一、紫杉醇诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡及对磷酸化Bcl-2的影响（论文文献综述）
李文杰[1]（2021）在《鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究》文中研究指明鸡贫血病毒VP3基因表达的凋亡蛋白Apoptin在正常细胞中无细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导细胞发生凋亡。表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3能够在多种肿瘤细胞中特异性表达Apoptin蛋白并诱导肿瘤细胞凋亡,且Ad-VT可以在肿瘤细胞中特异性复制起到溶瘤作用。癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年乳腺癌超越肺癌成为发病率第一的癌症;并且女性中乳腺癌的死亡率居女性癌症死亡率首位。目前针对乳腺癌的治疗方法副作用大,对转移患者疗效欠佳,并且患者经治疗后仍有复发的风险。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。在癌症内部有一部分细胞被称为癌症起始细胞或癌症干细胞,这部分细胞在癌症起始、治疗抵抗、转移和复发中起关键作用。这意味着,以乳腺癌干细胞为靶标可能是根除乳腺癌的有前途的治疗策略。迄今为止,还没有针对癌症干细胞的特定药物。因此,诱导癌症干细胞分化并靶向杀伤癌症干细胞可能有助于开发针对癌症的新的治疗策略,在治疗癌症时可能具有临床优势。本研究目的是富集分选表型为CD44+CD24-的乳腺癌干细胞,对其干细胞特性进行分析。利用本课题组前期构建的表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3作用于乳腺癌干细胞,分析重组腺病毒对细胞的杀伤作用、干性抑制及增加乳腺癌干细胞药物敏感性的作用。通过靶向癌症干细胞,诱导其分化,抑制其治疗抗性寻找临床癌症治疗的新策略。首先是采用无血清悬浮培养与磁珠分选方法富集分选乳腺癌干细胞,对其自我更新、分化、耐药性等进行分析;其次是利用重组腺病毒作用于乳腺癌干细胞,对乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等进行检测分析;之后检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体内肿瘤形成能力的影响、体内肿瘤杀伤作用;最后利用Ad-VT与紫杉醇联合应用于乳腺癌干细胞后,检测乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等,分析Ad-VT是否能够使乳腺癌干细胞对化疗药的敏感性增强,从而抑制癌症干细胞的治疗抗性。本研究主要取得如下结果:1.对乳腺癌干细胞的干性特征进行检测分析后发现,无血清培养条件下,乳腺癌干细胞能够形成乳腺癌细胞球;血清诱导实验显示乳腺癌干细胞能够分化增殖,自我更新能力强于乳腺癌细胞;干细胞调控因子表达上调,过表达与人类肿瘤干细胞相关的多个基因;对化疗药紫杉醇也具有一定的耐药性。2.通过检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体外抑制作用后发现,Ad-VT与Ad-VP3作用下,CD44+CD24-细胞群比例降低,干细胞调控因子表达下调,乳腺癌干细胞干性受到抑制;Ad-VT与Ad-VP3能够抑制细胞增殖;对细胞线粒体膜电位及凋亡蛋白表达进行检测,结果显示Ad-VT与Ad-VP3能够诱导乳腺癌干细胞线粒体途径的凋亡;细胞迁移与侵袭实验结果也显示乳腺癌干细胞的迁移侵袭能力受到抑制。3.检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的小鼠体内抑制作用。小鼠体内成瘤结果显示Ad-VT与Ad-VP3作用后的乳腺癌干细胞干性受到抑制,失去了体内肿瘤形成的能力;将状态良好的乳腺癌干细胞进行小鼠皮下注射荷瘤,重组腺病毒对荷瘤成功的小鼠进行注射治疗,结果显示Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞小鼠荷瘤模型具有体内杀伤作用,能够抑制小鼠体内肿瘤生长。4.Ad-VT与紫杉醇联合作用能够抑制乳腺癌干细胞耐药性,Ad-VT与紫杉醇联合使用后对乳腺癌干细胞的干性抑制、诱导细胞凋亡水平、对细胞的增殖抑制、迁移侵袭抑制均显着强于Ad-VT单独治疗组及紫杉醇单独治疗组,并且联合应用增强了对乳腺癌干细胞的小鼠体内肿瘤形成能力的抑制。综上所述,经富集分选的乳腺癌干细胞具有自我更新、分化、治疗抗性等干细胞特性,表达VP3蛋白的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞具有一定的体内外抑制作用,能够抑制乳腺癌干细胞干性,Ad-VT能够增强乳腺癌干细胞对药物的敏感性,抑制乳腺癌干细胞的治疗抗性,增强化疗药紫杉醇抑制乳腺癌干细胞的作用。
崔璐璐[2]（2021）在《DYNLT1调控细胞周期影响乳腺癌细胞增殖的机制研究》文中指出研究背景:根据WHO在2020年发布的最新数据显示,乳腺癌（breast cancer,BC）已超过肺癌,成为全世界女性发病率最高的恶性肿瘤。预计在2021年底,将有超57万名女性被新确证为乳腺癌,将有超过9万名女性死于乳腺癌。近年乳腺癌的治疗手段不断的更新迭代,无论在化疗方案的多样性,还是手术方式更新和放射治疗,尤其是靶向治疗、内分泌治疗及免疫治疗等不断进步,都为乳腺癌患者带来了更多的获益,大大延长了患者的总生存率和无疾病复发时间,尽管如此,但仍有30%40%的患者因复发转移而死亡。寻找更多乳腺癌的有效治疗靶点,提高乳腺癌的防治效果一直是一个重大的医学研究课题。恶性肿瘤的发生发展、转移通过恶性细胞的不断增殖来实现的,细胞增殖包括4个细胞周期,在这4个细胞周期中,大量的基因参与其中。本研究团队在之前的研究中,通过比较两对乳腺癌耐药组织标本中的转录差异基因,筛选出候选基因——DYNLT1。DYNLT1基因编码的动力蛋白轻链Tctex 1,是细胞质中动力蛋白复合物的几个非催化辅助成分之一,主要参与将动力蛋白连接到货物和调节动力蛋白功能的适配器蛋白中,为囊泡和细胞器提供马达,使其沿着微管在细胞内逆行运动。研究表明,DYNLT1蛋白可参与多种细胞功能,包括膜细胞器的运输,有丝分裂纺锤体定向,核迁移和细胞迁移等。但DYNLT1在乳腺癌中的作用尚未见报道。为进一步探讨DYNLT1在乳腺癌中的作用,本研究拟拟在细胞、动物及临床组织等多个层面,通过基因编辑干预DYNLT1的表达,观察DYNLT1对乳腺癌细胞生长周期从而影响癌细胞对化疗药物紫杉醇敏感性,为寻找乳腺癌治疗新的靶点提供思路。研究方法:1.利用公共平台的生物信息学数据,通过生物信息分析了解DYNLT1表达与临床预后指标（如OS、RFS）的相关性。2.通过慢病毒sh RNA系统构建稳定敲低DYNLT1的ZR 75-30、BT 549乳腺癌细胞株;通过转染过表达载体构建过表达DYNLT1的MDA-MB-231乳腺癌细胞株。3.通过CCK8和克隆形成来检测敲低及过表达DYNLT1后,乳腺癌细胞增殖能力的变化;通过流式分析来检测同步化后再释放,不同时间点（0h、4h、8h、12h、18h和24h）细胞周期的改变;采用q RT-PCR和WB实验检测细胞周期调控蛋白的变化。4.在敲低及过表达DYNLT1的乳腺癌细胞中,分别给予各周期抑制剂（thymidine、hydroxyurea、mimosine、nocodazole）处理,流式分析检测细胞周期的变化,q RT-PCR和WB实验检测细胞周期调控蛋白的表达。5.在敲低及过表达DYNLT1的乳腺癌细胞中,给予周期特异性化疗药物——紫杉醇,通过CCK8实验检测干预DYNLT1表达后细胞对紫杉醇药物毒性的变化;通过流式细胞仪检测细胞凋亡,WB实验检测相关凋亡蛋白表达。6.通过免疫共沉淀收集蛋白并进行质谱分析,分析在DYNLT1表达水平不同状态下,与DYNLT1结合的蛋白表达与细胞周期的关系。7.构建敲低或过表达DYNLT1的乳腺癌细胞原位裸鼠脂肪垫成瘤模型,待瘤体长到100mm3后,将裸鼠分成两组,给药组及未给药组,给药组根据体重腹腔注射紫杉醇（Paclitaxel浓度为1.2mg/ml,10ul/g）,隔2天给药一次。测量并记录裸鼠体重及肿瘤生长情况。瘤体收集后,免疫组化检测各组瘤体中DYNLT1、KI67及周期和凋亡通路相关蛋白的表达。8.收集乳腺癌患者的临床基本资料、病理资料及随访资料,结合免疫组化结果从临床层面分析DYNLT1的表达与乳腺癌临床特征的相关性。结果:1.通过对公共数据库TCGA的数据分析,发现在包括乳腺癌在内的大多数肿瘤中,DYNLT1在正常组织中的表达要明显低于肿瘤组织;同时,生存曲线分析发现,在乳腺癌中,高表达DYNLT1显着缩短患者的总生存时间（P<0.001）和无疾病复发时间（P<0.001）。2.通过CCLE（https://portals.broadinstitute.org/ccle）数据检测DYNLT1在不同亚型乳腺癌细胞株中的表达,结果发现,DYNLT1在ZR 75-30和BT 549乳腺癌细胞株中表达量较高,而在MDA-MB-231乳腺癌细胞中表达较低。在ZR 75-30和BT 549细胞中分别感染DYNLT1 sh RNA慢病毒。q RT-PCR和WB结果发现,ZR 75-30DY-SH及BT 549 DY-SH细胞中DYNLT1的表达量较对照细胞（ZR 75-30 NC-SH及BT 549 NC-SH）分别降低了80.3%±5.7%（p<0.01）、83.2%±2.7%（p<0.01）;同时,在MDA-MB-231细胞中转染DYNLT1过表达载体,q RT-PCR和WB结果发现MDA-MB-231 DY-Flag细胞中DYNLT1的表达量较对照组细胞MDA-MB-231NC-Flag升高2.0±0.2倍（p<0.01）。这些结果提示敲低及过表达DYNLT1的稳定细胞株构建成功CCK8增殖实验和平板克隆实验表明:与对照组细胞（ZR 75-30 NC-SH及BT 549 NC-SH）相比,敲低DYNLT1后明显抑制ZR 75-30 DY-SH及BT 549 DY-SH细胞的增殖能力;而过表达DYNLT1后,MDA-MB-231 DY-Flag细胞的增殖能力则明显强于对照组细胞（MDA-MB-231 NC-Flag）。3.通过流式细胞系分析发现,与对照组细胞（ZR 75-30 NC-SH）相比,敲低DYNLT1后,同步化后释放24h,G2/M期的比例为7.60%,显着低于对照组的20.30%（p<0.01）;通过给予不同周期抑制剂后发现,与对照组细胞（ZR 75-30 NC-SH）相比,敲低DYNLT1后,给药后,G2/M的比例为14.89%,显着低于对照组的35.46%（p<0.01）。4.通过IP实验将与DYNLT1结合的蛋白进行质谱分析,结果发现与DYNLT1结合的蛋白G2/M期细胞周期调节通路中富集最多。5.CCK8检测发现,敲低DYNLT1的稳定株较对照组细胞对紫杉醇药物（PTX）的敏感性增加,ZR 75-30细胞的IC50分别为:对照组10 ug/ml及敲低组4.5 ug/ml,流式细胞仪检测细胞凋亡也发现,在相同药物浓度下,DYNLT1敲低后与对照组细胞相比,细胞凋亡数量增多（ZR 75-30细胞在7.2 ug/ml时对照组与敲低组凋亡细胞比例分别为66%及82%,p<0.05）;BT 549细胞的IC50分别为:对照组12.5 ug/ml及敲低组6.0 ug/ml,流式细胞仪检测细胞凋亡也发现,在相同药物浓度下,DYNLT1敲低后与对照组细胞相比,细胞凋亡数量增多(BT 549细胞在5.4 ug/ml时对照组与敲低组凋亡细胞比例分别为（17.7%及45.8%,p<0.05）。6.体内实验表明:在脂肪垫原位成瘤模型中,敲低DYNLT1后,肿瘤的生长速度明显低于对照组;无论是对照组还是DYNLT1敲低组,给予紫杉醇腹腔注射后,肿瘤的生长速度均较未给药组明显减慢,但DYNLT1敲低组的瘤体缩小比例显着大于对照组（p<0.01）。免疫组化实验（IHC）结果显示:裸鼠瘤体组织中,DYNLT1敲低组细胞中,DYNLT1的蛋白表达明显低于对照组;同时,DYNLT1敲低组中Ki67表达相较于对照组明显减少,在未给药组中可以发现,Caspase3、Bcl2等相关凋亡蛋白在敲低组和对照组中无明显差别,给予紫杉醇干预后,敲低DYNLT1组凋亡蛋白Caspase3表达明显增高,而抗凋亡蛋白Bcl2在敲低组明显减少。7.通过对33例乳腺癌临床标本进行免疫组化染色,其中PR组共11例,SD组共10例,PD组共12例,结果显示在PR组比例为9%,SD组高表达DYNLT1的乳腺癌比例为30%,PD组比例为83.3%。结论:1.DYNLT1在乳腺癌中呈高表达,其表达与乳腺患者的总生存时间以及无疾病复发时间呈负相关。2.DYNLT1主要通过影响细胞周期G2/M期促进乳腺癌细胞增殖。3.高表达DYNLT1显着削弱乳腺癌细胞对M周期特异性化疗药紫杉醇的化疗敏感性。
王楠[3]（2021）在《干扰线粒体动力学增加胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗敏感性的机制研究》文中研究表明背景:胶质母细胞瘤是颅内恶性程度最高的原发性肿瘤,由于肿瘤细胞浸润性生长及常与重要脑功能区及神经纤维束毗邻的特点,导致手术全切困难,术后肿瘤复发不可避免。目前初发胶质母细胞瘤的标准治疗方案是最大化的手术切除+术后放化疗的综合治疗方案。即便如此,胶质母细胞瘤患者的预后仍不理想,疾病诊断后的中位生存期仅14.6-16.7个月。化疗在胶质母细胞瘤的治疗方案中的价值已被多个临床研究证实。然而,由于血脑屏障的存在,临床中常用的多种化疗药品在颅内均不能达到有效的药物治疗浓度,目前胶质母细胞瘤治疗的一线化疗药仍为替莫唑胺。替莫唑胺治疗可以有效延长胶质母细胞瘤患者中位生存期约2个月。与此同时,在临床治疗中发现,胶质母细胞瘤对替莫唑胺治疗的敏感性随时间延长而下降,这可能与肿瘤细胞中多种固有及获得性化疗耐药机制有关。近年来,随着对线粒体结构及功能认识的深入,人们愈加认识到线粒体可能以多种形式参与到了肿瘤细胞的化疗耐受过程,这也为我们克服胶质母细胞瘤的化疗耐药提供了新的思路。同时,在化疗过程中肿瘤细胞表现出的多重化疗耐药的现象提示我们在肿瘤耐药机制中存在一些共有的、核心的机制。基于能量代谢在细胞生命活动中的核心地位,我们将目光投向了化疗药物诱导下肿瘤细胞的能量代谢模式变化及其发生机制,以期找到新的方式来克服胶质母细胞瘤的化疗耐受,增强化疗效果,改善预后。在内外环境应激刺激的作用下,肿瘤细胞会以多种方式完成对细胞代谢的调动、调配以适应细胞不同的功能状态。而线粒体动力学是应激条件下肿瘤细胞完成细胞能量代谢重编程的重要参与者。线粒体动力学包括了线粒体的融合分裂、线粒体运输及线粒体自噬等过程。其中,线粒体分裂融合和线粒体自噬参与了细胞中线粒体系统质量与数量的控制过程。线粒体分裂由GTP酶动力蛋白Drp1及其受体Mff、Mid49/51等蛋白分子介导完成;线粒体融合由参与线粒体外膜融合的重要分子Mfn1/2及参与内膜融合的关键分子Opa1介导完成。线粒体分裂融合可以实现受损线粒体之间结构及功能上的互补,并可以将严重损伤的线粒体从线粒体系统中排除以实现线粒体功能的优化并有效减少有害代谢物的生成,而这在细胞器结构水平上表现为线粒体形态学的变化。线粒体自噬可由多条通路介导完成,而PINK1-Parkin通路在线粒体自噬的诸多通路中处于中心地位,它可以将受损的线粒体与溶酶体融合降解,直接地、精确地控制着线粒体的数量,保证线粒体系统的健康工作。化疗药物诱导肿瘤细胞出现线粒体形态学的变化已有较多研究报道,但其发生机制尚未完全阐明,而线粒体质量及数量的变化对细胞能量代谢有着重要的影响。这些变化在肿瘤细胞对化疗药物的反应中扮演了什么样的角色,是否能为肿瘤的化疗增敏提供新的策略,这些尚无定论的问题构成了本研究的主旨。即探讨在一线化疗药物替莫唑胺作用下胶质母细胞瘤细胞线粒体动力学的变化形式、背后机制及其对肿瘤细胞能量代谢的影响,并尝试通过干预线粒体动力学过程实现胶质母细胞瘤的化疗增敏。方法:1.乳酸、葡萄糖、ATP和ROS检测试剂盒及氧耗率（OCR）测定的方法对替莫唑胺等不同处理条件下SHG44、U87细胞及异体肿瘤组织的代谢模式及水平进行评价。2.蛋白免疫印迹（WB）和细胞免疫荧光的方法对不同处理条件下肿瘤细胞中多种目标蛋白的表达水平进行半定量研究。3.qPCR的方法对不同处理条件下目的基因在转录水平的表达进行评估;提取细胞总DNA并以qPCR的方法对线粒体DNA拷贝数的变化进行研究;并对替莫唑胺作用下线粒体DNA损伤水平进行评估。4.以特异性线粒体荧光探针标记线粒体以实现对线粒体数量及线粒体与各种目标蛋白的共定位水平的评估。此外,对荧光标记的线粒体进行显微镜拍照后以Image J进行后期处理实现对线粒体形态的量化评估。5.以质粒转染SHG44和U87细胞过表达TP53的方法研究P53蛋白对下游基因PINK1的表达调控效应。6.细胞免疫荧光共定位的方法对目标蛋白的亚细胞定位进行评价。7.使用线粒体及细胞核等细胞亚结构提取分离试剂盒对不同处理条件下细胞亚结构进行分离,并结合WB的方法对各结构中相关蛋白的表达水平进行半定量研究。8.MTT实验对不同处理条件下肿瘤细胞的活力进行评价。9.流式细胞术对不同处理条件下SHG44和U87细胞的凋亡水平进行评价。10.克隆形成实验对替莫唑胺和（或）WY14643体外抑制SHG44及U87细胞增殖的效应进行评估。11.以U87细胞建立裸鼠异体皮下荷瘤模型,在体内验证替莫唑胺和（或）WY14643对肿瘤的生长抑制效应。12.以透射电镜评估不同处理条件下异体肿瘤组织细胞中线粒体形态学变化。13.免疫组织化学的方法对不同条件下组织细胞内TP53及PINK1表达水平进行评价。结果:1.替莫唑胺处理条件下,胶质母细胞瘤细胞株SHG44和U87出现显着的能量代谢模式变化,表现为氧耗率增加,葡萄糖摄取消耗增加,细胞内ATP合成水平上调,肿瘤细胞氧化磷酸化水平上升,且两细胞株中均未出现细胞内ROS水平显着增加。2.在对替莫唑胺化疗应激条件下线粒体数量变化的评估中发现,替莫唑胺的处理可以引起SHG44和U87细胞中线粒体数量的增加;在进一步研究中发现SHG44和U87细胞中PINK1的表达水平下调,Parkin向线粒体的募集减少,PINK1的磷酸底物磷酸化泛素表达水平下调,且线粒体与溶酶体的融合减少,即替莫唑胺的处理下调了SHG44和U87细胞内线粒体自噬通量,实现了线粒体数量的积累。3.替莫唑胺可以诱导SHG44和U87细胞出现细胞核DNA损伤,引起SHG44细胞线粒体DNA的损伤,并伴随着显着的TP53高表达,而生物信息学的分析发现TP53的高表达和PINK1的表达呈负相关,而在GBM组织学标本中发现了同样的结果。4.在进一步研究中发现,DNA损伤引起的野生型TP53过表达可以下调细胞中PINK1的表达水平从而下调线粒体自噬水平;而在过表达TP53的细胞中,同样观察到了PINK1表达的下调;在TP53突变细胞株U251中,替莫唑胺可以诱导突变TP53和PINK1表达的上调;在可以诱导DNA损伤而不引起TP53表达上调的低剂量替莫唑胺处理条件下,PINK1的表达并未出现下调。这些实验结果验证了野生型P53蛋白可以负性调控PINK1的表达。5.替莫唑胺处理可以诱导SHG44、U87细胞中线粒体融合水平的提高;进一步研究中发现肿瘤细胞中Drp1向线粒体的募集减少。6.在对替莫唑胺处理条件下Drp1转位机制的研究中发现,替莫唑胺的处理可以在短时间内引起肿瘤细胞内ATP的供求失衡并激活AMPK;此外替莫唑胺的处理可以上调AMPK能量感知系统感受ATP变化的阈值。而激活的AMPK一方面可以促进细胞核内P53蛋白水平的上调,另一方面调控了Drp1向线粒体转位减少的过程并促进了线粒体融合的发生。7.Drp1分子在SHG44和U87细胞中的亚细胞分布存在差异,Drp1弥漫分布在SHG44细胞中,而在U87细胞核中浓聚。8.体外实验中,以线粒体分裂诱导剂WY14643和替莫唑胺联用可以引起替莫唑胺-肿瘤活力曲线下移,增加肿瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。而使用线粒体分裂抑制剂Mdivi1和替莫唑胺联用得到了相反的结果。进一步研究发现WY14643可以干扰替莫唑胺诱导的线粒体融合过程,并在一定程度上抵消替莫唑胺诱导的肿瘤细胞内ATP合成水平上调的现象,增加SHG44和U87细胞内ROS产生水平。而WY14643与替莫唑胺联用相较于单独使用替莫唑胺可以增加细胞凋亡比例,并表现出更强的肿瘤细胞单克隆形成抑制能力。9.在裸鼠皮下荷瘤实验模型的研究中发现WY14643和替莫唑胺联用可以明显抑制肿瘤生长;对肿瘤组织中凋亡相关蛋白表达水平进行检测发现两药联用组肿瘤组织凋亡相关蛋白表达水平更高;透射电镜检测发现WY14643可以一定程度抵消替莫唑胺诱导的线粒体的融合,肿瘤组织的ATP检测提示WY14643可以引起肿瘤组织中ATP水平下调。结论:1.替莫唑胺处理在SHG44和U87细胞中诱导的DNA损伤和反应性的TP53高表达可以通过下调PINK1的表达水平从而减少Parkin分子向线粒体的募集、下调线粒体自噬通量,导致肿瘤细胞中线粒体数量的积累。2.替莫唑胺处理SHG44和U87细胞引起的细胞内能量供求失衡导致AMPK的激活,而激活的AMPK可以上调细胞核内TP53的表达水平而影响线粒体自噬水平;此外AMPK尚可以通过减少Drp1向线粒体的转位促进线粒体融合的发生,实现线粒体系统的质量优化。3.干扰线粒体融合过程可以提高替莫唑胺处理条件下肿瘤细胞中ROS水平,降低ATP水平,增加替莫唑胺对胶质母细胞瘤化疗的敏感性。4.替莫唑胺化疗应激条件下SHG44和U87细胞中线粒体数量的积累和质量的优化是氧化磷酸化水平提高的重要原因,而这种上调的氧化磷酸化水平参与了肿瘤细胞的化疗耐药过程;阻断此代偿反应可以实现化疗的增敏。
刘景晨[4]（2021）在《三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响》文中研究表明视网膜母细胞瘤是具有高度侵袭性的眼部肿瘤,多见于5岁以内儿童。视网膜母细胞瘤的治疗效果依赖于早期发现和早期治疗,但由于社会经济及医疗条件的限制,很多患儿在临床的中晚期才获得诊治,疗效不佳且致盲率和致残率极高。目前对视网膜母细胞瘤的治疗主要有化疗、放疗、手术治疗及免疫治疗等,其中以化疗为基础的联合治疗是中晚期患儿最常用的方案。在临床治疗中,由于化疗药物的耐药性和毒副作用的存在,导致部分患儿难于得到及时而有效的治疗,因此需寻找毒副作用小且可负担的治疗手段或药物。三七总皂苷是从传统中药三七中提取的生物活性成分,广泛用于糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等眼科疾病的治疗。近年来在肝癌、乳腺癌、骨肉瘤、淋巴瘤、胰腺癌等肿瘤细胞的研究中证实三七总皂苷具有明确的抗肿瘤活性,但目前尚未发现其用于眼部肿瘤研究的报道。目的:研究三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响,以探索三七总皂苷抑制视网膜母细胞瘤的作用机制。方法:1.采用CCK-8实验分别检测三七总皂苷及卡铂对Y79细胞增殖的影响,并计算出两种药物的IC50值。参考CCK-8实验结果,实验分为阴性对照组、不同浓度（200、400、600ug/ml）三七总皂苷组及卡铂阳性对照组,使用流式细胞仪检测三七总皂苷对Y79细胞凋亡的影响,Western blot、实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的m RNA和蛋白表达。2.在信号通路的研究中,通过CCK-8实验分析PI3K抑制剂LY294002对Y79细胞增殖的影响并计算出IC50。检测阴性对照组和浓度梯度为200ug/ml、400ug/ml、600ug/ml的三七总皂苷组细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。然后按阴性对照组、三七总皂苷组、联合药物组及PI3K抑制剂组对Y79细胞进行分组处理,检测各组Y79细胞的凋亡情况和细胞中PI3K/AKT通路蛋白及凋亡相关蛋白的表达。3.使用流式细胞仪对阴性对照组、三七总皂苷组（浓度分别为200、400、600ug/ml）及卡铂阳性对照组中Y79细胞的细胞周期进行检测,应用Western blot、实时荧光定量PCR检测细胞周期相关基因的m RNA和蛋白表达。结果:1.与阴性对照组相比,三七总皂苷可以有效抑制Y79细胞的增殖（P<0.05）,CCK-8实验结果计算出24小时、48小时及72小时三七总皂苷对Y79细胞的半数抑制浓度值（IC50）分别为429.2ug/ml;343.8ug/ml,271.5ug/ml。卡铂对Y79细胞的24小时IC50值为63.60ug/ml。三七总皂苷作用于Y79细胞后,细胞的凋亡率随药物浓度增加而升高（P<0.05）,其中600ug/ml三七总皂苷促Y79细胞凋亡的作用最明显,其细胞凋亡率为22.30±1.08%。与阴性组相比,三七总皂苷处理后的Y79细胞中凋亡相关基因Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的m RNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）,促凋亡蛋白的活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表达量也显着增加（P<0.05）,而凋亡抑制基因Bcl-2的m RNA和蛋白表达则受到抑制（P<0.05）,组间对比结果显示,600ug/ml三七总皂苷对促凋亡基因的m RNA和蛋白表达的诱导作用最强（P<0.05）,对Bcl-2的m RNA和蛋白抑制作用也最明显（P<0.05）。三七总皂苷处理后的Y79细胞中Bax/Bcl-2值较阴性组明显升高（P<0.01）,600ug/ml三七总皂苷组中的Bax/Bcl-2值高于200ug/ml组（P<0.001）和400ug/ml组（P<0.005）。2.CCK8细胞增殖实验结果显示PI3K抑制剂LY294002可以有效抑制Y79细胞的增殖,其对Y79细胞的24小时IC50值为26.25umol/L。细胞凋亡检测结果显示三七总皂苷组、LY294002组及联合用药组的细胞凋亡率均高于阴性对照组（P<0.001）,联合用药组中Y79细胞的凋亡率最高,为35.59±0.85%。三七总皂苷处理Y79细胞后,细胞内PI3K及AKT1的总蛋白表达量与阴性组相比未见差异（P>0.05）,但PI3K/AKT通路中的磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT（Thr308）、p-AKT（Ser473）及p-m TOR的表达量明显低于阴性对照组（P<0.05）,在三七总皂苷处理组中的磷酸化蛋白表达量随药物浓度的增加而梯度下降（P<0.05）。与阴性组相比,200ug/ml三七总皂苷对PI3K/AKT通路拮抗蛋白PTEN的表达无明显影响（P>0.05）,但400ug/ml和600ug/ml三七总皂苷组中PTEN蛋白的表达量均明显升高（P<0.01）。三七总皂苷组、联合药物组及PI3K抑制剂组中的促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及活化蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8、Cleaved caspase-9的表达量较阴性组明显增加（P<0.05）。联合药物组中促凋亡蛋白的表达量高于三七总皂苷组和LY294002组（P<0.05）,各药物处理组细胞的Bcl-2蛋白表达量则均低于阴性组（P<0.01）,组间对比显示联合用药对Bcl-2蛋白的抑制作用最强（P<0.005）,药物处理后的Y79细胞内Bax/Bcl-2值均明显高于阴性组（P<0.005）,在联合用药组中的Bax/Bcl-2比值最高,为阴性组的2.62±0.16倍。3.按实验分组处理后,三七总皂苷各药物组处于G0/G1期的Y79细胞百分率均显着高于阴性组（P<0.01）,在600ug/ml三七总皂苷组中,G0/G1期Y79细胞所占百分比最高,为72.42±0.65%,而S期及G2/M期的细胞比例均低于阴性对照组（P<0.05）。三七总皂苷处理Y79细胞后,细胞内G0/G1期相关基因Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表达量较阴性组均明显下降（P<0.05）,并具有浓度依赖性,在600ug/ml三七总皂苷组中下降最显着（P<0.05）。结论:1.三七总皂苷能抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞的增殖、促进细胞的凋亡。2.三七总皂苷对Y79细胞的促凋亡作用可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路,进而调控凋亡相关基因的表达来实现。3.三七总皂苷能通过抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6的m RNA和蛋白的表达,诱导Y79细胞发生G0/G1期阻滞。
王文平[5]（2021）在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中认为研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:（1）从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞）,3种肾细胞（HK-2、HKC和293T细胞）和3种心脏细胞（H9c2、HUVEC和HCMEC细胞）;利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度（MNLC）;体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。（2）选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放、DAPI染色、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。（3）利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:（1）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。（3）蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:（1）细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。（3）蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。
曾卫平[6]（2021）在《初步探究菜蓟苦素抑制黑色素瘤细胞生长的作用及机制》文中研究说明研究目的:黑色素瘤是一类早期容易转移、死亡率很高的癌症,目前对此疾病的主要以药物治疗为主,早期的原位黑色素瘤能够手术治愈,目前进展期的黑色素瘤治疗药物虽然已经有了免疫和靶向药物治疗,但由于响应率低和药物毒副作用,他们的使用受到了限制。菜蓟苦素是一种来源于多种植物的倍半萜内酯,具有良好的生物学效应,具有潜在的抗癌作用。本课题通过观察菜蓟苦素对人黑色素瘤细胞的抑制作用及机制研究探讨了菜蓟苦素可以作为黑色素瘤治疗药物的可能性。研究方法:分别应用0、5、10、20、40、60、80μM的菜蓟苦素处理人黑色素瘤A375细胞和A2058细胞观察细胞生长增殖情况,绘制细胞活力图,计算IC50（药物使存活细胞数量抑制为原有细胞数量一半时的药物浓度）。通过Western Blot检测凋亡相关蛋白BAX、BCL-2及PARP等的表达情况,来观察菜蓟苦素是否诱发细胞发生凋亡,并检测了细胞周期相关蛋白Cyclin B1和CDK1的表达水平,来判断菜蓟苦素对黑色素瘤细胞周期的影响。用A375细胞种植在裸鼠皮下成瘤后,分成4组,分别用0（对照组）、10mg/Kg、20 mg/Kg、40 mg/Kg的菜蓟苦素（浓度都是IC50）腹腔注射治疗后宰杀裸鼠摘取肿瘤标本观察瘤体的生长情况。对用菜蓟苦素干预24h的人黑色素瘤A375细胞和用DMSO（溶剂）处理的对照组进行转录组测序,分析两组差异基因表达情况,进行GO、KEGG注释、KEGG信号通路富集来初步探究菜蓟苦素抑制黑色素瘤细胞生长的关键基因及可能机制。结果:应用不同浓度的菜蓟苦素处理人黑色素瘤A375细胞和A2058细胞,其生长受到抑制,IC50分别为:27.4μM和24.2μM。Western Blot检测BAX蛋白、BCL-2蛋白及PARP蛋白的结果显示:干预的菜蓟苦素浓度越高,BAX蛋白、PARP蛋白表达明显上调,BCL-2蛋白表达明显下调,Western Blot检测细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）和细胞周期蛋白依赖激酶1（CDK1）结果显示:干预的菜蓟苦素的浓度越高,Cyclin B1的表达明显上调,CDK1的表达明显下调。在动物实验中,腹腔注射的菜蓟苦素剂量越高,抑制皮下成瘤裸鼠体内的肿瘤的生长越明显,且对裸鼠体重无明显影响。菜蓟苦素干预后的A375细胞与未用菜蓟苦素处理的A375细胞进行转录组测序结果显示:一共有348个差异表达的基因,其中上调的差异基因有272个,下调的差异基因有76个。根据蛋白互作网络分析,IL-6、CXCL-8和SERPINE是明显上调的差异基因中转录的蛋白是连通性最好的几种蛋白,CENPA、B3GAT1、AURKB是明显下调的差异基因中连通性最好的蛋白,在黑色素瘤的蛋白质网络中具有重要的地位,可能与黑色素瘤的生长增殖有极重要的关系。根据KEGG信号通路富集散点图,其中富集的信号通路有TNF信号通路、VEGF信号通路、TGF-β信号通路、FOXO信号通路、NF-kappa b信号通路和Erb B信号通路。结论:1、菜蓟苦素在体外可能是通过促进黑色素瘤A375和A2058细胞的凋亡和阻滞细胞周期进程从而抑制其生长增殖且抑制效果随药物浓度增加越明显,其IC50分别为27.4μM和24.2μM。2、菜蓟苦素在体内能够明显抑制人黑色素瘤A375细胞诱导的裸鼠皮下成瘤模型中黑色素瘤瘤体的生长,且对裸鼠体重无明显影响。3、菜蓟苦素抑制黑色素瘤细胞生长的机制可能与TNF信号通路、VEGF信号通路、TGF-β信号通路、FOXO信号通路、NF-kappa b信号通路和Erb B信号通路相关。
祖玛丽[7]（2021）在《绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡的机制研究》文中研究指明研究目的:绞股蓝Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Makino属于传统中药和民族药,在我国西南少数民族地区应用广泛,是传统壮医的常用草药之一,用于治疗各种疾病,壮药名为gocaetmbaw。绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI是从绞股蓝中分离提取的皂苷类活性成分,为一对同分异构体。已有研究表明gypenoside L和gypenoside LI对多种癌细胞的生长具有抑制作用,但其在乳腺癌中的药理作用及其机制尚未见报道。2020年世卫组织国际癌症研究机构统计显示乳腺癌发病率居全球第一,女性生命健康受到严重威胁,目前对乳腺癌的治疗方式主要有手术、内分泌治疗、化疗、放疗以及靶向治疗等。由于缺乏有效的靶向治疗,高度转移性三阴乳腺癌（TNBC）的治疗仍具有很大的挑战性。E2F1转录因子为E2F家族成员之一,参与细胞周期调控和细胞凋亡。临床数据表明E2F1异常上调经常发生在各种类型的癌症中,与恶性进展和不良预后有关。ERCC6L是SNF2家族成员之一,参与染色质重塑、DNA重组和DNA修复,与多种癌症进展有关。因此,本课题目的是探究绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的抑制作用及分子机制。研究方法及结果:细胞表型实验证明gypenoside L和gypenoside LI均可抑制乳腺癌细胞增殖和迁移,还可诱导内源性细胞凋亡,而且gypenoside LI的药效要强于gypenoside L,尤其对于三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231。RNA-seq 测序、KEGG 和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）发现gypenoside L和gypenoside LI均可通过调控细胞周期发挥作用。流式周期检测发现gypenoside L可诱导乳腺癌细胞周期阻滞在G2/M期,gypenoside LI使细胞周期阻滞在G0/G1期。GO分析发现gypenoside L与细胞分裂、染色体分离有关;而gypenoside LI主要影响DNA复制。Metascape在线工具分析发现gypenoside LI下调的差异基因集或周期相关基因集主要受E2F1调控,转染实验及rescue实验证实gypenoside LI可通过抑制E2F1使细胞周期阻滞在G0/G1期,还可通过下调E2F1抑制ERCC6L的表达。而gypenoside L则不调控E2F1的表达。此外,gypenoside LI与siE2F1联合处理可发挥协同作用,使gypenoside LI在低浓度条件下便可杀死肿瘤细胞。而gypenoside L虽然不能抑制E2F1的表达,但可下调ERCC6L,结合在线数据库推测这可能与有丝分裂有关。此外,Western blot结果显示gypenoside L和gypenoside LI均不能改变p53的表达。由此可见,gypenoside L和gypenoside LI这对同分异构体发挥抗肿瘤作用并不依赖p53途径。结论:本研究证明gypenoside L和gypenoside LI可抑制乳腺癌细胞增殖、阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用均不依赖p53途径,但是二者的作用机制却有所不同:gypenoside L可使乳腺癌细胞周期阻滞在G2/M 期,而 gypenoside LI阻滞在G0/G1期;同时,gypenoside LI可通过E2F1下调ERCC6L的表达,而gypenoside L却不改变E2F1的表达,结合数据库分析推测下调ERCC6L可能与有丝分裂途径有关。
黄莉[8]（2020）在《PEITC调控结肠癌凋亡的机制研究及安全性评估》文中进行了进一步梳理结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病率占所有恶性肿瘤第三位,死亡率位于第五位,给人类的健康带来了巨大的威胁。结肠癌的病因不明确,发病机制十分复杂,早期基本无症状。手术是治疗结肠癌的主要方法,早期患者可以通过手术达到根治的效果,而中晚期患者通过手术很难根治,手术后容易转移或者复发。而针对不能进行手术的患者,以化疗为基础的综合治疗模式可以有效改善患者生存。异硫氰酸苯乙酯（PEITC）是十字花科植物的硫代葡萄糖苷降解产物,被报道可以降低肿瘤的发生率,抑制肿瘤细胞的增殖和生长,且对正常组织细胞无任何毒副作用。目前研究认为诱导细胞凋亡是PEITC可以抑制癌细胞增殖的重要机制,而理解PEITC诱导的细胞凋亡机制对于了解其作为临床上有用的化学预防或治疗剂是必不可少的。我们前期发现PEITC抑制结肠癌细胞增殖并诱导其凋亡,并且对正常肠的上皮细胞无影响,但其机制尚不清楚。因此,本论文将深入研究PEITC诱导细胞凋亡的途径及其分子机制,并通过裸鼠成瘤模型验证PEITC对结肠癌肿瘤的抑制效果和作用机制,最后对PEITC的安全性进行评价。我们选用了 2种不同的结肠癌细胞系（HCT116和SW620）及正常肠上皮细胞（NCM460）,用不同浓度的PEITC进行处理,通过MTT法、流式细胞仪、克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验,发现20 μM PEITC的PEITC可以显着性抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进结肠癌细胞凋亡,而对正常肠上皮细胞无影响。我们进一步通过western blot实验发现PEITC促进Caspase-3和Caspase-9的表达,通过JC-1和DCFH-DA方法发现PEITC抑制线粒体内膜膜电势并促进ROS产生,提示通过线粒体途径诱导细胞凋亡。我们分离细胞质组分后通过western blot检测Cyto-c和SMAC的表达,发现PEITC促进结肠癌细胞SMAC的表达,流式细胞仪结果进一步表明PEITC通过SMAC诱导结肠癌细胞凋亡。通过anti-SMAC进行免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,co-IP）实验发现PEITC作用后可促进SMAC与Survivin的相互作用,发挥诱导细胞凋亡作用。PEITC通过ERK和JNK蛋白的磷酸化促进凋亡相关蛋白表达及增加细胞凋亡比例,表明PEITC通过ERK/JNK通路介导结肠癌细胞凋亡。利用结肠癌裸鼠成瘤模型评价PEITC的抑癌效果及安全性,通过皮下接种法建立裸鼠成瘤模型,发现PEITC抑制结肠癌皮下移植肿瘤的生长,并促进裸鼠结肠癌皮下肿瘤中线粒体途径凋亡相关蛋白Caspase-9、SMAC蛋白表达,抑制Survivin蛋白表达,对裸鼠血常规三系细胞和肝肾功能均无影响。我们研究表明PEITC通过SMAC/Survivin信号通路调控线粒体途径诱导的结肠癌细胞凋亡。体内实验证明PEITC抑制裸鼠皮下移植肿瘤的生长,并通过SMAC/Survivin信号介导线粒体途径的凋亡,而不影响裸鼠肝肾功能、血常规三系细胞。本论文将为结肠癌的临床治疗提供新的理论基础和新的方向。
孙欣慰[9]（2020）在《KIF15对卵巢癌增殖和凋亡的影响及相关调控网络的生物信息学分析》文中进行了进一步梳理目的卵巢癌（Ovarian Cancer,Ov Ca）是在妇科恶性肿瘤中致死率排名第一位的肿瘤。卵巢癌起病隐匿,难于早期诊断,大部分患者在诊断时已进展至晚期。由于缺乏可靠的指标,卵巢癌的早期诊断和预后都是亟待解决的临床难题。此外,虽然卵巢癌的靶向治疗不断发展,但由于低应答率和耐药性的问题,仍有相当一部分患者难以从现有的靶向治疗中获益。基于此,寻找在卵巢癌早期就能够帮助诊断和预测患者预后情况,以及有望作为卵巢癌治疗靶点的新的生物标记物,成为卵巢癌诊断和治疗领域迫切需要解决的问题。生物信息学是生命科学与计算机科学相结合形成的一门新兴的交叉学科。近年来,随着GEO、TCGA等多个全球性肿瘤数据库不断建立和完善,肿瘤数据库的信息提取和深入挖掘已经成为了肿瘤研究的热点和重点。利用生物信息学方法挖掘肿瘤数据库的已有数据,有针对性地获取肿瘤相关分子,是获得有效生物标记物、筛选信号通路分子进而揭示肿瘤发生、发展内在机制的高效方法,运用该方法能够大大提高筛选诊断、预后和治疗靶标的效率和可靠性。因此,在本课题中,我们拟通过对GEO数据库、TCGA数据库等在线数据库中的卵巢癌相关数据进行数据挖掘,分析获得卵巢癌m RNA表达谱中的差异表达基因,结合多种生物信息学方法从这些差异表达基因中筛选获得能够显着影响卵巢癌患者生存期、帮助预测患者预后情况的生物标记物,再通过对目的基因功能和调控网络的研究,进一步了解目的基因在卵巢癌中发挥的作用及其调控机制,为该分子作为辅助诊断、预后预测因子或进一步作为治疗靶标应用于临床,提供理论依据。材料与方法1.GEO卵巢癌基因芯片数据挖掘、差异表达基因分析和目的基因筛选1)GEO卵巢癌数据集的检索、筛选和下载;使用R软件从质量灰度、权重、残差、残差符号、RLE、NUSE和RNA降解等多个方面对拟进行分析的基因芯片数据进行质量评估;2)对选取的4个GEO卵巢癌数据集进行数据预处理,剔除不合格样本后,使用RMA算法分别进行背景校正、标准化和log2处理,再将对照组和肿瘤组数据进行合并、汇总,通过Affymetrix平台的芯片注释文件,将探针ID转换为基因名称;分别对每个卵巢癌数据集进行差异表达分析;3)使用DAVID在线工具对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析;根据GO分析结果对增殖相关的差异表达基因进行筛选;4)使用Kaplan-Meier Plotter工具进行备选基因的OS和PFS生存分析,并绘制生存曲线;5)使用Oncomine公共数据平台进行备选基因表达分析和验证;6)使用GEPIA数据库对候选基因在不同分期的卵巢癌中的表达进行分析。2.KIF15在卵巢癌的表达验证和体内外功能研究1)利用GTEx来源的人体正常组织RNA-seq数据和TCGA来源的卵巢癌样本RNA-seq数据对KIF15在正常人体组织器官的表达和在卵巢癌中的差异表达进行分析;2)利用文献中报道的干细胞指数m RNAsi数据,采用WGCNA法揭示KIF15与卵巢癌干细胞增殖的相关性;3)免疫组化法检测卵巢癌组织芯片中KIF15蛋白的表达,并对免疫组化染色结果的评估;4)使用CCLE肿瘤细胞数据库获得45种卵巢癌细胞株的KIF15 m RNA数据,了解KIF15 m RNA在卵巢癌细胞株中的表达谱;5)Real time-PCR检测包括卵巢癌细胞株SKOV3、A2780、HO8910和Ovcar-3,宫颈癌细胞株Hela、Siha和C33a,肺腺癌细胞株A549、胰腺癌细胞株PANC-1和神经胶质母细胞瘤细胞株U87等多种肿瘤细胞株中KIF15 m RNA的表达;6)对卵巢癌细胞株进行sh RNA慢病毒转染,Real-time PCR和Western Blot法检测慢病毒转染效率;7)Celigo法细胞计数和CCK8法检测KIF15敲减后细胞增殖情况;8)FACS法和Caspase3-7法检测KIF15敲减后细胞凋亡情况;9)裸鼠成瘤实验及动物活体成像,观察成瘤情况,并对瘤体进行抗KIF15免疫组化染色。3.敲降KIF15卵巢癌细胞样本的基因表达谱检测与生物信息学分析1)对SKOV3细胞进行Sh RNA慢病毒感染,RT-PCR法验证敲降KIF15的效率;2)从A260/A280比值、RIN值和28s/18s比值三个指标,对总RNA的质量进行评估;3)使用3′IVT反应法对基因芯片进行检测;4)从质量灰度、权重、残差、残差符号、RLE、NUSE等多个方面对基因芯片质量进行分析;5)进行差异表达基因分析;6)运用基因富集分析工具Fun Rich、Clue GO和GSEA等不同方法对差异表达基因进行功能和信号通路的富集分析,筛选出凋亡相关的通路;4.敲降KIF15卵巢癌细胞样本的磷酸化蛋白芯片检测与生物信息学分析1)使用磷酸化蛋白芯片对敲降KIF15的SKOV3细胞样本进行检测,并对原始图片进行扫描和分析;2)依据m RNA基因表达谱的分析结果从磷酸化蛋白芯片的数据中筛选出对应的凋亡相关通路及通路上的分子,构建磷酸化蛋白核心网络;3)分别从m RNA水平和蛋白水平对三条信号通路上的分子作重叠性分析,确定三条凋亡相关通路的交叉分子,验证敲降KIF15是通过调控三条凋亡相关通路交联形成的网络发挥促凋亡作用的。结果1.GEO卵巢癌基因芯片数据挖掘、差异表达基因分析和目的基因筛选结果1)经过多个指标的评估,认为本研究选用的芯片质量较为可靠,可以进行后续数据分析;2)以|Log FC|≥1.5和p<0.05为差异基因的筛选标准;GSE40595数据集包含上调基因2544个,下调基因52个;GSE18520数据集包含上调基因582个,下调基因580个;GSE38666数据集包含上调基因1487个,下调基因205个;GSE36668数据集包含上调基因2216个,下调基因108个;4个数据集具有共同上调差异表达基因183个,下调差异表达基因7个;3)GO分析结果中,我们选取p值最小的前10位GO分类,其中与增殖相关的有5个,包括“cell division”,“mitotic nuclear division”,“cell proliferation”,“mitotic sister chromatid segregation”和“chromosome segregation”。在这5个GO分类的共42个基因中,存在17个富集于2个或2个以上细胞增殖相关GO分类的基因（SAC3D1,NUF2,FAM83D,TPX2,KIF11,ZWINT,CDCA3,NDC80,PTTG1,BUB1B,KIF15,KIF18B,SPAG5,CENPF,CDC20,CDK1 and KIF2C）;4)在Kaplan-Meier Plotter中进行生存分析,上述17个基因中,BUB1B,CDK1,CENPF,FAM83D、TPX2和KIF15等6个基因均与卵巢癌患者的总生存率（OS,p<0.01）和无进展生存率（PFS,p<0.05）呈负相关;5)在Oncomine数据库中,上述6个基因除FAM83D外均有权威数据集TCGA支持其m RNA在卵巢癌组织中存在差异表达,因此我们对其余5个基因进行进一步分析;6)BUB1B,CDK1,CENPF,TPX2和KIF15 m RNA的表达均与stage I-II期卵巢癌患者的PFS和OS呈明显负相关,且这些基因高表达于I-II期卵巢癌患者时较卵巢癌患者总体具有更大的风险比HR值;7)BUB1B、CENPF和KIF15在不同分期的卵巢癌组织中表达具有显着性差异,且早期（stage II）表达高于中晚期（stage III和IV）,这种差异在KIF15（F=5.03,p值=0.00692）高于BUB1B（F=4.7,p值=0.00954）和CENPF（F=3.8,p值=0.0232）。2.KIF15在卵巢癌的表达验证和体内外功能研究结果1)KIF15 m RNA在人体正常组织器官中,除骨髓外,均为低表达;在卵巢癌组织中存在过表达;2)WGCNA分析揭示了KIF15与卵巢癌细胞的干性调控相关,并参与卵巢癌干细胞的增殖调控;3)免疫组化染色提示KIF15蛋白仅存在于胞浆中。在90例不同病理类型的卵巢癌组织中,有68例（75.6%）存在KIF15蛋白的高表达,22例（24.4%）低表达,而在10例癌旁组织中,有2例（20%）高表达,其余8例（80%）均为低表达,KIF15蛋白在卵巢癌和癌旁组织中表达水平的差异具有显着性（p<0.05）;该组织芯片中除去10例癌旁组织和10例淋巴结转移腺癌,其余80例卵巢癌组织中,包括64例临床分期为I-II期的样本,其中KIF15高表达样本有49例（76.6%）;其余16例III-IV期样本中,KIF15高表达的有11例（68.8%）。在不同的病理类型中,5例透明细胞癌中有3例KIF15高表达（60%）),11例粘液性腺癌中有8例高表达（72.7%）,1例子宫内膜样腺癌为高表达,其余63例浆液性腺癌中,有49例（77.8%）高表达KIF15在不同的病理类型中,5例透明细胞癌中有3例KIF15高表达（60%）),11例粘液性腺癌中有8例高表达（72.7%）,1例子宫内膜样腺癌为高表达,其余63例浆液性腺癌中,有49例（77.8%）高表达KIF15。上述结果提示,KIF15蛋白在早期卵巢癌患者的组织中就有广泛的高表达,在不同病理类型的卵巢癌中均有广泛的高表达,没有明显的病理类型特异性。在包括妇科常见恶性肿瘤卵巢癌、宫颈癌和肺腺癌、胰腺癌、神经胶质母细胞瘤在内的10种肿瘤细胞株中,SKOV3的KIF15 m RNA表达最高,HO8910表达最低,其余8种细胞株的KIF15 m RNA表达量都介于这两种细胞株之间,本课题将SKOV3和HO8910两种细胞株作为我们后续功能实验中的细胞株;4)Sh RNA慢病毒对SKOV3的敲减效率为83.1%,HO8910的敲减效率为61.0%,可以满足后续实验的需要;5)Celigo细胞计数:将Day5这个观察时间节点的SKOV3细胞的细胞数与Day1的细胞数进行比较,Sh Control的细胞增殖倍数是7.63±0.11倍,Sh KIF15组的细胞增殖倍数是1.24±0.03倍,组间比较具有显着性差异(t检验,p值=6.82701×10-8);HO8910细胞Sh Control的增殖倍数是5.65±0.19倍,Sh KIF15组的增殖倍数是1.72±0.07倍,组间比较也具有显着性差异(t检验,p值=7.10173×10-11),提示敲降KIF15能够显着抑制细胞增殖;6)CCK8法检测:SKOV3 Sh Control组Day5的OD值是Day1 OD值的4.095±0.0294倍,Sh KIF15组Day5的OD值是Day1 OD值的2.483±0.038倍,HO8910Sh Control组Day5的OD值是Day1 OD值5.11±0.0291倍,Sh KIF15组Day5的OD值是Day1 OD值的2.416±0.0268倍,同种细胞组间进行比较,均具有显着性差异(t检验,SKOV3 p值=1.11593×10-12,HO8910 p值=3.85188×10-15),进一步验证了敲降KIF15能够显着抑制卵巢癌细胞增殖;7)FASC法检测细胞凋亡:在慢病毒感染后的72h对KIF15敲减后SKOV3和HO8910细胞的凋亡情况进行检测,SKOV3细胞Sh KIF15组凋亡细胞的比例是6.4±0.255%,Sh Control组的凋亡细胞比例是2.98±0.192%,HO8910 Sh KIF15组的凋亡细胞比例是10.58±0.577%,Sh Control组的凋亡细胞比例是4.03±0.142%。两种细胞Sh KIF15组的凋亡细胞比例均显着高于sh Control组(t检验,SKOV3 p值=5×10-5,HO8910 p值=4×10-5),提示敲降KIF15能够显着促进卵巢癌细胞凋亡;8)Caspase3-7法检测细胞凋亡:该方法所检测的发光信号的强弱程度与Caspase-3/7的活性成正比。在SKOV3和HO8910细胞中,sh KIF15组的发光信号强度（即Caspase活性的指标）均明显高于Sh Control组（t检验,SKOV3 p值=0.000847283,HO8910 p值=0.000283606）,提示sh KIF15组细胞凋亡率显着高于Sh Control组,进一步验证了KIF15敲减能够显着促进卵巢癌细胞凋亡;9)动物活体成像:注射Sh Control慢病毒感染的SKOV3的NC组10只裸鼠注射部位均显示不同强弱程度的荧光表达,提示皮下均有瘤体形成;而注射Sh KIF15慢病毒感染的SKOV3的KD组10只裸鼠,仅有1只裸鼠注射部位可见荧光信号,其余裸鼠均未见有明显的荧光信号,提示仅有1只裸鼠皮下有瘤体形成;10)裸鼠皮下成瘤:NC组的瘤体重量是1.482±0.273g,KD组只获得一枚皮下成瘤样本,肿瘤是0.061g,NC组的瘤体重量与KD组比具有显着性差异（t检验,p值=8.442×10-11）,提示KIF15敲减后的SKOV3细胞在裸鼠体内的成瘤能力明显下降;11)NC组瘤体抗KIF15免疫组化染色呈棕褐色,KD组呈淡黄色,提示在上述荷瘤实验所获得的瘤体中,KD组瘤体中的KIF15蛋白表达明显低于NC组。3.敲降KIF15的SKOV3细胞样本的基因表达谱检测与生物信息学分析1)总RNA质量分析:6个待测样本RNA纯度较高,完整性较好,质量合格,适合进行基因芯片分析;2)基因芯片质量分析:本研究中所用芯片和样本均质量可靠,这也是后续实验中数据分析可靠性的保证;3)差异表达基因分析结果:KD组与NC组进行比较,以|FC|≥1.5,p value值<0.05为标准对差异表达基因进行分析,筛选出表达上调基因134个,下调基因309个;4)Funrich软件功能和通路富集分析:在上调基因中,可以观察到生物过程主要富集于核酸代谢、细胞通讯和信号转导等过程,信号通路主要富集于Er Bb、TRAIL、PI3K/Akt等肿瘤相关通路和细胞粘附（Cell adhesion）相关通路中;在下调基因中,富集基因比例排在前三位的生物过程分别是蛋白代谢、抗凋亡（Anti-apoptosis）和蛋白定位,且信号通路富集（p<0.05）的前11条通路中有4条都与凋亡（Apoptosis）相关,依次是凋亡因子介导反应（Apoptotic factor-mediated reponse）,SMAC介导的IAP caspase复合物的解离（SMAC mediated dissociation of IAP:caspase complex）,SMAC结合IAPs（SMAC binds to IAPs）和SMAC介导凋亡反应（SMAC mediated apoptotic response）;5)Clue GO法通路富集分析:Apoptosis,TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三条信号通路是所有通路富集分析结果中囊括基因最多、最主要的通路,且均与凋亡相关;6)GSEA法富集分析:Apoptosis和TNFαsignaling via NFkb是上述差异基因的凋亡相关分子特征。4.敲降KIF15的SKOV3细胞样本的磷酸化蛋白芯片检测与生物信息学分析1)在蛋白水平上,敲降KIF15引起了Apoptosis,TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三条凋亡相关信号通路的激活;2)Apoptosis,TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三条凋亡相关信号通路在m RNA水平和蛋白水平均存在相互交联,构成凋亡相关调控网络;3)三条凋亡相关通路在m RNA水平上的交叉分子为MAP3K14和TNF,在蛋白水平上的交叉分子为NFk B-p105/p50,Phospho-Ser337、IKK-beta,Phospho-Tyr199、NFk B-p65,Phospho-Ser529和IKK-gamma,Phospho-Ser31,上述蛋白分子均存在显着的磷酸化,提示功能的激活。结论KIF15是卵巢癌中具有早期辅助诊断和预后预测价值的增殖相关基因。敲降在卵巢癌KIF15能够在体外显着抑制卵巢癌细胞的增殖,促进其凋亡,在体内亦能够明显抑制卵巢癌细胞成瘤。这种作用是敲降KIF15抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的共同结果。敲降KIF15通过Apoptosis、TNF signaling pathway和NF kappa B signaling pathway三条凋亡信号通路相互交联形成的调控网络的激活促进卵巢癌细胞的凋亡。因而,KIF15有望作为有效的治疗靶点应用于临床。
刘明阳[10]（2020）在《人参皂苷Rg3抑制人骨肉瘤细胞增殖及其分子机制研究》文中研究指明研究背景:骨肉瘤是发源于间充质干细胞的恶性肿瘤。骨肉瘤的发病年龄呈现双峰分布,常发病于青少年或老年人。由于大多数的骨肉瘤患者在诊断时时就有转移或微转移性,故几乎所有患者在手术切除的之前或之后都会接受多种药物联合化疗。患者往往耐受度较差,且复发几率较高。人参是一种原产于东北亚的草本植物,在东亚地区的传统医学中有着广泛的应用。作为人参中主要的活性物质之一,人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用在近年来越来越引起人们的重视。人参皂苷Rg3的甾体结构使得它可以与细胞膜、膜结合离子通道、以及胞内和胞外的受体相互作用来改变细胞的转录水平以来发挥抗肿瘤作用。研究方法:本实验应用MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、Transwell细胞侵袭实验检测了人参皂苷Rg3对骨肉瘤细胞系MG-63、HOS和U2OS增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响和对细胞周期作用。我们又进一步选择MG-63细胞作为研究对象,应用western blot、定量PCR、流式细胞术、小干扰RNA等实验手段进一步探究人参皂苷Rg3诱导细胞自噬、凋亡以及细胞周期阻滞的具体作用机制。实验结果:MTT实验发现人参皂苷Rg3以剂量依赖的方式抑制三种骨肉瘤细胞系MG-63、HOS以及U2OS的增殖。流式细胞术则验证人参皂苷Rg3的促三种肉瘤细胞系的凋亡。细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验验证了人参皂苷Rg3可以抑制三种骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭。WB实验发现经人参皂苷Rg3处理的的骨肉瘤细胞MG-63中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的水平与未加药的对照组相比有显着性地升高。Western blot和定量PCR证实人参皂苷Rg3组caspase-3的基因和蛋白表达水平增加,流式细胞术证实人参皂苷Rg3组细胞凋亡水平升高。而当我们使用代表性自噬通路抑制剂3-MA和人参皂苷Rg3同时作用于MG-63细胞时,WB实验和定量PCR显示3-MA可以显着逆转由人参皂苷Rg3导致的细胞凋亡和自噬相关蛋白的转录和表达水平的变化。而用小干扰RNA技术沉默LC3基因可以显着逆转人参皂苷Rg3导致的MG-63细胞的凋亡和迁移侵袭受限。WB实验显示人参皂苷Rg3可以使p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTORC1/mTORC1表达水平降低,而LC3/β-actin的表达水平增高,而加入PI3K激动剂IGF-1则可以逆转人参皂苷Rg3导致的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTORC1/mTORC1和LC3/β-actin表达水平的变化。流式细胞术检验经人参皂苷Rg3处理的骨肉瘤细胞系MG-63、HOS、U2OS处于G0/G1的细胞的比例上升,处于S期的细胞比例下降。WB实验结果显示人参皂苷Rg3处理的MG-63细胞中cyclinA、cyclinB的表达未见明显改变,而cyclinD1、CDK-4以及CDK-6的表达量显着下降,上游调节因子p53、p21的表达量显着上升。用小干扰RNA技术沉默p53基因可以显着逆转人参皂苷Rg3导致的周期阻滞作用和p21、cyclinD1、CDK4、CDK6表达水平的变化。实验结论:人参皂苷Rg3通过抑制PI3K/Akt/mTORC1,降低自噬抑制因子mTORC1的表达,引发细胞的自噬,LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平的增高,继而引起凋亡基因caspase-3转录和表达水平的升高并最终导致MG-63细胞的凋亡。同时,人参皂苷Rg3可以通过激活p53/p21来抑制G1期向S期转化的关键性蛋白cyclinD1和CDK-4、CDK-6的表达和活性使骨肉瘤细胞阻滞于G0/G1期。
二、紫杉醇诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡及对磷酸化Bcl-2的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、紫杉醇诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡及对磷酸化Bcl-2的影响（论文提纲范文）
（1）鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 凋亡素 |
| 1.2 溶瘤腺病毒与肿瘤治疗 |
| 1.3 癌症干细胞研究进展 |
| 1.3.1 癌症干细胞的概念 |
| 1.3.2 CSCs的鉴定 |
| 1.3.3 CSCs的特征 |
| 1.3.4 CSCs转录因子的标志 |
| 1.3.5 CSCs与癌症转移 |
| 1.3.6 CSC与临床治疗 |
| 1.3.7 CSCs与细胞凋亡 |
| 第二章 乳腺癌干细胞干性特征分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 试剂和材料 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乳腺癌干细胞MCF7-CSC分选培养与传代 |
| 2.2.2 MCF7-CSC血清诱导分化 |
| 2.2.3 细胞克隆形成能力 |
| 2.2.4 Western Blot检测MCF7-CSC干细胞调控因子表达水平 |
| 2.2.5 PCR Array检测人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.2.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MCF7-CSC分选培养 |
| 2.3.2 MCF7-CSC血清诱导分化能力 |
| 2.3.3 MCF7-CSC细胞克隆形成能力 |
| 2.3.4 MCF7-CSC干细胞调控因子表达 |
| 2.3.5 MCF7-CSC人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
| 2.3.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 重组腺病毒对MCF7-CSC的抑制作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株 |
| 3.1.2 试剂和材料 |
| 3.1.3 仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组腺病毒制备、纯化与毒价测定 |
| 3.2.2 重组腺病毒对MCF7-CSC干性抑制 |
| 3.2.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.2.4 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.2.5 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组腺病毒对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 3.3.2 CFSE检测重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 3.3.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
| 3.3.4 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 重组腺病毒对MCF7-CSC的小鼠体内抑制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株和动物 |
| 4.1.2 试剂和材料 |
| 4.1.3 仪器和设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的抑制 |
| 4.2.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内肿瘤杀伤作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的检测 |
| 4.3.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC的小鼠体内杀伤作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Ad-VT与 MCF7-CSC药物敏感性 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株和动物 |
| 5.1.2 试剂和材料 |
| 5.1.3 仪器和设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.2.2 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.2.3 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.2.4 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.2.5 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内肿瘤形成能力抑制 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
| 5.3.2 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
| 5.3.3 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
| 5.3.4 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
| 5.3.5 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内成瘤能力抑制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 6.3 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）DYNLT1调控细胞周期影响乳腺癌细胞增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表及中英文对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 在生物数据库中DYNLT1在乳腺癌中高表达 |
| 2. DYNLT1在体外促进乳腺癌细胞增殖 |
| 3. DYNLT1在体外通过影响细胞周期G2/M期促进乳腺癌增殖的机制研究 |
| 4. DYNLT1的表达对紫杉醇(PTX)药物敏感性的影响 |
| 5. DYNLT1对裸鼠肿瘤生成的影响及对紫杉醇药物的敏感性的影响 |
| 6. DYNLT1的表达水平与临床患者生存预后的关系 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞周期在肿瘤疾病中的影响 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）干扰线粒体动力学增加胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 概述GBM |
| 2.1.1 危险因素 |
| 2.1.2 临床表现 |
| 2.1.3 分子诊断及分型 |
| 2.1.4 GBM的临床治疗 |
| 2.2 GBM耐药机制 |
| 2.2.1 肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs) |
| 2.2.2 肿瘤细胞的药物外排机制 |
| 2.2.3 DNA损伤修复机制 |
| 2.2.4 肿瘤细胞中“促活”的信号转导通路 |
| 2.2.5 自噬(Autophagy) |
| 2.2.6 未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR) |
| 2.2.7 Bcl2 家族 |
| 2.2.8 能量代谢模式重编程 |
| 2.3 线粒体动力学概述及对细胞能量代谢影响 |
| 2.3.1 线粒体分裂融合 |
| 2.3.2 线粒体分裂融合与能量代谢的关系 |
| 2.4 线粒体动力学与肿瘤化疗耐药的关系 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 细胞系 |
| 3.1.4 实验使用质粒 |
| 3.2 实验仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞复苏 |
| 3.3.2 细胞培养与传代 |
| 3.3.3 细胞冻存 |
| 3.3.4 质粒提取 |
| 3.3.5 细胞转染 |
| 3.3.6 MTT细胞活力检测 |
| 3.3.7 细胞RNA提取 |
| 3.3.8 RNA逆转录 |
| 3.3.9 细胞DNA提取 |
| 3.3.10 qPCR |
| 3.3.11 线粒体DNA损伤水平检测 |
| 3.3.12 细胞线粒体蛋白提取 |
| 3.3.13 细胞核蛋白提取 |
| 3.3.14 蛋白样品制备 |
| 3.3.15 Western blot |
| 3.3.16 细胞免疫荧光 |
| 3.3.17 OCR测定 |
| 3.3.18 ATP测定 |
| 3.3.19 葡萄糖耗量测定 |
| 3.3.20 细胞乳酸分泌量测定 |
| 3.3.21 线粒体形态定量分析 |
| 3.3.22 克隆形成实验 |
| 3.3.23 免疫组织化学 |
| 3.3.24 透射电子显微镜检查 |
| 3.3.25 裸鼠荷瘤模型体内验证实验 |
| 3.4 数据分析及统计学方法 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 TMZ作用引起SHG44和U87 细胞能量代谢模式改变 |
| 4.1.1 TMZ处理条件下SHG44和U87 细胞出现氧化磷酸化水平的升高 |
| 4.1.2 TMZ诱导的氧化磷酸化水平升高不伴随细胞内ROS水平的升高 |
| 4.2 P53 蛋白下调线粒体自噬引起肿瘤细胞中线粒体数量积累 |
| 4.2.1 TMZ处理条件下SHG44和U87 细胞出现了线粒体数量的增多 |
| 4.2.2 线粒体自噬水平的下调促进了线粒体数量的积累 |
| 4.2.3 PINK1 表达的下调是TMZ诱导线粒体自噬通量下调的重要机制 |
| 4.2.4 P53 蛋白可能参与了TMZ处理条件下PINK1 表达的下调 |
| 4.2.5 TMZ 诱导 SHG44 和 U87 细胞出现 DNA 损伤和 TP53 高表达 |
| 4.2.6 P53 蛋白负向调控PINK1 的表达 |
| 4.3 TMZ 处理条件下,肿瘤细胞中 AMPK-Drp1 轴的激活是影响能量代谢模式的重要机制 |
| 4.3.1 TMZ可以诱导SHG44和U87 细胞中线粒体融合的发生 |
| 4.3.2 Drp1 向线粒体转位的减少是TMZ诱导线粒体融合的重要机制 |
| 4.3.3 TMZ诱导肿瘤细胞中能量供求失衡及AMPK的激活,AMPK调控了Drp1 的亚细胞分布 |
| 4.3.4 Drp1在SHG44和U87 细胞中的亚细胞定位存在差异 |
| 4.4 干扰TMZ诱导的线粒体融合可以影响细胞能量代谢模式、增加GBM对 TMZ化疗的敏感性 |
| 4.4.1 使用相关抑制剂可以干扰TMZ诱导的线粒体动力学改变 |
| 4.4.2 干扰线粒体动力学过程可以影响TMZ的浓度-活力曲线 |
| 4.4.3 干扰线粒体动力学可以影响TMZ诱导的能量代谢模式改变 |
| 4.4.4 干扰TMZ诱导的线粒体融合过程可以增强TMZ的化疗效果 |
| 4.4.5 体内实验中干扰线粒体融合增加异体移植瘤对TMZ治疗的敏感性 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在校期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第1部分 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡的影响 |
| 1.1 背景与目的 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.2.1 细胞系 |
| 1.2.2 实验药品及试剂 |
| 1.2.3 实验仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养及实验分组 |
| 1.3.2 三七总皂苷对Y79 细胞增殖的影响 |
| 1.3.3 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡的影响 |
| 1.3.4 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡基因m RNA表达的影响 |
| 1.3.5 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡基因蛋白表达的影响 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 三七总皂苷抑制Y79 细胞的增殖 |
| 1.4.2 三七总皂苷促进Y79 细胞的凋亡 |
| 1.4.3 三七总皂苷影响Y79 细胞凋亡基因m RNA的表达 |
| 1.4.4 三七总皂苷诱导Y79 细胞凋亡基因蛋白表达的改变 |
| 1.5 讨论 |
| 1.5.1 三七总皂苷对Y79 细胞增殖的抑制作用 |
| 1.5.2 三七总皂苷对Y79 细胞凋亡的诱导作用 |
| 1.6 结论 |
| 第2部分 三七总皂苷对Y79 细胞PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 2.1 背景与目的 |
| 2.2 主要试剂和耗材 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 实验药品及试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PI3K抑制剂LY294002对Y79 细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 PI3K抑制剂对Y79 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.3 三七总皂苷对Y79 细胞PI3K/AKT通路蛋白的影响 |
| 2.3.4 抑制PI3K/AKT通路对Y79 细胞凋亡相关蛋白的影响 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 LY294002 具有抑制Y79 细胞增殖的作用 |
| 2.4.2 LY294002 与三七总皂苷能协同促进Y79 细胞的凋亡 |
| 2.4.3 三七总皂苷影响Y79 细胞PI3K/AKT通路蛋白表达 |
| 2.4.4 抑制PI3K/AKT通路影响Y79 细胞凋亡蛋白的表达 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 抑制PI3K/AKT通路能促进Y79 细胞的凋亡 |
| 2.5.2 三七总皂苷对PI3K/AKT信号通路具有抑制作用 |
| 2.5.3 三七总皂苷抑制PI3K/AKT通路诱导Y79 细胞凋亡 |
| 2.6 结论 |
| 第3部分 三七总皂苷对Y79 细胞的细胞周期影响 |
| 3.1 背景与目的 |
| 3.2 主要试剂和耗材 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 实验药品及试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞复苏 |
| 3.3.2 实验分组 |
| 3.3.3 三七总皂苷处理Y79 细胞后对细胞周期的影响 |
| 3.3.4 三七总皂苷对Y79 细胞周期基因m RNA表达的影响 |
| 3.3.5 三七总皂苷对Y79 细胞周期基因蛋白表达的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 三七总皂苷诱导Y79 细胞阻滞于G0/G1期 |
| 3.4.2 三七总皂苷影响Y79 细胞中周期相关m RNA的表达 |
| 3.4.3 三七总皂苷影响Y79 细胞中周期相关蛋白的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 细胞周期的调控机制 |
| 3.5.2 三七总皂苷对Y79 细胞的周期阻滞作用 |
| 3.6 结论 |
| 问题与展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 植物源性天然产物抗视网膜母细胞瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（5）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状 |
| 1 药效成分 |
| 2 药理作用 |
| 3 不良反应研究现状 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展 |
| 1 CYP代谢 |
| 2 线粒体稳态 |
| 3 氧化损伤 |
| 4 细胞凋亡 |
| 5 胆汁淤积 |
| 6 Ca~(2+)浓度平衡破坏 |
| 7 免疫激活介导的炎症因子释放 |
| 8 特异反应 |
| 9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 第一节 肝细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 心血管细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 肝细胞毒性机制研究 |
| 2 心血管毒性机制研究 |
| 本章总结 |
| 第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制 |
| 第一节 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 生物信息分析 |
| 6 机制分析 |
| 7 PPI网络 |
| 8 潜在生物标志物 |
| 第二节 Q300靶向代谢组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 通路富集 |
| 6 通路分析 |
| 7 潜在生物标志物 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2 Q300靶向代谢组学 |
| 3 蛋白组学-代谢组学关联分析 |
| 第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证 |
| 1 动物组织Western blot验证 |
| 2 斑马鱼qPCR实验验证 |
| 3 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究 |
| 4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）初步探究菜蓟苦素抑制黑色素瘤细胞生长的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 黑色素瘤的流行病学与危险因素 |
| 1.2 黑色素瘤的发生与病理特征 |
| 1.3 黑色素瘤的治疗现状 |
| 1.4 菜蓟苦素(CYNAROPICRIN,CYN) |
| 第二章 实验材料与实验方法 |
| 2.1 细胞来源 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 CCK8 实验 |
| 2.7 免疫印迹实验(WESTERN BLOT) |
| 2.8 动物实验(菜蓟苦素在裸鼠体内对黑色素瘤生长的影响) |
| 2.9 转录组测序 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 CCK8 实验检测菜蓟苦素影响黑色素瘤细胞的活力 |
| 3.2 WESTERN BLOT检测用菜蓟苦素处理黑色素瘤A375 细胞和A2058 细胞后BAX、BCL-2 和PARP蛋白的表达 |
| 3.3 动物实验观察菜蓟苦素对黑色素瘤瘤体生长的影响 |
| 3.4 转录组测序结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 皮肤黑色素瘤的治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在读期间发表论文情况 |
（7）绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡 |
| 第一节 Gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 Gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞迁移 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三节 Gypenoside L和gypenoside LI诱导乳腺癌细胞凋亡 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第四节 结论与讨论 |
| 第二章 Gypenoside LI下调E2F1使乳腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期 |
| 第一节 Gypenoside LI影响乳腺癌细胞转录组 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 Gypenoside LI诱导乳腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三节 Gypenoside LI通过下调E2F1使乳腺癌细胞阻滞在G0/G1期 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第四节 Gypenoside LI通过下调ERCC6L抑制乳腺癌细胞增殖 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第五节 E2F1可调控ERCC6L的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第六节 结论与讨论 |
| 第三章 Gypenoside L诱导乳腺癌细胞周期G2/M期阻滞和细胞凋亡机制研究 |
| 第一节 Gypenoside L影响乳腺癌细胞转录组 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 Gypenoside L诱导乳腺癌细胞周期阻滞在G2/M期 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三节 Gypenoside L下调乳腺癌细胞中ERCC6L的表达可能与有丝分裂有关 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第四节 Gypenoside L诱导乳腺癌细胞产生ROS |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第五节 结论与讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 天然产物调节转录因子预防及治疗癌症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间主持及主要参与课题 |
（8）PEITC调控结肠癌凋亡的机制研究及安全性评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 结直肠癌 |
| 1.2 结直肠癌的发生发展 |
| 1.3 细胞凋亡通路及其调控机制 |
| 1.4 异硫氰酸苯乙酯(PEITC)在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.5 立项依据与研究内容 |
| 第二章 PEITC对结肠癌发展的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 细胞株 |
| 2.2.3 主要实验试剂 |
| 2.3 主要实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养及传代 |
| 2.3.2 MTT检测细胞增殖 |
| 2.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.4 克隆形成实验 |
| 2.3.5 细胞划痕实验 |
| 2.3.6 Transwell侵袭实验 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PEITC抑制结肠癌细胞增殖 |
| 2.4.2 PEITC诱导结肠癌细胞凋亡 |
| 2.4.3 PEITC抑制结肠癌细胞集落形成 |
| 2.4.4 PEITC抑制结肠癌细胞的迁移 |
| 2.4.5 PEITC抑制结肠癌细胞的侵袭 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 PEITC通过线粒体途径诱导结肠癌细胞凋亡 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 q-PCR |
| 3.3.3 Western blot |
| 3.3.4 OPA1多聚物和可溶性OPA1检测 |
| 3.3.5 用JC-1染色检测线粒体内膜膜电位 |
| 3.3.6 荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 PEITC促进结肠癌细胞Caspase-3和Caspase-9蛋白的活化 |
| 3.4.2 PEITC抑制结肠癌细胞的OPA1多聚物的形成,增加可溶性OPA1表达 |
| 3.4.3 PEITC下调结肠癌细胞的线粒体内膜膜电势 |
| 3.4.4 PEITC上调结肠癌细胞内活性氧(ROS)水平 |
| 3.4.5 PEITC促进结肠癌细胞的BAX/BCL-2比值 |
| 3.4.6 PEITC促进结肠癌细胞H2A.X磷酸化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PEITC通过SMAC/Survivin信号通路调控结肠癌细胞凋亡 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 SiRNA处理细胞 |
| 4.3.3 细胞质组分分离 |
| 4.3.4 Western blot |
| 4.3.5 流式检测细胞凋亡 |
| 4.3.6 免疫共沉淀 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 PEITC促进结肠癌细胞SMAC和Cyto-c的表达 |
| 4.4.2 PEITC通过SMAC诱导结肠癌细胞凋亡 |
| 4.4.3 PEITC诱导结肠癌细胞SMAC与Survivin结合 |
| 4.4.4 PEITC促进结肠癌细胞ERK和JNK蛋白的磷酸化 |
| 4.4.5 PEITC通过ERK和JNK通路促进凋亡相关蛋白表达 |
| 4.4.6 PEITC通过ERK和JNK通路促进细胞凋亡 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 利用结肠癌裸鼠成瘤模型评价PEITC的抑癌效果及安全性 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与材料 |
| 5.2.1 主要实验仪器 |
| 5.2.2 主要实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 SPF级动物饲养 |
| 5.3.3 裸鼠皮下成瘤模型的建立 |
| 5.3.4 实时定量PCR检测mRNA表达 |
| 5.3.5 Western blot检测蛋白表达 |
| 5.3.6 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 PEITC抑制结肠癌肿瘤的生长 |
| 5.4.2 PEITC促进结裸鼠结肠癌肿瘤中线粒体途径凋亡相关蛋白Caspase-9、SMAC,抑制Survivin蛋白表达 |
| 5.4.3 PEITC对裸鼠血常规三系细胞数量无影响 |
| 5.4.4 PEITC对裸鼠肝肾功能无影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 讨论和结论 |
| 6.1 讨论 |
| 6.2 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 异硫氰酸苯乙酯抗肿瘤凋亡机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
| 致谢 |
（9）KIF15对卵巢癌增殖和凋亡的影响及相关调控网络的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 卵巢癌组织基因表达谱数据挖掘和生物信息学方法进行目标基因筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 KIF15在卵巢癌组织中的表达分析以及其对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 KIF15在卵巢癌中调控网络的生物信息学分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Kinesin家族蛋白在肿瘤中的作用及Kinesin靶向治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）人参皂苷Rg3抑制人骨肉瘤细胞增殖及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 骨肉瘤的简介 |
| 1.1.1 骨肉瘤的发病机制 |
| 1.1.2 骨肉瘤的临床表现 |
| 1.1.3 骨肉瘤的组织学特征 |
| 1.1.4 骨肉瘤的影像学特征 |
| 1.1.5 骨肉瘤的分期 |
| 1.2 骨肉瘤的治疗 |
| 1.2.1 化学药物治疗 |
| 1.2.2 手术治疗 |
| 1.2.3 新型疗法 |
| 1.3 人参皂苷Rg3的抗肿瘤作用 |
| 1.3.1 人参皂苷的简介 |
| 1.3.2 人参皂苷Rg3的抗肿瘤机制 |
| 1.4 细胞自噬与肿瘤 |
| 1.4.1 细胞自噬的简介 |
| 1.4.2 自噬与肿瘤 |
| 1.5 细胞周期与肿瘤 |
| 1.5.1 细胞周期的介绍 |
| 1.5.2 细胞周期的调节 |
| 1.5.3 细胞周期与肿瘤 |
| 第2章 人参皂苷Rg3抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭的研究 |
| 2.1 实验样本 |
| 2.2 实验所需试剂材料和设备 |
| 2.2.1 主要试剂及材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 骨肉瘤细胞的培养 |
| 2.3.2 MTT法检测药物对细胞增殖的抑制作用 |
| 2.3.3 流式细胞分析 |
| 2.3.4 划痕实验 |
| 2.3.5 Transwell侵袭实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 MTT法检测骨肉瘤细胞的增殖 |
| 2.4.2 人参皂苷Rg3促进骨肉瘤细胞凋亡 |
| 2.4.3 人参皂苷Rg3抑制骨肉瘤细胞的迁移能力 |
| 2.4.4 人参皂苷Rg3抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 人参皂苷Rg3促进骨肉瘤细胞MG-63自噬和凋亡的实验研究 |
| 3.1 实验样本 |
| 3.2 实验所需试剂材料和设备 |
| 3.2.1 主要试剂及材料 |
| 3.2.2 主要仪器及设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞的培养与传代 |
| 3.3.2 定量PCR |
| 3.3.3 Western blot实验 |
| 3.3.4 划痕实验 |
| 3.3.5 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 人参皂苷Rg3促进MG-63细胞的自噬与凋亡 |
| 3.4.2 加入自噬抑制剂可以抑制人参皂苷Rg3导致的凋亡 |
| 3.4.3 沉默LC3基因可以抑制人参皂苷Rg3导致的凋亡 |
| 3.4.4 人参皂苷Rg3 通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路诱导自噬和凋亡 |
| 3.4.5 激活PI3K信号通路可以逆转人参皂苷Rg3 导致的MG-63 细胞凋亡比例的增加和迁移侵袭的抑制 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 人参皂苷Rg3抑制骨肉瘤细胞细胞周期的实验研究 |
| 4.1 实验样本 |
| 4.2 实验所需试剂材料和设备 |
| 4.2.1 主要试剂及器材 |
| 4.2.2 主要仪器及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养与传代 |
| 4.3.2 流式细胞检测细胞周期 |
| 4.3.3 Western blot实验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 人参皂苷Rg3阻滞骨肉瘤细胞阻滞于G0/G1期 |
| 4.4.2 人参皂苷Rg3对骨肉瘤细胞系MG-63周期蛋白及其依赖性激酶的作用 |
| 4.4.3 人参皂苷Rg3对细胞周期相关上游通路调控因子p53/p21的作用 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、紫杉醇诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡及对磷酸化Bcl-2的影响（论文参考文献）
- [1]鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究[D]. 李文杰. 广西大学, 2021(01)
- [2]DYNLT1调控细胞周期影响乳腺癌细胞增殖的机制研究[D]. 崔璐璐. 广州医科大学, 2021
- [3]干扰线粒体动力学增加胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗敏感性的机制研究[D]. 王楠. 吉林大学, 2021(01)
- [4]三七总皂苷对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响[D]. 刘景晨. 大理大学, 2021(09)
- [5]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
- [6]初步探究菜蓟苦素抑制黑色素瘤细胞生长的作用及机制[D]. 曾卫平. 汕头大学, 2021(02)
- [7]绞股蓝皂苷gypenoside L和gypenoside LI抑制乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡的机制研究[D]. 祖玛丽. 中央民族大学, 2021(12)
- [8]PEITC调控结肠癌凋亡的机制研究及安全性评估[D]. 黄莉. 南方医科大学, 2020(06)
- [9]KIF15对卵巢癌增殖和凋亡的影响及相关调控网络的生物信息学分析[D]. 孙欣慰. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [10]人参皂苷Rg3抑制人骨肉瘤细胞增殖及其分子机制研究[D]. 刘明阳. 吉林大学, 2020(01)