一、肝细胞癌SCT表现特征与Rb,PCNA的关系（论文文献综述）
叶超毅[1]（2021）在《ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺血管重构中的作用及机制》文中认为研究背景PH（pulmonary hypertension,肺高血压）一种严重的致死性疾病,主要表现为肺小血管重构、肺血管阻力增加和继发性右心衰竭。大量文献表明PASMCs（pulmonary arterial smooth muscle cells,肺动脉平滑肌细胞）的过度增殖和迁移是PH发生发展的重要病理因素。ZIP12是锌转运蛋白家族的一员,可将细胞外锌离子转运至细胞内。最新的研究发现,ZIP12的表达上调与缺氧诱导的细胞内游离锌离子的升高和PASMCs的过度增殖有关。ZIP12基因敲除可抑制缺氧诱导的细胞外锌离子内流及细胞增殖,改善肺血管重构,抑制肺动脉压力的升高。然而,ZIP12 在 MCT（monocrotaline,野百合碱）诱导的 PAH（pulmonary arterial hypertension,肺动脉高压）大鼠中的表达及其作用机制仍不明确。目的本研究的目的是观察ZIP12在MCT诱导的PAH大鼠肺组织中的表达,并研究其在PASMCs增殖和迁移中的作用及可能机制。方法第一部分ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中的表达根据团队前期制定的方案,采用间隔一周分2次腹腔注射20mg/kg的MCT建立PAH大鼠模型。在MCT给药4周后,检测血流动力学指标、RVHI（right ventricular hypertrophy index,右心室肥厚指数）和肺及右心组织形态学改变。采用免疫荧光和免疫组化染色检测肺组织中ZIP12的表达及定位情况。RT-qPCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,实时荧光定量 PCR）检测肺组织中ZIP12mRNA的表达情况。Western blot检测肺组织中ZIP12、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA 和 cyclin D1 的蛋白质表达情况。第二部分ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移中的作用从MCT诱导的PAH大鼠和对照组大鼠肺动脉分离并培养PASMCs。通过形态学和α-SMA免疫荧光染色对细胞进行鉴定。使用ZIP12单克隆抗体和细胞膜标记探针DiO对PASMCs进行染色,确定细胞内ZIP12的表达定位。构建ZIP12敲除和过表达慢病毒,分别转染PAH-PASMCs和Ctrl-PASMCs。采用EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）掺入法检测细胞增殖。划痕实验检测细胞迁移能力。Western blot检测ZIP12、PCNA和cyclin D1的蛋白质表达水平。第三部分ZIP12参与野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的机制探索为了进一步探讨ZIP12调控细胞增殖和迁移的分子机制,首先通过Western blot检测10%FBS（fetalbovine serum,胎牛血清）刺激的 Ctrl-PASMCs 和 PAH-PASMCs中AKT和ERK1/2的磷酸化。将ZIP12基因敲除和过表达慢病毒分别转染PAH-PASMCs和Ctrl-PASMCs,检测ZIP12沉默和过表达对AKT和ERK1/2磷酸化的影响。之后分别使用PI3K/AKT通路抑制剂（LY294002,10μM）和ERK通路抑制剂（U0126,10μM）对ZIP12过表达的PASMCs进行预处理。采用EdU掺入法检测细胞增殖。划痕实验检测细胞迁移能力。Western blot检测p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、PCNA 和 cyclin D1 的蛋白质表达水平。结果第一部分ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中的表达MCT 给药 4 周后,mPAP（mean pulmonary arterial pressure,平均肺动脉压）、RVHI、WA%（percentwall area,血管壁面积百分比）、WT%（percent wall thickness,血管壁厚度百分比）和远端动脉肌化程度与对照组相比显着升高（mPAP:Ctrl 19.07±2.53mmHg,PAH31.18±2.67mmHg,P<0.05;RVHI:Ctrl25.60±4.78%,PAH 50.55±6.77%,P<0.05;WA%:Ctrl61.93±5.03,PAH 94.08±2.49,P<0.05;WT%:Ctrl 23.15±5.80,PAH 72.05±6.96,P<0.05;非肌化血管:Ctrl 66.57±10.39%,PAH 18.38±9.04%,P<0.05;部分肌化血管:Ctrl 20.18±7.45%,PAH 31.05±7.34%,P<0.05;完全肌化血管:Ctrl 13.25±7.17%,PAH 50.57±12.53,P<0.05）,并且PCNA阳性细胞数和血管周围胶原沉积较对照组均明显增多。右心室HE染色结果显示,MCT诱导的PAH组心肌细胞横截面积较正常对照组相比显着增加（心肌细胞横截面积:Ctrl 174±31.44μm2,PAH 443.88±69.89μm2,P<0.05）。RT-qPCR和Westernblot结果显示,在MCT诱导的PAH大鼠肺组织中ZIP12mRNA和蛋白质表达水平较对照组相比均显着升高（P<0.05）。免疫荧光和免疫组化染色结果显示,ZIP12在MCT诱导的PAH大鼠肺动脉平滑肌层的表达明显增强。此外,与对照组相比,MCT诱导的PAH大鼠肺组织中p-AKT、p-ERK1/2、PCNA和cyclin D1的蛋白表达水平显着增加（P<0.05）,而AKT和ERK1/2的表达无显着差异（P>0.05）。第二部分ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移中的作用分离培养的PASMCs呈长梭形,边界清晰,经α-SMA免疫荧光染色证实分离培养的细胞为平滑肌细胞。细胞免疫荧光染色显示ZIP12分布于细胞膜上。与Ctrl-PASMCs相比,PAH-PASMCs的增殖和迁移率显着增加（细胞增殖率:Ctrl-PASMCs 11.06±1.32%,PAH-PASMCs25.23±3.62%,P<0.05;细胞迁移率:24h:Ctrl-PASMCs 21.24±2.90%,PAH-PASMCs 46.74±6.93%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 39.01±6.74%,PAH-PASMCs 77.93±11.76%,P<0.05）。通过 Western blot检测PCNA和cyclin D1的表达证实了上述结果（P<0.05）。这些作用可通过沉默 ZIP12 而得到显着抑制（细胞增殖率:Ctrl-PASMCs 12.11±1.62%,PAH-PASMCs 21.53±2.47%,PAH-PASMCs+LV-shNC 19.93±4.56%,PAH-PASMCs+LV-shZIP 1214.14±1.85%,P<0.05;细胞迁移率:24h:Ctrl-PASMCs 23.02±3.62%,PAH-PASMCs 43.36±4.87%,PAH-PASMCs+LV-shNC 42.20±6.71%,PAH-PASMCs+LV-shZIP12 29.95±2.41%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 40.89±3.60%,PAH-PASMCs 82.34±7.06%,PAH-PASMCs+LV-shNC 76.46±5.60%,PAH-PASMCs+LV-shZIP1250.23±5.55%,P<0.05）。相反,过表达ZIP12能够促进细胞的增殖和迁移（细胞增殖率:Ctrl-PASMCs 12.46±1.23%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 10.90±1.61%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12 18.03±0.77%,P<0.05;细胞迁移率:24h:Ctrl-PASMCs 26.11±3.39%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 20.92±8.79%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP1260.28±9.81%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 44.58±3.80%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 37.67±10.65%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12 77.03±10.06%,P<0.05）,上调 PCNA和 cyclin D1 的表达（P<0.05）。第三部分ZIP12参与野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的机制探索Westernblot 结果显示,10%FBS 刺激 PAH-PASMCs 诱导的 AKT 和 ERK1/2的磷酸化程度明显高于Ctrl-PASMCs（P<0.05）。在PAH-PASMCs中沉默ZIP12显着抑制AKT和ERK1/2的磷酸化（P<0.05）,然而在Ctrl-PASMCs中过表达ZIP12显着促进AKT和ERK1/2的磷酸化（P<0.05）。使用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理ZIP12过表达的Ctrl-PASMCs能够部分抑制ERK1/2磷酸化的增加,而ERK通路抑制剂U0126对AKT的磷酸化没有影响,表明AKT位于ERK1/2的上游。此外,LY294002能够完全抑制ZIP12过表达对细胞增殖和迁移的促进作用,而U0126仅表现出部分抑制的作用（细胞增殖率:Ctrl-PASMCs 11.49±1.05%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 11.32±1.36%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP1219.85±0.60%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+LY294002 4.81±1.30%,Ctr1-PASMCs+LV-ZIP12+U0126 15.31±0.39%,P<0.05;细胞迁移率:24h:Ctrl-PASMCs 30.29±3.22%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 20.94±6.01%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP1257.48±8.76%,Ctrl-PASMCs±LV-ZIP12+LY294002 24.53±3.31%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+U0126 44.53±7.03%,P<0.05;48h:Ctrl-PASMCs 41.92±8.98%,Ctrl-PASMCs+LV-NC 36.06±9.18%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12 78.99±5.73%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+LY294002 36.74±2.15%,Ctrl-PASMCs+LV-ZIP12+U012660.91±8.04%,P<0.05）。结论1.ZIP12在MCT诱导的PAH大鼠肺组织中表达升高;2.ZIP12参与了MCT诱导的PAH大鼠PASMCs的过度增殖和迁移;3.ZIP12可通过AKT/ERK通路调控PASMCs的增殖和迁移。
胡博[2]（2021）在《长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究》文中研究说明背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种原发性肝脏恶性肿瘤,在世界范围内发病率高、治疗效果欠佳。随着靶向治疗药物如索拉非尼、伦伐替尼,以及免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂的出现,其预后得到一定的改善,但5年生存率仍旧不高。竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）揭示了RNA间相互作用的新机制,即以长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）为主的非编码RNA通过竞争性共享微小RNA（microRNA,miRNA）来调节mRNA（messenger RNA,信使RNA）的表达,这种调节机制在癌症的发病机理中扮演了重要的角色。但是,ceRNA在HCC中的功能作用及调节机制仍未被完全解释,新的ceRNA调控轴亟待探究。lncRNA CYTOR是一种已被证实在多种肿瘤中发挥促进细胞增殖、迁移等作用的非编码基因,并可作为多种miRNA的内源性海绵。然而,lncRNACYTOR作为ceRNA在HCC发生、发展中的作用及调控网络目前仍不十分清楚。因此,本研究以lncRNACYTOR为起点,探索ceRNA调节机制在HCC中的应用。材料与方法:通过检索癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,获得人类HCC的lncRNA、mRNA和miRNA数据集表达数据和相应临床信息。下载基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）数据库中GSE62232和GSE84402的HCC相关RNA数据用于后续验证。借助在线数据分析工具,分析lncRNA CYTOR在多种肿瘤类型及HCC相关数据集中的表达情况。借助R语言分析lncRNA CYTOR在TCGA数据库中HCC肿瘤组织及癌旁正常肝组织中的差异表达情况,以及其表达水平与TCGA数据库HCC患者总生存期（overall survival,OS）之间的关系。分析lncRNA CYTOR与常用临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤分级、临床分期和T、N、M分期之间的关联性,并进一步整合这些参数,通过单因素及多因素Cox回归分析探究lncRNA CYTOR独立预测患者预后的能力。之后,识别TCGA数据库HCC样品中差异表达的miRNA,同时使用ENCORI软件（starbase3.0）预测目标lncRNA的靶向的miRNA,选择差异分析中表达下调的miRNA与预测的miRNA做交集后得出候选miRNA。同理,基于TCGA数据库分析HCC样品中差异表达的mRNA,并基于ENCORI软件使用6个数据库（PITA、miRNAmap、DIANA-microT、miRanda、PicTar 和 TargetScan）预测候选 miRNA 靶向的mRNA,选择差异分析中表达上调的mRNA与预测的mRNA做交集后得出候选的mRNA。使用基因集富分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）来识别与所筛选出的mRNA高表达相关的基因集和通路途径,探索其潜在的功能。结果:lncRNACYTOR在多种癌症的肿瘤组织（如结肠癌、肾透明细胞癌、膀胱尿路上皮癌等）及多个HCC相关数据集中（如GSE54236、GSE64041、GSE36376等）相较于癌旁组织表达上调。在TCGA数据库中,与癌旁正常组织相比,HCC组织中的lncRNACYTOR表达水平显着增高（P<0.001）;且高表达患者组的OS较低表达患者组显着缩短（P<0.001）。临床病理参数关联性分析显示,lncRNACYTOR的表达水平与病理分级（Grade）显着相关,且G2与G1（P<0.01）、G3与G2（P<0.05）、G3与G1（P<0.001）和G4与G1（P<0.05）之间存在显着性差异;该基因在临床Ⅱ期（StageⅡ）的表达水平较临床Ⅰ期（StageⅠ）显着上调（P<0.001）,在T2期及T4期的表达水平较T1期显着上调（P<0.001;P<0.05）。独立预后分析表明lncRNA可独立于上述临床参数来预测HCC患者的预后（P<0.05）。ENCORI软件分析得出miR-125b-5p可作为lncRNA CYTOR的靶向miRNA,后续6个数据库综合分析得出KIAA1522及PODXL可作为miR-125b-5p的候选靶向mRNA。对二者进行差异分析、生存分析及与miR-125b-5p的相关分析后,选择KIAA1522作为目标靶向mRNA。相较于癌旁组织,KIAA1522在GSE62232和GSE84402的HCC组织中表达显着上调（P<0.001）。GSEA富集分析结果表明,cell cycle信号通路、adherens junction信号通路、Notch信号通路、mTOR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、apoptosis信号通路和tight junction信号通路相关的基因集在高KIAA1522表达的表型中显着富集。结论:探究lncRNA的表达情况、生物学功能,构建新的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴是研究HCC发病机制的有效手段。lncRNA在HCC组织中表达水平显着上调,与多种临床病理参数相关,且可作为HCC患者潜在的预后生物标志物。此外,lncRNA CYTOR可通过靶向miR-125b-5p进而调节KIAA1522的表达参与HCC的发生发展。背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种由多种病因引起肿瘤,目前仍是人类最常见、最致命的恶性肿瘤之一。因此,寻找新的、临床上有效的HCC诊断及预后生物标志物至关重要。本实验的主要目的是基于第一部分生物信息学分析的结果,探索长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）CYTOR、微小RNA（microRNA,miRNA）miR-125b-5p 以及蛋白编码信使 RNA（messenger RNA,mRNA）KIAA1522的靶向调控作用及该调控轴在HCC发生、发展中的作用。材料与方法:通过脂质体将目的基因相关载体转染至正常肝细胞（HHL-5）及几种HCC细胞（SK-Hep-1、Hep3b和Huh-7）后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测 HCC 细胞中 lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522的表达,并筛选实验细胞。免疫组化检测KIAA1522在HCC组织及癌旁正常组织中的表达情况。采用双荧光素酶报告基因检测试验证实lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522间的调控关系。之后,利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测不同转染条件下HCC细胞的增殖情况,采用流式细胞仪分析转染后HCC细胞周期的变化,使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL）观察转染后 HCC 细胞的凋亡情况;并通过蛋白免疫印迹实验（western blot,WB）分析检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等相关蛋白的表达。结果:转染后,相较于HHL-5细胞,Hep3b细胞中上述基因的表达均是最为显着的,故选择Hep3b细胞进行下一步实验。双荧光素酶报告基因检测实验的结果显示miR-125b-5p mimic+CYTOR-wt 共转染组和miR-125b-5p mimic+KIAA1522-wt 共转染组Hep3b细胞的荧光素酶活性显着降低;lncRNA CYTOR可直接作用于miR-125b-5p,而miR-125b-5p可直接靶向KIAA1522。CCK-8实验结合WB检测结果显示敲低lncRNACYTOR抑制了 HCC细胞的增殖,并下调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则促进了细胞的增殖并上调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达。流式细胞仪分析结合WB检测结果显示敲低lncRNA CYTOR 降低了 S期及G2/M期比值,下调了 cyclin D1及cyclin E等蛋白的表达而上调了 p21表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则升高了 S期及G2/M期比值,并上调了 cyclin D1等蛋白的表达并下调了 p21表达。TUNEL细胞凋亡检测结合WB检测提示敲低lncRNA CYTOR可促进Hep3b细胞凋亡,下调Bcl-2的表达同时上调 Bax 的表达及 cleaved caspase3/caspase 3、cleaved caspase9/caspase 9;而抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过表达则抑制Hep3b细胞凋亡,上调Bcl-2的表达并下调 Bax 的表达及 cleaved caspase 3/caspase 3、cleaved caspase 9/caspase 9。结论:综上所述,HCC中过表达的lncRNA CYTOR可通过靶向抑制miR-125b-5p进而上调KIAA1522的表达水平,促进HCC细胞增殖、影响细胞周期并抑制细胞凋亡。本研究为肝细胞癌的发生机制注入了新的见解。
李玉强[3]（2021）在《组蛋白甲基转移酶RIZ1介导的lncRNA HOTAIRM1失活对肝细胞癌生物学行为的影响及其分子机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:在全球范围内,肝癌是第二大最常见的癌症死亡原因,每年导致超过700,000例死亡,它是一种侵袭性的恶性肿瘤,通常预后较差,五年生存率估计低于9%。作为重要的表观遗传调控机制,组蛋白甲基化在许多生物学过程中都起着重要作用,与视网膜母细胞瘤蛋白相互作用的锌指蛋白1（retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene1,RIZ1）是一种甲基转移酶,RIZ1能使组蛋白的H3K9甲基化成H3K9me1。长非编码RNA（lnc RNA）是一组长度大于200个核苷酸的非蛋白质编码RNA。越来越多的证据表明,可能作为癌基因或抑癌基因的lnc RNA在人类疾病的病理生理中,尤其是在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用。但是,Lnc RNA在肝癌中的调控机制尚未完全阐明。鉴于此,本研究目的是探讨组蛋白甲基转移酶RIZ1是否可以介导lnc RNA HOTAIRM1启动子上的H3K9me1富集,通过靶向mi R-125b来调节肝细胞癌的生长和转移。研究其表达改变的情况及其可能发生的分子机制,进而从一个新的角度阐述RIZ1和Lnc RNA HOTAIRM1在肝细胞癌中发挥作用的机制。研究方法:1.研究RIZ1与lnc RNA HOTAIRM1在肝细胞癌中的表达及其临床意义（1）利用TCGA数据库和GEPIA数据库分析RIZ1与lnc RNA HOTAIRM1在肝细胞癌组织表达水平及其临床意义。（2）采用q RT-PCR检测本科室收集的肝细胞癌患者组织样本、血液样本及细胞培养中RIZ1和HOTAIRM1表达情况及其临床意义。（3）Western Blot和免疫组织化学染色方法测定肝细胞癌患者组织样本中RIZ1蛋白表达水平。2.研究组蛋白甲基转移酶RIZ1介导的HOTAIRM1启动子上的H3K9me1富集对肝细胞癌细胞生物学行为的影响（1）构建RIZ1和HOTAIRM1干扰慢病毒:LV-RIZ1-RNAi（97334-1）,LV-RIZ1-RNAi（97335-1）,LV-RIZ1-RNAi（97336-1）;L V-HOTAIRM1-RNAi（97354-1）,LV-HOTAIRM1-RNAi（97355-1）,LV-HOTAIRM1-RNAi（97356-1）;及阴性对照病毒:KLLVCONO77（hu6-MCS-ubiquitin-EGFP-IRES-puro mycin）;HOTAIRM1过表达慢病毒:LV-HOTAIRM1（65150-1）,阴性对照病毒为C ON238（ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-pur-omycin）,摸索出慢病毒对肝细胞癌细胞感染的MOI和最佳感染条件。（2）用LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染肝细胞癌细胞后,研究RIZ1干扰后对肝细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响;利用PI染色法检测干扰RIZ1后对肝细胞癌细胞周期的影响;通过Annexin V-PE染色法检测RIZ1干扰后对肝细胞癌细胞凋亡的影响。（3）我们采用染色质免疫沉淀（Ch IP）实验分析评估H3K9me1与HOTAIRM1启动子的结合。（4）采用Western Blot方法测定LV-RIZ1-RN Ai慢病毒转染后,肝细胞癌细胞中的H3K9me1表达情况;用q RT-PCR方法检测转染LV-RIZ1-RNAi慢病毒后肝细胞癌细胞HOTAIRM1的表达水平。（5）用LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi或LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1共转染肝细胞癌细胞,分析肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡的情况。3.研究lnc RNA HOTAI RM1与mi R-125b相互作用对肝细胞癌生物学行为的影响及其临床意义。（1）运用生物信息学软件预测lnc RNA HOTAIRM1的靶向mi RNA。（2）通过双荧光素酶报告基因实验,验证HOTAIRM1是否可以直接结合mi R-125b,我们构建了HOTAIR M1-wt荧光素酶报告基因载体和HOTAIRM1-mut 3’-UTR荧光素酶报告基因载体,并进行荧光素酶报告基因分析。（3）通过q RT-PCR测定用LV-HOTAIRM1-RNAi或LV-HOTAIRM1慢病毒转染肝细胞癌细胞后mi R-125b的表达水平。（4）用LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染后,通过q RT-PCR测定mi R-125b在肝细胞癌细胞中的表达水平。（5）为了研究mi R-125b对肝细胞癌细胞生物学行为的影响,我们构建了LV-hsamir-125b-1慢病毒。（6）将慢病毒LV-hsa-mir-125b-1或LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1或LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1转染肝细胞癌细胞后,分析肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡情况。（7）通过q RT-PCR检测我们收集的肝细胞癌患者组织样本、血液样本及肝细胞系中mi R-125b的表达情况。结果:1.（1）利用TCGA数据库和GEPIA数据库对肝细胞癌患者组织中的RI Z1与lnc RNA HOTAIRM1表达水平进行分析。通过分析可以看出在肝细胞癌患者癌组织中,RIZ1的表达升高而HOTAIRM1的表达下降;分析发现RIZ1的表达与年龄和TNM分期无关,与性别有关,女性肝细胞癌患者癌组织样本中RIZ1的表达比男性高;Kaplan-Meier分析表明,RIZ1的高表达与总生存期降低有关;HOTAIR M1的表达量与肝细胞癌的Stage分级没有明显的差异;Kaplan-Meier分析表明,肝细胞癌患者HOTAIRM1的高表达与总生存期延长没有明显的差异。（2）实时荧光定量PCR检测结果显示:在肝细胞癌患者组织样本中,癌组织中RIZ1高表达;肝细胞癌患者血液样本中RIZ1表达量比正常患者的表达量高;HCC-LM3、HEPG2、LO2肝细胞系中,HCC-LM3细胞中RIZ1高表达。在肝细胞癌患者组织样本中,正常组织中HOTAIRM1高表达;肝细胞癌患者血液样本中HOTAIRM1表达量比正常患者的表达量低;HCC-LM3、HEGP2、LO2肝细胞系中,LO2细胞中HOTAIRM1高表达。（3）Western Blot和免疫组织化学染色方法测定结果显示RIZ1在肝细胞癌患者癌组织中是高表达的。（4）分析发现RIZ1和HOTAIRM1的表达情况与患者肿瘤大小及肿瘤数量密切相关,但其与患者年龄、性别、乙肝、肝硬化、AFP、门静脉癌栓、肿瘤分化程度及TNM分期等因素无关。2.（1）LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染HEPG2的最佳感染条件为,LV-RIZ1-RNAi（97336-1）慢病毒+Hi Trans G P组,MO I=10;LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染HCC-LM3的最佳感染条件为,LV-RIZ1-RNAi（97334-1）慢病毒+Hi Trans G P组,MOI=20;LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi共转染HEPG2,最佳感染条件为,LV-RIZ1-RNAi（97336-1）+LV-HOTAIRM1-RNAi（97355-1）慢病毒+Hi Trans G A组,MOI=10;LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1共转染H CC-LM3的最佳感染条件为,LV-RIZ1-RNAi（97334-1）+LV-HOTAIRM1（65150-1）慢病毒+Hi Trans G P组,MOI=20。（2）Ch IP分析可评估H3K9me1与HOTAIRM1启动子的结合,并且我们观察到HEPG2和HCC-LM3细胞中H3K9me1与HOTAIRM1启动子之间的结合增加。（3）Western Blot方法测定结果显示,LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染后,HEPG2和HCC-LM3细胞中的H3K9me1表达受到抑制。（4）用LV-RI Z1-RNAi慢病毒转染后,对HEPG2和HCC-LM3细胞进行分析,结果表明,与对照组相比,抑制RIZ1的表达降低了HEPG2和HCC-LM3细胞的增殖、侵袭、和迁移,增加了细胞的凋亡;细胞周期分析结果表明,对RIZ1的抑制增加了HEPG2和HCC-LM3 S期细胞的比例,结合细胞增殖实验结果,说明RIZ1干扰之后可促进肝细胞癌停滞与S期。（5）LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒共转染HEP G2细胞,HEPG2细胞中RIZ1的下调表达和HOTAIRM1抑制的共同作用可逆转R IZ1沉默对肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡。（6）LV-RIZ1-RNAi+LV-HOT AIRM1共转染HCC-LM3细胞,RIZ1抑制和HOTAIRM1过度表达共同作用进一步抑制了HCC-LM3的细胞增殖、侵袭和迁移,增强了细胞的凋亡。3.（1）我们使用Star Base 2.0数据库预测HOTAIRM1的靶mi RNA,发现mi R-125b是HOTAIRM1的靶mi RNA。（2）我们构建了HOTAIRM1-wt荧光素酶报告基因载体和HOTAIRM1-mut3’UTR荧光素酶报告基因载体,并进行了荧光素酶报告基因分析。结果表明,mi R-125b过表达导致HOTAIRM1-WT的荧光素酶活性显着降低,而HOTAIRM1-MUT则没有。这些结果表明,HOTAIRM1可以直接结合mi R-125b。（3）用LV-H OTAIRM1-RNAi或LV-HOTAIRM1慢病毒转染HEPG2细胞和HCC-LM3细胞。结果表明,HOTAIRM1的过表达显着抑制了mi R-125b的表达,而HOTAIRM1的下调则反向支持了肝癌细胞中mi R-125b的表达。（4）用LV-RIZ1-RNAi慢病毒转染H EPG2和HCC-LM3细胞,结果表明,RIZ1的沉默抑制了HEPG2和HCC-LM3细胞中mi R-125b的表达水平。（5）用LV-HOTAIRM1-RNAi或LV-HOTAIRM1-RNAi+L V-hsa-mir-125b-1慢病毒转染HEPG2细胞,HOTAIRM1在HEPG2细胞中的下调表达,促进了细胞增殖,侵袭和迁移;抑制了细胞的凋亡。和mi R-125b过表达共同作用进一步促进了HEPG2细胞增殖、侵袭和迁移,抑制了细胞的凋亡。（6）用L V-HOTAIRM1或LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1慢病毒转染HCC-LM3细胞,结果表明,HOTAIRM1的过表达抑制了HCC-LM3细胞的增殖、侵袭和迁移,促进了细胞的凋亡,并且完全逆转了过表达HOTAIRM1和mi R-125b的共转染结果。（7）肝细胞癌患者癌组织及血液样本中mi R-125b高表达,细胞培养样本HCC-LM3细胞中mi R-125b高表达。（8）分析发现mi R-125b的表达情况与患者乙肝、肿瘤大小及肿瘤数量密切相关,与患者年龄、性别、肝硬化、AFP、门静脉癌栓、肿瘤分化程度及TNM分期等因素无关。结论:1.通过TCGA和GEPIA数据库结合我们收集的样本进行分析,结果表明肝细胞癌患者的组织和血液样本中RIZ1表达水平上调,而HOTAIRM1的表达下调。肝细胞系中,HCC-LM3细胞中RIZ1高表达,LO2细胞中HOTAIRM1高表达。2.Kaplan—Meier生存曲线分析表明RIZ1的高表达与总生存期降低有关,HOTAIRM1的高表达与肝细胞癌患者总生存期延长没有明显的差异。3.RIZ1和HOTAIRM1的表达情况与患者肿瘤大小及肿瘤数量密切相关,即RIZ1高表达与RIZ1低表达的肝细胞癌组织相比,其肿瘤体积相对较大,肿瘤数目相对较多;HOTAIRM1高表达与HOTAIRM1低表达的肝细胞癌组织相比,其肿瘤体积相对较小,肿瘤数目相对较少。4.肝细胞癌细胞中H3K9me1与HOTAIRM1启动子之间的结合增加;RIZ1的下调可以有效抑制肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移,增强细胞凋亡;再和HOTAIRM1过表达共同作用后进一步抑制了肝细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移,增强了细胞的凋亡;再和HOTAIRM1抑制共同作用后可逆转RIZ1下调对肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移、和凋亡;说明组蛋白甲基转移酶RIZ1可以介导H3K9me1在HOTAIRM1启动子上的富集,从而调节了肝细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡。5.生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验证明mi R-125b可通过直接结合与HOTAIRM1相互作用。mi R-125b在肝细胞癌患者癌组织及血液样本中高表达,在HCC-LM3细胞培养样本中高表达。HOTAIRM1在HEPG2细胞中的下调表达,促进了细胞增殖,侵袭和迁移,抑制了细胞的凋亡。和mi R-125b过表达共同作用进一步促进了HEPG2细胞增殖、侵袭和迁移,抑制细胞的凋亡。HOTAIRM1的过表达抑制了HCC-LM3细胞的增殖、侵袭和迁移,促进了细胞的凋亡,并且完全逆转了过表达HOTAIRM1和mi R-125b的共转染结果。mi R-125b的表达情况与患者乙肝、肿瘤大小及肿瘤数量密切相关,即mi R-125b高表达的肝细胞癌组织与mi R-125b低表达的肝细胞癌组织相比,其肿瘤体积相对较大,肿瘤数目相对较多;乙肝阳性患者中mi R-125b高表达的多,乙肝阴性患者中mi R-125b低表达的多。6.总之我们研究发现组蛋白甲基转移酶RIZ1可以介导lnc RNA HOTAIRM1启动子上的H3K9me1富集,并通过靶向mi R-125b来调节肝细胞癌的生长和转移,这可以进一步影响肝细胞癌的发生和发展。从而为肝癌的治疗提供新的靶标和思路。
孟子琦[4]（2020）在《基于整合生物信息学的复方苦参注射液治疗三种常见肿瘤作用机制研究》文中研究指明研究背景在世界范围内,肝癌、胰腺癌、肺癌高居恶性肿瘤发病率和死亡率的前列,严重威胁着人们的生命健康,也给家庭和社会带来了沉重的负担。中药注射剂在肿瘤治疗中具有独特的优势,广泛应用于临床。但由于中药具有多成分、多途径、多靶点、多功能的特点,导致药效物质基础不明确、作用机制不清楚,增加了研究的难度,严重影响了国际化的进程。复方苦参注射液具有清热利湿,凉血解毒,散结止痛的作用,临床上广泛用于恶性肿瘤的治疗,然而其作用机制尚未完全阐明。近年来伴随着生物信息学的迅猛发展,新理念、新思路不断涌现,网络药理学与生物信息学的结合成为提高中医药研究水平的重要路径。基于此,本研究运用整合生物信息学方法,分析探究复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的作用机制。研究目的通过生物信息学方法确认肝癌、胰腺癌中的关键基因。通过网络药理学方法预测、筛选复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的化学成分、作用靶点和信号通路并进行网络构建,从系统层面揭示复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的多成分、多靶点、多通路复杂机制。研究方法1.生物信息学分析在肝癌关键基因研究中,从GEO数据库下载基因芯片数据集,使用limma包进行差异表达分析,之后采用RobustRankAggreg包对数据集进行整合分析,筛选出共同被确认为差异表达的基因。通过STRING获取差异基因的蛋白互作信息,导入Cytoscape构建蛋白互作网络,并使用MCODE进行模块分析。通过DAVID进行GO和KEGG富集分析。利用KM plotter、GEPIA进行生存分析、表达水平分析和关联性分析。在胰腺癌关键基因研究中,从TCGA数据库下载转录组测序数据和患者的临床信息,利用WGCNA包构建共表达网络、识别基因模块并与临床信息相关联。通过Cytoscape对模块进行可视化,并使用CytoHubba确定关键基因。通过clusterProfiler包进行GO富集分析,并通过DAVID进行KGEE通路富集分析。采用survival包进行单因素Cox回归分析,随后根据单因素的P值筛选基因进行多因素Cox回归分析,构建生存相关的线性风险评估模型,通过Kaplan-Meier生存曲线评估高、低风险组样本的总体生存率差异情况。采用survivalROC包绘制ROC曲线,评价预后模型的预测准确性。2.网络药理学分析在复方苦参注射液治疗肝癌作用机制研究中,通过文献检索获得复方苦参注射液的化学成分,通过 STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction、TCMSP 获取化学成分的靶点。通过TTD、GEO、TCGA获得肝细胞癌相关基因。使用Cytoscape构建“化合物-潜在靶点网络”、“化合物-肝细胞癌靶点网络”、“药物-化合物-靶点-通路网络”,对网络的关键拓扑参数进行分析。通过DAVID进行GO和KEGG富集分析。使用KM plotter、GEPIA进行生存分析和关联性分析。利用AutoDock进行分子对接模拟。在复方苦参注射液治疗胰腺癌作用机制研究中,通过文献检索获得复方苦参注射液的化学成分,通过 STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction、TCMSP 获取化学成分的靶点。通过合并TTD、TCGA以及WGCNA筛选出的关键基因得到胰腺癌相关基因。随后通过STRING获取蛋白互作信息。使用Cytoscape构建“化合物-潜在靶点网络”、“化合物靶点-胰腺癌靶点蛋白互作网络”、“药物-化合物-蛋白互作靶点-通路网络”,并使用MCODE对网络进行模块分析。通过DAVID进行GO和KEGG富集分析。利用AutoDock+进行分子对接模拟。在复方苦参注射液治疗肺癌作用机制研究中,通过文献检索获得复方苦参注射液的化学成分,通过STITCH、SuperPred、SwissTargetPrediction获取化学成分的靶点,通过TTD、OMIM获得肺癌相关基因。随后通过STRING获取蛋白互作信息。使用Cytoscape构建“化合物-潜在靶点网络”、“肺癌靶点蛋白互作网络”、“化合物-肺癌靶点网络”、“药物-化合物-靶点-通路网络”,对网络的关键拓扑参数进行分析。通过DAVID进行GO和KEGG富集分析并通过systemsDock进行分子对接模拟。研究结果1.生物信息学分析结果对13个肝细胞癌基因芯片数据集进行整合分析,得到380个差异基因,包括293个下调基因和87个上调基因。通过蛋白互作网络与模块分析得到1 1个关键基因（CDK1、CCNB2、CDC20、CCNB1、TOP2A、CCNA2、MELK、PBK、TPX2、KIF20A、AURKA）和2个重要模块。富集分析表明,差异基因主要与代谢相关通路有关,关键基因和模块1与细胞周期密切相关。生存分析发现关键基因均与肝细胞癌患者生存时间呈负相关。表达水平分析表明关键基因均在肝细胞癌中高表达,关联性分析表明CDK1的表达与其他关键基因的表达呈正相关。对TCGA胰腺癌转录组测序数据进行筛选,共得到177个样本和5000个基因用于WGCNA分析,并得到11个基因模块。通过肿瘤分级、肿瘤分期和患者的生存状态最终筛选出黑色模块和蓝色模块作进一步研究。GO富集分析显示黑色模块与肿瘤的发生发展密切相关,蓝色模块与肿瘤的分化、侵袭和转移密切相关。KEGG通路富集分析显示,黑色模块中的基因主要富集在细胞周期、p53信号通路等通路上。蓝色模块中的基因主要富集在粘蛋白型O-聚糖的生物合成、花生四烯酸代谢、ECM-受体相互作用、紧密连接等通路上。通过网络分析,分别筛选出黑色模块和蓝色模块中的5个关键基因（NCAPG、BUB1、CDK1、TPX2、DLGAP5;INAVA、MST1R、TMPRSS4、TMEM92、SFN）,且这些基因均在胰腺癌中高表达。生存分析得到5个基因构建预后模型,其中TSPOAP1与胰腺癌患者生存时间呈正相关,ADGRG6、GPR87、FAM111B、MMP28与胰腺癌患者生存时间呈负相关。2.网络药理学分析结果在复方苦参注射液治疗肝癌作用机制研究中,通过网络分析,筛选出6个关键靶点（BCHE、SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A、CDK1）,其中 CDK1 在肝细胞癌中高表达,其余5个均为低表达。GO富集分析显示,复方苦参注射液调控的与肝细胞癌有关的靶点主要富集在细胞周期、凋亡过程调控、代谢过程等生物过程中。KEGG通路富集分析表明,这些靶点主要与药物代谢-细胞色素P450、花生四烯酸代谢等通路有关。此外,关联性分析结果表明SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A的表达与CDK1的表达有很强的负相关关系。生存分析结果表明,CDK1与肝细胞癌患者生存时间呈负相关,SRD5A2、EPHX2、ADH1C、ADH1A与肝细胞癌患者生存时间呈正相关。在复方苦参注射液治疗胰腺癌作用机制研究中,通过网络分析与模块分析,筛选出6个关键靶点（AKT1、MAPK1、MAPK3、EGFR、CDK1、JAK1）和3个重要模块。GO富集分析显示,3个重要模块主要与细胞周期、细胞增殖、JAK-STAT级联、MAPK级联、磷酸化,凋亡过程调控有关。KEGG通路富集分析表明,3个重要模块显着富集在细胞周期、ErbB信号通路、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路等通路上。在复方苦参注射液治疗肺癌作用机制研究中,通过网络分析,筛选出8个关键靶点（CHRNA3、DRD2、PRKCA、CDK1、CDK2、CHRNA5、MMP1、MMP9）。GO 富集分析显示,复方苦参注射液调控的与肺癌有关的靶点显着富集在有丝分裂细胞周期G1/S转换、蛋白质磷酸化、ERK1和ERK2级联的调控、激酶活性等生物过程和分子功能中。KEGG通路富集分析表明,这些靶点主要参与癌症通路、癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt信号通路、非小细胞肺癌和小细胞肺癌等通路。研究结论本研究综合运用网络药理学和生物信息学方法,在系统层面揭示了复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的化学成分、作用靶点和信号通路。初步阐释了复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的作用机制可能与协同调控多个关键靶点和通路有关。本研究可为中药注射剂治疗不同类型恶性肿瘤的作用机制研究提供线索和思路,为进一步开展复方苦参注射液治疗肝癌、胰腺癌、肺癌的基础实验研究以及促进治疗肝癌、胰腺癌、肺癌中药的临床合理应用提供参考和借鉴。
张骏[5]（2020）在《羽扇豆醇肝靶向脂质体的制备及其抗肝细胞癌研究》文中研究说明目的:肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率排在世界第五位,是世界第三高死亡率的肿瘤。目前有多种HCC治疗方案,但是全球HCC患者5年生存率仍然低于5%,其主要原因是手术切除术、化学疗法通常会有严重的副作用。因此,迫切需要寻找和研究出一种安全有效的新药物或药物传递系统来改善以上的弊端,从而到达预防和治疗HCC的目的。国内外研究报道狼毒、京大戟、蒲公英等中药对多种肿瘤模型具有显着抑制作用,而越来越多的研究表明中药中的单体成分（雷公藤红素、斑蝥素）对肿瘤性疾病具有一定的治疗作用。羽扇豆醇是狼毒、京大戟、蒲公英等中药中的主要化学成分,大量研究证实羽扇豆醇在多种肿瘤细胞系和癌症模型中发挥了显着的抗肿瘤作用。但是,由于羽扇豆醇存在不溶于水,生物利用度低等缺点,从而限制了其开发使用。因此,需要一种新型药物载体改善其作用性质以及它的靶向性。本课题首先构建一个具有肝靶向性长循环能力的羽扇豆醇脂质体,然后作用于HepG2细胞研究该制剂的靶向性以及肿瘤相关的蛋白信号通路,最后利用SB（睡美人转座子）介导的高压尾静脉注射转染AKT/c-Met诱导的小鼠HCC模型作为实验动物模型,进一步验证最佳剂量下的羽扇豆醇肝靶向长循环脂质体的抗肿瘤能力、靶向能力及其分子机制。本课题为羽扇豆醇给药系统研究提供新思路,同时为基因转染建立的小鼠原位肝细胞癌模型应用于靶向给药体内药效学评价提供新的依据。方法:1.采用HPLC建立羽扇豆醇含量测定的方法;采用超滤离心法、过膜法以及鱼精蛋白沉淀法进行筛选适合羽扇扇豆醇脂质体包封率测定的方法;以包封率为评价指标,考察适合脂溶性药物的脂质体制备方法;采用单因素试验法筛选影响羽扇豆醇普通脂质体的因素,为后续羽扇豆醇肝靶向脂质体的制备工艺提供参考。2.以包封率和粒径为评价指标,采用正交试验法,考察主要影响因素对羽扇豆醇肝靶向脂质体制备工艺的影响,优选最佳制备工艺;考察不同的冻干保护剂对羽扇豆醇脂质体包封率和粒径的影响,优选最佳冻干保护剂;采用TEM、SEM观察脂质体的形态,动态光散射法测粒径、PDI、ZETA电位;采用透析的方法考察游离羽扇豆醇、羽扇豆醇脂质体、羽扇豆醇肝靶向脂质体的体外释放行为,并对体外释放进行模拟方程拟合;以包封率和粒径为评价指标,考察游离羽扇豆醇、羽扇豆醇脂质体、羽扇豆醇肝靶向脂质体的稀释稳定性、长期稳定性以及血浆稳定性。3.体外靶向性研究中,采用流式细胞仪检测相同剂量不同剂型的羽扇豆醇制剂对HepG2细胞摄取效果来进行定性研究;采用HPLC检测相同剂量不同剂型的羽扇豆醇制剂在HepG2细胞中的摄取量来进行定量研究;体内靶向性研究,采用活体成像仪进行检测相同剂量不同剂型的制剂在FVB小鼠体内各脏器的分布情况。4.采用HPLC对相同剂量不同剂型的羽扇豆醇制剂在SD大鼠中不同时间点的血药浓度进行检测,平均血药浓度-时间数据用DAS3.0软件以非房室模型进行统计矩拟合分析。5.体外药效学评价中,采用CCK8法测定相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对HepG2细胞生存率的影响;采用流式细胞仪检测相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对细胞凋亡、周期的影响;采用Western blot检测相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对HepG2细胞AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路相关蛋白表达的影响。6.采用高压尾静脉转染技术,在FVB/N小鼠肝脏内同时过表达AKT（带有HA-Tag）和c-Met（带有V5-Tag）进行肝细胞癌模型造模,研究相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对AKT/c-Met诱导的小鼠肝脏外观、肝脏重量、病理学组织的影响;采用qPCR检测相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对AKT/c-Met诱导的HCC小鼠肝癌标志物的影响;采用Western blot检测相同剂量的不同剂型羽扇豆醇制剂对AKT/c-Met诱导的小鼠AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路相关蛋白的表达的影响。结果:1.建立了羽扇豆醇的HPLC含量测定方法;羽扇豆醇在氯仿中的溶解度最高,在水中不溶;最终确定过膜法为羽扇豆醇脂质体包封率的测定方法,薄膜分散法为羽扇豆醇脂质体的制备方法;通过单因素试验法确定了影响羽扇豆醇脂质体制备工艺最大的因素是药脂比、磷胆比、PEG2000-DSPE。2.通过正交试验工艺考察,包封率为考察指标,最终确定羽扇豆醇肝靶向脂质体最佳制备工艺为磷胆比7:1,药脂比1:10,Gal-PEG-DSPE在处方中的质量百分比为10%;以包封率和粒径为评价指标,选择蔗糖为冻干保护剂时所有比例粒径和包封率均在合格范围内,且在15%的质量百分比的时候包封率最高,最终确定加入处方质量比15%的蔗糖为冻干保护剂;释放度考察中游离羽扇豆醇（Free Lupeol）在10h内释放了接近70%,而羽扇豆醇脂质体（Lupeol-L）、羽扇豆醇肝靶向脂质体（Gal-Lupeol-L）在10 h内只释放了大约40%,动力学拟合后发现Free Lupeol的释放符合一级动力学方程,Lupeol-L、Gal-Lupeol-L的释放符合Weibull方程;稀释稳定性考察结果表明羽扇豆醇脂质体在稀释20倍的条件下比较稳定,长期稳定性考察结果表明羽扇豆醇冻干脂质体在4℃冰箱存放6个月是稳定的,溶血性考察结果表明Free Lupeol有轻微溶血,而Lupeol-L、Gal-Lupeol-L不溶血。3.体外靶向定性研究结果表明靶向组的摄取强度要高于游离药物组和非靶向药物组,定量研究结果表明Gal-Lupeol-L是游离Lupeol摄取量的1.65倍,是Lupeol-L摄取量的1.17倍（P<0.05）;体内靶向性研究结果表明Gal-NR-L组在小鼠肝脏部位的荧光一直持续到24h,而游离NR和NR-L组的小鼠在肝脏部位的荧光5 h时基本消失。4.药动学研究结果表明羽扇豆醇靶向组的药时曲线下面积约为游离药物组的3倍;羽扇豆醇靶向组的平均滞留时间MRT和血浆半衰期T1/2分别约为游离药物组的2.36倍和3.21倍。5.Free Lupeol、Lupeol-L、Gal-Lupeol-L作用于HepG2细胞24 h、48 h的IC50值分别为163μM、126μM、87μM,122μM、82μM、61μM;Free Lupeol、Lupeol-L、Gal-Lupeol-L的凋亡率分别为4.3%、8.73%、18.51%,Gal-Lupeol-L可以阻滞HepG2细胞于G2/M期;与Free Lupeol组相比,Gal-Lupeol-L组处理后的HepG2细胞AKT/mTOR相关蛋白（p-AKT308、p-AKT473、p-RPS6、FASN）、Ras/MAPK通路下游的主要效应分子p-ERK1/2表达以及肿瘤增殖标志物PCNA表达也都显着降低。6.成功制备了高压尾静脉转染AKT、c-Met质粒共表达的肝细胞癌模型,Gal-Lupeol-L给药组小鼠的肝脏指数和肝脏重量较游离组明显减轻（P<0.05）;Gal-Lupeol-L组相较Free Lupeol组的小鼠肝脏肝小叶结构更为清晰,空泡减轻的更为明显,胞浆更加丰富;与Free Lupeol和Lupeol-L组相比,Gal-Lupeol-L给药后的小鼠肝脏AFP、GPC3、Epcam的mRNA表达水平降低的更为明显（P<0.01）;与Free Lupeol处理组相比,Gal-Lupeol-L组处理后的AKT/c-MET诱导的HCC小鼠的AKT/mTOR相关蛋白（p-AKT308、p-AKT473、p-RPS6、FASN）、Ras/MAPK通路下游的主要效应分子p-ERK1/2表达以及肿瘤增殖标志物PCNA表达降低的更为明显。结论:成功的制备了包封率高、粒径小于200 nm的肝靶向羽扇豆醇脂质体;相较于游离羽扇豆醇和非靶向羽扇豆醇脂质体,它在体外和体内都具有更好的靶向性;在药动学方面,羽扇豆醇肝靶向脂质体在体内的平均滞留时间MRT和血浆半衰期T1/2都要优于游离羽扇豆醇;羽扇豆醇肝靶向脂质体在体外对HepG2细胞显示出比较好的细胞毒性、凋亡效率,对AKT/c-Met通路相关蛋白表达降低的效果更好;羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导的HCC小鼠具有一定的抗肿瘤作用并且相关通路抑制作用相较于游离羽扇豆醇和非靶向羽扇豆醇脂质体更好。
余廷东[6]（2019）在《黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响及TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组学研究》文中研究表明研究内容:本研究共分为四部分:1.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702生物学行为的影响研究;2.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录测序研究及差异表达分析;3.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录组关联分析;4.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响与TP53突变的原发性肝细胞癌的转录组联合分析及验证目的:研究黄曲霉毒素B1（AFB1）在肝微粒体代谢后的次级代谢产物对肝细胞株HL-7702的影响材料和方法:AFB1+NADPH（2mM最终浓度）+肝微粒体（1.5mg/mL最终浓度）与PBS混合,放入37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育30分钟,获得AFB1在肝微粒体代谢后的次级代谢产物混合液。将上述混合液干预人肝细胞株HL-7702,培养箱中孵育30分钟,PBS清洗三遍后加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养液继续培养。用MTT法检测24小时至96小时不同浓度AFB1对细胞株HL-7702的生长活性的影响。用流式细胞仪检测AFB1干预后24小时的HL-7702细胞株周期和凋亡情况。酶联免疫法检测AFB1干预后24小时的HL-7702细胞株8羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）变化。Sanger法对AFB1干预后96小时的HL-7702细胞株进行TP53 R249S突变检测。数据统计和计算采用SPSS 22.0软件包,作图使用GraphPad Prism 6.0软件。符合正态分布的计量资料的描述使用均数±标准差进行描述。用t检验对正态分布的计量资料分组之间进行比较。P<0.05为统计学差异达到显着性。结果:1.MTT结果显示:HL-7702细胞在AFB1处理后24小时和48小时,实验组（AFB1浓度为:0.001μM,0.005μM.0.025μM,0.125μM,0.625μM,1.25μM 和 2.5μM）、阳性对照组及空白对照组之间细胞增殖活性无显着性差异,于AFB1处理后72小时至96小时,各组细胞增殖活性出现显着差异,不同浓度的AFB1处理的HL-7702细胞增殖活性均有不同程度降低,AFB1浓度越大,细胞增殖活性越低。细胞培养至96小时,正常细胞组、对照组和AFB1浓度为0.00lμM组间细胞增殖活性差异统计学无显着性（P>0.05）,其余各组之间细胞增殖活性差异有显着性（P<0.05）。2.流式细胞技术检测浓度为2μM和0.2μM AFB1干预的HL-7702细胞G1-G0期或G2-M期比例与浓度为0.02μM组比较均有显着差异（P<0.05）。而浓度为0.02μM干预组与肝微粒体对照组和空白对照组比较,无显着差异。3.浓度为2μM和0.2μM AFB1干预的HL-7702细胞8-OHdG含量较浓度为0.02μM干预组均显着增加（P<0.001）,0.02μM干预组与肝微粒体对照组和空白对照组无显着差异。4.浓度为2μM的AFB1在肝微粒体代谢后产物干预HL-7702细胞能诱发细TP53 R249S第三位碱基G突变成T。结论:AFB1在肝微粒体代谢后的产物抑制人正常肝细胞株HL-7702生长活性并导致G2/M细胞周期停滞,并呈浓度相关性;但AFB1在2μM及以下浓度短期干预未引起HL-7702细胞早期凋亡。AFB1在肝微粒体代谢后产物干预HL-7702细胞能诱发细TP53 R249S第三位碱基G突变成T目的:用全转录组测序技术检测AFB1对肝细胞株HL-7702影响的全转录组变化情况,并进行显着差异表达的转录组进行分析。材料和方法:实验组用AFB1（0.2μM）+NADPH（2mM最终浓度）+肝微粒体（1.5mg/mL最终浓度）,对照组用肝微粒体+NADPH,放入恒温培养箱中孵育30分钟,孵育后混合液干预HL-7702细胞30分钟,PBS清洗三遍,然后加入完全培养液继续培养48小时。胰酶消化,收集细胞,标注标签,液氮速冻,干冰运输至检测公司进行全转录组测序和测序数据分析。结果:通过全转录组测序,发现AFB1影响肝细胞株HL-7702以下转录组显着差异表达:1.1027基因mRNA显着差异表达,其中上调432个,下调595个,GO富集分析显示,AFB1引起mRNA显着差异表达的基因主要参与了调控细胞周期、增殖、凋亡、粘附、代谢、细胞化学刺激反应、DNA损伤修复和血管生成等生物学进程。KEGG通路分析提示AFB1可能影响TNF信号通路、TGF-β、染色体重组、P53信号通路、NF-κB信号通路、细胞周期、粘附和AMPK信号通路等。2.显着差异表达lncRNA共29个,其中上调15个,下调14个。3.显着差异表达的共miRNA9个,其中上调3个,下调6个4.显着差异表达的circRNA共72个,其中上调35个,下调37个结论:AFB1显着影响肝细胞株HL-7702的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA的表达,对其显着差异表达的基因进行富集分析显示:差异基因参与了细胞周期、增殖、凋亡、粘附和DNA损伤修复等生物学进程。并可能参与调控TNF信号通路、TGF-β、染色体重组、P53信号通路、NF-κB信号通路、细胞周期、粘附和AMPK等信号通路。目的:在转录组水平探索AFB1对肝细胞株HL-7702影响的各转录组变化之间的关联性及其可能的相互调控机制。材料和方法:分析材料来源于论文第二部分全转录组测序数据。使用Novofinder（诺禾致源）、miRanda-3.3a、PITA、RNAhybrid、psRobot、GOSeq-topGO:Release 2.12、KOBAS:version 2.0、Cytoscape 等软件对显着差异表达的全转录组数据进行关联分析,并构建ceRNA调控网络。结果:1.AFB1影响细胞株HL-7702显着差异表达的29个lncRNA和mRNA显着差异表达的757个基因之间有共存或共表达的关系。其中lncRNAs上调,伴随mRNA上调的靶基因有234个;lncRNAs下调,伴随mRNA下调的靶基因有439个。功能富集分析提示这些差异基因和细胞周期的调节、分化、细胞代谢、DNA重组及损伤修复有关,并和P53信号通路、癌症相关信号通路相关。2.AFB可能影响HL-7702细胞以下lncRNA与miRNA之间的调控:CDKN2B-AS1 与 hsa-miR-122-5p 和 hsa-miR-455-3p,CTD-3014M21.1 与hsa-miR-41 1-5p 和 hsa-miR-3591-3p,LINC00162 与 hsa-miR-3591-3p 和hsa-miR-494-3p,PP7080 与 hsa-miR-122-5p 和 hsa-miR-3690,PSMA3-AS1与 hsa-miR-455-3p 和 hsa-miR-41 1-5p,RP11-658F2.8 和 hsa-miR-31-5p,SBF2-AS1 与 hsa-miR-41 1-5p,SCARNA9 与 hsa-miR-379-5p。3.本研究发现9个显着差异表达的miRNA（hsa-miR-455-3p、hsa-miR-41 1-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3690、hsa-miR-3591-3p）共调控534个mRNA显着差异表达的靶基因。基因富集分析提示这些候选靶基因参与调控细胞分子功能、细胞代谢与发展进程以及蛋白结合的调控,并参与调控细胞周期、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路、AMPK信号通路、NF-kB信号通路等。4.AFB1可能影响HL-7702细胞以下circRNA与基因之间的调控:hsacirc0078538-EZR、hsacirc0017348-ZNF124、novelcirc0005089-ZNF124、novelcirc0002289-CEP 128、novelcirc0000551-BIRC2)5.对全转录组差异表达数据进行ceRNA网络分析,共构建出以6个miRNA（上调:hsa-miR-455-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-31-5p;下调:hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3690、hsa-miR-3591-3p）为核心的lncRNA-miRNA-gene 调控网络。结论:全转录组关联分析提示AFB1影响HL-7702细胞的lncRNA,miRNA,circRNA和mRNA之间存在相互调节关系。用显着差异表达的miRNA（hsa-miR-455-3p,hsa-miR-41 1-5p,hsa-miR-3 1-5p;hsa-miR-122-5p,hsa-miR-3690,hsa-miR-3591-3p）构建出六个 lncRNA-miRNA-基因调控网络。目的:利用论文第二部分全转录组差异表达数据和TCGA数据库TP53 R249S突变与不突变的HCC显着差异的表达谱进行联合分析,挖掘AFB1与TP53 R249S突变HCC具有共同作用的分子标志物。研究它们在HCC中TP53 R249S突变的作用,探索AFB1在其相关性HCC的发生及疾病进展的机制。材料和方法:从TCGA数据库获取HCC的表达谱（mRNA、lncRNA和miRNA）、临床病理及预后资料,以TP53 R249S突变与否进行分组,获取显着差异的表达谱信息,然后与论文第二部分差异表达的全转录测序数据进行联合分析,取交集获得候选差异表达谱信息。并在本中心已完成TP53 R249S突变测序的HCC样本进行验证,分析其与临床病理及预后之间的关系。利用GO和KEGG进行分子生物学功能及相关通路机制预测。TCGA原发性肝癌表达谱数据表达差异分析采用EdgeR软件包处理。候选表达谱差异基因癌和癌旁组织统计学差异分析采用配对样本t检验,其次,基因在TP53 R249S突变和非突变肿瘤和癌旁组织样本的相对表达量统计学差异分析采用独立样本t检验。比较突变组与非突变组、候选表达谱基因高表达和低表达组两组间各项临床因素的分布差异用卡方检验。各临床因素与临床预后的分析采用Kaplan-Meier生存曲线、单因素Cox风险模型。各组间曲线统计学差异比较采用Log Rank检验。各个分组风险比（Hazard Ratio,HR）与 95%置信区间（Confidence Interval,CI）评估 TP53 R249S突变状态以及基因表达量高低与临床预后的相关性。统计学分析均采用SPSS 22.0,P<0.05被认为差异达到统计学显着性。统计作图采用GraphPad Prism 6.0软件绘制。结果:1.AFB1干预后HL-7702细胞株的全转录组测序数据与TCGA数据库中HCC TP53 R249S突变的表达谱共同分析筛选出6个mRNA显着差异表达的基因,包括上调基因:CTXN1、CDCP1、CALB2;下调基因:CRYAB、EN03、GPRC5A。未发现有共同显着差异表达的lncRNA或miRNA。2.独立样本验证中发现 CDCP1、CALB2、CRYAB、EN03 和 GPRC5A 5个基因在癌组织中mRNA表达水平低于癌旁组织（P<0.05）,在TP53 R249S突变的癌组织中CALB2、CRYAB和GPRC5A的mRNA表达水平要高于TP53非突变的癌组织（P<0.05）。3.CDCP1和CTXN1可能与HBV DNA复制有显着相关（两者P=0.035）而CTXN1和GPRC5A可能与HCC的分化程度显着相关（两者P=0.047）。4.TP53 R249S突变与TCGA数据库HCC的TNM分期有关（P=0.039）,分期越晚,突变可能性越大。TP53 R249S非突变的患者总生存时间（t=1791 days）长于存在突变患者（t=334 days）。对重要的复发生存时间而言,HCC患者携带非突变的TP53 R249S复发风险更低（HR=0.37,95%CI=0.19-0.73,P=0.003）5.生物信息学功能富集分析提示CALB2、CRYAB和GPRC5A可能与TP53基因存在调控关系。结论:全转录组测序数据与TCGA数据库中HCC TP53 R249S突变的表达谱共同分析筛选出6个mRNA显着差异表达的基因,包括CTXN1、CDCP1、CALB2、CRYAB、EN03、GPRC5A。其中CALB2、CRYAB 和GPRC5A可能参与TP53基因调控以及与TP53 R249S突变相关。TP53 R249S突变与HCC患者不良预后有关。
陈天驰[7]（2019）在《HJURP抑制p21表达促进肝细胞癌增殖的分子机制研究》文中研究指明背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）大约占肝癌的75%,是一种病死率很高的恶性肿瘤。虽然针对肝细胞癌的治疗方法较多,但根治性的治疗手段仍旧是手术切除和肝移植。目前,HCC患者术后的高复发率和死亡率是导致患者术后五年总生存率偏低（仅为18%）的重要原因。要提高HCC的治疗效果,除了医疗诊治技术手段的不断提升,了解该疾病的发生发展机制并找出合适的干预治疗靶点亦十分重要。同时,肝癌的众多生物学功能中,肿瘤细胞不受控制地增殖是肝细胞癌进展的重要原因之一。综上,研究HCC增殖过程中的关键分子机制有望为该疾病的治疗提供新的理论基础及治疗策略。目的:本课题旨在研究HJURP分子促进肝细胞癌增殖的分子机制,并在肝癌细胞系和临床大样本中验证该分子的表达水平并探究其临床意义。首先,从体外构建HJURP稳定敲低及过表达的细胞模型,其次,在体外和体内水平上验证该分子能够调控肝癌细胞增殖的生物学功能,最终,深入阐明HJURP抑制p21表达的具体信号通路及分子机制。材料与方法:1、从浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科收集219对肝癌及匹配的癌旁组织标本,从医院病历系统中统计相关的临床病理信息,利用实时荧光定量PCR、免疫组织化学的方法检测HJURP分子在HCC组织及癌旁组织的表达水平,分析HJURP与临床病理特征及HCC患者预后的相关性;2、从Oncomine数据库中提取HJURP分子在肝癌及癌旁组织中的表达数据,进行统计分析;3、通过慢病毒转染对肝癌细胞系HCC-LM3,Huh7进行转染,构建稳定敲低细胞株,用MHCC-97H细胞构建HJURP过表达细胞株,运用CCK-8、流式细胞周期检测、克隆形成及裸鼠皮下成瘤实验来验证HJURP促进肝细胞癌增殖的生物学功能,并用western免疫印迹实验检测细胞周期G1期相关的关键蛋白;4、在HJURP稳定转染的细胞模型中,运用western免疫印迹、免疫荧光验证HJURP调控抑癌分子p21的核浆穿梭,利用蛋白质免疫共沉淀技术检测p21的泛素化水平,并用免疫组织化学的方法在组织标本中证实HJURP与p21的表达呈负相关;5、在HJURP稳定转染的肝癌细胞株中,运用western免疫印迹实验通过信号通路的抑制剂及激活剂验证HJURP通过抑制MAPK/ERK1/2和激活AKT/GSK3β信号通路从而调控p21的出核及泛素化降解;6、通过功能回复实验证实HJURP促进p21泛素化降解的关键E3泛素化连接酶为SKP2。结果:1、在219对肝癌临床标本中,免疫组织化学及实时定量荧光PCR的结果证实HJURP在肿瘤组织中的表达水平显着高于癌旁组织,且74.54%的肿瘤组织中HJURP呈现高表达趋势。同时,western免疫印迹的结果提示,在6种常见的肝癌细胞系中,HJURP的表达也比正常肝细胞系高;2、体外和体内实验表明,HJURP敲低明显降低肝癌细胞的CCK-8吸光度和克隆形成、裸鼠皮下成瘤的能力,且引起肝癌细胞的G1期阻滞。在过表达HJURP后,肝癌细胞的增殖能力明显增强;3、HJURP促进p21蛋白从细胞核穿梭至细胞浆。同时,HJURP抑制p21发生在翻译后水平上。蛋白质免疫共沉淀的结果证实,HJURP促进p21的泛素化降解,主要是被E3泛素化连接酶SKP2降解;4、HJURP敲低之后,p21主要表达在细胞核内,且p-ERK1/2与p-GSK3β的表达增加,p-AKT的表达降低,HJURP过表达之后,p-ERK1/2与p-GSK3β的表达降低。此外,敲低HJURP之后加入ERK1/2通路抑制剂U0126和AKT通路激动剂SC-79后,p-ERK1/2与p-GSK3β的表达得到回复,且肝癌细胞的增殖能力也能够得到一定程度的回复;5、肝癌临床标本中的免疫组织化学的结果表明,HJURP高表达的标本中有69.5%呈现p21低表达,同时HJURP低表达的标本中有66.7%的标本呈现p21高表达;6、通过对临床标本对应的临床病理数据进行分析,结果提示HJURP高表达患者的总体生存率明显低于HJURP低表达者,且HJURP的高表达与肿瘤的大小及肿瘤的AJCC分期有相关性。结论:1、HJURP在肝癌组织中呈明显高表达,且与肝细胞癌的增殖功能及HCC患者的不良预后相关;2、敲低及过表达HJURP可以分别显着降低和增加肝细胞癌的增殖功能,且HJURP促进p21从细胞核穿梭至胞浆,并被SKP2泛素化降解;3、MAPK/ERK1/2和AKT/GSK3β信号通路参与HJURP抑制p21表达的生物学过程,是HJURP促进肝细胞癌增殖的潜在分子机制。
李自雄[8]（2018）在《乙肝病毒large S基因及其变异促进HCC发生发展的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:基于全球的肿瘤登记数据,肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的发病率在男性和女性肿瘤中分别位列第五位和第九位,而每年因HCC而死亡的患者,在男性和女性肿瘤中排列为第二位和第六位。中国每年新发HCC和因其死亡人数均约占到世界范围内的50%左右。我国HCC患者绝大部分是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）慢性感染导致的;而且HBV慢性感染人群基数庞大,这是引起HCC高发的最主要原因之一。HBV large S基因（preS1/preS2/S）编码了病毒颗粒的表面蛋白,是病毒感染肝细胞、机体抗原识别表位和引起HCC发生发展的关键影响因素。前期大量的流行病学数据显示,该基因片段preS区的相关变异是促进HCC发生发展的危险因素。但是何种preS变异序列,以及这些变异是通过何种机制导致了HCC的发生,目前尚无相关研究能够完全阐明。研究目的:证实影响HBV慢性感染患者发生HCC的危险因素,阐明何种HBV preS区的基因变异能促进HCC的发生;在体外实验中,发现这些变异序列所引起的癌症相关表型的改变和调控的下游基因与其作用机制;在体内实验中,验证large S序列及变异的致炎、致癌效果。为后续如何预防慢性HBV感染患者发生HCC和进行相应的治疗,提供理论依据。研究方法:应用纳入2114位HBV慢性感染者队列,设计特异性引物扩增患者外周血中HBV基因组preS区片段,采用sanger测序的方法,序列比对后鉴定相关preS变异。纳入患者人口学资料、临床一般信息和治疗信息等,采用COX单因素和多因素风险回归模型分析方法,促进HCC发生和患者肝病相关死亡的风险因素。应用HBV large S基因野生型和筛选出的三种变异型序列,构建相关慢病毒载体,转染HepG2细胞系;通过检测细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、裸鼠皮下荷瘤等表型,观察相关基因序列对细胞恶性表型的影响。测定不同细胞内RNA表达谱芯片,比较分析large S基因及其变异调控的下游基因。通过实时荧光定量PCR（reverse transcription quantitative PCR,RT-qPCR）、免疫印迹实验（Western Blot,WB）等分子生物学实验研究其可能的调控机制。将相关基因序列构建Sleeping Beauty相关载体,用尾静脉注射的方式表达于小鼠肝脏。阐明变异型large S基因所致小鼠肝脏炎症状态和肝细胞癌的发生情况。通过小鼠肝脏RNA表达谱芯片的测定,比较分析large S基因及相关变异在动物体内的调控的基因及参与的信号通路。后续相关分子的免疫组化等实验来验证靶分子的表达水平,进一步验证large S基因及其变异调控的作用机制。研究结果:该研究第一部分,人群队列的研究结果显示,2114例HBV慢性感染患者队列,随访的中位时间为8.92年,总共随访18406人年。在随访期间内,共有209例患者发生HCC,发生率为9.89%（209/2114）。经COX回归分析后,我们得出男性患者、高年龄患者、肝硬化、HBV C2基因亚型、未使用抗病毒治疗、高直接胆红素（>7mmol/L）、甲胎蛋白阳性、低白蛋白水平（<35g/L）、低血小板计数（<100×109 g/L）是促进HCC发生的危险因素（P<0.05）。此外,HBV基因组preS区中C3116T和T31C突变促进了HCC的发生发展。在HBV慢性感染者体内,C2为主要基因亚型（73.1%）,由C2基因亚型所引起的HCC发生,占83.3%（125/150）。HBV C2基因亚型相关preS变异,如G2950A、G2951A、A2962G、C2964A、A3054T、C3063G、T3069G和A3120T,均促进了HCC的发生。preS区相关变异的组合,如G2950A/G2951A/A2962G/C2964A（mutation 1）,促进了HCC的发生（HR 2.51,95%CI,1.10-5.74;P=0.030）;联合突变C3116T/T31C（mutation 2）变异也增加了HBV慢性感染患者HCC的发病风险（HR1.57,95%CI,1.07-2.31;P=0.022）。此外,preS2 deletion（>5bp）在使用抗病毒治疗的人群中,促进了HCC发生（HR 2.81,95%CI,1.27-6.22;P=0.011）。课题第二部分,体外实验结果显示,HBV large S基因deletion序列较wild type序列显着提高了细胞增殖能力、软琼脂克隆能力和裸鼠皮下荷瘤能力（P<0.05）。但三种变异型large S序列（mutation 1、mutation 2和deletion）对细胞迁移、细胞侵袭等细胞转移运动能力没有提升,差异无统计学意义（P>0.05）。在转染目的基因后,mRNA表达谱芯片结果显示,野生型large S基因主要影响了细胞内基因转录、细胞周期和促进细胞凋亡等生物学进程。Mutation 1、mutation 2和deletion序列与wild type基因比较后发现,三种变异均降低了细胞凋亡和细胞内免疫相关基因的表达,并上调了癌症相关的信号通路。基因定量的结果也证实了促进凋亡的相关基因OLR和PMAIP1在变异组中低于wild type组,且抑制凋亡基因BIRC3和BIRC2则在变异组中高于wild type组。癌症相关基因的表达水平,如STAT3信号通路在deletion组中,其表达水平较wild type组高（P=0.027）。Western blot实验的结果显示,STAT3分子的表达水平在三种变异组中高于野生型large S组,但磷酸化后的p-STAT3蛋白表达量在各组间未见明显差异。在STAT3分子抑制剂stattic作用下,各组间的细胞增殖趋于一致。而在STAT3信号通路激动剂IL-6作用下,各组间的细胞增殖能力有显着的提高,并增大了组间差异。相关交互作用分析显示,三种变异型large S基因与炎症因子,协同通过IL-6/STAT3信号通路促进了HepG2细胞的增殖。通过构建好的小鼠模型,发现3种变异型large S基因导致小鼠的生存期受到不同程度的降低。三种变异型基因（mutation 1、mutation 2和deletion）引起小鼠肝脏肿瘤的发生率,较wild type有不同程度的提高,分别为36.4%（4/11）、57.1%（4/7）、66.7%（4/6）,(Ptrend=0.023)。肝脏实物图和H&E染色镜下可见表达HBV large S基因的小鼠肝脏炎症状态明显,肝细胞呈现出水肿、变性;在严重挤压状态下,肝脏特征性结构不明显。肝癌相关特异性分子CK18、细胞增殖相关蛋白Ki-67和PCNA的免疫组化评分,在mutation 1、mutation 2和deletion组中均较vector组或wild type组显着提高（P<0.05）。小鼠肝脏的mRNA表达谱芯片结果显示:野生型large S基因的表达,调节了细胞凋亡、免疫应激,以及癌症相关相关信号的激活。Mutation 1、mutation 2和preS2 deletion序列的表达后与野生型large S基因比较,这些相关均进一步的上调了小鼠肝脏细胞内炎症与癌症相关基因集,以及癌症相关信号通路的激活。小鼠外周血中相关分子ELISA结果显示,炎-癌转化相关细胞因子IL-5、IL-6和IL-12均表现为,wild type组中的表达较vector组高,而三种变异型组较wild type组高。此外,表达三种变异型large S基因的小鼠肝脏中,STAT3和p-STAT3分子的表达评分均较vector组与wild type组高,差异有统计学意义（P<0.05）。上述结果表明,三种large S基因变异,尤其是preS2 deletion可与小鼠体内的炎症状态,共同通过激活IL-6/STAT3相关信号通路,进而促进了HCC的发生发展。研究结论:本课题通过队列研究证实了众多临床指标和HBV基因preS区相关突变是慢乙肝患者发生HCC的危险因素。进一步研究发现相关preS区的组合突变（G2950A/G2951A/A2962G/C2964A,C3116T/T31C和preS2 deletion）,具有促进慢性HBV感染者发生HCC的作用。在体外实验中,证实三种变异型large S基因,尤其是preS2 deletion序列可通过上调STAT3分子的表达,激活癌症相关信号通路,促进了HCC的发生发展。小鼠模型中,也证实了三种变异型large S基因的表达具有促进小鼠肝脏炎症、癌症的作用。本课题充分解释了HBV large S基因preS区相关突变促癌发生发展的作用机制,为防控HCC的发生,提供了新的思路。
庞小娟[9]（2014）在《肝细胞癌发展中PPARγ磷酸化修饰的机制及调控作用》文中认为原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一,其病程短、发展快、死亡率高,列为世界肿瘤死亡率的第三位。据国际癌症研究中心（IARC）统计:我国每年死于肝癌约34万人,占全世界肝癌死亡人数的55%以上。加之肝癌患者的5年生存率极低,从而使之成为威胁我国人口健康最重大的疾病之一。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的原发性肝癌,发病机制十分复杂,成因不明,已知诱因包括肝炎病毒感染、肝硬化、肝脏长期慢性炎症、黄曲霉毒素摄入等。HCC的发展是一个多阶段且复杂的过程,染色体异常、遗传多态性、基因突变、信号转导调控异常等皆为决定HCC发展的重要因素。值得注意的是:转录因子功能模式与肝细胞癌增殖、侵袭、转移的关系已被众多研究所证实,过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）即为其中一个重要的与HCC发生发展密切相关的转录因子。PPARy是细胞内重要的核受体,也是代谢相关疾病的重要药物靶点。前期研究报道指出:PPARγ配体对多种肿瘤如HCC、结肠癌、乳腺癌、肺癌等具有抑制作用,特别是在HCC治疗方面,PPARγ活性调控被誉为是一种潜在的有前途的治疗手段。尽管PPARy活性调控已被证实在许多HCC实验模型中具有影响HCC发展的效应,但其中的分子机制还处于探讨时期。特别是在PPARy翻译后修饰（post-translational modifications,PTM）功能解析方面,尚未有任何研究建立PPARy翻译后修饰与HCC发生发展之间的确切关系。本研究基于临床中出现的现象——HCC病人肝癌组织切片中出现PPARγSer84位的磷酸化高表达,这种现象虽然未经大量临床标本分析所证实,但却提示我们:PPARγSer84可能与HCC的发展具有内在联系,因此,本论文从研究PPARγ磷酸化在HCC病程发展中的确切作用出发,首次探讨了两者之间的联系及可能的分子机制。本论文研究工作包括以下四方面:一、PPARγ磷酸化与HCC发展的关系1.HCC自发模型构建及PPARy磷酸化分析:使用化学诱变剂二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）诱导小鼠HCC自发模型,测量并观察在12个月实验期间,小鼠的体重,生长以及死亡情况;通过病理切片分析与HCC相关标志物（Ki67、PCNA和AFP）分析,证实小鼠HCC模型诱导成功;免疫组化、western blot结果分析显示,与正常肝组织相比,HCC小鼠肝脏中磷酸化PPARy（Ser82）的表达水平显着升高:EMSA结果表明,小鼠肝癌组织中PPARγ的转录活性明显下降;值得注意的是:随着HCC发展进程的变化,PPARy磷酸化的表达水平逐渐升高,提示PPARy磷酸化与小鼠HCC的恶性进展具有内在联系。2.裸鼠模型构建与体内实验:首先运用ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems包装过表达野生型（wild type,WT）、非磷酸化（S84A）和磷酸化（S84D）PPARy的慢病毒颗粒并感染HepG2细胞,Blasticidin药物进行细胞抗性筛选,得到PPARγW1、PPARγ384A和PPARyS84D稳转HepG2细胞株;接着将三种稳转的HepG2细胞接种于裸鼠皮下,构建HCC异位模型。测量实验期间,小鼠的体重、肿瘤体积、生长以及死亡情况。结果显示:PPARγS84D中肿瘤的生长速度最快、瘤体最重,这组肿瘤中PCNA的表达水平最高;与PPARβWT相比,PPARγS84A肿瘤生长速度慢、瘤体重量轻、PCNA表达水平低,但瘤体重量的差异没有统计学意义。说明PPARy磷酸化介导肝癌细胞增殖、生长,引起肿瘤生长加快,并促进肿瘤恶性进展。3.人病理标本中PPARy磷酸化分析:收集临床17例肝癌病人HCC样本,进行病理切片及肿瘤标志物检测;运用免疫组化检测结果显示,12例病人中出现了 HCC区域PPARy磷酸化表达水平高于癌旁肝组织,70%的比例提示PPARγ磷酸化对人HCC的发展可能有促进作用。因为未能收集足够正交试验的病理标本数,所以此项实验结果仅起参考作用。二、MEK/ERK激酶介导的PPARy磷酸化及其对HCC发展的影响1.MEK/ERK激酶活性分析:在DEN诱导的HCC动物模型中,运用免疫组化、western blot对MEK/ERK激酶水平进行分析。结果发现:与PPARγ磷酸化程度相平行,PPARy磷酸化上游激酶ERK1/2的表达水平增加,同时对ERK1/2的上游激酶MEK的分析显示磷酸化MEK表达水平上升,ERK1/2与MEK磷酸化水平皆显着高于正常C57小鼠的肝组织;运用免疫组化分析肝癌病人HCC样本,亦发现在癌组织中,磷酸化ERK1/2和磷酸化MEK的表达量显着高于癌旁组织。这些结果提示:在HCC发展中,PPARγ磷酸化程度增加可能是由于MEK/ERK激活所致。2.抑制MEK/ERK激酶活性可降低PPARy磷酸化水平:为进一步证实MEK/ERK激活导致PPARy磷酸化,我们运用SMMC 7721、Hep3B、HepG2和Hepa1-6建立了体外分析的细胞模型,运用MEK激酶抑制剂PD0325901处理肝癌细胞,以观察是否可通过抑制激酶的活性,而改变PPARy磷酸化的表达水平。Western blot分析发现当MEK/ERK被抑制后,PPARγ磷酸化水平降低,荧光素酶报告基因结果亦显示:PPARγ磷酸化水平被抑制同时,PPARγ转录活性提高,说明通过抑制MEK/ERK,可以降低PPARγ磷酸化进而提高PPARy的转录活性。与此同时,运用MTT和流式分析肝癌细胞增殖与细胞周期状态,发现PPARy磷酸化水平降低后,肝癌细胞增殖速度被抑制,细胞周期阻滞在G1期,值得注意的是,动态分析结果显示在0,24,48hr时间段内,HCC细胞增殖力与PPARγ磷酸化程度呈正相关。3.MEK/ERK对PPARγ磷酸化作用的体内分析:在细胞实验基础之上,我们进一步运用动物实验进行MEK/ERK对PPARy磷酸化效应分析,实验首先构建HepG2裸鼠种植瘤模型,等肿瘤体积达到100 mm3时,将小鼠随机分为DMSO、罗格列酮（rosiglitazone,RSG）、PD0325901、RSG+PD0325901 四组,腹腔注射给药28天,分析抑制MEK/ERK是否可抑制PPARy磷酸化,观察RSG是否协同PD0325901,增效其抑制HCC恶性进展的功能。结果显示:抑制MEK/ERK后,PPARγ磷酸化程度显示降低,肿瘤生长速度明显减缓,肿瘤体积减小,RSG对PPARγ磷酸化表达水平的抑制程度较小、对肿瘤生长速度和肿瘤体积没有影响,RSG和PD0325901联合用药与单独使用PD0325901的效果接近。三、PPARγ磷酸化对肝癌细胞生长的影响1.PPARy磷酸化增强肝癌细胞增殖:对表达PPARγWT、PPARγS84A和PPARγS84D稳转HepG2细胞株进行NimbleGen全基因组表达谱芯片实验分析,GO分析报告显示,调节细胞增殖能力的基因差异表达显着富集,进一步运用Q-PCR验证芯片分析结果发现:与PPARγWT、PPARγS84A相比,PPARγS84D细胞中促增殖基因表达显着升高;进一步运用MTT实验、细胞克隆形成实验以及CFSE流式检测结果亦证实:PPARγS84D细胞增殖能力显着高于PPARγWT与PPARγS84A细胞,说明肝癌细胞中PPARγ磷酸化后改变了下游转录模式,使肿瘤细胞增殖力显着增强。2.PPARy磷酸化抑制肝癌细胞细胞周期阻滞:进一步通过流式分析检测HepG2稳转细胞株的细胞周期变化,结果显示:PPARγS84DHepG2细胞中,处于G1期的细胞数目减少,而S期细胞数目增加,说明PPARy磷酸化抑制细胞周期阻滞;Q-PCR对周期调控分子的检测实验表明:PPARy磷酸化降低了控制G1期的蛋白依赖性激酶抑制子（p18、p21和p27）的表达水平,促进cyclin A的表达,说明PPARy磷酸化后,可通过调控细胞周期调控分子对细胞周期进行干扰,使细胞周期阻滞减弱。3.PPARγ磷酸化对肝癌细胞细胞凋亡不产生影响:以上细胞实验充分证明:PPARy磷酸化可通过增强肝癌细胞增殖与抑制肝癌细胞细胞周期阻滞,而促进肝癌细胞生长。运用Annexin V/PI双染检测细胞凋亡,结果显示:在PPARγWT、PPARγS84A和PPARγS84D稳转的HepG2细胞中,细胞凋亡没有显着差异。四、肝癌细胞糖酵解重要功能基因分析1.芯片分析:在验证了 MEK/ERK激酶介导的PPARy磷酸化对HCC发展产生确切影响的基础之上,运用生物信息学分析法对PPARγWT、PPARγS84A和PPARγS84D稳转细胞株进行全基因组表达谱进行分析,根据评分及生物信息学方法对芯片数据进行分析,发现PPARy磷酸化显着影响细胞糖酵解途径中的重要的功能酶。与PPARγS84A相比,PDK-1、PGK1、PFK2等酶在PPARγS84D细胞中发生了上调;进一步对差异基因进行Q-PCR进验证,结果与芯片分析数据相符,验证了芯片数据所指示糖酵解途径差异表达,说明PPARγ磷酸化对肝癌细胞的糖酵解产生了影响。2.葡萄糖和乳酸检测:根据芯片数据,我们运用葡萄糖、乳酸分析法在HepG2及三种PPARγHepG2稳转株中进行了细胞分解葡萄糖能力的分析,结果显示:与PPARγS84D细胞株相比,PPARγWT和 PPARγS84A都对葡萄糖摄入量显着减少,用MEK抑制剂PD0325901处理HepG2后,细胞表现出极显着的葡萄糖吸收和乳酸释放量。说明PPARy磷酸化可伴随细胞糖酵解增强,这也解释了肝癌细胞快速生长的原因。综上所述,本论文研究工作首次建立了 PPARy磷酸化与HCC发展之间的联系,即PPARγ磷酸化对HCC发展具有促进作用。基于该生物学效应的发现,我们进行了进一步的细胞与动物实验研究工作,发现MEK/ERK激酶为介导PPARy磷酸化的关键激酶,抑制MEK/ERK激酶可加强肝癌细胞的细胞周期阻滞、抑制细胞增殖,从而表现出对HCC发展的良好遏制作用,提示与PPARγ磷酸化修饰相关的分子节点在介导HCC发展中的重要性。研究还发现PPARγ磷酸化后,其下游转录模式发生了变化,导致差异表达基因富集于糖酵解途径,糖酵解水平增高使肝癌细胞保持快速生长,促进HCC向恶性化程度发展。
王伯庆[10]（2013）在《CBX4在肝细胞癌中的生物学功能及其对肝癌预后的影响和分子机制》文中研究指明目的：CBX4（Chromobox4）最初被证实具有E3连接酶活性,参与了染色质重组与转录抑制,能维持上皮干细胞的干性,阻止其衰老。截至目前,CBX4与肿瘤的关系研究很少,本研究旨在检测CBX4在原发性肝癌中的表达情况,分析CBX4表达与原发性肝癌术后预后的关系,初步探讨CBX4在原发性肝细胞癌中的作用。同时考察敲低CBX4基因对肝癌细胞的哪些恶性表型产生影响,初步阐释相关的分子机制。方法：1)实时荧光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）和Western Blot分别检测原发性肝癌术后标本的癌组织和癌旁正常肝组织中CBX4的mRNA丰度和蛋白表达水平；2)免疫组织化学检测有完整临床预后资料的246例石蜡包埋原发性肝癌和癌旁组织标本中CBX4的蛋白表达；3)用Pearson Chi-Square Kruskal-Wallis tests法分析CBX4表达与原发性肝癌临床病理特征的关系,Kaplan-Meier method/log-rank test分析与预后有关的因素,多因素Cox回归模型筛选分析和预后有关的独立危险因素；4)分别在原发性肝癌的细胞株,BEL7402和QGY7703细胞中,瞬时转染小RNA干扰片段,敲低内源性CBX4。通过MTT细胞增殖活性实验检测细胞增殖能力,平板克隆形成实验检测肝癌细胞克隆形成能力；5)敲低肝癌细胞内源性CBX4后,用胸腺嘧啶核苷双阻断方法使BEL7402和QGY7703细胞同步化于G1/S交界处,然后释放进入S期,流式细胞仪检测并比较不同时间点细胞进入S期的比例；6)敲低内源性CBX4后,Western blot检测下游与细胞增殖和细胞周期调控相关的靶基因变化。结果：1)CBX4在原发性肝癌组织较癌旁正常肝组织表达上调。在实时荧光定量PCR检测的8对配对新鲜标本中,癌组织CBX4的mRNA丰度比癌旁肝组织升高；Western blot检测相同的8对配对标本中,癌组织中CBX4蛋白表达也比癌旁肝组织升高；2)246例原发性肝癌手术切除标本,用IHC染色评分后分析,发现CBX4在原发性肝癌患者中存在表达失调。与癌旁组织相比,肝癌组织中CBX4蛋白表达明显上调,且主要定位在肝癌细胞的胞浆：3)CBX4表达在原发性肝癌中的临床意义。免疫组化结果显示,CBX4表达与原发性肝癌患者的临床病理特征密切相关,主要包括：血清AFP水平（P=0.036）,肿瘤大小（P=0.029）,病理分化（P=0.033）,临床TNM分期（P=0.032）。原发性肝癌患者胞浆CBX4高表达者预后差,总生存期（overall survival, OS）和无复发生存期（recurrence free survival, RFS）比CBX4低表达的患者缩短（OS, P=0.003; RFS,P=0.012）。多因素Cox回归分析显示,CBX4浆表达和肝肿瘤数目是原发性肝癌患者总生存期和无复发生存期的独立预后因素。4)分别在肝癌细胞株BEL7402和QGY7703敲低内源性CBX4能够降低原发性肝癌细胞增殖活性和细胞克隆形成能力；敲低内源性CBX4后,细胞的增殖活性降低,克隆形成数减少,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）；5)敲低内源性CBX4后,原发性肝癌细胞由G1/S交界处进入S期的细胞比例较对照组减少,差异有统计学意义（P<0.05）,即细胞由G1/S转换点进入S期的速度减慢：6)CBX4基因可以通过抑制PCNA和cyclinE2,上调p16影响原发性肝癌细胞增殖和G1/S关键点的转换。结论：1)CBX4在原发性肝癌中较癌旁肝组织表达上调；2)CBX4主要定位在肝癌组织的细胞胞浆；3)CBX4胞浆表达水平与原发性肝癌患者预后呈反向相关,CBX4可以作为原发性肝癌术后预后的一个独立预测指标；4)CBX4与原发性肝癌细胞恶性增殖和克隆形成能力密切相关；5)CBX4基因可以通过PCNA而维持原发性肝癌细胞的快速增殖活性；6)CBX4可以通过调控cyclinE2和p16影响肝癌细胞的周期进展。
二、肝细胞癌SCT表现特征与Rb,PCNA的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝细胞癌SCT表现特征与Rb,PCNA的关系（论文提纲范文）
（1）ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺血管重构中的作用及机制（论文提纲范文）
| 附录 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中的表达 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移中的作用 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 ZIP12参与野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移的机制探索 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 锌转运蛋白SLC39A/ZIPs和SLC30A/ZnTs的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 第一部分: 应用生物信息学方法筛选新的肝细胞癌相关的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: lncRNA CYTOR/miR-125b-5p/KIAA1522调控轴在肝细胞癌细胞系中的作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 非编码RNA在肝细胞癌发生与发展中的调节作用及临床应用(文献综述) |
| 第一章 引言 |
| 第二章 作为ceRNA的ncRNA及其它ncRNA在肝细胞癌发展中的可能作用及机制 |
| 第三章 ncRNA在HCC诊断及预后中的临床应用 |
| 第四章 结论、局限性和展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（3）组蛋白甲基转移酶RIZ1介导的lncRNA HOTAIRM1失活对肝细胞癌生物学行为的影响及其分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:RIZ1与lncRNA HOTAIRM1 在肝细胞癌中的表达及其临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂和耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 TCGA和 GEPIA数据 |
| 2.2.2 组织样本与资料 |
| 2.2.3 血液样本与资料 |
| 2.2.4 细胞 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 TCGA数据库 |
| 2.3.2 组织总RNA提取 |
| 2.3.3 细胞总RNA的提取 |
| 2.3.4 血液RNA的提取 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.6 肝细胞癌组织样本HE染色 |
| 2.3.7 肝细胞癌组织样本免疫组织化学染色 |
| 2.3.8 RIZ1 一步法反转录-荧光定量PCR |
| 2.3.9 lncRNA HOTAIRM1 荧光定量PCR |
| 2.3.10 Western Blot方法测定蛋白水平 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 利用TCGA 数据库和GEPIA 数据库研究RIZ1与lncRNA HOTAIRM1 在肝细胞癌组织中表达水平及其临床意义。 |
| 3.1.1 肝细胞癌患者癌组织和正常组织中RIZ1 的表达情况 |
| 3.1.2 RIZ1 表达水平与组织临床病理学参数的关系 |
| 3.1.3 RIZ1 表达水平与肝细胞癌患者预后的关系 |
| 3.1.4 肝细胞癌患者癌组织和正常组织中HOTAIRM1 的表达情况 |
| 3.1.5 HOTAIRM1 表达水平与病理分期的关系 |
| 3.1.6 HOTAIRM1 表达水平与肝细胞癌患者预后的关系 |
| 3.2 RIZ1 荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3 HOTAIRM1 荧光定量PCR检测结果 |
| 3.4 RIZ1 在肝细胞癌患者组织样本中的蛋白表达 |
| 3.4.1 Western Blot方法测定RIZ1 在肝细胞癌患者组织样本中的蛋白表达 |
| 3.4.2 免疫组织化学染色方法测定RIZ1 在肝细胞癌患者组织样本中的蛋白表达 |
| 3.5 组织和细胞样本RNA琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 3.6 科室组织样本中RIZ1和HOTAIRM1 在肝细胞癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达情况 |
| 3.7 科室血液样本中RIZ1和HOTAIRM1 的表达情况 |
| 3.8 L02、HEPG2 和 HCC-LM3 细胞中RIZ1 和 HOTAIRM1 的表达情况 |
| 3.9 科室组织样本中RIZ1和HOTAIRM1 的表达水平与临床病理学参数之间的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:组蛋白甲基转移酶RIZ1 介导的HOTAIRM1 启动子上的H3K9me1 富集对肝细胞癌细胞生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 LO2 人永生化肝细胞、HEPG2 人肝癌细胞和HCC-LM3 人高转移肝癌细胞复苏、培养、传代及冻存。 |
| 2.3.2 染色质免疫沉淀(Ch IP)实验 |
| 2.3.3 慢病毒的构建和细胞转染 |
| 2.3.4 细胞总RNA的提取 |
| 2.3.5 细胞划痕实验 |
| 2.3.6 Transwell细胞侵袭实验 |
| 2.3.7 CCK8 实验 |
| 2.3.8 细胞周期检测 |
| 2.3.9 细胞凋亡检测 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 LO2 人永生化肝细胞、HEPG2 人肝癌细胞和HCC-LM3 人高转移肝癌细胞的细胞形态 |
| 3.2 构建慢病毒质粒的的测序结果 |
| 3.2.1 构建RIZ1-RNAi慢病毒质粒的测序结果 |
| 3.2.2 构建HOTAIRM1-RNAi慢病毒质粒的测序结果 |
| 3.2.3 构建LV-HOTAIRM1 慢病毒引物的测序结果 |
| 3.3 ChIP分析H3K9me1与HOTAIRM1 启动子的结合 |
| 3.4 慢病毒对HEPG2和HCC-LM3 细胞的感染MOI和最佳感染条件 |
| 3.4.1 LV-RIZ1-RNAi慢病毒感染的MOI和最佳感染条件 |
| 3.4.2 LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1-RNAi干扰慢病毒共感染HEPG2,感染的MOI和最佳感染条件 |
| 3.4.3 LV-RIZ1-RNAi+LV-HOTAIRM1 慢病毒共感染HCC-LM3,感染的MOI和最佳感染条件 |
| 3.5 LV-RIZ1-RNAi慢转染后肝细胞癌细胞中H3K9me1 的表达情况 |
| 3.6 RIZ1 对肝细胞癌细胞增殖活性的影响 |
| 3.7 RIZ1 对肝细胞癌细胞侵袭的影响 |
| 3.8 RIZ1 对肝细胞癌细胞迁移的影响 |
| 3.9 RIZ1 对肝细胞癌细胞周期的影响 |
| 3.10 RIZ1 对肝细胞癌细胞凋亡的影响 |
| 3.11 RIZ1 的下调表达和HOTAIRM1 抑制的共同作用对肝细胞癌细胞增殖的影响 |
| 3.12 RIZ1 的下调表达和HOTAIRM1 抑制的共同作用对肝细胞癌细胞侵袭的影响 |
| 3.13 RIZ1 的下调表达和HOTAIRM1 抑制的共同作用对肝细胞癌细胞迁移的影响 |
| 3.14 RIZ1 的下调表达和HOTAIRM1 过表达的共同作用对肝细胞癌细胞增殖的影响 |
| 3.15 RIZ1 的下调表达和HOTAIRM1 过表达的共同作用对肝细胞癌细胞侵袭的影响 |
| 3.16 RIZ1 的下调表达和HOTAIRM1 过表达的共同作用对肝细胞癌细胞迁移的影响 |
| 3.17 RIZ1 的下调表达和HOTAIRM1 抑制的共同作用对肝细胞癌细胞凋亡的影响 |
| 3.18 RIZ1 的下调表达和HOTAIRM1 过表达的共同作用对肝细胞癌细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分:lncRNA HOTAIRM1与miR-125b相互作用对肝细胞癌生物学行为的影响及其临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 细胞 |
| 2.2.2 组织样本与资料 |
| 2.2.3 血液样本与资料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 lncRNA HOTAIRM1 靶向miRNA预测 |
| 2.3.2 HEPG2 人肝癌细胞和HCC-LM3 人高转移肝癌细胞培养 |
| 2.3.3 慢病毒的构建和细胞转染 |
| 2.3.4 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.5 miR-125b 荧光定量 PCR |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 预测HOTAIRM1 的靶miRNA |
| 3.2 双荧光素酶报告基因实验 |
| 3.3 慢病毒对HEPG2和HCC-LM3 细胞的感染MOI和最佳感染条件 |
| 3.3.1 LV-HOTAIRM1 慢病毒感染的MOI和最佳感染条件 |
| 3.3.2 LV-HOTAIRM1-RNAi慢病毒感染的MOI和最佳感染条件 |
| 3.3.3 LV-hsa-mir-125b-1 慢病毒感染的MOI和最佳感染条件 |
| 3.3.4 LV-HOTAIRM1-RNAi+LV-hsa-mir-125b-1 慢病毒共感染的MOI和最佳感染条件 |
| 3.3.5 LV-HOTAIRM1+LV-hsa-mir-125b-1 慢病毒共感染的MOI和最佳感染条件 |
| 3.4 HOTAIRM1 表达与miR-125b表达之间的关系 |
| 3.5 RIZ1 表达与miR-125b表达之间的关系 |
| 3.6 miR-125b在肝细胞癌细胞中的表达情况 |
| 3.7 HOTAIRM1 干扰和miR-125b过表达共同作用对肝细胞癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响 |
| 3.8 HOTAIRM1 过表达和miR-125b过表达共同作用对肝细胞癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响 |
| 3.9 miR-125b荧光定量PCR检测结果 |
| 3.10 科室组织样本中miR-125b在肝细胞癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达情况 |
| 3.11 科室血液样本中miR-125b的表达情况 |
| 3.12 细胞培养样本中 miR-125b 的表达情况 |
| 3.13 科室组织样本中 miR-125b 的表达水平与临床病理学参数之间的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 综述 lncRNA 与组蛋白甲基化在肝癌中的研究现状及展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于整合生物信息学的复方苦参注射液治疗三种常见肿瘤作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 复方苦参注射液抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 综述二 复方苦参注射液临床应用进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 基于整合生物信息学的复方苦参注射液治疗三种常见肿瘤作用机制研究 |
| 一、基于生物信息学的肝癌关键基因研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 二、基于网络药理学的复方苦参注射液治疗肝癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 三、基于生物信息学的胰腺癌关键基因研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 四、基于网络药理学的复方苦参注射液治疗胰腺癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 五、基于网络药理学的复方苦参注射液治疗肺癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 技术路线 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 结语 |
| 1 研究成果 |
| 2 研究的创新与特色 |
| 3 研究的展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（5）羽扇豆醇肝靶向脂质体的制备及其抗肝细胞癌研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 处方前研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 脂质体中羽扇豆醇含量测定方法的建立 |
| 2.2 羽扇豆醇脂质体包封率测定方法及制备方法的考察 |
| 2.3 羽扇豆醇溶解度的测定 |
| 2.4 羽扇豆醇普通脂质体影响因素考察 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 羽扇豆醇含量测定方法的建立 |
| 3.2 羽扇豆醇包封率及制备方法的考察结果 |
| 3.3 羽扇豆醇溶解度测定结果 |
| 3.4 羽扇豆醇普通脂质体影响因素考察结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 第二章 羽扇豆醇肝靶向脂质体制备工艺及表征 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 正交试验法优化羽扇豆醇肝靶向脂质体处方 |
| 2.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体冻干工艺的考察 |
| 2.3 羽扇豆醇肝靶向脂质体理化性质的考察 |
| 2.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体稳定性的考察 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 羽扇豆醇肝靶向脂质体制备工艺的考察结果 |
| 3.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体冻干保护剂考察结果 |
| 3.3 羽扇豆醇肝靶向脂质体理化性质的考察结果 |
| 3.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体制剂稳定性考察结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 羽扇豆醇肝靶向脂质体体内和体外靶向性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 羽扇豆醇肝靶向脂质体体外靶向性研究 |
| 2.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体体内靶向性研究 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 羽扇豆醇肝靶向脂质体体外靶向性研究结果 |
| 3.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体体内靶向性研究结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 第四章 羽扇豆醇肝靶向脂质体药代动力学研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 羽扇豆醇标准溶液的配制 |
| 2.2 血浆样品的处理 |
| 2.3 羽扇豆醇体内分析方法的考察 |
| 2.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体在大鼠体内药代动力学研究 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 羽扇豆醇体内分析方法的建立 |
| 3.2 血药浓度测定结果 |
| 3.3 平均血药浓度-时间曲线 |
| 3.4 统计矩拟合分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第五章 羽扇豆醇肝靶向脂质体对HepG2 细胞行为学研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞复苏 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞冻存 |
| 2.4 工作液的配制 |
| 2.5 细胞增殖抑制实验 |
| 2.6 细胞凋亡实验 |
| 2.7 细胞周期实验 |
| 2.8 羽扇豆醇肝靶向脂质体促细胞凋亡分子机制研究 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 细胞增殖抑制实验结果 |
| 3.2 细胞凋亡实验结果 |
| 3.3 细胞周期实验结果 |
| 3.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体促细胞凋亡分子机制研究结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 第六章 羽扇豆醇肝靶向脂质体体内药效学研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品及试剂 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 质粒的提取及鉴定 |
| 2.2 质粒溶液的配制 |
| 2.3 高压尾静脉转染造模 |
| 2.4 分组与给药 |
| 2.5 小鼠肿瘤检测 |
| 2.6 苏木精-伊红(HE)染色 |
| 2.7 肝组织中RNA的提取和q RT-PCR(即时聚合酶链式反应)检测 |
| 2.8 羽扇豆醇靶向脂质体抗AKT/c-MET诱导HCC分子机制研究 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 质粒酶切实验结果 |
| 3.2 羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导FVB小鼠肿瘤生长的影响 |
| 3.3 羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导小鼠肝脏病理学变化的影响 |
| 3.4 羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导小鼠的肝脏肝细胞癌标志物表达水平的影响 |
| 3.5 羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导的HCC小鼠肝脏的AKT/mTOR以及Ras/MAPK相关蛋白的影响 |
| 4 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录1 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录2 在读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响及TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组学研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702生物学行为的影响研究引言 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录测序研究及差异表达分析引言 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录组关联分析引言 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响与TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组联合分析及验证 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 综述 黄曲霉毒素B1体内代谢与原发性肝细胞癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（7）HJURP抑制p21表达促进肝细胞癌增殖的分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HJURP在肝癌细胞和组织中的表达水平及其临床病理意义 |
| 前言 |
| 1 HJURP在临床标本和细胞系中的表达情况及与患者临床病理特征和预后的相关性 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析统计 |
| 1.4 实验结果 |
| 2 讨论 |
| 3 结论 |
| 第二部分 HJURP抑制p21表达促进肝细胞癌增殖的作用及其分子机制研究 |
| 前言 |
| 1 通过体内和体外实验验证HJURP促进肝癌的增殖 |
| 1.1 验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 2 HJURP通过抑制p21的表达促进肝癌的增殖 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 3 HJURP通过E3泛素化连接酶SKP2促进p21的泛素化降解 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 4 HJURP通过MAPK/ERK1/2和AKT/GSK3β信号通路促进p21出核 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（8）乙肝病毒large S基因及其变异促进HCC发生发展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 主要英文缩写词表 第一部分 |
| 慢性HBV感染人群队列中large |
| S基因相关变异与患者HCC发生率及死亡率的相关研究 前言 一、材料 二、方法 三、结果 四、讨论 第二部分 |
| HBV |
| large |
| S基因及变异在体内体外实验中的作用与机制研究 前言 一、材料 二、方法 三、结果 四、讨论 参考文献 附录 综述 参考文献 在读期间发表论文和科研工作情况 致谢 |
（9）肝细胞癌发展中PPARγ磷酸化修饰的机制及调控作用（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 综述 |
| 一、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)简介 |
| 1. HCC的风险因子 |
| 2. HCC的发病机制 |
| 3. HCC的治疗方法 |
| 二、过氧化物酶体增殖物激活受体γ( Peroxisome proliferator-activatedreceptorγ,PPARγ) |
| 1. PPARγ的结构和组织学分布 |
| 2. PPARγ的配体 |
| 3. PPARγ的生物学功能 |
| 4. PPARγ的翻译后修饰 |
| 三、细胞增殖 |
| 1. 周期和细胞增殖 |
| 2. 代谢与细胞增殖 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PPARγ磷酸化与HCC发展的关系 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. PPARγ磷酸化与小鼠HCC发展的关系 |
| 1.1 DEN诱导小鼠HCC模型建立 |
| 1.2 PPARγ磷酸化在DEN诱导的HCC中表达水平升高 |
| 1.3 DEN诱导的HCC中PPARγ转录活性下降 |
| 1.4 PPARγ磷酸化与HCC发展进程相关 |
| 2. 裸鼠模型构建与体内实验 |
| 2.1 稳转HepG2细胞株的建立 |
| 2.2 磷酸化抑制PPARγ的转录活性 |
| 2.3 PPARγ磷酸化促进肿瘤生长 |
| 3. 人病理标本中PPARγ磷酸化分析 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 MEK/ERK激酶介导的PPARγ磷酸化及其对HCC发展的影响 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. MEK/ERK激酶活性分析 |
| 2. 抑制MEK/ERK激酶活性可降低PPARγ磷酸化水平 |
| 2.1 MEK/ERK的抑制导致PPARγ磷酸化表达下降 |
| 2.2 MEK/ERK介导的PPARγ磷酸化的下降对HCC细胞增殖和周期的影响 |
| 3. MEK/ERK对PPARγ磷酸化作用的体内分析 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 PPARγ磷酸化对肝癌细胞生长的影响 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 基因芯片与细胞增殖检测 |
| 1.1 基因芯片分析 |
| 1.2 HCC细胞增殖检测 |
| 2. 细胞周期分析及周期调控分子检测 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 肝癌细胞有氧糖酵解重要功能基因分析 |
| 一、实验材料和方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 芯片分析 |
| 2. 葡萄糖和乳酸检测 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）CBX4在肝细胞癌中的生物学功能及其对肝癌预后的影响和分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 前言 第一部分 CBX4在肝细胞癌中的表达及其与预后的关系 |
| 引言 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 第二部分 CBX4基因在原发性肝癌中的生物学功能 |
| 引言 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 结论 致谢 参考文献 综述 |
| 参考文献 攻读博士期间发表的学术论文 个人简历 导师评阅表 |
四、肝细胞癌SCT表现特征与Rb,PCNA的关系（论文参考文献）
- [1]ZIP12在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺血管重构中的作用及机制[D]. 叶超毅. 福建医科大学, 2021(02)
- [2]长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究[D]. 胡博. 北京协和医学院, 2021(02)
- [3]组蛋白甲基转移酶RIZ1介导的lncRNA HOTAIRM1失活对肝细胞癌生物学行为的影响及其分子机制的研究[D]. 李玉强. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]基于整合生物信息学的复方苦参注射液治疗三种常见肿瘤作用机制研究[D]. 孟子琦. 北京中医药大学, 2020(04)
- [5]羽扇豆醇肝靶向脂质体的制备及其抗肝细胞癌研究[D]. 张骏. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [6]黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响及TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组学研究[D]. 余廷东. 广西医科大学, 2019(08)
- [7]HJURP抑制p21表达促进肝细胞癌增殖的分子机制研究[D]. 陈天驰. 浙江大学, 2019(03)
- [8]乙肝病毒large S基因及其变异促进HCC发生发展的机制研究[D]. 李自雄. 中国人民解放军海军军医大学, 2018(01)
- [9]肝细胞癌发展中PPARγ磷酸化修饰的机制及调控作用[D]. 庞小娟. 南京大学, 2014(05)
- [10]CBX4在肝细胞癌中的生物学功能及其对肝癌预后的影响和分子机制[D]. 王伯庆. 新疆医科大学, 2013(02)