一、超嗜热菌中逆促旋酶的研究进展（论文文献综述）
庄滢潭,刘芮存,陈雨露,杨岑玥,余岩,王涛,王友亮,宋亚军,滕越[1]（2022）在《极端微生物及其应用研究进展》文中提出极端微生物是指在高/低温、高/低p H、高盐、高压等极端环境条件下生存的微生物.特殊的生存条件导致其具有特殊的遗传背景和代谢途径,并可产生功能特殊的酶类和活性物质.随着系统生物学和合成生物学技术的发展,极端微生物作为一类特殊的微生物群体,在生物医疗、生物能源和生物材料等领域具有巨大的应用潜力.极端微生物相关研究也对生命起源与演化、生物工程技术等领域的发展具有重大意义.本文对极端环境及极端微生物的概念和分类进行了回顾,综述了极端微生物在不同环境条件下的适应机制及其酶的应用,并介绍了合成生物学在极端微生物研究中的应用情况.此外,由于极端微生物和极端酶的特殊性和高效性,本文还探讨了极端微生物开发过程中的挑战,以及其在航空航天与国防安全领域的综合应用潜力,并指出了相关研究的必要性.
代瑞阳[2]（2017）在《新型GyrB/ParE抑制剂和LpxC抑制剂的设计合成与生物活性评价》文中指出由细菌引起的严重感染已经成为人类健康和生命的重大威胁。其中多药耐药的革兰阴性菌最难以防治,然而相应的抗菌药物却十分稀缺。因此,临床上迫切需要安全、有效的抗革兰阴性菌药物。细菌II型拓扑异构酶,即细菌DNA促旋酶和拓扑异构酶IV是细菌DNA复制和细胞存活所必需的关键酶,是所有细菌共有的组成成分,也是重要的抗菌药靶点。两种酶均是由两类亚基所组成的四聚体（[（GyrA）2（GyrB）2]和[（ParC）2（ParE）2]）。近年来发现的Gyr B/ParE双靶点抑制剂,作用于GyrB亚基和ParE亚基的ATP水解酶区域,通过竞争性抑制ATP水解,阻断酶催化反应的能量供应,进而抑制细菌DNA复制,导致细菌死亡,是区别于喹诺酮类药物的一类具有全新作用机制的抑制剂。一些化合物如Vertex公司的苯并咪唑脲系列和Tirus公司的三环系列还具有不错的抗革兰阴性菌活性,因而具有非常好的研究前景。脂多糖（LPS）层是革兰阴性菌细胞壁外层所特有的结构,而其组分之一的类脂A（Lipid A）负责将LPS锚定在细胞外膜上,进而防止外来物质的侵入。研究表明类脂A对革兰阴性菌的生长至关重要,抑制其合成能导致细菌死亡。而LpxC是类脂A生物合成中所必需的一个金属蛋白酶,且在革兰阴性菌中广泛存在。该酶能被小分子金属蛋白酶抑制剂所抑制,是很有吸引力的抗菌药物靶点。我们根据DNA促旋酶和拓扑异构酶IV中ATP水解酶与小分子抑制剂的结合模式,利用药效团拼接、生物电子等排、基团替换等方法将具有抗革兰阴性菌活性的苯并咪唑系列的母核与Tirus公司三环系列中对发挥抗革兰阴性菌活性起重要作用的氨基片段相结合,设计合成了9个全新结构的GyrB/ParE抑制剂。另一方面,我们从另一类金属酶抑制剂——肽脱甲酰基酶（PDF）抑制剂结构中受到启发,将N-甲酰羟胺片段引入到现有的LpxC抑制剂中,设计合成了4个新结构的化合物,期望得到活性保持,代谢更稳定,毒性更小的Lpx C抑制剂。但遗憾的是,我们所设计的化合物在体外抗菌活性测试中,对所试菌株并没有表现出明显的抗菌活性,证明了我们这一系列的改造失败了。虽然结构改造没有取得成功,但也为这两类抑制剂的后续设计开发进一步提供了构效关系理论基础。
冯晓远[3]（2017）在《基于宏基因组学的深古菌进化和代谢潜能研究》文中指出海洋沉积物中蕴含着丰富的微生物资源,其细胞计数总量达到2.9×1029,这个数目与估算得到的海洋微生物总量相当。但是由于此类微生物缺少实验室可培养菌株,其代谢方式和生态功能都有待深入研究。深古菌（Bathyarchaeota）在海洋沉积物中广泛分布,且具有很高的丰度。目前的系统发育研究将深古菌定义为一个独立的古菌门（Phylum）分类单元,其分为至少19个亚群;然而,目前只有七篇深古菌相关的基因组报道,其不同亚群所具有的代谢特征和生理特点也所知甚少。本课题中主要使用宏基因组技术手段,直接对瓜伊马斯盆地深海热液沉积物中的环境DNA进行测序和分析,以研究这一环境中深古菌的生理特征及生态功能,及其可能存在的特殊的环境适应性。本课题中,我们首先对深古菌16S r RNA基因序列分类系统进行了更加精细的划分,在原有的亚群分类基础上,新确定了四个新的深古菌亚群,即Bathy-3bc/20/21/22,这四个亚群在之前的分类系统中处于未确定的状态。此外,我们还利用宏基因组技术手段,从瓜伊马斯盆地的两个深海热液沉积物中测序和分装得到16个深古菌基因组,并将其与通过文献调研收集到的26个已公开发表基因组进行了系统发育树的构建和比较基因组分析。通过系统发育树的构建,我们将其中38个基因组定位到11个不同的深古菌亚群,4个基因组由于缺少相关的标记基因,暂时不能确定其亚群分类。通过比较基因组分析,我们发现并确定了目前已知的深古菌亚群的核心代谢途径,这些途径包括蛋白质降解途径、糖酵解途径、柠檬酸循环、还原型乙酰辅酶A途径和产乙酸途径。其中,亚群Bathy-15编码古菌类型和细菌类型两种还原型乙酰辅酶A途径,而其他亚群则仅包含其中的古菌类型;亚群Bathy-20/21通过编码磷酸乙酰转移酶-乙酸激酶（pta-ack）基因完成产乙酸的代谢途径,而其他亚群则通过编码乙酰辅酶A连接酶（acd）基因来实现相同的代谢功能。此外,不同的深古菌亚群还显示出多样的异养代谢有机化合物的底物降解潜能,尤其是亚群Bathy-20,和其他亚群相比具有更加丰富的碳水化合物降解途径和独有的有机硫化物降解途径。除了代谢特征的差异,亚群Bathy-1/20/21/22等分装自瓜伊马斯盆地深海热液沉积物样本的深古菌亚群还具有嗜热性的生存策略。总之,深古菌的核心代谢途径为兼性厌氧的蛋白质和其他有机化合物发酵作用、还原型乙酰辅酶A途径和产乙酸自养途径。本课题揭示了深古菌复杂的内部亚群分类多样性和多样的代谢潜能,同时也说明在不同环境下生存的不同深古菌亚群可能具有不同的生态作用。
张瑶心[4]（2014）在《嗜盐蛋白酶SptC的成熟机制及其几丁质结合结构域功能的研究》文中指出几丁质是是虾蟹等甲壳动物的外壳、昆虫的外骨骼和许多真菌细胞壁的重要组成成分。许多微生物分泌各种酶来降解含几丁质生物质,为自身的代谢提供物质与能量,这些酶包括几丁质酶、乙酰葡萄糖胺糖苷酶、蛋白酶等,它们通过协同作用完成对几丁质的降解。人们已经详细研究了细菌和真核生物分泌的几丁质降解代谢途径,但到目前为止,已报道的具有几丁质降解能力的嗜盐古生菌仅有Haloferax mediterranei。极端嗜盐古生菌Natrinema sp. J7-2由本实验室从湖北应城盐矿分离得到,该菌株的基因组编码一个几丁质降解代谢相关的基因簇,其中包含一个蛋白酶基因sptC。与其他嗜盐胞外蛋白酶的C端延伸区所不同的是,SptC的C端延伸区由PkdD和ChBD这两个结构域组成。在本研究中,我们重点探讨了该酶自加工成熟机制及其在Natrinema sp. J7-2的几丁质分解代谢系统可能发挥的作用。首先,我们对Natrinema sp. J7-2基因组中几丁质分解代谢相关的基因簇及其编码的蛋白进行生物信息学分析。该几丁质分解代谢相关的基因簇在Natrinema属的成员中高度保守,它不仅编码几丁质酶（Chi1, Chi2and Chi3）、几丁质结合蛋白（Cbp）、糖类物质的ABC转运系统、胞内糖苷酶,还编码一个胞外蛋白酶SptC。Chi1、Chi2、Chi3、Cbp和SptC这五个蛋白前体均含有PkdD和ChBD这两个结构域,并且这两个结构域在氨基酸序列上呈现出相似性,表明这几个蛋白质在进化和功能方面具有相关性。同时,我们通过实验证明菌株J7-2具备降解几丁质的能力并能利用其降解产物作为唯一碳源进行生长。其次,我们对重组SptC体外活化过程进行了研究,并通过构建一系列缺失突变体,探讨N端前肽、PkdD和ChBD在蛋白酶活化、活性和稳定性方面的功能。重组SptC （SptC*）在高盐条件下的活化过程经历两步加工：首先SptC通过顺式加工对N端前肽核心区域（N*）进行切割,形成自加工复合物N*-IwT；随后,自加工复合物中的N*和连接肽通过反式加工被降解,并伴随着ChBD的切除,N*-IWT转变为由催化功能域和PkdD组成的成熟酶。在SptC自加工成熟过程中,N端前肽作为分子内伴侣帮助前体正确折叠,N端前肽缺失突变体SptCAN无法正确折叠。C端延伸区对于SptC的折叠和自加工并不是必需的,但是缺失C端延伸区会导致SptC成熟速度减慢。SptC及各突变体成熟酶的最适盐浓度为3-3.5M NaCl,它们需要高盐条件以维持自身稳定性。PkdD的存在提高了SptC成熟酶的活性但对稳定性没有影响。然后,我们对SptC与几丁质相关功能进行研究。ChBD介导SptC与几丁质结合,而且ChBD对几丁质的结合能力随着盐浓度的上升而增强。SptC无法与纤维素或壳聚糖结合。同时,几丁质和纤维素可以加快SptC及各C端缺失突变体的成熟速度,而含有ChBD的自加工复合物（N*-I1WT和N*-IΔPkdD）可以通过ChBD与几丁质结合,增加与几丁质相互作用的机会并提高几丁质周围自加工复合物的局部浓度,从而使几丁质对SptC*和SptCAPkdD的成熟促进效果更为显着。此外,我们选取了与SptC同源但不含ChBD的SptA、pyrolysin、S41、sphericase和WF146蛋白酶,对多糖促进蛋白酶成熟的作用进行了进一步探讨。结果显示,多糖虽然均无法与这五种蛋白酶结合,但几丁质和纤维素能在一定程度上加快WF146蛋白酶的成熟速度,并且与它们对SptCΔCTE和SptCΔChBD的成熟促进效果相似。这些结果表明,这些多糖对蛋白酶成熟的促进作用并不完全依赖于ChBD的存在,而可能与蛋白酶的氨基酸序列特异性有关。最后,我们发现SptC可以在高盐浓度下降解虾壳粉中的蛋白质组分。虾壳粉被自加工复合物N*-IWT处理后可溶肽段的释放的速度比被成熟酶MWT处理过的样品要快。究其原因,可能是N*-IWT通过ChBD与虾壳粉中几丁质结合不仅加快N*-IWT的活化,还增加了虾壳粉周围的成熟酶浓度,从而加快了蛋白酶对虾壳蛋白质的降解。这些结果表明,蛋白酶SptC可能参与嗜盐古生菌Natrinema sp. J7-2对含几丁质生物质的降解。
冯守帅[5]（2014）在《极端嗜酸氧化硫硫杆菌筛选及贫黄铜矿生物浸出研究》文中研究表明伴随全球高品位原矿储量减少及金属需求量日益增加，如何有效提炼低品位的贫尾矿已成为世界性难题。生物浸出工艺具有经济、环保且可有效提炼贫尾矿等优点，是解决以上问题的新型绿色冶炼技术。然而由于极低品位和复杂构成，黄铜矿的生物浸出机理尚未完善，工业化应用进展也并不理想。本文从极端嗜酸Acidithiobacillusthiooxidans（A. thiooxidans）的筛选及其极端耐酸机理研究开始，提出强化生物浸出的复合体系和组合工艺，建立了定性定量分子探针检测方法，揭示了浸出过程不同集落态的群落演变规律，并初步构建贫黄铜矿生物浸出机理模型。主要研究如下：（1）极端嗜酸氧化硫硫杆菌筛选及耐酸机理研究。采用以异养微生物-Rhodotorulasp.作为底层培养物的双层平板法，将筛选化能自养型浸矿微生物的筛选周期缩减1/3，检出率提高3.1倍。从福建紫金矿业的工业化生物堆浸的浸出液筛得1株极端嗜酸硫氧化菌种，对无机强酸耐受能力可达pH0.2。经生理特性及双重分子特征基因鉴定为A.thioodidans ZJJN-3，保藏于中国典型微生物保藏中心-CCTCC M2012104。进而从胞内pH、细胞形态、细胞多糖、细胞膜脂肪酸成分、ATPase活性及耐酸相关蛋白转录水平等对其极端耐酸机理进行研究。伴随酸胁迫的增强，细胞荚膜层先明显增厚后逐渐褪去。细胞多糖含量也呈先上升后下降趋势。细胞膜不饱和脂肪酸比例从37.85%显着提升至49.06%，而且环丙烷脂肪酸比例维持在12.56%-18.59%。ATPase活性明显增强，相关耐酸蛋白抗逆体系GrpE/DnaK/DnaJ的基因相对转录水平提升至原有水平的2.23-3.50倍。基于以上结果初步构建A. thioodidans ZJJN-3的耐酸协同机制模型。（2）双菌协同浸出贫黄铜矿技术研究。基于Starkey-硫化矿培养基的重复补料分批培养模式，将A. thioodidans ZJJN-3的硫转化率和生物量生产强度提高31.1%和187.9%。关键生化参数、扫描电镜（SEM）及X射线衍射（XRD）结果均表明在双菌协同效应下，增强了浸出体系中生化活跃度并减弱钝化作用。最终浸出效率为Acidithiobacillusferrooxidans CUMT-1（A. ferrooxidans CUMT-1）纯菌体系的1.81倍。分别采用恒pH、Ag+和Cl-体系抑制钝化效应和加速生化反应速率。确定最佳复合浸出体系为恒pH1.3-2.0mg·L-1Ag+-2.5g·L-1Cl-。在更高的生物量和化学反应速率基础上，有效减弱了黄钾铁矾沉淀和S0膜的钝化作用。最终Cu2+浓度和浸出率分别达55.5mg·L-1和55.0%，约为对照体系的两倍。外源能源底物、分阶段恒pH调控和补料发酵策略分别被用于缩减贫黄铜矿分批浸出过程菌矿适应期、减弱中后期黄钾铁矾钝化及降低矿物底物抑制作用。确定最优组合工艺为2g·L-1Fe2++2g·L-1S0、三阶段恒pH调控（pH1.3-1.0-0.7）和补料-分批策略（0.5+0.125×4）。在7L搅拌式发酵罐验证结果表明，组合工艺更好的平衡了各浸出阶段中生物和化学效应。最终Cu2+浓度、浸出率和平均浸出速率分别达到89.1mg·L-1、44.1%和2.23mg·L-1·d-1，比原始水平提高约53%。（3）定量检测浸矿微生物的分子探针技术构建。结合分子探针、核酸S1酶消解功能及荧光标记等手段，建立了一种浸矿微生物专用定性定量检测方法。基于目标菌种16SrRNA保守区域设计特异性分子探针。比对结果表明分子探针与近缘菌种有2个或更多的碱基差异。进而优选了分子探针检测关键步骤的操作条件。如低非特异性吸附的封闭和洗脱条件（250μL0.1%BSA，30min，以0.5%PBST洗脱为辅助）、细胞破碎方式（300W，50%空白比，超声破碎4min，以细胞裂解液为辅助）、探针工作浓度（主探针100nM，捕获探针10nM，信号探针10nM）、杂交时间（1h，0.5h，0.5h）、杂交温度（30℃，45℃，45℃）、核酸S1酶酶切时间（20min）及荧光素抗体工作浓度（1:5000稀释比例）。最终建立分子探针检测标准曲线，线性系数达98.64%，细胞量的检测低限为103cells·mL-1左右。纯菌、混菌及浸出体系验证结果表明该检测方法特异性和准确性良好，可有效应用于后续浸出过程中群落结构演变分析。（4）双菌集落演化规律对贫黄铜矿浸出的影响。结合分子探针检测技术，对浸出过程双菌不同集落态的演变规律及其影响进行了翔实的研究。附着细胞对浸出体系中自由细胞群落的影响显着。仅占总生物量比例3.8%-11.6%的附着细胞缺失却可导致19.1%-31.2%自由细胞损失，尤其以A. thiooxidans ZJJN-3纯菌体系最为明显。双菌体系中附着细胞的缺失使得A. thiooxidans ZJJN-3在与A. ferrooxidans CUMT-1的群落竞争力明显下降，表明A. thiooxidans ZJJN-3对附着细胞有更强的依赖性。与此同时，关键化学参数的变化也证实了附着细胞的重要性。脱附着体系中Fe2+和SO24-浓度的最大减少量均高达40%左右。XRD及傅里叶红外变换光谱技术（FTIR）对矿渣分析均表明附着细胞与硫代谢紧密相关。约37.5%-50.5%甚至更高的浸出效率与吸附作用有直接关联。在生物和化学效应平衡的基础上，归纳总结了强化贫黄铜矿生物浸出的工艺和策略，并初步构建贫黄铜矿生物浸出机理模型。
吕杰[6]（2013）在《极端嗜盐古生菌Natrinema属遗传操作系统的初步构建及其启动子跨域启动活性的普遍性分析》文中认为1998年Terry J. McGenity根据16SrRNA序列以及其他的一些分类特征提出Natrinema属,目前在该属中还没有遗传操作系统相关的研究报道。Natrinema sp. J7-1及J7-2是本实验室保存的极端嗜盐古生菌Natrinema属的两个菌株,基因测序结果证实,二株菌的染色体序列几乎一模一样,唯一的差别在于携带的质粒,J7-1含有pHH205,而J7-2中的质粒为pJ7-I。本论文以极端嗜盐古生菌Natrinema sp. J7系列菌株为研究对象,对其相关遗传学元件进行研究。以J7-2及CJ7（不含质粒）菌株作为Natrinema属的代表,进行了该属中的遗传操作系统的初步研究构建工作：以J7-2菌株作为古生菌的代表,对其具有跨域启动活性的启动子的普遍性进行了初步的研究。Natrinema属中没有遗传操作系统的报道,而本实验室对该属中的J7-1和J7-2菌株已有广泛的研究,部分研究对于构建Natrinema属J7-2及CJ7菌株的遗传操作系统提供了有用的信息。营养缺陷型常作为筛选标记广泛应用于菌株的遗传操作系统的研究。通过NTG以及紫外诱变的方式,对J7-2菌株进行诱变处理,分离筛选营养缺陷型菌株,分别为J7-2-1,J7-2-22,J7-2-26和J7-2-52。通过实验确定其缺陷类型分别为：J7-2-1为亮氨酸营养缺陷型,J7-2-26为赖氨酸营养缺陷型,J7-2-22与J7-2-52为精氨酸营养缺陷型。再根据全基因组信息结合PCR扩增片段验证,进一步确定其突变基因及突变类型,分别为J7-2-1中突变基因为leuB基因（1752）,编码3-异丙基苹果酸脱氢酶,突变为从690bp到701bp的长12bp的缺失突变；在J7-2-26中,突变基因为dapD （4049）,编码2,3,4,5-四氢吡啶-2,6-二羧酸N-琥珀酰转移酶,突变为从583bp到600bp的长18bp的缺失突变；J7-2-52的argC基因（262）,编码N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶,1051bp处发生点突变,由G突变为A,此突变使得密码子GGG突变为GAG。野生型J7-2基因组能够转化营养缺陷型菌株J7-2-1及J7-2-26,并使菌株恢复原养型。leuB或者dapD基因扩增产物、含有leuB或者dapD基因的整合质粒也同样可以转化营养缺陷型菌株J7-2-1及J7-2-26,并使菌株恢复原养型。说明线性片段及环状质粒可以转化Natrinema属的菌株,同样说明在该属中PEG介导的原生质体转化方法的可行性。外源α-淀粉酶基因可以通过整合质粒中筛选标记基因同源重组的方式一起整合到营养缺陷型菌株基因组上,并能表达有淀粉酶活性的蛋白,说明外源的DNA通过整合质粒转化,可以表达于Natrinema sp. J7-2的营养缺陷型菌株中。这些结果均证明该属是可以进行遗传转化和遗传操作的。与此同时,我们尝试构建宿主／穿梭载体的遗传操作体系。pHH205是菌株J7-1的内源性质粒,由于没有筛选标记,先将其转化不含此质粒的J7-2菌株及CJ7菌株,并通过丝裂霉素C诱导恢复过夜的转化体系,通过检测噬菌斑的方法,发现其上清可以感染敏感菌株J7-2并形成噬菌斑。这再次证实了Natrinema属中遗传转化的可行性,同时该结果是第一次用实验的方式证实了质粒pHH205即为噬菌体SNJ1的原噬菌体。以Mev为选择标记、以pHH205全长,构建携带Mev选择标记的穿梭质粒pUC19-Mev-pHH205i8。该质粒转化J7-2及CJ7后能得到具有Mev抗性的转化子,且能够提到相应的质粒,说明该穿梭质粒在J7系列菌株中确实有复制功能。在寻找pHH205上的最小复制区时发现,含有8.715Kb的4号片段的穿梭载体可以有复制功能,但是转化效率不高。含有7.047Kb的8号片段以及含有2.706Kb的16号片段的穿梭载体转化后也曾筛到转化子,但转化效率非常低,甚至只得到一个转化子。从这些转化子中未能提到可见的质粒DNA,说明拷贝数可能较低。但将质粒DNA提取物重新转化大肠杆菌却能重新得到转化子并检测到目标质粒。说明8号片段和16号片段上含有能在Natrinema属极端嗜盐古菌中进行自主复制的区域。从实验结果中我们还发现质粒转化CJ7的效率要高于J7-2,其原因可能是J7-2中含有一个大小约为95Kb的pJ7-I大质粒,该质粒有可能会影响外源DNA转化J7-2菌株的效率。质粒稳定性实验结果显示在无抗连续培养十天的情况下,pUC19-Mev-pHH205i8质粒的稳定性高于pUC19-Mev-pHH2054质粒,几乎没有质粒丢失,而pUC19-Mev-pHH2054质粒存在不同程度丢失的情况,推测其原因可能是4号片段中缺少了能够稳定质粒的元件,因而菌株在无抗培养情况下,质粒没有相应的筛选压力会有不同程度的丢失。产噬菌斑能力及SNJ1侵染实验的工作也同时进行。其结果为转化pUC19-Mev-pHH205i8质粒的菌株经MMC诱导后期上清可侵染敏感菌J7-2并有噬菌斑的产生,而转化pUC19-Mev-pHH2054质粒的菌株诱导后的上清中则没有噬菌斑的产生。另一方面,SNJ1不能侵染含有pUC19-Mev-pHH205i8质粒的菌株,但是却能侵染含有pUC19-Mev-pHH2054质粒的菌株,这说明,与全长的i8片段相比,4号片段中可能缺少了使宿主菌对外源病毒颗粒产生免疫的元件。上述结果为后续研究噬菌体遗传学特征及噬菌体侵染裂解机制等工作奠定了基础。本实验室前期曾发现Haloarcular hispanicaα-淀粉酶基因启动子在大肠杆菌和极端嗜盐古生菌中都具有启动活性,分析其启动子发现有类似于大肠杆菌启动子保守元件“-10B0x”,推测这可能是其有两域启动活性的原因。为了探究古生菌启动子具有跨域启动活性现象是否具有一定的普遍性,我们以Natrinema sp.J7-2基因组为代表对该问题进行进一步的研究。为此需要构建两个载体,分别用于检测启动子在细菌和古生菌两域中的启动活性。对大肠杆菌-沃氏富盐菌穿梭载体pSY1进行改进,构建了大肠杆菌-沃氏富盐菌的穿梭表达载体pAJ,并通过在两域中分别表达两种不同的蛋白对其穿梭表达及多克隆位点的功能进行了验证。在细菌中,对启动子探针载体pKK232-8进行改进,构建了启动子探针载体pUKM,对其多克隆位点的功能以及启动子探针载体的功能也做了相应的验证工作。分别通过pUKM载体和pAJ载体分析并检测了来自于Natrinema sp.J7-2基因组上的定向以及随机选取的预测启动子片段在细菌和古生菌两域中的启动活性,发现以‘’-10Box"为基础的定向选取的17个预测的启动子中有16个在细菌中有相应的启动活性,而随机选取中的34个预测启动子则大部分是在细菌中没有启动活性,只有6个有启动活性,而且它们的启动活性要低于定向挑取的预测启动子。分析随机选取的有活性的预测启动子片段后,发现它们中有一个也有类似于定向选取的预测启动子中的‘’-10Box"元件的存在,其他启动子中也有预测的元件,推测随机挑取的预测启动子启动活性低于定向挑取预测启动子的启动活性的原因是缺少类似‘’-10Box’’元件的存在。这与大多数的古生菌的启动子的保守元件（BRE元件,TATA box以及转录起始区）并不相同。根据相应的实验结果我们推测在古生菌中存在一定数量的具有跨域启动活性的启动子,而且其与细菌及真核生物中的启动子存在着某种程度的进化关系。
胡咏梅[7]（2012）在《硫磺矿硫化叶菌Sso0660和Sso0661基因的表达与功能研究》文中进行了进一步梳理硫化叶菌是古菌遗传学、生理和生化研究的模式生物。在硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobu）solfataricusP2菌株的基因组中,推测至少有37个基因编码假定的蛋白酶、蛋白酶亚基或肽酶。然而迄今为止,仅有6个蛋白酶或肽酶（包括Sso2045、Sso2154和CPSso等）得以被鉴定和进行了酶学性质分析,其余的假定蛋白酶都没有被解析。例如,Sso0660和Sso0661在S.solfataricus P2基因组的数据库中被预测编码锌依赖的蛋白酶,因为与细菌中的TldD和TldE（PmbA）序列相似而被分别注解为TldD和TldE同源类似物。虽然体内的遗传学实验证据支持Escherichia coli的TldD和TldE具有蛋白酶活性的假说,并预测这两个蛋白可能形成蛋白酶复合物行使功能,但缺乏明确的生物化学证据;而对Thermotoga maritima中TldE（PmbA）的晶体结构分析后,并没有在其中发现金属的结合位点或任何水解酶结构域,TldE是否具有蛋白酶活性由此产生争议。在目前的文献中还没有TldD和TldE生化性质的相关报道,TldD和TldE具有怎样的生理功能还不明确。为此,本文围绕S.solfataricus P2中的Sso0660和Sso0661基因的表达和功能进行了研究,获得了以下几个方面的结果:1.通过构建 pSeSD-0660、pSeSD-0661、pET30a-0660 和 pET30a-0661 等表达载体,实现了Ss 0o60和Sso0661基因的同源与异源表达。同源表达的Sso0660和Sso0661产物可溶,而异源表达的Sso0660和Sso0661大多以包涵体的形式存在。通过凝胶过滤、质谱分析结合点突变,确定了 Sso0660单体的分子量为49851 Da,两个单体首先通过C416处的分子链间二硫键形成二聚体,在此基础上再形成36聚体;同源超表达的重组Sso0661为单体,分子量为47346 Da。2.从生化角度证实了 Sso0660和Sso0661具有蛋白酶活性。包涵体经过变性、复性可获得有活性的重组Sso0660和Sso0661蛋白酶,与可溶性的重组酶一样,可分解蛋白酶的通用底物FTC-BSA、azocasein和gelatin,最适作用pH是7。同源和异源超表达的重组Sso0660最适的作用温度分别为75℃和55℃,重组Sso0661最适的作用温度是65℃。Sso0660和Sso0661对金属蛋白酶的抑制剂EDTA和o-phenanthroline最为敏感,说明均为金属蛋白酶。火焰法原子吸收结果表明,每摩尔Sso0660分子含有1摩尔锌,而Sso0661并不含锌。多序列比对结果显示TldD和TldE拥有共同保守的"DDEG"模序,TldD则独有"HExxxH"模序以及位于C端的半胱氨酸残基。点突变结果表明,"HExxxH"和"DDEG"模序与Sso0660的锌结合有关,D278E改变切割位点,可能为活性性中心。3.揭示了古菌Sso0660同源超表达与硫化叶菌程序性死亡（PCD）之间可能存在的相关性。因为Sso0660超表达后,细胞出现基因组DNA降解、胞内caspase-like活性增高、细胞不易被培养和生长严重滞后现象,显示出古菌TldD超家族成员调控古菌程序性死亡（PCD）的重要性。Sso0660蛋白对caspase的通用抑制剂Z-VAD-fmk敏感,能与抗人caspase-8的抗体杂交,并展现caspase-8-like的活性,说明Sso0660具有caspase8-like的免疫活性和生理活性,为古菌中的死亡蛋白酶,在古菌PCD中行使重要功能。这是首次在古菌域中鉴定具有caspase-like活性的蛋白的报道。4.构建了 pSeSD-0660/0661的共表达载体,采用共纯化和免疫共沉淀技术发现Sso0660和Sso0661形成了复合体。进一步推测TldD与TldE在体内可能存在相互制约的关系,但具体作用机制尚待深入的研究。
岳怡涵[8]（2012）在《OsDCL3b基因沉默对稻穗生长发育的影响》文中进行了进一步梳理Dicer是一种高度保守的核糖核酸酶,在植物中称为Dicer-like （DCL）蛋白。Dicer/DCL的直接生物学功能主要是加工生成各种具有调控功能的小分子RNA,这些调控小RNA进一步影响其他相关蛋白基因的时空表达,进而影响生物个体的生长发育、抗病虫害能力和逆境适应能力等。因而,研究Dicer/DCL蛋白基因的功能对揭示真核生物的基因表达调控机理具有十分重要的意义。本研究基于RNA干扰技术,对水稻OsDCL3b进行了转基因沉默分析,获得了影响稻穗生长发育的T2代转基因阳性纯合植株,发现OsDCL3b基因主要影响21nt和24nt大小的小RNA的生物合成,为深入研究OsDCL3b基因调控稻穗生长发育的遗传途径奠定了基础。主要结果如下：1、基于改造了的RNAi-Ubi质粒pYL,成功构建了OsDCL3b的转基因沉默载体,利用农杆菌介导转化水稻中花11,获得了转基因T2代阳性纯合株系。2、荧光定量PCR比较分析发现,OsDCL3b基因在其中2个T2代转基因纯合株系DCL4-6和DCL6-1幼穗中的表达量分别比其在野生型中花11幼穗中的表达量减少了约30%和70%；大田种植成熟期表型分析结果表明,这2个T2代转基因纯合株系植株的结实率分别只有40.0%和37.7%,而野生型中花11的结实率高达91.7%,同时这2个T2代转基因纯合株系植株的每穗枝梗数和总粒数变少,穗长变短；表明OsDCL3b基因与稻穗的生长发育密切相关。3、对DCL6-1和对照中花11幼穗中大小为21～36nt的小RNA进行测序比较分析发现,OsDCL3b基因主要影响21nt和24nt大小的小RNA的生物合成；这些小RNA在水稻第2号染色体上分布最多,分别占总数的32.9%（DCL6-1）和24.3%（对照中花11）,在水稻其他染色体上的分布量均未到总数的10.0%。
张丽梅,贺纪正[9]（2012）在《一个新的古菌类群——奇古菌门（Thaumarchaeota）》文中认为基于16S rRNA基因的系统发育关系,古菌域（Archaea）被分为两个主要类群:广古菌门（Euryarchaeota）和泉古菌门（Crenarchaeota）。近20年来,微生物分子生态学技术的快速发展和应用显示,在中温环境中广泛存在着大量的未培养古菌,而且它们可能在自然界重要元素（N、C）的生物地球化学循环中发挥着重要作用。最初,这些未培养古菌因在16S rRNA基因系统发育上与泉古菌关系较密切而被称作中温泉古菌（non-thermophilic Crenarchaeota）。而近年来,对更多新发现的中温古菌核糖体RNA基因序列和其它分子标记物进行的分析均不支持中温泉古菌由嗜热泉古菌进化而来的假设,而揭示其可能代表古菌域中一个独立的系统发育分支。基因组学、生理生态特征等分析也显示中温泉古菌与泉古菌具有明显不同的特征。因而专家建议将这些古菌（中温泉古菌）划分为一个新的门,成为古菌域的第三个主要类群—Thaumarchaeota（意译为奇古菌门）。这一新古菌门提出后得到其他研究证据的支持和认可。本文对目前已知的奇古菌门的分类地位演化、基因组学、多样性和生理代谢特征等作一简要综述。
王维[10]（2010）在《嗜热微生物热稳定与热适应机制的研究》文中指出地球上的生命具有强大的适应能力。大部分生物的生存温度范围在20℃～50℃,还有很多生物可以在50℃以上的高温或者20℃以下的低温环境中生长。生长温度在+46℃以上的被称为嗜热微生物。嗜热微生物的热适应机制一直都是人们非常关注的问题。得益于微生物基因组序列数据的积累以及生物信息学的发展,我们可以从基因组和蛋白质组的角度来探讨嗜热微生物的热稳定和热适应机制。前人对于微生物嗜热机制的研究多局限于对某一种蛋白家族的序列或结构的分析。但是到目前为止,已经积累了大量的微生物基因组序列信息。因此,我们决定从微生物全基因组和全蛋白质组的角度,来综合地分析蛋白质和氨基酸对嗜热微生物热稳定和热适应的影响,以及嗜热微生物蛋白功能的演化。本论文首先选取了526个细菌的全蛋白质组序列,利用双向比对的方法找出全部的同源蛋白,从蛋白的序列组成方面入手分析热稳定和热适应的机理。结果表明嗜热微生物在蛋白质的氨基酸组成上存在偏好性。通过对蛋白的功能和COG分析发现,嗜热微生物中特有的一些蛋白质,更多地参与细胞生物信息的存储与处理过程。最后还对这些蛋白的结构做了分析。此外,本论文还研究了氨基酸的稳定性在嗜热微生物热稳定和热适应方面的贡献。通过考察297个原核微生物基因组中氨基酸含量与最适生长温度（OGT）之间的相关性来衡量氨基酸稳定性在生物热适应中所起到的作用。我们的研究发现除了DNA和蛋白质稳定性对热适应的作用之外,氨基酸的稳定性也是嗜热微生物热适应的决定因素之一。这些发现不仅为前人提出的假设提供了进一步的证据支持,而且也表明了氨基酸的稳定性对嗜热菌中氨基酸残基的选择有重要影响。通过考察Top-90中同源蛋白的氨基酸含量,进一步说明氨基酸的稳定性对蛋白质的残基组成有贡献。
二、超嗜热菌中逆促旋酶的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、超嗜热菌中逆促旋酶的研究进展（论文提纲范文）
（1）极端微生物及其应用研究进展（论文提纲范文）
| 1 嗜热微生物 |
| 1.1 嗜热微生物的定义及分布 |
| 1.2 嗜热微生物的适应机制 |
| 1.3 酶及其应用 |
| 2 嗜冷微生物和耐冷微生物 |
| 2.1 嗜冷微生物的定义及分布 |
| 2.2 嗜冷微生物的适应机制 |
| 2.3 酶及其应用 |
| 3 嗜盐微生物 |
| 3.1 嗜盐微生物的定义及分布 |
| 3.2 嗜盐微生物的适应机制 |
| 4 嗜碱微生物 |
| 4.1 嗜碱微生物的定义及分布 |
| 4.2 嗜碱微生物的适应机制 |
| 4.3 酶及其应用 |
| 5 嗜酸微生物 |
| 5.1 嗜酸微生物的定义及分布 |
| 5.2 嗜酸微生物的适应机制 |
| 5.3 酶及其应用 |
| 6 极端微生物在下一代工业生物技术中的应用 |
| 7 结论与展望 |
（2）新型GyrB/ParE抑制剂和LpxC抑制剂的设计合成与生物活性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 抗菌药物的研发现状 |
| 1.2 细菌耐药性 |
| 1.3 GyrB/ParE抑制剂概述 |
| 1.3.1 细菌Ⅱ型拓扑异构酶 |
| 1.3.2 GyrB/ParE抑制剂研发历程 |
| 1.3.3 GyrB/ParE抑制剂构效关系 |
| 1.3.4 小结 |
| 1.4 LpxC抑制剂类抗菌药物概述 |
| 1.4.1 革兰阴性菌的结构特点 |
| 1.4.2 类脂A的生物合成途径 |
| 1.4.3 LpxC的生理学特性 |
| 1.4.4 LpxC的催化机理 |
| 1.4.5 LpxC抑制剂的研发历程 |
| 1.4.6 LpxC抑制剂的构效关系 |
| 1.4.7 小结 |
| 1.5 论文的研究目的及意义 |
| 第2章 GyrB/ParE抑制剂和LpxC抑制剂的设计与合成 |
| 2.1 GyrB/ParE抑制剂的设计与合成 |
| 2.1.1 化合物设设计 |
| 2.1.2 化合物的合成 |
| 2.2 GyrB/ParE抑制剂体外抗菌活性测试与结果分析 |
| 2.3 LpxC抑制剂的设计与合成 |
| 2.3.1 化合物设计 |
| 2.3.2 化合物的合成 |
| 2.4 LpxC抑制剂体外抗菌活性测试与结果分析 |
| 第3章 实验部分 |
| 3.1 化学实验部分 |
| 3.2 生物活性测试部分 |
| 3.2.1 GyrB/ParE抑制剂抗菌活性测试实验 |
| 3.2.2 LpxC抑制剂抗菌活性测试实验 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（3）基于宏基因组学的深古菌进化和代谢潜能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 古菌概述 |
| 1.2 海洋环境微生物研究进展简介 |
| 1.3 宏基因组测序 |
| 1.3.1 测序平台介绍 |
| 1.3.2 宏基因组测序 |
| 1.4 深古菌概述 |
| 1.4.1 深古菌的命名与分布 |
| 1.4.2 深古菌的亚群分类 |
| 1.4.3 影响深古菌亚群分布特点的环境因子 |
| 1.4.4 基因组信息揭示的深古菌生理功能 |
| 1.5 本课题的研究目的、思路以及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 样本信息 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶方法进行DNA提取 |
| 2.2.2 宏基因组库构建和测序 |
| 2.3 生物信息学分析 |
| 2.3.1 测序数据组装和基因组分装 |
| 2.3.2 基于16SrRNA基因的系统发育树构建 |
| 2.3.3 功能基因的预测和注释 |
| 2.3.4 针对物种进化地位的系统发育树构建 |
| 第三章 实验结果和讨论 |
| 3.1 基因组组装和分装信息 |
| 3.2 深古菌亚群分类 |
| 3.2.1 基于16SrRNA基因序列的亚群分类 |
| 3.2.2 基于保守核糖体蛋白序列的进化地位确认 |
| 3.3 深古菌代谢途径分析 |
| 3.3.1 核心代谢途径分析 |
| 3.3.2 有机化合物底物降解潜能 |
| 3.3.3 其他代谢途径分析 |
| 3.3.4 环境适应性分析 |
| 第四章 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（4）嗜盐蛋白酶SptC的成熟机制及其几丁质结合结构域功能的研究（论文提纲范文）
| 本研究的主要创新点 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 极端环境微生物 |
| 1.2 嗜盐微生物(halophiles) |
| 1.3 枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶(Subtilase) |
| 1.4 蛋白酶的加工成熟 |
| 1.5 蛋白酶的C端延伸区(C-terminal extension,CTE) |
| 1.6 多糖 |
| 1.7 几丁质的生物降解 |
| 1.8 嗜盐蛋白的异源表达 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 蛋白酶SptC及相关蛋白的生物信息学分析 |
| 3.1 菌株J7-2中的几丁质分解代谢相关基因簇 |
| 3.2 蛋白酶SptC及相关蛋白的序列分析及结构预测 |
| 3.3 菌株J7-2的降解几丁质能力的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 SptC的自加工成熟及其成熟酶性质 |
| 4.1 重组SptC(SptC~*)的表达、纯化与活化 |
| 4.2 SptC~*的变性、复性及成熟 |
| 4.3 SptC~*的自加工成熟过程的解析 |
| 4.4 N端前肽及CTE在SptC~*折叠及成熟过程中的作用 |
| 4.5 成熟酶的活性及稳定性 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 第五章 SptC与几丁质的相互作用及ChBD的功能 |
| 5.1 SptC与几丁质的结合 |
| 5.2 SptC与其他多糖的结合 |
| 5.3 几丁质及其他多糖对SptC成熟的影响 |
| 5.4 多糖对其他蛋白酶的促进作用 |
| 5.5 多糖对不同蛋白酶成熟的促进作用的比较 |
| 5.6 SptC对虾壳中蛋白质的降解作用 |
| 5.7 讨论 |
| 5.8 本章小结 |
| 全文总结及研究展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）极端嗜酸氧化硫硫杆菌筛选及贫黄铜矿生物浸出研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物浸出概述 |
| 1.2 贫黄铜矿生物浸出研究 |
| 1.2.1 贫黄铜矿生物浸出意义 |
| 1.2.2 生物浸出机制演变过程 |
| 1.3 浸矿微生物研究现状 |
| 1.3.1 浸矿微生物 |
| 1.3.2 浸矿微生物耐酸机理 |
| 1.4 贫黄铜矿浸出工艺及强化策略 |
| 1.4.1 浸出工艺 |
| 1.4.2 生物浸出强化策略 |
| 1.5 浸出过程群落结构研究趋势 |
| 1.5.1 浸矿微生物检测技术 |
| 1.5.2 浸出过程群落结构演变规律 |
| 1.6 立体依据和研究内容 |
| 1.6.1 立题依据和研究意义 |
| 1.6.2 本论文主要研究内容 |
| 第二章 极端嗜酸氧化硫硫杆菌筛选及耐酸机理研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 菌种样本 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.2.4 实验仪器与试剂 |
| 2.2.5 双层平板筛选极端嗜酸氧化硫硫杆菌 |
| 2.2.6 极端 A. thiooxidans ZJJN-3 筛选与鉴定 |
| 2.2.7 荧光定量 PCR 实验 |
| 2.2.8 主要参数测定及分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 建立快捷高效的浸矿微生物筛选方法 |
| 2.3.2 极端 A. thiooxidans ZJJN-3 分类鉴定 |
| 2.3.3 A. thiooxidans ZJJN-3 极端耐酸机理分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 双菌协同浸出贫黄铜矿技术研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与仪器 |
| 3.2.2 A. thioodidans ZJJN-3 培养模式优化实验 |
| 3.2.3 双菌协同浸出实验 |
| 3.2.4 复合催化浸出体系实验 |
| 3.2.5 组合浸矿工艺实验 |
| 3.2.6 分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 A. thiooxidans ZJJN-3 培养模式优选 |
| 3.3.2 双菌协同浸出贫铜矿的生化参数分析 |
| 3.3.3 复合催化浸出体系的建立 |
| 3.3.4 组合浸出工艺强化贫黄铜矿浸出 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 定量检测浸矿微生物的分子探针技术构建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 培养基及培养条件 |
| 4.2.3 仪器与试剂 |
| 4.2.4 分子探针设计及总流程 |
| 4.2.5 分子探针检测技术具体步骤 |
| 4.2.6 分子探针检测技术的特异性和准确性验证实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 分子探针检测的原理和特异性分析 |
| 4.3.2 分子探针检测技术关键操作条件优选 |
| 4.3.3 分子探针检测技术定性定量效果分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 双菌集落演化规律对贫黄铜矿浸出的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料与仪器 |
| 5.2.2 浸出实验 |
| 5.2.3 脱附着体系定义 |
| 5.2.4 总自由细胞和附着细胞菌体浓度测定 |
| 5.2.5 双菌体系中菌体浓度测定 |
| 5.2.6 主要化学参数检测方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 双菌集落演化规律及对生物群落影响 |
| 5.3.2 附着细胞对关键化学参数影响 |
| 5.3.3 贫黄铜矿双菌体系浸出机制模型的构建 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1：论文涉及的基因序列、检测图谱及缩略词 |
| 附录2：作者在攻读博士学位期间主要科研成果 |
（6）极端嗜盐古生菌Natrinema属遗传操作系统的初步构建及其启动子跨域启动活性的普遍性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 古生菌 |
| 1.1.1 古生菌名称的由来 |
| 1.1.2 古生菌的分类 |
| 1.1.3 古生菌的形态和细胞学特征 |
| 1.1.4 古生菌的生态环境 |
| 1.1.5 古生菌的基本遗传学特征 |
| 1.1.6 古生菌的启动子 |
| 1.2 嗜盐古生菌 |
| 1.2.1 嗜盐古生菌的概述 |
| 1.2.2 嗜盐古生菌的基因组研究 |
| 1.2.3 嗜盐古生菌中构建的遗传操作系统 |
| 1.2.4 嗜盐古生菌中的Natrinema属的简单介绍 |
| 1.3 古生菌噬菌体在古生菌遗传操作系统中的应用 |
| 1.4 本研究的背景、内容和意义 |
| 2 Natrinema sp.J7-2遗传操作系统的初步构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 试剂、溶液及仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 常用的分子生物学方法 |
| 2.2.2 Natrinema sp.J7-2的诱变处理 |
| 2.2.3 Natrinema sp.J7-2营养缺陷型菌株的筛选及验证 |
| 2.2.4 Natrinema sp.J7-2营养缺陷型菌株缺陷类型的鉴定 |
| 2.2.5 嗜盐古生菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.6 Natrinema sp.J7-2营养缺陷型菌株缺陷突变基因及突变位点的确定 |
| 2.2.7 菌株转化 |
| 2.2.8 转化子的鉴定 |
| 2.2.9 Natrinema sp.J7-2营养缺陷型菌株转化子中检测α-淀粉酶基因 |
| 2.2.10 pHH205转化Natrinema sp.J7-2及CJ7后的噬菌斑检测 |
| 2.2.11 Natrinema sp.J7-2的抗性实验 |
| 2.2.12 穿梭载体的构建流程 |
| 2.2.13 质粒稳定性实验 |
| 2.2.14 噬菌体的相关实验 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 营养缺陷型菌株的诱变与筛选 |
| 2.3.2 以pHH205为基础构建的E.coli-Natrinema sp.J7-2穿梭载体 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 Natrinema sp.J7-2启动子跨域启动活性现象的普遍性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 试剂、溶液及仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 大肠杆菌质粒DNA的碱裂解法提取 |
| 3.2.2 基因的扩增 |
| 3.2.3 一步提质粒 |
| 3.2.4 多克隆位点序列的构建 |
| 3.2.5 限制性内切酶的酶切反应体系 |
| 3.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.7 电泳DNA样品的回收纯化 |
| 3.2.8 末端补平 |
| 3.2.9 酶切载体后去磷酸化处理 |
| 3.2.10 DNA样品纯化 |
| 3.2.11 连接反应 |
| 3.2.12 大肠杆菌转化实验 |
| 3.2.13 嗜盐古生菌转化实验 |
| 3.2.14 转化子鉴定 |
| 3.2.15 嗜盐古生菌质粒DNA的提取 |
| 3.2.16 嗜盐古生菌基因组DNA的提取 |
| 3.2.17 氯霉素抗性实验及CAT ELISA测定 |
| 3.2.18 总蛋白的测定 |
| 3.2.19 WF146蛋白酶检测 |
| 3.2.20 α-淀粉酶检测及酶活测定 |
| 3.2.21 β-半乳糖苷酶检测及酶活测定 |
| 3.2.22 Western blot |
| 3.2.23 RNA提取 |
| 3.2.24 5'-3'RACE |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 在古生菌中检测启动子活性的载体 |
| 3.3.2 在细菌中检测启动子活性的载体 |
| 3.3.3 有跨域启动活性的古生菌启动子 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 总结 |
| 中外文参考文献 |
| 攻博期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）硫磺矿硫化叶菌Sso0660和Sso0661基因的表达与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 古菌 |
| 1.2 硫化叶菌 |
| 1.2.1 硫化叶菌的发现 |
| 1.2.2 硫化叶菌的基因组测序 |
| 1.2.3 硫化叶菌的遗传操作体系 |
| 1.3 蛋白酶及其分类 |
| 1.4 启动和执行细胞程序性死亡的蛋白酶 |
| 1.4.1 细胞程序性死亡 |
| 1.4.2 Caspases |
| 1.4.3 Caspase-like蛋白 |
| 1.4.4 古菌PCD及其相关基因 |
| 1.5 硫化叶菌蛋白酶研究进展 |
| 1.5.1 硫化叶菌中的金属蛋白酶 |
| 1.5.2 硫化叶菌中的半胱氨酸蛋白酶 |
| 1.5.3 硫化叶菌中的丝氨酸蛋白酶 |
| 1.5.4 硫化叶菌中的天冬氨酸蛋白酶 |
| 1.6 TLDD和TLDE蛋白研究进展 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 培养基配方和培养条件 |
| 2.2.1 LB(Luria-Bertani)培养基 |
| 2.2.2 硫化叶菌培养基 |
| 2.3 主要分子生物学或生化试剂 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 2.5 重组表达载体的构建 |
| 2.5.1 硫化叶菌总DNA的提取 |
| 2.5.2 引物的设计与合成 |
| 2.5.3 PCR扩增 |
| 2.5.4 T-A克隆 |
| 2.5.5 E. coli DH5α感受态的制备及酶连产物的化学转化 |
| 2.5.6 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.5.7 质粒DNA的酶切与验证 |
| 2.5.8 表达载体的构建 |
| 2.6 点突变 |
| 2.7 重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.7.1 pET原核表达载体T7强启动子的诱导表达原理 |
| 2.7.2 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.7.3 重组蛋白在硫化叶菌中的诱导表达 |
| 2.7.4 诱导表达培养物的预处理 |
| 2.7.5 用His-Gravitrap镍柱亲和层析纯化带His-tag的重组蛋白 |
| 2.7.6 透析 |
| 2.7.7 包涵体复性 |
| 2.7.8 凝胶过滤 |
| 2.8 SDS-PAGE分析与凝胶成像 |
| 2.8.1 分离胶的灌制 |
| 2.8.2 浓缩胶的灌制 |
| 2.8.3 样品制备和上样 |
| 2.8.4 电泳、考染、脱色 |
| 2.8.5 银染、脱色 |
| 2.9 抗体制备 |
| 2.10 WESTERN BLOTTING |
| 2.10.1 Western blotting的原理 |
| 2.10.2 Western blotting的具体操作步骤 |
| 2.11 酶联免疫吸附测定(ELISA) |
| 2.11.1 酶联免疫吸附测定的原理 |
| 2.11.2 间接法ELISA的具体操作步骤 |
| 2.12 质谱分析 |
| 2.13 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.14 重组蛋白酶的活力测定 |
| 2.14.1 以FITC-BSA为底物的蛋白酶酶活测定 |
| 2.14.2 以azocasein为底物的蛋白酶酶活测定 |
| 2.14.3 蛋白酶活力染色法 |
| 2.14.4 相对酶活的计算方法 |
| 2.14.5 温度和pH值对酶活力的影响 |
| 2.14.6 金属离子对蛋白酶酶活的影响 |
| 2.14.7 蛋白酶抑制剂对蛋白酶酶活的影响 |
| 2.14.8 caspase活性分析 |
| 2.15 锌含量的测定 |
| 2.16 流式细胞分析和显微照相 |
| 2.17 共表达/共纯化分析蛋白复合物 |
| 2.17.1 共表达/共纯化及其原理 |
| 2.17.2 共表达/共纯化的具体操作步骤 |
| 2.18 免疫共沉淀分析蛋白质之间的相互作用 |
| 2.18.1 免疫共沉淀及其原理 |
| 2.18.2 免疫共沉淀具体操作步骤 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Sso0660和Sso0661蛋白的序列分析和功能预测 |
| 3.1.1 Sso0660和Sso0661蛋白同属TldD超家族 |
| 3.1.2 预测Sso0660和Sso0661均为胞内蛋白 |
| 3.1.3 古菌与细菌TldD和TldE蛋白的多序列比对 |
| 3.1.4 泉古菌中TldD蛋白的多序列比对 |
| 3.1.5 TldD蛋白与真核生物DPPⅢ的多序列比对 |
| 3.2 Sso0660和Sso0661相关超表达基因工程菌株的构建 |
| 3.2.1 Sso0660和Sso0661基因的PCR扩增 |
| 3.2.2 Sso0660同源与异源超表达菌株的构建 |
| 3.2.3 Sso0661同源与异源超表达菌株的构建 |
| 3.2.4 Sso0660各突变的同源与异源超表达菌株的构建 |
| 3.2.5 Sso0660与Sso0661共表达同源超表达菌株的构建 |
| 3.3 Sso660和Sso0661蛋白的超表达、性质与功能分析 |
| 3.3.1 Sso0661异源超表达以包涵体为主 |
| 3.3.2 Sso0661同源超表达产物为可溶的单体形式 |
| 3.3.3 Sso0660的同源超表达与纯化 |
| 3.3.4 Sso0660异源超表达以包涵体为主 |
| 3.3.5 鼠抗重组Sso0660和鼠抗重组Sso0661抗体的制备 |
| 3.3.6 异源超表达Sso0660蛋白酶的二聚体化与切割成熟 |
| 3.3.7 异源超表达重组Sso0660为36聚体 |
| 3.3.8 重组Sso0660为高温中性蛋白酶 |
| 3.3.9 重组Sso0661蛋白展现微弱的蛋白水解活性 |
| 3.3.10 重组Sso0661蛋白酶不分解牛胰岛素B链 |
| 3.3.11 重组Sso0661蛋白酶为高温中性蛋白酶 |
| 3.3.12 重组Sso0660和Sso0661均展现金属蛋白酶活性 |
| 3.3.13 Sso0660同源超表达菌株出现生长受阻的表型 |
| 3.3.14 Sso0660的切割成熟与硫化叶菌胞内caspase活性增高相关 |
| 3.3.15 重组Sso0660蛋白酶展现caspase-8-like活性 |
| 3.3.16 重组Sso0661蛋白酶展现caspase-8-like的免疫活性 |
| 3.3.17 流式细胞分析Sso0660同源超表达菌株的PCD特征 |
| 3.3.18 共表达/共纯化证实Sso0660和Sso0661形成复合物 |
| 3.3.19 Co-IP证实Sso0660和Sso0661形成蛋白复合物 |
| 3.3.20 金属离子对重组Sso0660和Sso0661蛋白酶的影响 |
| 3.3.21 C_(416)参与Sso0660链间二硫键的形成 |
| 3.3.22 D278E改变Sso0660蛋白酶的切割与激活 |
| 3.3.23 "HExxxH"和"DDEG"模序与Sso0660的锌结合相关 |
| 4 讨论与展望 |
| 4.1 SSO0660和SSO0661可能参与反螺旋酶活性的调节 |
| 4.2 SSO0660的切割与激活机制 |
| 4.3 TLDD超家族与古菌的程序性死亡调控 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 文中所用引物 |
| 附录2 测序比对结果 |
| 博士期间学术成果 |
| 致谢 |
（8）OsDCL3b基因沉默对稻穗生长发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 Dicer/Dicer-like蛋白基因的研究概况 |
| 1.1.1 Dicer/Dicer-like蛋白基因的结构特点 |
| 1.1.2 Dicer/Dicer-like蛋白基因的功能 |
| 1.1.3 植物中Dicer-like蛋白基因的研究概况 |
| 1.2 水稻中Dicer-like蛋白基因的研究进展 |
| 1.2.1 水稻中Dicer-like蛋白基因的数量与分布 |
| 1.2.2 水稻中Dicer-like蛋白基因的功能研究 |
| 1.3 RNA干扰技术在基因功能研究中的应用 |
| 1.3.1 基因功能研究的基本方法 |
| 1.3.2 RNA干扰技术的基本原理 |
| 1.3.3 RNA干扰技术在基因功能研究中的应用 |
| 1.4 本研究的主要内容、目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器及材料 |
| 2.1.1 实验主要用酶和试剂 |
| 2.1.2 实验主要仪器和器械 |
| 2.1.3 实验用主要载体和菌株 |
| 2.1.4 实验植物材料 |
| 2.1.5 实验所需培养基的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 籼稻93-11幼穗总RNA的提取 |
| 2.2.2 干涉目的片段的RT-PCR扩增 |
| 2.2.3 转基因沉默载体的构建 |
| 2.2.4 基因沉默载体的遗传转化 |
| 2.2.5 转基因T_0代阳性植株的鉴定 |
| 2.2.6 转基因T_2代阳性纯合植株的获得 |
| 2.2.7 荧光定量PCR分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 干涉目的片段的RT-PCR扩增 |
| 3.2 OsDCL3b基因沉默载体构建与转化 |
| 3.3 转基因T_0代阳性植株的鉴定 |
| 3.4 转基因T_2代阳性纯合植株幼穗中OsDCL3b的表达 |
| 3.5 转基因T_2代阳性纯合植株成熟期的表型分析 |
| 3.6 T_2代突变株与野生型水稻幼穗中小RNA的比较分析 |
| 3.6.1 18-36 nt小RNA的数量分布比较 |
| 3.6.2 突变体与对照幼穗中共有和特有小RNA的比较 |
| 3.6.3 突变体与对照幼穗中所测小RNA在染色体上的分布 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 小分子RNA在生物体中的调控作用 |
| 4.2 植物中DCL类型与功能的多样性 |
| 4.3 DCL蛋白基因在植株不同组织部位的差异表达 |
| 4.4 植物中phased small RNA的加工生成 |
| 4.5 OsDCL3b基因的趋同进化及其功能 |
| 附 缩略词表 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的成果 |
（10）嗜热微生物热稳定与热适应机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 嗜热微生物概述 |
| 1.2 研究嗜热微生物的意义 |
| 1.3 嗜热微生物嗜热机制的研究进展 |
| 1.3.1 细胞结构层次上的研究 |
| 1.3.2 基因组(DNA)水平上的热适应机制的研究 |
| 1.3.3 转录组(RNA)水平上热适应机制的研究 |
| 1.3.4 蛋白质水平上的热适应机制的研究 |
| 1.4 本论文的研究目的及意义 |
| 1.5 本论文的组织结构 |
| 第二章 蛋白质的热稳定与嗜热微生物热适应的关系 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 数据收集 |
| 2.2.2 同源蛋白的识别及分组 |
| 2.2.3 蛋白质特性参数的计算 |
| 2.2.4 同源蛋白功能及COG注释 |
| 2.2.5 统计HT-only组同源蛋白的fold结构 |
| 2.2.6 统计HT-only组同源蛋白的辅因子 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 526个古细菌和真细菌中同源蛋白的识别 |
| 2.3.2 HT-only组的功能分析及三组同源蛋白的COG组成 |
| 2.3.3 氨基酸组成与蛋白质特性参数的分析 |
| 2.3.4 HT-only组同源蛋白fold结构及辅因子的使用 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 氨基酸的热稳定性与嗜热微生物热适应的关系 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 数据收集 |
| 3.2.2 数据处理 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
四、超嗜热菌中逆促旋酶的研究进展（论文参考文献）
- [1]极端微生物及其应用研究进展[J]. 庄滢潭,刘芮存,陈雨露,杨岑玥,余岩,王涛,王友亮,宋亚军,滕越. 中国科学:生命科学, 2022(02)
- [2]新型GyrB/ParE抑制剂和LpxC抑制剂的设计合成与生物活性评价[D]. 代瑞阳. 西南交通大学, 2017(10)
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- [9]一个新的古菌类群——奇古菌门（Thaumarchaeota）[J]. 张丽梅,贺纪正. 微生物学报, 2012(04)
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