发生远距离RNA-RNA互作位点的定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 七核苷酸滑动序列的保守性 |
| 4.2 七核苷酸滑动序列临近下游的激发元件 |
| 4.3 假节点对移码的影响 |
| 4.4 七核苷酸滑动序列与临近下游激发元件之间的距离关系 |
| 4.5 远距离互作元件 |
| 4.6 TBTV Rd Rp -1 位移码调控模型 |
| 4.7 RNA结构体外分析 |
| 4.8 体外翻译体系（WGE）的应用 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 附录 |
（5）云南烟草丛顶病复合病原物的寄主范围（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1感染烟草丛顶病的烟株 |
| 1.2传毒蚜虫 |
| 1.3测试寄主的培育 |
| 1.4蚜虫传毒测试寄主范围及TBTD相关病毒检测 |
| 1.5接种植物总RNA提取 |
| 1.6接种植物中TBTD的4种病原物RT-PCR检测 |
| 2结果与分析 |
| 2.1蚜虫传毒接种寄主的症状反应 |
| 2.2RT-PCR检测接种植物中云南烟草丛顶病的4种病原物 |
| 3讨论 |
（6）烟草丛顶病毒复制酶的移码翻译调控和基因组复制的定量研究系统的初创（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 烟草丛顶病毒 |
| 1.2 RNA病毒基因组的表达策略 |
| 1.3 RNA病毒的基因组复制 |
| 1.4 本研究的研究目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株、植物种子 |
| 2.1.2 感病叶片 |
| 2.1.3 分子生物学试剂 |
| 2.1.4 主要试验仪器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 质粒小量提取(碱裂解法) |
| 2.2.2 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.2.3 重叠延伸PCR |
| 2.2.4 核酸的沉淀及浓缩 |
| 2.2.5 质粒或片段的酶切 |
| 2.2.6 PCR产物或酶切产物的回收 |
| 2.2.7 连接反应 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21(DE3)Rosetta制备 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21(DE3)Rosetta的转化 |
| 2.2.10 菌落PCR筛选重组质粒 |
| 2.2.11 原核表达 |
| 2.2.12 原核表达产物的可溶性检测 |
| 2.2.13 可溶性蛋白的Ni-NTA Resin亲和层析纯化(His标签) |
| 2.2.14 可溶性蛋白的Amylose Resin亲和柱层析纯化(MBP标签) |
| 2.2.15 蛋白的切胶纯化 |
| 2.2.16 抗血清的制备 |
| 2.2.17 间接ELISA测效价 |
| 2.2.18 抗原亲和纯化 |
| 2.2.19 Western Blot分析 |
| 2.2.20 体外转录制备RNA |
| 2.2.21 体外翻译及检测 |
| 2.2.22 原生质体的侵染 |
| 2.2.23 RdRp介导的体外复制实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TBTV复制酶的移码翻译机制的定量研究体系的创建 |
| 3.1.1 TBTV ORF1蛋白多克隆抗体的制备 |
| 3.1.1.1 TBTV ORF1原核表达载体的构建 |
| 3.1.1.2 TBTV ORF1的原核表达及纯化 |
| 3.1.1.3 TBTV ORF1抗血清的制备、效价测定以及免疫原性分析 |
| 3.1.1.4 TBTV ORF1抗血清的抗原亲和纯化 |
| 3.1.1.5 TBTV ORF1多抗的应用性分析 |
| 3.1.2 TBTV ORF2移码翻译机制的定性 |
| 3.1.3 海肾荧光素酶(Renilla luciferase,Rluc)多克隆抗体的制备 |
| 3.1.3.1 Rluc原核表达载体的构建 |
| 3.1.3.2 Rluc蛋白的原核表达及纯化 |
| 3.1.3.3 Rluc抗血清的制备、效价测定以及免疫原性分析 |
| 3.1.3.4 Rluc抗血清的抗原亲和纯化 |
| 3.1.3.5 Rluc多抗的应用性分析 |
| 3.1.4 TBTV移码翻译机制的定量研究体系的初步创建 |
| 3.2 TBTV RdRp介导的体外复制研究体系的创建 |
| 3.2.1 TBTV RdRp的获得 |
| 3.2.1.1 TBTV ORF1/ORF2融合蛋白的原核表达载体构建 |
| 3.2.1.2 TBTVORF1/ORF2融合蛋白的原核表达及可溶性分析 |
| 3.2.2 TBTV ORF1/ORF2融合蛋白介导的体外复制体系的创建 |
| 3.2.2.1 RNA模板的制备 |
| 3.2.2.2 TBTV ORF1/ORF2融合蛋白介导的体外复制体系的初试 |
| 3.3 其它工作 |
| 3.3.1 TBTV ORF3和ORF4蛋白的纯化 |
| 3.3.2 涉及TBTV ORF2移码定量研究的缺失突变载体的构建 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于原核表达 |
| 4.2 关于抗血清/多克隆抗体的制备 |
| 4.3 关于TBTV ORF2的移码翻译机制定性及定量研究体系的创建 |
| 4.4 关于TBTV RdRp介导的基因组复制的研究体系的创建 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附表1 引物列表 |
| 附表2 质粒列表 |
（7）三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 三七病毒病病原鉴定的研究概况 |
| 1.2 PnVY 的发现及其基因组结构 |
| 1.3 马铃薯 Y 病毒属病毒简介及部分基因功能 |
| 1.4 双生病毒的研究概况 |
| 1.4.1 双生病毒的分类、寄主范围及介体传播 |
| 1.4.2 双生病毒的危害 |
| 1.5 TYLCCNV 和 TYLCCNB 的研究概况 |
| 1.5.1 TYLCCNV 和 TYLCCNB 的生物学特性及其基因组结构 |
| 1.5.2 TYLCCNV 和 TYLCCNB 在中国的研究现状 |
| 1.5.3 TYLCCNV 在云南的发生分布及其遗传多样性 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常用分子生物学试剂和仪器 |
| 2.1.2 常用缓冲液及培养基配方 |
| 2.1.3 菌种及载体 |
| 2.2 侵染三七的病毒种类鉴定 |
| 2.2.1 三七病叶 dsRNA 的提取 |
| 2.2.2 cDNA 文库构建 |
| 2.2.3 三七病叶的病毒提纯 |
| 2.2.4 提纯病毒的负染、SDS-PAGE 电泳及质谱分析 |
| 2.2.5 三七病样总核酸的提取 |
| 2.2.6 PnVY 寄主范围的测定 |
| 2.2.7 检测引物的序列 |
| 2.2.8 RT-PCR 及 PCR 检测 |
| 2.2.9 PCR 产物的纯化回收、克隆及序列拼接、确认及提交 |
| 2.2.10 TYLCCNV 及 TYLCCNB 对三七的侵染 |
| 2.3 三七病毒病田间调查及 PnVY、TYLCCNV 双重 PCR 检测方法建立 |
| 2.3.1 三七病毒病田间调查时间与地点 |
| 2.3.2 CTAB 法提取总核酸 |
| 2.3.3 双重 PCR 检测方法的建立 |
| 2.3.4 田间样品分子检测统计 |
| 2.4 侵染三七的 PnVY 及 TYLCCNV 不同分离物间全基因组分子变异 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 CTAB 法提取总核酸 |
| 2.4.3 引物的设计与序列 |
| 2.4.4 RT-PCR 检测、纯化回收，克隆及序列拼接、确认及提交 |
| 2.4.5 不同 PnVY 分离物的基因组序列分析 |
| 2.4.6 不同 TYLCCNV 和 TYLCCNB 分离物的基因组序列分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 侵染三七的病毒种类的鉴定 |
| 3.1.1 可能引起三七病毒病的其他病毒 RT-PCR 检测结果 |
| 3.1.2 TYLCCNV 及 TYLCCNB 对三七的侵染 |
| 3.1.3 dsRNA 电泳检测 |
| 3.1.4 cDNA 文库构建 |
| 3.1.5 电镜观察 |
| 3.1.6 SDS-PAGE 电泳及蛋白质质谱分析 |
| 3.1.7 SbDV 的 RT-PCR 检测 |
| 3.2 PnVY 寄主范围测试 |
| 3.2.1 三七病样 dsRNA 提取产物和提纯病毒的 RT-PCR 检测结果 |
| 3.2.2 供试寄主的症状类型及 RT-PCR 检测结果 |
| 3.3 三七病毒病田间调查及 PnVY 和 TYLCCNV 分子检测 |
| 3.3.1 田间三七病毒病症状类型 |
| 3.3.2 田间三七病毒病的发生特点 |
| 3.3.3 双重 RT-PCR 检测体系的初步建立 |
| 3.3.4 田间三七病样的 PnVY 和 TYLCCNV 分子检测统计 |
| 3.4 侵染三七的 PnVY 及 TYLCCNV 不同分离物的分子变异 |
| 3.4.1 不同 PnVY 分离物的基因组全序列分析 |
| 3.4.2 不同 TYLCCNV 分离物的基因组全序列比较分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 三七病毒病可能的其他病原 |
| 4.1.1 dsRNA 分析技术 |
| 4.1.2 ToMV、CMV 及 SbDV 等三七上可能存在的病毒病原 |
| 4.1.3 TYLCCNV 和 TYLCCNB 对三七的致病性及危害 |
| 4.1.4 PnVY 寄主范围的测试 |
| 4.2 双重 RT-PCR 检测 PnVY 与 TYLCCNV 体系的建立 |
| 4.3 三七病毒病的田间调查及症状类型与病毒病原的相关性 |
| 4.4 不同 PnVY 分离物编 P1 的氨基酸变异 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 发表的文章及授权专利 |
（8）侵染烟草、萝卜的芜菁花叶病毒CP基因序列差异及烟蚜传毒能力研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 TuMV的研究进展 |
| 1.1 TuMV的生物学特性 |
| 1.2 TuMV基因组结构和功能 |
| 1.3 TuMV的CP基因研究进展 |
| 1.4 TuMV的检测鉴定技术 |
| 2 烟蚜的研究进展 |
| 2.1 烟蚜的生物学、生态学特性 |
| 2.2 对烟株的危害 |
| 2.3 烟蚜传播非持久性病毒的蚜传机理 |
| 引言 |
| 第二章 武隆地区烟草花叶病和介体蚜虫发生情况田间调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验地点 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.4 试验方法 |
| 1.5 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 蚜虫田间种群数量消长动态 |
| 2.2 有翅蚜发生与烟草花叶病的关系 |
| 3 讨论 |
| 第三章 烟草花叶病毒病样品的病原种类检测 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病原种类 |
| 2.2 烟草TuMV流行分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 侵染烟草和萝卜的TuMV CP基因序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 RT-PCR结果 |
| 2.2 RT-PCR产物的克隆及重组子鉴定 |
| 2.3 序列测定与分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 烟蚜不同实验种群传播烟草TuMV的能力 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 取食不同寄主的烟蚜传毒效率测定 |
| 2.2 不同虫口密度下烟蚜传毒效率测定 |
| 3 讨论 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）烟草丛顶病毒（TBTV）ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用（论文提纲范文）
| 1 结果 |
| 1.1 目的片段及序列测定 |
| 1.2 原核表达载体的构建 |
| 1.3 重组ORF3和ORF4的诱导表达及鉴定 |
| 1.4 表达产物的纯化 |
| 1.5 抗血清的制备及效价测定 |
| 1.6 抗血清的Western的鉴定 |
| 1.7 抗血清的初步应用 |
| 1.7.1 DAS-ELISA检测不同地区、烟株不同部位的带毒率 |
| 1.7.2 DAS-ELISA检测传毒介体蚜虫的带毒率 |
| 2 讨论 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 RT-PCR扩增 |
| 3.2.2 PCR产物的克隆 |
| 3.2.3 ORF3和ORF4原核表达载体的构建 |
| 3.2.4 ORF3、ORF4的诱导表达及SDS-PAGE检测 |
| 3.2.5 ORF3和ORF4融合蛋白的纯化 |
| 3.2.6 TBTV ORF3和ORF4抗血清的制备及效价测定 |
| 3.2.7 抗血清的初步应用 |
（10）烟草马铃薯Y病毒（PVY）病株及温度对烟蚜生长发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1 烟蚜研究进展 |
| 1.1 烟蚜的寄主范围和危害 |
| 1.2 烟蚜的生物学、生态学特性 |
| 1.3 烟蚜的传毒特性 |
| 2 烟草马铃薯Y病毒的研究进展 |
| 2.1 烟草PVY的生物学特性 |
| 2.2 危害与症状 |
| 2.3 传播途径 |
| 2.4 分离方法 |
| 2.5 检测方法 |
| 前言 |
| 第2章 烟草马铃薯Y病毒(PVY)的分离和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鉴别寄主鉴定结果 |
| 2.2 间接ELISA检测结果 |
| 3 讨论 |
| 第3章 烟蚜传播马铃薯Y病毒(PVY)的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同获毒时间对传毒效应的影响 |
| 2.2 烟蚜传毒时间对传毒效应的影响 |
| 2.3 烟蚜数量对传毒效应的影响 |
| 2.4 不同虫态对传毒效应的影响 |
| 3 讨论 |
| 第4章 烟草PVY病株及温度对烟蚜生长发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 分级标准 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 温度对烟蚜生长发育及产仔量的影响 |
| 2.2 烟草PVY病株对烟蚜生长发育及产仔量的影响 |
| 2.3 温度对烟蚜存活率的影响 |
| 2.4 PVY病株对烟蚜存活率的影响 |
| 2.5 不同温度下健康烟株上烟蚜的种群主要生命表参数 |
| 2.6 不同温度下PVY病株上烟蚜的种群主要生命表参数 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、烟草丛顶病穴TBTV雪传毒特性及寄主范围研究（论文参考文献）
- [1]烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译中的远距离RNA-RNA互作[D]. 窦宝存. 山东农业大学, 2020
- [2]烟草丛顶病病原病毒复合体各组分传播特性的研究[D]. 张未. 云南大学, 2019(03)
- [3]烟草丛顶病毒不依赖帽子翻译机制的RNA结构基础与分子进化[D]. 王德亚. 山东农业大学, 2017(08)
- [4]烟草丛顶病毒RNA依赖RNA聚合酶的-1型移码翻译机制研究[D]. 于成明. 山东农业大学, 2017(08)
- [5]云南烟草丛顶病复合病原物的寄主范围[J]. 马普权,刘芳,谭冠林,田芝花,李凡. 云南农业大学学报(自然科学), 2015(03)
- [6]烟草丛顶病毒复制酶的移码翻译调控和基因组复制的定量研究系统的初创[D]. 王国鲁. 山东农业大学, 2014(01)
- [7]三七病毒病病原种类鉴定及其相关病毒分子变异分析[D]. 李晓静. 云南农业大学, 2014(12)
- [8]侵染烟草、萝卜的芜菁花叶病毒CP基因序列差异及烟蚜传毒能力研究[D]. 李夏莲. 西南大学, 2012(08)
- [9]烟草丛顶病毒（TBTV）ORF3和ORF4的原核表达、抗血清制备及应用[J]. 龙亚芹,王万东,左瑞娟,李凡,尹朝先,陈海如. 农业生物技术学报, 2011(02)
- [10]烟草马铃薯Y病毒（PVY）病株及温度对烟蚜生长发育的影响[D]. 李华. 西南大学, 2008(09)