一、应用序列培养系统培养鼠囊胚的效果观察（论文文献综述）
朱纯宇[1]（2021）在《甘草素对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤影响的研究》文中认为随着国内外对哺乳动物体外受精及胚胎体外发育研究的日益深入,动物生物技术也开始备受关注。体外胚胎培养非常重要,然而,在体外胚胎生产与体内相比更加困难。在体外胚胎生产过程中,容易受到各种因素影响并产生过量的活性氧（ROS）,破坏ROS平衡,从而使胚胎发生氧化损伤,氧化损伤影响胚胎发育,最终导致胚胎凋亡。氧化损伤是影响胚胎体外发育的关键因素,因此减少胚胎体外发育中的氧化损伤对研究胚胎体外发育机制和动物胚胎工程具有重大意义。改善和优化体外培养体系将会有效促进体外优质胚胎的生产,同时可以更好地贡献于胚胎生物工程技术和人类疾病动物模型上的应用。本论文旨在探究抗氧化剂甘草素（Liquiritigenin,LQ）对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤的影响,从抗氧化角度,阐明中药LQ在哺乳动物早期胚胎体外培养上的潜在机制,并为进一步开发和利用提供理论依据和研究思路。本试验设计四个试验组,即对照组（KSOM）、LQ处理组（LQ+KSOM）、H2O2处理组（H2O2+KSOM）、H2O2+LQ处理组（H2O2+LQ+KSOM）,利用0、10、20、30、40、50μmol/L的甘草素处理昆明小白鼠的早期胚胎,比较不同试验组2-细胞率、4-细胞率和囊胚率,筛选出最适甘草素的浓度。收集上述四个试验组昆明小白鼠囊胚,利用DCFH-DA检测小鼠囊胚内ROS水平,利用CMF2HC检测小鼠囊胚内GSH水平,利用JC-1荧光染色法检测小鼠囊胚线粒体膜电位水平,最后对抗氧化酶相关基因（SOD1、CAT、GPx-1）、凋亡相关基因（BCL-2、Bax、Fas、Fas L、Caspase-3）、全能性相关基因（Oct-4）进行q RT-PCR反应,检测m RNA表达水平,以此来进一步评价LQ对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤的影响。试验结果如下:1、20μmol/L的LQ处理组2-细胞发育率、4-细胞发育率、囊胚发育率（P<0.05）均高于其他浓度组,因此在小鼠体外胚胎培养的最适浓度为20μmol/L。2、H2O2处理组的ROS水平显着高于对照组（P<0.05）,极显着高于LQ处理组（P<0.01）,但添加LQ以后,LQ降低了H2O2诱导的小鼠囊胚内ROS水平,与对照组水平相似。3、H2O2处理组的GSH水平显着低于对照组（P<0.05）,极显着低于LQ处理组（P<0.01）,但添加LQ以后,LQ升高了H2O2诱导的小鼠囊胚内GSH水平,与对照组水平相似。4、H2O2+LQ处理组比H2O2处理组显着增加线粒体膜电位（P<0.05）,并抑制其凋亡。5、添加LQ可以上调抗氧化酶相关基因SOD1、CAT、GP1的m RNA转录表达水平,增强抗氧化作用。6、添加LQ可以上调抗凋亡基因BCL-2的表达水平,下调促凋亡相关基因Bax、Fas、Fas L、Caspase-3的表达水平,减少胚胎凋亡。7、添加LQ可以提高全能性基因Oct-4的m RNA表达水平,促进胚胎发育。综上所述,在体外培养小鼠胚胎过程中添加20μmo L/L的LQ,有效降低了H2O2诱导的氧化损伤小鼠胚胎的ROS水平、提高了GSH水平和线粒体膜电位水平。从分子角度,LQ调节了抗氧化酶相关基因、凋亡相关基因和全能性相关基因,从而有效缓解了H2O2诱导的小鼠胚胎的氧化损伤,对小鼠体外优质胚胎生产具有一定促进作用。
刘默凝[2]（2021）在《乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立》文中指出多能干细胞（Pluripotent stem cells,PSCs）在成年个体中具有向所有细胞类型分化的潜力,具有无限的自我更新能力。哺乳动物多能干细胞通常被分为三种类型:胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）、诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）和成体多能干细胞。诱导并建立乌骨绵羊iPSCs可为摸索绵羊ESCs体外培养条件奠定科学基础。在家畜中,只有猪获得了不依赖外源基因的iPSCs,牛、山羊、绵羊暂未见相关报道,对于家畜iPSCs的诱导还需进一步深入探索。本实验首先建立乌骨绵羊体细胞耳成纤维细胞系,使用不同转录因子体系对乌骨绵羊体细胞进行重编程,尝试获得具有强发育潜能或者定向发育潜能的绵羊iPSCs。随后对获得的乌骨绵羊iPSCs从细胞形态、核型、内源性多能基因表达、体内外三胚层分化能力以及发育潜能等方面进行研究,结果如下:（1）本实验通过组织块培养法从出生后15日龄的乌骨绵羊耳部皮肤成功分离雌、雄性两个乌骨绵羊成纤维细胞系,获得的细胞系核型正常（2n=54）、生长曲线符合正常细胞生长规律（S型）、无支原体污染,可作为诱导乌骨绵羊iPSCs的起始细胞系。（2）以piggyBac+Tet-on载体为基础设计并构建PB-TRE-sLargeT（SV40 Large T）、PB-TRE-hTERT和PB-TRE-sLhT（sLargeT和hTERT）三个表达载体,并通过电转染的方法整合至乌骨绵羊成纤维细胞基因组,在添加1.0μg/m L Doxycycline的条件下成功表达相应外源基因,证明三个载体可用于后续乌骨绵羊iPSCs的诱导。（3）X8（b OSMK+pNhL+sLhT）诱导体系、B9-LT（b OSMK+pNhL+hRL+sLargeT）诱导体系和10a（b OSMK+pNhL+hRL+sLhT）诱导体系均可诱导雄性乌骨绵羊成体细胞重编程,并且SV40 Large T可提高piggyBac+TET-on载体诱导的乌骨绵羊iPSCs重编程效率;本实验共建立了344个细胞克隆形态类似小鼠或人PSCs的乌骨绵羊iPSCs细胞系,其中X8诱导体系121个、B9-LT诱导体系134个、10a诱导体系89个;由X8诱导体系获得内源性OCT4激活程度最高的细胞系:X8-4,命名为:siPSC-4。（4）本实验建立的乌骨绵羊诱导多能干细胞系siPSC-4可稳定传代49代,核型正常（2n=54,31/40,77.5%）,内源性OCT4表达稳定,免疫荧光检测表达多能性基因OCT4、SOX2、NANOG和REX1,具有体外三胚层的分化能力并可在体内形成具有中、内胚层分化的畸胎瘤;此外,实验结果表明,STO饲养层细胞有助于siPSC-4内源基因OCT4的持续表达,在Feeder Free培养条件下,siPSC-4内源OCT4的表达量下降;另外小鼠和人类na（?）vePSCs的干细胞培养液2i、t2i、4i、5i以及小鼠拓展多功能干细胞（Expanded potential pluripotent stem cells,EPSCs）培养液不能维持siPSC-4的正常生长,最终细胞全部凋亡;（5）本实验建立的siPSC-4可参与小鼠和绵羊早期胚胎的发育,在15%（3/20）小鼠囊胚内细胞团（Inner cell mass,ICM）、26%（6/24）绵羊囊胚ICM中可检测到td-tomato标记的siPSC-4细胞;本研究首次使用piggyBac+TET-on转座系统表达外源转录因子（bovine OCT4、SOX2、KLF4、c MYC,porcine NANOG,human LIN28,SV40 Large T和human TERT）将雄性乌骨绵羊成体细胞重编程为诱导多能干细胞。获得表达多能基因、具备体外三胚层分化能力的乌骨绵羊iPSCs,为进一步研究绵羊全能胚胎干细胞的建系提供了优良的实验材料。
段乳侠[3]（2021）在《小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞上皮间质转化的研究》文中提出研究背景微囊泡（Microvesicles,MV）是细胞释放的直径100-1000 nm的脂质双分子膜性囊泡,它们选择性地包装源细胞的多种生物活性物质,如脂质、细胞因子、趋化因子、生长因子、特异性及非特异性蛋白、DNA、m RNA、microRNA、lnc RNA、circ RNA等[1],介导细胞间信号的传递。近来研究表明,囊胚能够分泌微囊泡且作用于受体细胞,改变受体细胞功能和行为[2]。在哺乳动物中,妊娠的建立需要通过胚胎发出怀孕识别信号,然后胚胎植入和胎盘形成[3]。胚胎植入是囊胚与母体子宫内膜相互“对话”的结果,囊胚在原癌基因、粘附分子等的调控下有序侵袭母体子宫内膜,在此过程中,子宫内膜在各种细胞因子、雌激素、孕激素和粘附因子组成的网络系统的精确调控下,产生对胚胎的容受性[4]。在此期间,子宫内膜上皮细胞发生了明显的形态和结构变化,以适应胚胎的着床。其主要特征是上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）,即上皮细胞首先失去极性和细胞间黏附,然后获得侵袭和迁移能力,最终转化为间充质表型[4]。细胞间的交流传统上认为是通过直接细胞间接触或通过细胞分泌的信号分子传递信息进行。近来研究显示,MV在细胞间转移也是一种重要细胞通讯方式[5],且微囊泡的信使功能主要依赖来源细胞的表型[6]。因此,我们推测,囊胚微囊泡参与囊胚与子宫内膜细胞对话,且与子宫内膜上皮-间质转化可能存在一定联系。因此,本课题采用孕3.5天BABL/C小鼠囊胚和子宫内膜原代细胞为材料,建立囊胚微囊泡与子宫内膜上皮细胞的共培养体系,分析植入前囊胚MV对子宫内膜上皮细胞上皮-间质转化的影响。验证囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞向间质细胞转化的可能性,为胚胎植入过程中MV通讯提供依据。研究目的1.建立一种小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的优化方法。2.验证小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞上皮-间质转化的现象和可能机制。研究方法1.用不同的酶和不同纯化方法处理子宫内膜组织得到子宫内膜上皮细胞,用形态学观察、细胞免疫荧光法和流式细胞术鉴定子宫内膜上皮细胞特征性蛋白Cytokeratin-8的表达,以检测细胞纯度,建立一种小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的优化方法。2.取孕3.5天BABL/C孕鼠子宫,收集囊胚,经超高速离心结合密度梯度离心分离纯化MV,透射电子显微镜观察其形态,纳米颗粒跟踪仪测定其尺寸分布,WB分析其特征性蛋白Tsg101与CD63的表达。建立囊胚MV与子宫内膜上皮细胞（mEEC）共培养模型,ECIS实时监测120 h内子宫内膜上皮细胞侵袭力的动态变化。取12 h、36 h、48 h、60 h、84 h、120 h作为时间节点,将植入前囊胚MV与mEE细胞共培养组与mEE细胞对照组的电阻值进行比较分析。q PCR分析MV miRNA组成,通过对这些miRNA及其靶基因的生物信息学分析,预测了可能对受体细胞侵袭有促进作用的miRNA和和诱导EMT的可能机制。3.以PKH26对囊胚MV染色示踪,建立植入前囊胚MV与mEE细胞的共培养体系,分别设置0 h、48 h、96 h组别。采用激光共聚焦显微镜检测植入前囊胚MV进入mEE细胞的过程。通过Western-blot实验和细胞免疫组化实验检测mEE细胞对E-cadherin、Vimentin蛋白的表达。并采用Image J软件进行细胞表达E-cadherin、Vimentin蛋白相对量化分析。研究结果1.两种方法中,上皮细胞分离后成团,贴壁较慢,将5×105个细胞接种于24孔板中,24 h后,细胞可长至80%爬片,使用胰蛋白酶消化均不可传代培养。形态学及上皮细胞特异性抗体Cytokeratin-8鉴定为上皮细胞。流式细胞仪鉴定Dispase Ⅱ与胰酶消化后差速贴壁纯化（方法A）所提上皮细胞纯度为80%,胶原酶I与DNase消化后过筛纯化（方法B）所提上皮细胞纯度为60%,方法A可简单、高效地培养出原代上皮细胞,且具备上皮细胞生物学特性,是一种良好的小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的方法。2.孕3.5天囊胚处理后通过超高速离心结合密度梯度离心分离出一种直径主要约在200 nm的球形微囊泡,并表达微囊泡特征蛋白Tsg101和CD63。ECIS结果显示mEE细胞与小鼠囊胚MV共培养至12 h、24 h、36 h其侵袭力与mEE细胞对照组相比较无明显差异（P>0.05）,当培养至48 h、60 h时,实验组mEE细胞的侵袭力明显高于对照组细胞（P<0.05）,当培养至84 h、120 h时,实验组mEE细胞的侵袭力极显着高于对照组细胞（P<0.01）。PCR结果显示植入前囊胚MV中有224个与侵袭相关的miRNA,占总侵袭相关miRNA的近一半,80个miRNA可以促进侵袭。尽管抑制侵袭的miRNA在数量上占优势,但一些促进侵袭的miRNA在MV中已经有了高水平的表达,如miR-346、miR-21。提示小鼠囊胚MV诱导上皮细胞EMT可能是MV携带miRNA-21靶向PTEN激活PI3K/AKT通路调控的。3.植入前囊胚MV与mEE细胞共培养0 h,mEE细胞内没有PKH26标记的MV,共培养96 h,有大量的MV聚集在mEE细胞的胞质内及细胞核周边。且相比于共培养0 h,共培养96 h的mEE细胞对PKH26标记的MV的摄取率显着升高（P<0.01）。与此同时,E-caderhin蛋白在mEE细胞中表达显着下调（P<0.05,P<0.01）,Vimentin蛋白在mEE细胞中表达显着上调（P<0.05,P<0.01）。结论1.采用Dispase Ⅱ酶和胰蛋白酶共同消化子宫组织再经差速贴壁纯化获得子宫内膜上皮细胞原代的培养方法可简单、高效地培养出原代上皮细胞,是一种良好的小鼠子宫内膜上皮细胞原代分离和纯化的优化方法。2.植入前囊胚MV与mEE细胞共培养体系确定了植入前囊胚MV是能够促进mEE细胞侵袭能力的,且能够影响mEE细胞E-caderhin蛋白、Vimentin蛋白的表达。基于小鼠囊胚MV含有的miRNA种类以及特性,此结果提示mEE细胞侵袭性增强进而向间质细胞转化的可能性是与小鼠囊胚携带着miRNA-21靶向PTEN激活PI3K/AKT通路调控的。
贺霞[4]（2020）在《小分子化合物组合重编程小鼠胚胎成纤维细胞为胚外内胚层样细胞》文中提出利用小分子化合物已成功实现了体细胞向诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）的转变,经证实在该过程中产生了一种不可缺少的中间阶段细胞,即化学诱导胚外内胚层样细胞（chemical induced extraembryonic endoderm-like,ciXEN）,它们在基因表达模式和分化潜能上与胚胎源性胚外内胚层细胞（embryo-derived extraembryonic endoderm,eXEN）极为相似。但是ciXEN细胞的其它生物学特性和小分子化合物对ciXEN细胞体外维持培养的影响还尚未有系统性报道。本研究以小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEFs）为起始细胞,利用小分子化合物组合,获得无外源基因整合的ciXEN细胞;通过基因组测序、qPCR分析、免疫荧光、悬滴培养和代谢模式分析等验证ciXEN细胞的生物学特性;此外,通过去除培养液中的小分子化合物和bFGF验证其对ciXEN细胞体外维持培养的影响。1.利用小分子化合物组合重编程MEFs获得ciXEN细胞不同数量起始细胞经小分子化合物组合的持续处理,发现细胞逐渐聚集成团并最终形成边缘清晰的克隆;对细胞克隆进行计数时发现以4×104个MEFs进行重编程时获得的细胞克隆数最多,基质胶能将克隆形成率提高31.47±3.86倍,且这些细胞克隆呈Sox17和Foxa2双阳性。挑取的细胞克隆重新贴壁后,从其中能长出大量上皮样细胞。小分子化合物组合消除了成纤维细胞相关基因表达而获得了胚外内胚层细胞基因表达谱,同时该过程伴随着间质上皮转化。ciXEN细胞产生过程中胚外内胚层标记物、上皮相关基因、Sox2和Cxcr4表达量增加,而间质标记基因和成纤维细胞相关基因的表达水平下降,且E-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平与其mRNA表达水平相一致。此外,该小分子化合物组合作用于小鼠新生成纤维细胞（mouse neonatal fibroblasts,MNFs）后,细胞聚集形成了排列松散的克隆,并证实3×104个MNFs是最适起始细胞密度;另外这些MNFs源性克隆亦呈Sox17和Foxa2双阳性。这些结果表明该小分子化合物组合能实现MEFs向ciXEN细胞的重编程,也适用于MNFs向ciXEN细胞重编程。2.ciXEN细胞生物学特性鉴定对细胞克隆中长出的上皮样细胞进行体外传代扩增,取第5代ciXEN细胞进行后续实验。形态学上,低密度时ciXEN细胞呈强折光性短梭形而高密度时ciXEN细胞则成上皮样。ciXEN细胞表面有微绒毛,其内部超微结构异于MEFs。对第5代ciXEN细胞的基因表达进行分析,发现ciXEN细胞的胚外内胚层标记基因、上皮标记基因、Sox2和Cxcr4的表达水平明显高于MEFs而成纤维细胞标记基因和间质基因的mRNA水平则显着低于MEFs,但不表达Nanog和Oct4。且ciXEN细胞中E-cadherin、Gata4、Foxa2、Sox17、Sox2和vimentin表达呈阳性而Oct4和Nanog表达呈阴性,这与western blot结果相一致。ciXEN细胞具有强增殖能力,能体外扩增至少30代并维持细胞核型稳定,低代次和高代次ciXEN细胞的形态保持不变。在基因表达上,它们维持着胚外内胚层标记物、上皮相关标记基因和Sox2的高水平表达,而不表达多潜能相关基因和成纤维细胞标记物。此外,ciXEN细胞不仅能体外经诱导分化为脏壁内胚层,还能自发分化为外胚层和内胚层源性细胞,尤其是能分化成功能性肝细胞。对ciXEN细胞的转录组进行深入分析时,发现ciXEN细胞的产生过程涉及细胞结构和功能的重塑,同时还伴随着能量代谢的重塑。然而经系列代谢相关分析发现ciXEN细胞不依赖糖酵解供能,且在小分子化合物组合重编程过程中添加促进糖酵解的PS48并未增加细胞克隆形成率。上述结果表明ciXEN细胞尚未达到多潜能阶段且保留一定间质记忆,具有高度增殖能力和向脏壁内胚层和功能性肝细胞分化的可塑性;此外ciXEN细胞的产生过程伴随着能量代谢的重塑,但细胞的代谢模式并未转变成糖酵解。3.研究小分子化合物和bFGF对ciXEN细胞体外培养的影响去除ciXEN细胞维持培养液中的小分子化合物和bFGF后,细胞形态呈圆形上皮样,且诱导胚外内胚层样（induced extraembryonic endoderm-like cells,iXEN）细胞仍维持胚外内胚层基因和上皮基因的高表达而不表达间质基因和成纤维细胞基因,这与免疫荧光结果和western blot结果达成一致。此外,去除小分子化合物和bFGF后培养的iXEN细胞仍能向功能性肝细胞分化。这些结果表明小分子化合物和bFGF不是ciXEN细胞体外维持培养所必不可少的成分。
程蕊[5]（2020）在《基于“嫉妒不孕”理论探讨心理应激对小鼠卵母细胞氧化应激水平及早期胚胎发育的影响》文中进行了进一步梳理目的（1）通过观察不同程度心理应激刺激下雌性小鼠体重、旷场试验及糖水偏好试验,证实心理应激小鼠模型制备成功,促排卵收集卵母细胞,检测卵母细胞内活性氧（ROS）浓度、超氧化物歧化酶2（SOD2）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）m RNA水平,以研究不同程度心理应激对小鼠卵母细胞氧化应激水平的影响;（2）小鼠体内受精,收集受精卵进行体外培养,通过检测不同程度心理应激刺激后小鼠早期胚胎2细胞率、8细胞率、囊胚形成率、囊胚孵出率、囊胚分级,以及囊胚凋亡程度,以研究不同程度心理应激对小鼠早期胚胎发育的影响。基于心理应激与中医肝郁理论的紧密联系,为临床从肝郁-心理应激角度治疗女性生殖功能下降提供新思路。方法实验一心理应激对小鼠卵母细胞氧化应激水平的研究选取4～5周龄健康雌性未孕的ICR小鼠80只,随机分为4组,即正常组,心理应激强、中、弱刺激组,每组20只。正常组不给予任何干预,实验组按照心理应激模型制备方法,给予不同程度且不可预知性刺激,连续刺激6周。刺激前后分别记录各组小鼠的体重;刺激后各组小鼠在旷场中随机5分钟内小鼠的静止时间、运动时间、运动总距离、中央活动时间、外周活动时间的变化;以及刺激后各组小鼠的糖水偏好指数,以证实心理应激小鼠模型制备成功。造模成功后,对小鼠促排卵获取卵母细胞,采用化学荧光法测定小鼠卵母细胞内ROS浓度,应用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法测定卵母细胞内SOD2、CAT、GSH-Px三种抗氧化酶m RNA水平,以研究不同程度心理应激对小鼠卵母细胞氧化应激水平的影响。实验二心理应激对小鼠早期胚胎发育的研究根据实验一心理应激小鼠造模成功后,进行体内受精,次日晨检阴栓后收集并处理受精卵,显微镜下观察各组小鼠的受精卵数、2细胞胚胎数、8细胞胚胎数、囊胚数及形态评分,记录各组小鼠早期胚胎2细胞率、8细胞率、囊胚形成率、囊胚孵出率、囊胚分级,采用原位脱氧核苷酸末端转移酶介导的d UTP缺口末端标记法（TUNEL）测定各组小鼠囊胚的凋亡程度,以研究不同程度心理应激对小鼠早期胚胎发育的影响。结果所有实验数据均采用SPSS24.0统计软件进行分析。定量资料以均数±标准差（<sub>x±s）表示,方差齐时组间比较采用单因素方差分析（one-way anova）,组间两两比较采用LSD检验,方差不齐时组间比较采用Welch’s anova,组间两两比较采用Games-Howell检验。等级资料组间比较及组间两两比较采用Kruskal-Wallis H检验。P<0.05为差异有统计学意义。实验一1.刺激前后各组小鼠体重的比较刺激前,4组小鼠体重比较,差异无统计学意义（P>0.05）;刺激6周后,心理应激强、中、弱刺激组小鼠体重均低于正常组,差异有统计学意义（P<0.05）;中、弱刺激组小鼠体重高于强刺激组,差异有统计学意义（P<0.05）。2.刺激6周后各组小鼠旷场试验结果的比较刺激6周后,心理应激强、中、弱刺激组小鼠的静止时间和外周活动时间均高于正常组,差异有统计学意义（P<0.05）;中、弱刺激组小鼠的静止时间低于强刺激组,差异有统计学意义（P<0.05）;刺激6周后,心理应激强、中、弱刺激组小鼠的运动时间、中央活动时间和运动总距离均低于正常组,差异有统计学意义（P<0.05）;中、弱刺激组小鼠的运动时间和运动总距离高于强刺激组,差异有统计学意义（P<0.05）;中刺激组小鼠的中央活动时间高于强刺激组,差异有统计学意义（P<0.05）。3.刺激6周后各组小鼠糖水偏好指数的比较刺激6周后,心理应激强、中、弱刺激组小鼠的糖水偏好指数均低于正常组,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.各组小鼠卵母细胞内ROS浓度的比较心理应激强、中、弱刺激组小鼠卵母细胞内ROS浓度均高于正常组,差异具有统计学意义（P<0.05）;且随着刺激强度的增加,小鼠卵母细胞内ROS浓度升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。5.各组小鼠卵母细胞内SOD2、CAT、GSH-Px表达水平的比较心理应激强、中、弱刺激组小鼠卵母细胞内SOD2、CAT、GSH-Px表达水平均低于正常组,差异有统计学意义（P<0.05）;且随着刺激强度的增加,小鼠卵母细胞内SOD2、CAT、GSH-Px表达水平降低,差异均有统计学意义（P<0.05）。实验二1.各组小鼠早期胚胎发育的比较4组小鼠的2细胞率、8细胞率和囊胚形成率比较,差异有统计学意义（P<0.05）。两两比较显示,心理应激强刺激组小鼠的2细胞率低于正常组,强、中刺激组小鼠的8细胞率、囊胚形成率均低于正常组,差异均有统计学意义（P<0.05）;中、弱刺激组小鼠的2细胞率、8细胞率、囊胚形成率均高于强刺激组,差异有统计学意义（P<0.05）;4组小鼠的囊胚孵出率比较,差异无统计学意义（P>0.05）。2.各组小鼠囊胚分级结果的比较4组小鼠的囊胚分级比较,差异有统计学意义（P<0.05）。正常组、心理应激强、中刺激组小鼠的囊胚均以4级为主,弱刺激组小鼠的囊胚以2级和4级为主。两两比较显示,强、中刺激组小鼠的囊胚分级与正常组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。3.各组小鼠囊胚凋亡程度的比较心理应激强、中、弱刺激组小鼠的囊胚凋亡荧光强度均高于正常组,差异有统计学意义（P<0.05）;且随着刺激强度的增加,小鼠的囊胚凋亡荧光强度增强,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论1.心理应激导致小鼠卵母细胞内ROS水平升高,引发卵母细胞内氧化应激反应,损伤卵母细胞的抗氧化系统,降低卵母细胞内SOD2、CAT、GSH-Px三种抗氧化酶的含量,从而损害卵母细胞功能。2.心理应激导致小鼠早期胚胎发育能力减退,降低小鼠早期胚胎2细胞率、8细胞率及囊胚形成率,影响各级囊胚占比,进而影响囊胚发育进程,并增强囊胚凋亡程度,从而使胚胎质量下降。3.心理应激造成卵母细胞氧化应激损伤,降低早期胚胎发育潜能,进而导致不孕症的发生,与中医“嫉妒不孕”学说存在共通性。通过此研究为临床从肝郁-心理应激角度治疗女性不孕症提供新的思路和方法,并为中医“情志致病”理论在现代医学模式下的推广应用提供科学依据。
王旗[6]（2020）在《纳米金非侵入性介导外源基因进入小鼠早期胚胎细胞的研究》文中研究表明将特定的外源基因导入真核细胞中,并整合到受体细胞基因组中得到稳定表达的技术,称为基因导入,它是改变生物遗传性状的根本途径。目前,显微注射是目前使用较为广泛的基本技术,它的优势是基因导入效果相对稳定,成功率也比较高。但是,实现这些优点需要熟练的技术人员和拥有昂贵的实验仪器。同时,在显微镜下通过精细的操作来避免卵母细胞的损伤和精确的控制DNA注射量来确保卵母细胞的安全都是有相当困难的,并且只能够一个接一个的进行注射,处理样品的数量有限。因此,传统的将外源基因物质转入胚胎细胞的方法已不能满足当前研究的要求,特别是利用CRISPR/Cas9进行基因编辑和RNA干扰进行基因沉默等技术的进步,也迫切的需要一种新的方法来取代传统的技术方法。本研究使用聚乙烯亚胺（PEI）包裹的金纳米粒子（AuNPs）负载质粒DNA成功的构建出了一种行之有效的基因载体系统,在尽量减轻胚胎细胞所受伤害的同时降低了技术难度。本研究将小鼠受精卵在含有AuNPs@PEI@DNA载体复合物（APD）的KSOM培养基中培养,培养至囊胚形成后植入假孕母鼠体内,从而获得转基因后代。通过荧光观察,证实了GFP在早期胚胎细胞中的表达,并且通过分析基因分型、免疫荧光检测和DNA测序鉴定等实验数据,证明GFP序列确实整合到了后代个体的染色体中并得到表达。此外,TUNEL试验和囊胚细胞分化分析表明APD对小鼠早期胚胎发育具有良好的安全性。这些结果表明,AuNPs基因载体作为传统显微注射的替代技术,无需昂贵的仪器设备和熟练的技术人员,就可以简单有效地将外源基因物质导入小鼠早期胚胎细胞中,将极大地促进生命科学各个方面的研究。
杨硕[7]（2020）在《TP、ALC和NAC组合处理对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤的保护作用》文中提出在体外胚胎培养环节,易产生过量的活性氧,过多的活性氧会使细胞发生氧化应激,引发细胞损伤和细胞凋亡,最终导致细胞死亡。本研究验证三种抗氧化剂茶多酚（TP）、乙酰左旋肉碱（ALC）和N-乙酰-L半胱氨酸（NAC）组合使用,是否通过Keap1-Nrf2通路,调节下游基因表达,对H2O2诱导的小鼠体外胚胎产生抗氧化作用,并抑制细胞凋亡。将TP（5μM）、ALC（10 μM）和NAC（10 μM）最适浓度组合添加到培养液,实验分为四组:对照组,抗氧化剂组,H2O2处理组,H2O2+抗氧化剂处理组。首先通过对上述四组的胚胎相关指标（如2-细胞发育率、4-细胞发育率和囊胚发育率）的观测,来验证TP、ALC和NAC三种抗氧化剂组合使用对胚胎早期发育的影响。收集四组昆明小鼠囊胚,利用DCFHDA测定上述四组小鼠胚胎囊胚期ROS水平,利用CMF2HC对上述四组小鼠胚胎囊胚期GSH表达进行测定。然后利用Western-Blot手段对小鼠囊胚期胚胎Keap1-Nrf2通路中相关蛋白Keap1及Nrf2的表达进行测定,及利用RT-qPCR对Keap1-Nrf2通路下游基因SOD1,GPX1,CAT的表达进行测定。之后利用JC-1法对囊胚期胚胎的线粒体膜电位进行测定,用TUNEL法对细胞凋亡进行检测。并且对细胞凋亡相关基因Bcl-2,Bax,Caspase-3及全能性基因OCT-4的表达进行测定。得到如下结果:（1）对于TP、ALC和NAC组合添加对氧化损伤小鼠胚胎早期发育的影响,各处理组之间卵裂率、四细胞率无显着差异,H2O2处理组的囊胚率显着低于对照组（P<0.05）,在培养基中添加组合抗氧化剂之后,恢复到对照组相似的水平。（2）H2O2处理组的ROS水平显着高于单独添加抗氧化剂组（P<0.05）,GSH水平显着低于单独添加抗氧化剂组（P<0.05）,处理组ROS水平显着低于其他组（P<0.05）,GSH水平显着高于其他组（P<0.05）,H2O2+抗氧化剂处理组的ROS和GSH的表达量恢复至对照组的水平。（3）TP、ALC和NAC对胚胎氧化损伤的保护作用是通过激活Keap1-Nrf2通路来产生的,经H2O2诱导的小鼠胚胎在培养基中添加组合抗氧化剂之后,细胞浆内的Keap1及Nrf2和细胞核内Nrf2的蛋白表达水平恢复至对照组的水平,下游基因SOD1,GPX1,CAT的表达同样显示出相似的趋势。（4）添加组合抗氧化剂组相比于H2O2处理组的囊胚显着增加了线粒体膜电位极性（P<0.05）,降低细胞内凋亡指数（P<0.05）,恢复至对照组的水平。（5）添加组合抗氧化剂之后,囊胚中的胚胎多能性相关基因OCT4的mRNA转录水平显着升高（P<0.05）,抗凋亡基因Bcl-2的转录上调,促凋亡基因Bax,Caspase-3的转录下调。以上结果表明,在培养基中组合添加三种抗氧化剂（TP、ALC、NAC）,会通过Keap1-Nrf2通路,调节小鼠囊胚期胚胎下游基因表达,对小鼠体外胚胎产生抗氧化作用,并抑制凋亡。
贺一博[8]（2020）在《黄芪总黄酮对氧化损伤小鼠胚胎凋亡相关基因表达的影响》文中研究说明黄芪是一种已经用了两千多年的中药,可以增强机体的免疫能力、抗衰老、抗应激、保肝、利尿、有较广泛的抗菌作用。而黄芪总黄酮（TFA）则是黄芪的主要成分。在之前的研究中已经知道黄芪总黄酮可以清除人体内的自由基、保护心脑血管、抗癌、抗菌的作用并且降低小鼠早期胚胎内的ROS水平。本实验在之前的研究上继续研究TFA在细胞和基因层面上对昆明小鼠早期胚胎体外发育的影响,TFA对体外培养小鼠囊胚的ROS水平、GSH（谷胱甘肽）水平、和对细胞凋亡相关基因的表达的影响。本试验采取了之前研究中TFA的最适浓度为75 mg/L,将实验分为三组对照组（C组）、H2O2处理组（H组）、H2O2+最适浓度TFA组（TH组）。进行了囊胚形态比较,三组发育率的比较,通过DCFH-DA荧光染色测定三组小鼠囊胚的ROS水平、GSH水平、线粒体膜电位水平（JC-1）,利用RTq-PCR测定Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2、FAS、FASL、Cy-c 基因的表达量。结果显示:1、在TFA对胚胎的发育率的影响中,TH组与C组在2细胞与4细胞时期的发育率没有明显差异而显着高于H组（p<0.05）,而在囊胚期TH组显着低于C组（p<0.05）且显着高于H组（p<0.05）;2、在TFA对胚胎ROS水平的影响中,TH组与C组无显着差异且显着低于H 组（p<0.05）;3、在TFA对胚胎GSH水平的影响中,TH组与C组无显着差异且显着高于H 组（p<0.05）;4、在TFA对胚胎JC-1水平的影响中,TH组显着高于H组且显着低于C组（p<0.05）;5、在TFA对小鼠囊胚相关抗氧化酶基因的影响中,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表达量TH组与C组无显着差异且显着低于H组（p<0.01）,Bcl-2/Bax基因的表达量TH组显着低于H组且显着高于C组（p<0.01）,Cy-c的基因表达量TH组与C组无显着差异且显着低于H组（p<0.01）,FAS/FASL基因的表达量TH组与C组无显着差异且显着低于H组（p<0.01）。综上述结果显示,黄芪总黄酮可以降低氧化损伤小鼠早期胚胎的ROS的水平而增高了 GSH和线粒体膜电位的水平,在基因层面调节了凋亡相关基因的表达。从而保护了胚胎细胞,降低了氧化损伤。
邵红莲[9]（2020）在《小鼠植入后胚胎体外延时培养体系的建立以及应用》文中进行了进一步梳理小鼠作为研究哺乳动物胚胎早期发育的模型,已有40多年的历史,它是目前研究最广泛和透彻的模式动物。哺乳动物着床前后的很多重要事件在小鼠上做了深入研究,而植入后胚胎发育的相关机制一直是近年来国内外学者的关注热点。通过建立小鼠胚胎体外延时培养体系,可以使我们更深入的研究小鼠植入后胚胎发育的相关机制,也可以作为其他哺乳动物胚胎体外培养体系的建立以及优化提供参考依据。然而,EPS细胞的产生为哺乳动物多能干细胞的研究提供一个新的思路,为生物技术和再生医学的转化研究提供了一个独特的细胞平台。该论文结合小鼠胚胎体外培养体系的建立,制备EPS细胞与小鼠早期胚胎嵌合体,通过体外延时培养技术,研究了人鼠嵌合体的发育情况,通过小鼠胚胎胚层marker OCT4,GATA6和CDX2鉴定与EPS细胞共表达。揭示了EPS细胞在小鼠早期胚胎发育过程中也能维持良好的细胞干性,并通过单细胞RNA-seq测序及生物信息分析技术对嵌合的EPS细胞进行t-SNE分析得出EPS细胞在转录组水平接近小鼠正常细胞的转录组表达情况,与免疫荧光结果一致,EPS细胞在小鼠胚胎内三胚层均有嵌合,揭示了干细胞在异种嵌合中的潜在应用前景。
孙洪政[10]（2019）在《MAT2A/MAT2B在小鼠卵母细胞成熟及早期胚胎发育中的功能研究》文中提出哺乳动物卵母细胞成熟及早期胚胎发育受众多信号通路以及转录因子的调控。卵母细胞的成熟需要经过两次减数分裂过程,在减数分裂过程中,MAPK信号通路参与了调控纺锤体的组装和染色体的正常排列。受精后的胚胎即进入着床前发育阶段,该阶段包括两个关键过程,一个是合子基因组激活,该过程是由母源调控向胚胎调控转换的关键时期。早期胚胎发育的另一个重要过程是桑椹胚-囊胚转换,该过程会出现内细胞团以及滋养层的分化。转录因子以及表观修饰因子在这两个过程中发挥着重要作用。发现关键调控因子在卵母细胞成熟或早期胚胎发育中所发挥的作用是揭示发育过程复杂性和系统性的基础。甲硫氨酸腺苷转移酶II（MATII）是哺乳动物体内进行甲硫氨酸代谢的关键复合物,它是由催化亚基α以及调控亚基β组成。其中,α亚基是由MAT2A基因编码而成;β亚基是由MAT2B基因编码而成。该复合物通过催化甲硫氨酸形成S-腺苷甲硫氨酸（SAM）进而与机体转甲基代谢通路紧密相关,同时SAM也是生物体内甲基基团的最主要来源。MAT2A和MAT2B蛋白广泛分布于生物体的多种细胞类型中,参与了体内众多DNA与组蛋白甲基化修饰。本研究通过筛选及功能分析,对MAT2A及MAT2B基因在小鼠卵母细胞及早期胚胎发育中的表达模式进行研究,并且对MAT2B基因在小鼠卵母细胞成熟过程中的功能进行了研究,同时对MAT2A基因在小鼠早期胚胎发育中的功能以及与组蛋白甲基化修饰的关联进行了相关研究,研究结果如下:（1）通过定量及免疫荧光染色实验,确定了MAT2A和MAT2B基因在小鼠卵母细胞及着床前胚胎发育过程中的表达模式。结果显示MAT2B基因在卵母细胞GV期及MII期显着高表达,并且MAT2B蛋白在GV期呈现明显的核定位。MAT2A基因在MII期、1-细胞期至桑椹胚阶段均呈现高表达模式,在囊胚期其mRNA水平开始降低,免疫荧光染色分析MAT2A蛋白从2-细胞期呈现明显的核定位,这与其参与基因的转录调控相一致。（2）通过干扰片段显微注射实验,研究沉默MAT2B基因对小鼠卵母细胞减数分裂过程的影响。结果发现,干扰MAT2B基因后小鼠卵母细胞的成熟率显着降低,MI期阻滞率显着升高。沉默MAT2B会显着抑制ERK1/2的磷酸化,影响MAPK通路的正常功能。进一步研究发现,MAT2B蛋白通过与GIT1相互作用促进ERK1/2的磷酸化,进而调控下游蛋白发挥功能。同时,MAT2B基因的敲降会影响纺锤体的正常组装以及染色体的正常排列,同时敲降MAT2B后会影响Fgf8,Cdc2和Gdf9等母源mRNA的正常降解,导致这些母源mRNA异常高表达。（3）通过干扰片段显微注射实验,研究沉默MAT2A基因对小鼠合子基因组激活的影响。结果发现,干扰MAT2A基因后小鼠早期胚胎发育阻滞在2-细胞期,即合子基因组激活期。并且沉默MAT2A基因后会导致2-细胞胚胎整体转录水平降低、DNA损伤以及合子基因的表达异常。MAT2A基因沉默导致的2-细胞期阻滞可以通过显微注射MAT2A mRNA进行部分挽救并可发育至囊胚期。（4）通过添加MAT2A蛋白催化功能抑制剂以及甲硫氨酸饥饿培养,研究MAT2A蛋白的催化功能在小鼠桑椹胚向囊胚转换过程中的作用。结果发现,添加抑制剂或者甲硫氨酸饥饿培养均会显着降低囊胚率,使小鼠早期胚胎发育阻滞于桑椹胚期。通过沉默MAT2A基因并同时注射催化位点突变型MAT2A mRNA可以得到与以上相似的结果。说明MAT2A蛋白的催化功能对于桑椹胚-囊胚转换过程至关重要。进一步研究发现,添加抑制剂培养或者甲硫氨酸饥饿培养会导致小鼠胚胎桑椹胚期的H3K4me3水平降低,说明MAT2A蛋白催化甲硫氨酸形成SAM的过程对于小鼠桑椹胚期正常表观基因组的建立以及向囊胚期的发育至关重要。综上所述,本论文研究了甲硫氨酸代谢关键复合物MATII的亚基β和α,其编码基因MAT2B和MAT2A分别在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的功能。证明了MAT2B通过调控MAPK信号通路影响小鼠卵母细胞减数分裂成熟,干扰MAT2B基因会导致小鼠卵母细胞异常阻滞于MI/AI期;另一方面研究了MAT2A对于小鼠合子基因组激活的影响以及MAT2A催化功能对于桑椹胚-囊胚转换过程的影响,验证了MAT2A作为转录因子参与合子基因组激活的调控,同时MAT2A作为一种酶参与调控甲硫氨酸代谢过程并影响桑椹胚期表观基因组建立及向囊胚期的发育。
二、应用序列培养系统培养鼠囊胚的效果观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用序列培养系统培养鼠囊胚的效果观察（论文提纲范文）
（1）甘草素对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 甘草素概述 |
| 1.2 活性氧对动物生殖细胞的影响 |
| 1.3 早期胚胎体外培养及发育 |
| 1.4 胚胎抗氧化酶基因 |
| 1.5 胚胎凋亡基因 |
| 1.6 胚胎全能性基因 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验试剂与仪器 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 试验设计 |
| 2.5 试验方法 |
| 2.6 统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 不同浓度甘草素对体外培养小鼠早期胚胎发育的影响 |
| 3.2 甘草素对氧化损伤小鼠早期胚胎体外发育的影响 |
| 3.3 甘草素对氧化损伤小鼠囊胚内ROS水平的影响 |
| 3.4 甘草素对氧化损伤小鼠囊胚内GSH水平的影响 |
| 3.5 甘草素对氧化损伤小鼠囊胚内线粒体膜电位的影响 |
| 3.6 甘草素对氧化损伤小鼠囊胚中抗氧化基因表达的影响 |
| 3.7 甘草素对氧化损伤小鼠囊胚中凋亡基因表达的影响 |
| 3.8 甘草素对氧化损伤小鼠囊胚中全能性基因表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 甘草素提高氧化损伤小鼠早期胚胎发育率 |
| 4.2 甘草素降低氧化损伤小鼠囊胚内ROS水平 |
| 4.3 甘草素提高氧化损伤小鼠囊胚内GSH水平 |
| 4.4 甘草素增强氧化损伤小鼠囊胚内线粒体膜电位水平 |
| 4.5 甘草素提高氧化损伤小鼠囊胚抗氧化酶基因的表达 |
| 4.6 甘草素降低氧化损伤小鼠囊胚凋亡基因的表达 |
| 4.7 甘草素提高氧化损伤小鼠囊胚全能性基因的表达 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A (作者简介) |
| 附录B (在研期间发表的论文) |
（2）乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 乌骨羊 |
| 1.2 多能干细胞的概述 |
| 1.2.1 多能干细胞的起源 |
| 1.2.2 在体外获取不同多能状态的干细胞 |
| 1.3 家畜胚胎干细胞的研究进展 |
| 1.3.1 牛、猪、绵羊胚胎干细胞的研究进展 |
| 1.3.2 Wnt信号通路是维持家畜多能干细胞的关键信号 |
| 1.4 家畜诱导多能干细胞的研究进展 |
| 1.4.1 家畜PSCs重编程的方法 |
| 1.4.2 牛诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.4.3 山羊及绵羊诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.5 多能干细胞在家畜物种中的应用 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 乌骨绵羊成纤维细胞的分离及饲养层细胞的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器及耗材 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 细胞培养液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 乌骨绵羊成纤维细胞系的建立 |
| 2.2.2 STO feeder的制备 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 乌骨绵羊耳成纤维细胞的原代培养 |
| 2.3.2 乌骨绵羊耳成纤维细胞的传代 |
| 2.3.3 乌骨绵羊耳成纤维细胞的生长曲线 |
| 2.3.4 乌骨绵羊成纤维细胞支原体检测结果 |
| 2.3.5 乌骨绵羊成纤维细胞染色体分析结果 |
| 2.3.6 乌骨绵羊耳成纤维细胞的复苏效果 |
| 2.3.7 STO细胞解冻后的状态 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表达载体的构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验仪器及耗材 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 质粒PB-TRE-hRL、pBABE-hygro-hTERT、pSG5 LargeT simian virus的转化与提取 |
| 3.2.2 线性载体的制备 |
| 3.2.3 目的基因的获得 |
| 3.2.4 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表达载体的构建与鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT表达载体质粒图谱 |
| 3.3.2 质粒PB-TRE-hRL酶切结果 |
| 3.3.3 sLargeT和 hTERT基因RT-PCR扩增产物电泳结果 |
| 3.3.4 PB-TRE-sLhT载体构建中间基因RT-PCR扩增产物电泳结果 |
| 3.3.5 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT测序结果 |
| 3.3.6 PB-TRE-sLargeT、PB-TRE-hTERT和 PB-TRE-sLhT电转染成纤维细胞结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器及耗材 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.1.4 质粒 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 电转染 |
| 4.2.2 乌骨绵羊iPSCs的传代及冻存 |
| 4.2.3 乌骨绵羊iPSCs内源基因表达情况的检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 不同诱导体系的iPSCs细胞系建系率 |
| 4.3.2 不同诱导体系获得的iPSCs克隆形态的比较 |
| 4.3.3 不同诱导体系诱导初期iPSCs细胞克隆的形态变化 |
| 4.3.4 不同诱导体系获得的iPSCs细胞系内源基因激活情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 乌骨绵羊iPSCs发育潜能的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验仪器及耗材 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 主要试剂的配制 |
| 5.1.5 质粒 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 siPSC-4和siPSC-6 外源转基因检测 |
| 5.2.2 碱性磷酸酶染色 |
| 5.2.3 免疫组织化学检测 |
| 5.2.4 拟胚体体外分化 |
| 5.2.5 畸胎瘤体内分化 |
| 5.2.6 siPSC-4减DOX培养测试 |
| 5.2.7 siPSC-4 异种嵌合能力检测 |
| 5.2.8 siPSC-4 同种嵌合能力检测 |
| 5.2.9 转录组文库构建、测序及分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 siPSC-4和siPSC-6 细胞干细胞特性分析 |
| 5.3.2 经典培养液中siPSC-4 细胞形态及内源基因的表达 |
| 5.3.3 无饲养层细胞条件下培养siPSC-4 内源基因表达检测 |
| 5.3.4 siPSC-4 细胞嵌合体发育潜能分析 |
| 5.3.5 RNA测序结果分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞上皮间质转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写一览表 |
| 第一章 文献综述 细胞外微囊泡(MV)对上皮间质转化调控作用的研究进展 |
| 1.1 微囊泡(MV) |
| 1.2 上皮间质转化(EMT) |
| 1.3 微囊泡在病理过程EMT中的作用 |
| 1.3.1 MV与肿瘤中EMT的关系 |
| 1.3.2 MV与肾病中EMT的关系 |
| 1.3.3 MV与肝病中EMT的关系 |
| 1.4 微囊泡在EMT中的作用机制 |
| 1.4.1 MV诱导EMT的发生 |
| 1.4.2 MV抑制EMT的发生 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 小鼠子宫内膜上皮细胞分离、纯化方法优化及鉴定 |
| 3.1 材料、试剂和仪器 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 mEE细胞原代培养及纯化 |
| 3.2.2 细胞免疫荧光法 |
| 3.2.3 流式细胞术法 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 小鼠子宫大体图 |
| 3.3.2 Dispase II与胰酶消化后差速贴壁纯化的细胞 |
| 3.3.3 胶原酶I与 DNase消化后过细胞筛纯化的细胞 |
| 3.3.4 细胞免疫荧光法检测Cytokeratin-8 表达 |
| 3.3.5 流式细胞术检测Cytokeratin-8 表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞的侵袭性 |
| 4.1 材料、试剂及仪器 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 超排卵与提取囊胚 |
| 4.2.2 囊胚MV制备 |
| 4.2.3 囊胚MV鉴定 |
| 4.2.4 mEE细胞的培养 |
| 4.2.5 小鼠囊胚MV与子宫内膜上皮细胞(mEEC)的共培养 |
| 4.2.6 细胞动态分析仪分析mEE侵袭力的变化 |
| 4.2.7 qPCR法分析囊胚MV促进侵袭性的miRNA |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 植入前囊胚形态 |
| 4.3.2 鉴定植入前囊胚MV的形态、大小及其特征蛋白 |
| 4.3.3 细胞动态分析仪实时监测mEE侵袭力的变化 |
| 4.3.4 植入前囊胚微囊泡中miRNAs情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 小鼠囊胚微囊泡对子宫内膜上皮细胞E-cadherin、Vimentin表达的影响 |
| 5.1 材料、试剂和仪器 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 超排卵与提取囊胚 |
| 5.2.1.1 BABL/C小鼠超数排卵、合笼、检栓 |
| 5.2.1.2 提取囊胚 |
| 5.2.2 囊胚的MV制备 |
| 5.2.3 小鼠囊胚MV与子宫内膜上皮细胞(mEEC)的共培养 |
| 5.2.4 mEE细胞的培养 |
| 5.2.5 激光共聚焦观察囊胚MV进入mEE细胞的过程 |
| 5.2.6 Western-blot分析mEE细胞表达E-caderhin 蛋白、Vimentin 蛋白水平 |
| 5.2.7 ICC法分析mEE细胞表达E-caderhin 蛋白、Vimentin 蛋白水平 |
| 5.2.8 Image J分析免疫组化光密度值 |
| 5.2.9 Image J分析westen-blot条带灰度值 |
| 5.2.10 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 植入前囊胚MV进入mEE细胞过程 |
| 5.3.2 植入前囊胚MV下调mEE细胞表达E-caderhin蛋白水平 |
| 5.3.3 植入前囊胚MV上调mEE细胞表达Vimentin蛋白水平 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
（4）小分子化合物组合重编程小鼠胚胎成纤维细胞为胚外内胚层样细胞（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1篇 文献综述 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 胚外内胚层细胞研究概况 |
| 2.1 ELSCs的定义及种类 |
| 2.2 XEN细胞的生物学特性 |
| 2.3 XEN细胞的培养条件 |
| 2.4 XEN细胞的来源 |
| 2.5 XEN细胞与CR间的联系 |
| 2.6 XEN细胞的应用 |
| 第3章 XEN样细胞在CR中的研究进展 |
| 3.1 体细胞重编程的研究概况 |
| 3.2 CR过程中的XEN样细胞 |
| 3.3 CR过程中MET的作用 |
| 3.4 化学重编程产生ciXEN细胞时小分子化合物的选择 |
| 3.5 ciXEN细胞研究存在的问题 |
| 第4章 CR过程中代谢重塑的研究现状 |
| 4.1 代谢的定义、分类及意义 |
| 4.2 CR过程中的代谢变化 |
| 4.3 XEN细胞的代谢特点 |
| 第4章 问题与展望 |
| 第2篇 实验研究 |
| 第1章 利用小分子化合物组合重编程产生ciXEN细胞 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第2章 ciXEN细胞生物学特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 去除小分子化合物后iXEN细胞生物学特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于“嫉妒不孕”理论探讨心理应激对小鼠卵母细胞氧化应激水平及早期胚胎发育的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 技术路线图(一) |
| 技术路线图(二) |
| 实验一 心理应激对小鼠卵母细胞氧化应激水平的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验操作 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 实验二 心理应激对小鼠早期胚胎发育的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验操作 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 心理应激与女性自然生育力及辅助生殖技术结局的研究进展 |
| 1 心理应激与女性自然生育力的相关性 |
| 2 心理应激与辅助生殖技术的相关性 |
| 3 心理应激对女性生殖内分泌的影响机制 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）纳米金非侵入性介导外源基因进入小鼠早期胚胎细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 综述 |
| 1.1 基因导入的概念 |
| 1.2 基因导入的技术方法 |
| 1.2.1 物理方法 |
| 1.2.2 生物学方法 |
| 1.2.3 化学方法 |
| 1.3 基因载体 |
| 1.3.1 有机纳米粒子载体 |
| 1.3.2 无机纳米粒子载体 |
| 1.4 基因载体导入的路径 |
| 1.4.1 载体与DNA复合 |
| 1.4.2 载体穿过细胞膜 |
| 1.4.3 载体逃离内涵体 |
| 1.4.4 载体入核 |
| 1.5 本研究的选题思路及研究意义 |
| 第2章 纳米金基因载体的构建及性能分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 AuNPs-PEI的制备 |
| 2.2.3 AuNPs-PEI的表征 |
| 2.2.4 APD的制备 |
| 2.2.5 AuNPs-PEI负载性能的分析 |
| 2.2.6 AuNPs-PEI的细胞毒性 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 AuNPs-PEI的表征 |
| 2.3.2 AuNPs-PEI的负载能力及稳定性分析 |
| 2.3.3 AuNPs-PEI的细胞毒性 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 基因载体介导外源基因导入小鼠早期胚胎细胞 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 以APD介导GFP质粒进行体外转染实验 |
| 3.2.3 以两种分子量PEI构建的APD进行体外转染实验 |
| 3.2.4 以免疫荧光检测鉴定GFP的表达 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 体外转染后GFP的表达情况 |
| 3.3.2 两种分子量PEI构建的APD载体效果分析 |
| 3.3.3 GFP免疫荧光检测的结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 纳米金基因载体对小鼠早期胚胎发育和后代生长的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验方法 |
| 4.2.2 TUNEL染色法检测小鼠胚胎细胞的凋亡 |
| 4.2.3 免疫荧光技术检测小鼠胚胎细胞中Oct4和Cdx2 的表达 |
| 4.2.4 小鼠胚胎移植 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 TUNEL检测结果 |
| 4.3.2 Oct4和Cdx2 免疫荧光检测结果 |
| 4.3.3 胚胎移植获得子代小鼠 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 鉴定胚胎移植子代小鼠染色体中的GFP |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验方法 |
| 5.2.2 基因分型验证子代小鼠染色体中的GFP |
| 5.2.3 质粒DNA的测序 |
| 5.2.4 以免疫荧光检测子代小鼠脾脏中的GFP表达 |
| 5.2.5 使用γH2AX抗体检测小鼠胚胎细胞中的DNA双链断裂 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 基因分型的结果 |
| 5.3.2 基因测序结果 |
| 5.3.3 脾脏的免疫荧光检测结果 |
| 5.3.4 γH2AX抗体检测胚胎细胞DNA双链断裂情况 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在校期间公开发表论文及着作情况 |
（7）TP、ALC和NAC组合处理对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 茶多酚(Tea Polyphenols)概述 |
| 1.2 乙酰左旋肉碱概述 |
| 1.3 N-乙酰半胱氨酸(NAC)概述 |
| 1.4 Keap1-Nrf2-ARE信号通路 |
| 1.5 抗氧化反应的氧化还原信号模型 |
| 1.6 凋亡通路及研究进展 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验时间及地点 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 实验主要药品 |
| 2.1.4 实验试剂的配置 |
| 2.1.5 实验主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠的超数排卵 |
| 2.2.2 胚胎的收集 |
| 2.2.3 胚胎的培养 |
| 2.2.4 ROS水平的测定 |
| 2.2.5 GSH水平的测定 |
| 2.2.6 JC-1水平测定 |
| 2.2.7 TUNEL检测 |
| 2.2.8 RT-qPCR反应 |
| 2.2.9 Western-blot检测 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 TP、ALC和NAC组合处理对氧化损伤小鼠胚胎早期发育的影响 |
| 3.2 TP、ALC和NAC组合处理对氧化损伤小鼠胚胎内ROS水平及GSH水平的影响 |
| 3.3 TP、ALC和NAC组合处理对氧化损伤小鼠胚胎Keap1-Nrf2通路的检测 |
| 3.4 TP、ALC和NAC组合处理对氧化损伤小鼠胚胎Keap1-Nrf2通路下游抗氧化酶基因mRNA表达的测定 |
| 3.5 TP、ALC和NAC组合处理对氧化损伤小鼠胚胎内JC-1水平的影响 |
| 3.6 TP、ALC和NAC组合处理对氧化损伤小鼠胚胎凋亡指数的影响 |
| 3.7 TP、ALC和NAC组合处理对氧化损伤小鼠胚胎凋亡相关基因mRNA表达的测定 |
| 3.8 TP、ALC和NAC组合处理对氧化损伤小鼠胚胎全能性相关基因mRNA表达的测定 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 TP、ALC和NAC组合处理提高早期胚胎发育率 |
| 4.2 TP、ALC和NAC组合处理减少胚胎内氧化应激水平 |
| 4.3 TP、ALC和NAC组合处理调节Keap1-NRF2-ARE信号通路 |
| 4.4 TP、ALC和NAC组合处理提高胚胎内线粒体膜电位水平 |
| 4.5 TP、ALC和NAC组合处理影响细胞内凋亡水平 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）黄芪总黄酮对氧化损伤小鼠胚胎凋亡相关基因表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 黄芪总黄酮 |
| 1.2 早期胚胎体外培养 |
| 1.3 细胞凋亡 |
| 1.4 细胞凋亡基因 |
| 1.4.1 半胱天冬酶 |
| 1.4.2 B淋巴细胞瘤-2基因 |
| 1.4.3. 细胞色素c |
| 1.4.4 Fas/FasL |
| 1.5 ROS |
| 1.6 谷胱甘肽 |
| 1.7 JC-1 |
| 1.8 研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验时间和地点 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 实验主要仪器、药品 |
| 2.3.1 实验主要仪器 |
| 2.3.2 实验主要药品 |
| 2.4 实验试剂的配置 |
| 2.4.1 孕马血清促性腺激素(PMSG)的配置 |
| 2.4.2 人绒毛膜促性腺激素(hCG)的配置 |
| 2.4.3 0.1%透明质酸酶的配置 |
| 2.4.4 25 μmol/L过氧化氢(H_2O_2)溶液的配置 |
| 2.4.5 75mg/LTFA黄芪总黄酮(TFA)工作液的配置 |
| 2.4.6 M2缓冲液的配置 |
| 2.4.7 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)的配置 |
| 2.4.8 4-氯甲基-6,8-二氟-7-羟基香豆素(CMF2HC)的配制 |
| 2.4.9 JC-1工作液的配制 |
| 2.4.10 固相RNase清除剂工作液的配置 |
| 2.4.11 70%乙醇的配置 |
| 2.4.12 Buffer RPE工作液的配置 |
| 2.4.13 引物稀释 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 小鼠超数排卵处理 |
| 2.5.2 小鼠胚胎的收集和培养 |
| 2.5.3 小鼠胚胎氧化损伤模型的建立 |
| 2.5.4 实验分组 |
| 2.5.5 ROS水平的检测 |
| 2.5.6 GSH水平的检测 |
| 2.5.7 JC-1水平的检测 |
| 2.5.8 总RNA提取 |
| 2.5.9 反转录 |
| 2.5.10 RTq-PCR |
| 2.6 统计方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 TFA对小鼠胚胎体外发育的影响 |
| 3.1.1 囊胚形态的比较 |
| 3.1.2 早期胚胎发育率的比较 |
| 3.2 TFA对氧化损伤小鼠囊胚ROS水平的影响 |
| 3.3 TFA对氧化损伤小鼠囊胚GSH水平的影响 |
| 3.4 TFA对氧化损伤小鼠囊胚线粒体膜电位的影响 |
| 3.5 TFA对氧损伤小鼠囊胚Caspase基因表达的影响 |
| 3.5.1 TFA对氧损伤小鼠囊胚Caspase-3基因表达的影响 |
| 3.5.2 TFA对氧损伤小鼠囊胚Caspase-8基因表达的影响 |
| 3.5.3 TFA对氧损伤小鼠囊胚Caspase-9基因表达的影响 |
| 3.6 TFA对氧损伤小鼠囊胚Cyt-c基因表达的影响 |
| 3.7 TFA对氧损伤小鼠囊胚Fas/FasL基因表达的影响 |
| 3.7.1 TFA对氧损伤小鼠囊胚Fas基因表达的影响 |
| 3.7.2 TFA对氧损伤小鼠囊胚FasL基因表达的影响 |
| 3.7.3 TFA对氧损伤小鼠囊胚Fas/FasL基因表达的影响 |
| 3.8 TFA对氧损伤小鼠囊胚Bcl-2/Bax基因表达的影响 |
| 3.8.1 TFA对氧损伤小鼠囊胚Bcl-2基因表达的影响 |
| 3.8.2 TFA对氧损伤小鼠囊胚Bax基因表达的影响 |
| 3.8.3 TFA对氧损伤小鼠囊胚Bcl-2/Bax基因表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）小鼠植入后胚胎体外延时培养体系的建立以及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 小鼠植入后胚胎体外延时培养的建立与优化 |
| 1.1 绪论 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 实验所用的设备和耗材 |
| 1.2.2 实验所用试剂 |
| 1.2.3 实验用到的溶液及培养基的配制 |
| 1.2.4 实验动物 |
| 1.3 小鼠胚胎的获取以及培养方法 |
| 1.3.1 超数排卵 |
| 1.3.2 ICR小鼠胚胎的获取(取2细胞) |
| 1.3.3 去除囊胚透明带 |
| 1.3.4 植入后胚胎的体外延时培养 |
| 1.3.4.1 2D体外延时培养 |
| 1.3.4.2 3D体外延时培养(Ibi Treat-μ-slide-8-well腔室载玻片) |
| 1.3.5 胚胎的回收以及免疫荧光染色鉴定 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 小鼠植入后胚胎2D培养体系 |
| 1.4.2 小鼠植入后胚胎3D培养体系的建立 |
| 1.4.3 小鼠植入后胚胎3D培养体系的优化 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 胚胎干细胞的背景简介与EPS的培养 |
| 2.1 绪论 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验所用的设备和耗材 |
| 2.2.2 实验所用试剂和药品 |
| 2.2.3 实验用到的溶液及培养基的配制 |
| 2.3 EPS的培养方法及干性检测 |
| 2.3.1 细胞计数 |
| 2.3.2 小鼠成纤维细胞培养(MEF) |
| 2.3.2.1 复苏 |
| 2.3.2.2 传代 |
| 2.3.2.3 细胞污染的判断 |
| 2.3.2.4 MEF污染的检测方法 |
| 2.3.2.5 冻存 |
| 2.3.3 利用小鼠成纤维细胞制作饲养层细胞 |
| 2.3.4 EPS的复苏 |
| 2.3.5 EPS的传代 |
| 2.3.6 EPS细胞支原体检测 |
| 2.3.7 EPS细胞的冻存 |
| 2.3.8 EPS干性的免疫荧光检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 小鼠成纤维细胞(MEF)的培养结果 |
| 2.4.2 EPS的培养回收细胞免疫荧光检测图 |
| 2.4.3 支原体检测结果 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 小鼠胚胎和EPS嵌合体的制备 |
| 3.1 绪论 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验所用的设备和耗材 |
| 3.2.2 实验所用试剂 |
| 3.2.3 操作液的制备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠胚胎的准备(早期桑葚胚,early morula) |
| 3.3.2 EPS消化成单细胞的制备 |
| 3.3.3 Mouse-EPS嵌合体的制备 |
| 3.3.3.1 注射针和持卵针的制备 |
| 3.3.3.2 显微操作仪以及相关仪器的开启 |
| 3.3.3.3 注射针和持卵针的安装 |
| 3.3.3.4 嵌合体的注射 |
| 3.3.4 囊胚和E6.5胚胎的回收以及免疫荧光检测方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Mouse-EPS注射前嵌合时期以及注射细胞数的探讨 |
| 3.4.1.1 Mouse-H9-EPS注射前嵌合时期以及注射细胞数的探讨 |
| 3.4.1.2 Mouse-JB-EPS注射前嵌合时期以及注射细胞数的探讨 |
| 3.4.2 Mouse-EPS嵌合体植入后体外延时培养至E6.5 的免疫荧光检测EPS细胞在体内的嵌合情况分析 |
| 3.4.2.1 Mouse-H9-EPS在小鼠胚胎体内的嵌合情况分析 |
| 3.4.2.2 Mouse-JB-EPS在小鼠胚胎体内的嵌合情况分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 单细胞的获得和样品处理 |
| 4.1 绪论 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验所用的设备和耗材 |
| 4.2.2 实验试剂与药品 |
| 4.2.3 实验用到溶液的配制 |
| 4.3 单细胞的获取及处理方法 |
| 4.3.1 单细胞的收取 |
| 4.3.2 单细胞的处理 |
| 4.3.3 cDNA纯化 |
| 4.3.4 单细胞的建库 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 单细胞的收取情况 |
| 4.4.2 单细胞数据处理结果 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 生物信息分析 |
| 5.1 绪论 |
| 5.2 分析方法 |
| 5.2.1 RNA-seq数据预处理 |
| 5.2.2 数据过滤 |
| 5.2.3 降维及Marker基因筛选 |
| 5.3 分析结果 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）MAT2A/MAT2B在小鼠卵母细胞成熟及早期胚胎发育中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 综述部分 |
| 第一章 卵母细胞成熟及早期胚胎发育 |
| 1.1 卵母细胞减数分裂过程及调控机制 |
| 1.1.1 卵母细胞减数分裂过程 |
| 1.1.2 卵母细胞减数分裂调控 |
| 1.2 早期胚胎发育的合子基因组激活 |
| 1.2.1 合子基因组激活的时间 |
| 1.2.2 合子基因组激活的机制 |
| 1.2.3 母源mRNA的翻译 |
| 1.2.4 母源mRNA的清除 |
| 1.2.5 转录调控因子 |
| 1.2.6 染色质重塑 |
| 1.3 囊胚的形成和发育 |
| 1.3.1 致密化和极化的发生 |
| 1.3.2 内细胞团和滋养层的形成 |
| 1.3.3 囊胚期组蛋白修饰 |
| 第二章 MAT2A及 MAT2B的研究进展 |
| 2.1 MAT2A研究进展 |
| 2.2 MAT2B研究进展 |
| 2.3 甲硫氨酸代谢调控 |
| 2.4 甲硫氨酸代谢与DNA甲基化 |
| 2.5 早期胚胎发育的甲硫氨酸供给 |
| 2.6 研究目的和意义 |
| 试验部分 |
| 第三章 MAT2A和MAT2B在HEPG2及LO2细胞中的表达和定位 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 RNA提取 |
| 3.2.3 反转录与实时荧光定量PCR |
| 3.2.4 基因扩增与载体构建 |
| 3.2.5 细胞转染 |
| 3.2.6 细胞免疫荧光染色 |
| 3.2.7 蛋白免疫印迹检测 |
| 3.2.8 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2细胞系中的表达 |
| 3.3.2 MAT2A和MAT2B在HepG2以及LO2细胞系中的定位 |
| 3.3.3 MAT2A和MAT2B过表达影响其亚细胞分布 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 MAT2B调控小鼠卵母细胞减数分裂成熟 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 卵母细胞及受精卵的采集和培养 |
| 4.2.2 卵母细胞显微注射 |
| 4.2.3 胚胎实时荧光定量PCR |
| 4.2.4 胚胎免疫荧光染色 |
| 4.2.5 MAT2B及 GIT1 过表达载体构建 |
| 4.2.6 细胞培养 |
| 4.2.7 蛋白质免疫共沉淀 |
| 4.2.8 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MAT2B在卵母细胞期高表达 |
| 4.3.2 敲降MAT2B对卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.3 MAT2B与 GIT1 互作并激活MAPK通路 |
| 4.3.4 U0126 处理对卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.5 敲降MAT2B影响纺锤体排列和母源mRNA降解 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 MAT2A在小鼠合子基因组激活中的功能研究 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 组织RNA提取 |
| 5.2.3 小鼠卵母细胞及胚胎的采集与培养 |
| 5.2.4 mRNA反转录 |
| 5.2.5 蛋白免疫印迹检测 |
| 5.2.6 胚胎显微注射 |
| 5.2.7 胚胎免疫荧光染色 |
| 5.2.8 胚胎实时荧光定量PCR |
| 5.2.9 体外转录 |
| 5.2.10 胚胎转录活性检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 MAT2A及 MAT2B在小鼠多组织中的表达模式 |
| 5.3.2 MAT2A及 MAT2B在小鼠卵母细胞及早期胚胎中的表达模式 |
| 5.3.3 免疫荧光检测MAT2A在小鼠早期胚胎中的分布模式 |
| 5.3.4 MAT2A干扰RNA的验证 |
| 5.3.5 敲降MAT2A导致小鼠2-细胞胚胎阻滞 |
| 5.3.6 敲降MAT2A对2-细胞转录水平的影响 |
| 5.3.7 胚胎发育挽救实验 |
| 5.3.8 细胞水平敲降MAT2A后影响组蛋白甲基化修饰 |
| 5.3.9 敲降MAT2A后对2细胞胚胎组蛋白甲基化的影响 |
| 5.3.10 敲降MAT2A后导致2细胞胚胎DNA损伤 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 MAT2A在小鼠囊胚发育中的功能研究 |
| 6.1 材料和试剂 |
| 6.1.1 主要材料 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 小鼠胚胎获取 |
| 6.2.2 小鼠胚胎培养 |
| 6.2.3 胚胎免疫荧光染色 |
| 6.2.4 胚胎实时荧光定量PCR |
| 6.2.5 MAT2A催化位点突变载体构建 |
| 6.2.6 体外转录 |
| 6.2.7 胚胎显微注射 |
| 6.2.8 胚胎凋亡染色 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 环亮氨酸处理对胚胎发育的影响 |
| 6.3.2 环亮氨酸处理对组蛋白甲基化修饰的影响 |
| 6.3.3 甲硫氨酸饥饿培养对胚胎发育的影响 |
| 6.3.4 甲硫氨酸饥饿培养对组蛋白甲基化修饰的影响 |
| 6.3.5 MAT2A催化突变体对胚胎发育的影响 |
| 6.3.6 抑制MAT2A催化活性对胚胎凋亡的影响 |
| 6.3.7 抑制MAT2A催化活性对囊胚细胞数的影响 |
| 6.3.8 抑制MAT2A催化活性对囊胚基因表达的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 不足之处和进一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、应用序列培养系统培养鼠囊胚的效果观察（论文参考文献）
- [1]甘草素对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤影响的研究[D]. 朱纯宇. 延边大学, 2021
- [2]乌骨绵羊诱导多能干细胞的建立[D]. 刘默凝. 内蒙古农业大学, 2021
- [3]小鼠囊胚微囊泡诱导子宫内膜上皮细胞上皮间质转化的研究[D]. 段乳侠. 西南大学, 2021(01)
- [4]小分子化合物组合重编程小鼠胚胎成纤维细胞为胚外内胚层样细胞[D]. 贺霞. 吉林大学, 2020(01)
- [5]基于“嫉妒不孕”理论探讨心理应激对小鼠卵母细胞氧化应激水平及早期胚胎发育的影响[D]. 程蕊. 天津中医药大学, 2020(04)
- [6]纳米金非侵入性介导外源基因进入小鼠早期胚胎细胞的研究[D]. 王旗. 阜阳师范大学, 2020(12)
- [7]TP、ALC和NAC组合处理对H2O2诱导的小鼠胚胎氧化损伤的保护作用[D]. 杨硕. 延边大学, 2020(05)
- [8]黄芪总黄酮对氧化损伤小鼠胚胎凋亡相关基因表达的影响[D]. 贺一博. 延边大学, 2020(05)
- [9]小鼠植入后胚胎体外延时培养体系的建立以及应用[D]. 邵红莲. 昆明理工大学, 2020(05)
- [10]MAT2A/MAT2B在小鼠卵母细胞成熟及早期胚胎发育中的功能研究[D]. 孙洪政. 西北农林科技大学, 2019