一、组织工程技术体外重建角膜上皮层的实验研究（论文文献综述）
延亚云[1]（2021）在《基于光交联水凝胶的体外角膜再生研究》文中指出角膜盲是第二大致盲眼病,绝大多数患者可通过移植健康的供体角膜来治愈,更严重的情况下,通过植入没有生物活性的人工角膜来治疗。然而供体角膜严重短缺以及人工角膜具有并发症的风险,基于此,使用角膜组织工程技术手段构建可行的角膜替代物是很有前景的角膜盲治疗方法。选择合适的生物支架材料和种子细胞是角膜组织工程迫切需要解决的两个关键问题。本论文首先通过甲基丙烯酸酐（MA）对明胶进行改性,改善其热稳定性,制备了四种不同浓度（7%、10%、15%和30%）的甲基丙烯酸酯化明胶（GelMA）水凝胶,并对其理化、光学性质以及生物相容性进行了表征。结果表明,GelMA浓度越低,水凝胶的杨氏模量越小,亲水性和光学性能越好。同时通过MTT检测、活/死染色、细胞形态学观察实验,研究在不同浓度GelMA水凝胶上培养的大鼠骨髓间充质干细胞（rBMMSCs）的细胞粘附性、活力和增值情况。此外,通过免疫荧光染色和角膜基质细胞标志基因的表达来表征rBM-MSCs分化为角膜基质样细胞的能力,其中标志物包括Keratocan、Lumican、ALDH1A1、α-SMA。体外实验的研究结果表明,7%浓度的GelMA水凝胶更有利于rBM-MSCs的生长和增殖,然而30%GelMA水凝胶为rBM-MSCs分化为角膜基质样细胞提供了更好的动态微环境。其次,同样通过MA对透明质酸进行改性,合成甲基丙烯酸酯化透明质酸（HAMA）水凝胶。将GelMA（10%w/v）和HAMA（0.5%w/v）混合以制备GelMA/HAMA双网络（DN）水凝胶。通过机械性能、光学性能、亲水性、体外原位降解等表征实验,研究GelMA、HAMA和DN水凝胶的理化性能差异,发现DN水凝胶在可见光区域是光学透明的,拥有超越GelMA和HAMA单网络水凝胶的良好机械性能,且亲水性与人体正常角膜相似。最后,对DN水凝胶进行生物学性能测试。体外兔角膜上皮细胞（CEp Cs）培养结果显示,在DN水凝胶上培养CEp Cs增值效果明显,表明该水凝胶具有良好的细胞粘附性和优异的生物相容性。通过免疫荧光染色来表征体外培养的CEp Cs中特异性标志物角蛋白3（CK3）的表达。实验结果表明,与GelMA、HAMA单网络水凝胶相比,DN水凝胶更有利于维持CEp Cs在体外对CK3的表达。所有实验结果都表明,GelMA/HAMA DN水凝胶具有作为角膜上皮组织工程生物支架的潜力。
杨雪[2]（2020）在《血浆纤维蛋白膜负载骨髓间充质干细胞与角膜上皮细胞用于大鼠角膜碱烧伤修复的实验研究》文中提出据世界卫生组织估计,全球有490万人患有双侧角膜盲,单侧角膜盲的患病人数约为2300万人。对于严重的角膜损伤,进行角膜移植是目前最有效的治疗手段。但全世界捐赠角膜数量有限,解决这种短缺的方法之一便是使用组织工程化全部或部分厚度的角膜移植物。组织工程种子细胞来源多为干细胞,其中骨髓间充质干细胞（Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）来源广泛,使用方便,且免疫原性低,为种子细胞的首选。现阶段在角膜损伤的治疗中多使用生物相容性好的羊膜作为支架材料来负载干细胞。目前研究中已发现通过体外间接接触共培养的方式BMSCs可以向角膜上皮细胞分化,但在使用BMSCs治疗角膜损伤时,受到早期损伤部位微环境的影响,BMSCs在损伤部位很难存活;使用羊膜作为支架材料面临材料来源有限,成本较高的问题。为解决以上问题,本课题进行了以血浆纤维蛋白膜为支架负载BMSCs与角膜上皮细胞,作为组织工程角膜植片,对角膜损伤修复的实验研究。研究工作主要包括以下内容:1大鼠BMSCs及角膜上皮细胞的分离培养与鉴定采用全骨髓贴壁法提取大鼠BMSCs,体外培养贴壁生长,呈梭形,排列呈旋涡状,具有方向性;流式细胞术检测发现,所提取的大鼠BMSCs表面抗原CD90呈阳性,CD34呈阴性,与文献报道一致。采用酶消化法对大鼠角膜上皮细胞进行分离提取,细胞贴壁生长,呈多角形,免疫荧光结果显示所提取的细胞表达角膜上皮细胞的特异性蛋白CK12。2角膜上皮细胞对接触共培养BMSCs的诱导分化使用CFSE对BMSCs进行标记,然后将BMSCs与角膜上皮细胞按照1:3、1:1、3:1的比例进行7天接触共培养。然后,流式细胞术分选出BMSCs后,采用qRT-PCR检测BMSCs中角膜上皮细胞相关基因p63、CK12的mRNA水平。结果显示,原本不表达p63、CK12基因的BMSCs在与角膜上皮细胞进行接触共培养后表达这两种角膜上皮细胞相关基因,且随着共培养体系中角膜上皮细胞比例的升高,BMSCs中这两种角膜上皮细胞相关基因的表达量均上升。这一结果表明受直接接触共培养的角膜上皮细胞诱导BMSCs呈现向角膜上皮细胞分化的改变,且共培养体系中角膜上皮细胞的比例影响BMSCs的分化程度。3血浆纤维蛋白膜的制备与性能检测3.1制备通过颈静脉窦取血获得大鼠全血,离心后取上层血浆,加入Ca2+促凝后获得血浆凝胶,压缩除去凝胶内多余液体后冻干,获得血浆纤维蛋白膜。3.2扫描电镜观察膜片结构扫描电镜检测发现,血浆纤维蛋白膜片表面微孔分布较为均匀,孔径大小多分布在25～30μm,多孔结构有利于细胞附着与及营养物质的运输。3.3流变仪检测所制膜片粘弹性对冻干复水的膜片与新鲜膜片分别进行流变学检测,结果显示二者的弹性模量G’均大于粘性模量G",且冻干复水膜片的G’与G"均大于新鲜膜片。这一结果表明冻干后复水的血浆纤维蛋白膜相较新鲜膜片有着更好的粘弹性,不易发生形变,即刚度更高,负载细胞后将其用于移植治疗时操作更便利。3.4扫描电镜观察血浆纤维蛋白膜上细胞负载情况将分离培养的BMSCs和角膜上皮细胞接种于冻干复水的血浆纤维蛋白膜上,培养24h后,采用超临界干燥技术获得负载细胞的干燥膜片。对其进行扫描电镜观察,发现两种细胞均存在于膜片表面,表明所制备的血浆纤维蛋白膜片可以用做负载细胞的支架。4血浆纤维蛋白膜片负载BMSCs及角膜上皮细胞对大鼠角膜碱烧伤的治疗4.1对大鼠碱烧伤后角膜损伤愈合情况的影响利用荧光素钠染色法检测了在角膜碱烧伤3、7天时大鼠角膜上皮损伤的愈合情况。结果发现,随着损伤后天数的增加,损伤组、空白膜片组与负载细胞膜片组的大鼠角膜上皮缺损率均有不同程度的减少;在3天和7天,角膜上皮细胞的缺损率均为损伤组>空白膜片治疗组>负载细胞的膜片治疗组,且各组之间的上皮缺损率均有显着性差异（p<0.0001）。在角膜碱烧伤后第7、14天对角膜损伤部位进行了 HE染色观察,结果发现随着天数的增加,三组大鼠角膜损伤部位的上皮及基质结构都有着不同程度的恢复,其中空白膜片组与负载细胞膜片组角膜损伤部位结构恢复更好,后者角膜损伤部位结构恢复最好,在第14天时已接近正常角膜结构。这一结果表明,使用自制负载细胞膜片可以有效促进角膜损伤的愈合。4.2对大鼠碱烧伤后炎症反应的影响采用免疫荧光染色方法检测了大鼠角膜碱烧伤后7天、14天角膜组织中基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9）,金属蛋白酶组织抑制剂-1（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1,TIMP-1）,白介素-6(（Interleukin-6,IL-6）及肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）的表达。结果发现,第7天和第14天负载细胞的膜片治疗组与空白膜片治疗组角膜中,这四种炎症相关因子的表达相较于损伤组都有着不同程度的减少,负载细胞的膜片治疗组角膜中这些炎症相关因子的表达最少。这说明纤维蛋白膜片可以减轻大鼠角膜碱烧伤后炎症反应,在膜片负载细胞后对炎症的抑制效果更好。4.3对大鼠碱烧伤后角膜纤维化的影响采用免疫荧光染色方法检测了大鼠角膜碱烧伤后第7天、第14天角膜组织中平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）的表达。结果表明,第7天和第14天负载细胞的膜片治疗组与空白膜片治疗组角膜中α-SMA的表达相较于损伤组都有着明显的减少,负载细胞的膜片治疗组角膜中α-SMA的表达最少。这说明纤维蛋白膜片可以抑制大鼠角膜碱烧伤后的角膜纤维化,在膜片负载细胞后抑制角膜纤维化的作用更强。4.4负载BMSCs及角膜上皮细胞的血浆纤维蛋白膜片中BMSCs在大鼠角膜碱烧伤部位的分化与植入利用 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-1-（2-deoxy-β-D-ribofuranosyl）uracil5-Bromouracil deoxyriboside,5-BrdU）标记对 BMSCs 进行示踪以检测 BMSCs 在损伤角膜组织的植入情况。结果显示,在第7天没有在角膜损伤部位检测到BMSCs,但在第14天时在角膜损伤部位检测到有少量BMSCs,且免疫荧光染色后发现BMSCs表达CK12。这表明以血浆纤维蛋白膜支架以及负载的角膜上皮细胞组成的微环境下,BMSCs在早期修复阶段（7～21天）可以植入到损伤部位,并能够向角膜上皮细胞分化。总之,本课题将BMSCs与角膜上皮细胞装载于自制的血浆纤维蛋白膜支架上制备了组织观察细胞膜片,移植用于大鼠角膜碱烧伤时,显示出有效减轻角膜损伤部位炎症反应,抑制角膜损伤部位的纤维化程度,加快角膜伤口愈合的作用,还发现部分BMSCs成功植入大鼠角膜损伤部位并向角膜上皮细胞分化。这些结果提示,该组织工程细胞膜片值得进一步研究,或有望为角膜损伤提供新的治疗方案,为构建组织工程角膜提供新的组合方式。
覃岚凤[3]（2020）在《复合改性胶原膜及间充质干细胞用于角膜修复的研究》文中指出角膜是眼睛最外层的透明组织,容易受到损伤而进一步发展成角膜病,角膜病已成为我国的第二大类致盲性角膜疾病。目前,角膜移植术是治疗角膜盲的金标准,然而全世界角膜供体的稀缺是影响手术治疗的最大障碍,且移植术后的免疫排斥问题也不可忽视。因此,迫切需要寻找到角膜再生修复替代材料并解决术后免疫排斥问题。胶原作为天然角膜细胞外基质的主要成分,在角膜再生修复方面应用广泛。然而胶原力学性能差（不耐手术缝合）的缺点限制了其在生物医学领域的应用。纤维素纳米晶具有优异的力学性能和较好的生物相容性,将纤维素纳米晶复合到胶原中可得到具有良好力学性能和生物相容性的胶原基复合材料。间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的成体干细胞,能促进组织修复和抗免疫排斥反应,在再生医学领域受到了极大的关注,在角膜损伤治疗方面也有广泛的研究。因此,本论文拟将复合改性胶原膜及间充质干细胞用于角膜损伤后的再生修复。本研究以牛跟腱I型胶原作为基础材料,通过向胶原溶液中加入不同质量的纤维素纳米晶的水分散液得到不同质量比的胶原基纤维素纳米晶复合膜,其质量比分别为0wt%,1 wt%,3 wt%,5 wt%,7 wt%和10 wt%。对不同质量比的胶原基纤维素纳米晶复合膜进行理化性能和体外细胞实验研究,结果表明:纤维素纳米晶的加入能够有效增强胶原膜的力学强度,与纯胶原膜相比,10 wt%CNCs的拉伸强度和弹性模量分别增加了3.5和2.7倍;且纤维素纳米晶的加入不会对胶原膜本身的溶胀性能和透光性能产生影响,但复合膜的降解速率加快,而7 wt%CNCs与纯胶原膜降解速率相似;体外细胞实验表明,兔角膜上皮细胞和角膜基质细胞在胶原基纤维素纳米晶复合膜上具有良好的粘附形态和细胞增殖,表明胶原基复合膜具有良好的生物相容性;体外细胞划痕实验和TGF-β1诱导下角膜基质细胞向肌成纤维细胞分化实验显示,7 wt%CNCs能显着加快划痕的愈合以及抑制角膜基质细胞向肌成纤维细胞的分化。因此,7 wt%CNCs各方面性能较好,能够满足角膜修复的需要,在角膜再生修复方面具有潜在的应用价值。另外,本研究采用全骨髓贴壁法提取了兔骨髓间充质干细胞,通过体外培养鉴定和共培养研究骨髓间充质干细胞向角膜上皮样细胞的分化以及在TGF-β1诱导下对角膜基质细胞向肌成纤维细胞分化的抑制作用,接下来将移植COL-GA和注射BMSCs用于角膜机械损伤修复的研究,结果表明:本研究提取的细胞经鉴定为BMSCs;与角膜基质细胞共培养的环境中,BMSCs向角膜上皮样细胞分化,而在TGF-β1诱导条件下,与BMSCs共培养的角膜基质细胞向肌成纤维细胞的分化行为被有效抑制;体内动物实验结果表明BMSCs能够在一定程度上抑制角膜基质的纤维化,移植COL-GA能够加快并短时间内维持完全的在上皮化过程,移植COL-GA和注射BMSCs联合使用可一直维持完全再上皮化。综上,本论文基于胶原材料力学性能差以及角膜损伤后基质纤维化的问题,通过引入不同含量的纤维素纳米晶成功制了力学性能较好的胶原基纤维素纳米晶复合膜,研究胶原基纤维素纳米晶复合膜的理化性能和生物学性能,提取并鉴定兔骨髓间充质干细胞,研究骨髓间充质干细胞多向分化和抗纤维化的潜能,最后将戊二醛熏蒸的纯胶原膜与间充质干细胞注射联合用于角膜损伤后的修复,为角膜再生修复研究提供理论参考,对角膜再生修复替代材料和角膜干细胞注射治疗的发展具有重要的参考价值。
张璐[4]（2019）在《兔角膜基质细胞及脱细胞猪角膜基质构建组织工程角膜移植的研究》文中提出[目 的]通过体外培养原代兔CSCs,以APCM为支架材料构建组织工程角膜基质,探讨植入CSCs后的APCM在兔角膜深板层移植中的生长情况,为后期组织角膜工程的研究提供实验基础。[方 法]（1）体外分离培养原代兔CSCs并鉴定;（2）用经慢病毒（LV Lentivirus）转染的EFGP标记兔CSCs,通过倒置荧光显微镜、流式细胞仪确定最佳感染时间及M0I值;（3）以APCM为支架材料,行兔角膜深板层移植,取新西兰大白兔24只,分为3组。实验组:APCM+兔CSCs;对照组A:APCM组;对照组B:兔角膜原位缝合组;（4）各组术后1-4周、8周眼前段照相及荧光素染色;（5）术后1周、1个月、2个月前段OCT测角膜厚度;（6）术后2个月各组取材做冰冻切片免疫荧光及HE染色、GFP免疫组化检测。[结 果]（1）成功分离培养出兔角膜基质细胞;（2）经LV-EGFP转染的兔CSCs倒置荧光显微镜下观察,吸出病毒液24h后即可观察到绿色荧光,随着时间的延长荧光强度逐渐增强,72h为最佳转染时间;流式细胞仪检测在MOI=400时,LV-EGFP对兔CSCs的存活率无影响;（3）动物实验造模后8周中,实验组角膜8点方位新生血管长入角膜约2mm,角膜透明,未见明显瘢痕,荧光素染色示植片中央区域有着色;对照组A角膜2点方位新生血管长入角膜约3mm,植片中央区域荧光素着色;对照组B角膜7点方位新生血管长入角膜约1mm,角膜透明,荧光素染色示角膜点状着色;（4）眼前段OCT实验组角膜基质信号较均匀,植片与植床紧密融合生长;对照组A角膜基质层信号欠均匀,可见移植的APCM与原基质间有明显的界限,融合欠佳;对照组B基质层灰度均匀,可见清晰的的上皮层,基质层和内皮层;（5）术后测各组中央角膜厚度分别为:323μm、166μm、324μm;（6）冰冻切片免疫荧光检测实验组可见绿色荧光,对照组A/B均未见荧光;免疫组化实验组可见GFP表达阳性,对照组A/B均为阴性。[结 论]注射有兔CSCs的APCM,可作为支架材料,体外构建兔组织工程角膜,植片与原角膜植床融合生长良好,结构、功能更接近于兔自体角膜,可为临床研究角膜移植提供良好的原料。
熊思佳[5]（2019）在《胶原膜表面图案化及其调控角膜细胞行为的研究》文中认为生物材料表面拓扑结构可以有效调控细胞的铺展、增殖、迁移和分化等一系列行为,在组织修复过程中发挥着重要作用,目前已引起极大的关注。对于角膜组织工程而言,天然角膜的基底膜表面及基质层中均存在丰富的微纳米拓扑结构,是角膜功能行使的结构基础。因此,将微纳米拓扑结构应用于角膜组织工程支架的构建,研究材料表面微纳米拓扑结构对角膜细胞的调控规律,不仅能加深人们对角膜细胞与其生长的微环境之间相互作用的理解,还对体外构建结构和性能仿生的角膜修复材料,促进角膜组织工程的发展具有重要的理论意义和应用价值。本研究使用胶原作为基底材料,采用软刻蚀与溶液浇注相结合的方法在胶原膜表面精确构建了深度相同,宽度分别为25μm、50μm和100μm的三种微米级沟槽结构,采用扫描电子显微镜、接触角测量仪和紫外-可见分光光度计等方法表征了微沟槽结构对胶原膜理化性能的影响,并通过体外细胞实验研究了其对角膜上皮细胞的形态及行为的调控作用。研究发现,微沟槽结构可使胶原膜的接触角由53°下降至30°40°之间;微沟槽结构还能提高胶原膜的离子渗透性能,沟槽宽度为100μm的胶原膜的离子渗透系数能达到1.3×10-6 cm2/s。细胞实验结果表明,角膜上皮细胞和基质细胞均能在微沟槽胶原膜上实现群体定向排列,取向程度最高可达80%。微沟槽胶原膜可促进上皮细胞的定向迁移,沟槽越窄,定向迁移速度越快。此外,微沟槽结构还能抑制基质细胞向肌成纤维细胞分化,随沟槽宽度增加,抑制效果越显着。本研究还模仿凸点结构在胶原膜表面构建了直径分别为2μm、5μm和10μm有序微点阵结构及其组成的混合微点阵结构,并利用原子力显微镜、接触角测量仪和体外细胞实验等手段研究了微点阵结构对胶原膜理化性能及角膜细胞形态和行为的影响。结果表明,与平滑胶原膜相比,微点阵胶原膜的表面疏水性和表面粗糙度显着增加;微点阵结构还能增加胶原膜的拉伸强度,10μm的微点阵胶原膜的力学强度可达1.8 MPa。细胞实验表明,微点阵结构能显着改变角膜上皮细胞和基质细胞的形态,使细胞形状由椭圆形、长方形和梭形向三角形和星形转变,细胞的面积和圆度降低,长径比增大;直径为10μm的微点阵结构能够诱导上皮细胞定向排列,取向度增加至40%;伴随着细胞的形态变化,微点阵胶原膜上细胞的粘附效率和增殖速率呈现出显着的下降趋势。综上,本研究基于材料表面拓扑结构与细胞相互作用这一基本科学问题,通过微纳加工技术在胶原表面构建了微沟槽和微点阵结构,研究其对胶原膜理化性能以及角膜细胞行为的影响规律,有助于进一步理解材料表面拓扑结构与角膜细胞之间的相互作用,对角膜组织工程支架的设计具有重要的指导意义。
袁晓龙[6]（2015）在《利用鱼类胶原蛋白支架体外构建组织工程全层人角膜的研究》文中认为角膜是位于眼球最前壁的一层透明膜,具有一定的曲率半径,在维持视功能和保护眼球方面发挥了不可替代的重要功能。人角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层构成,其中,厚度约50μm的上皮层由6-8层人角膜上皮细胞（HCEP细胞）构成,厚度约500μm的基质层由人角膜基质细胞（HCS细胞）和主要由胶原蛋白组成的高度有序的细胞外基质构成,厚度约5μm的内皮层由单层人角膜内皮细胞（HCE细胞）组成。角膜因位于眼表最前端,直接与外界接触,故极易受到损伤和感染,一旦发生病变将会引起角膜混浊、视力下降甚至致盲。目前,临床上治疗角膜病盲的唯一有效手段是角膜移植。但遗憾的是,由于捐献角膜数量的严重不足及捐献角膜老化,致使绝大数角膜病盲患者无法通过角膜移植重见光明。近年来角膜组织工程技术的快速发展,使组织工程角膜的体外构建成为可能,而组织工程角膜作为捐献角膜的等效替代物,则是目前从根本上解决捐献角膜高度匮乏问题、使众多角膜病盲患者恢复视功能的唯一希望。如何获得足量正常的种子细胞和生物相容性理想的载体支架一直是制约组织工程角膜规模化体外构建的两大因素,已成为角膜组织工程领域的研究热点和难点。在种子细胞方面,目前的研究主要集中在干细胞、转染组织细胞系和原代组织细胞的体外培养上,但由于体外培养条件、伦理或潜在致瘤性等多种限制,目前仍无法满足组织工程角膜规模化构建对种子细胞的需求。近年来,本实验室成功建立了非转染无致瘤性的HCE、HCS和HCEP的三种组织细胞系,并以其为种子细胞先后进行了组织工程人角膜内皮、基质和上皮的体外构建研究,达到了较为理想的动物移植效果,使利用非转染人角膜组织细胞系规模化构建组织工程角膜成为可能。在载体支架方面,目前的研究主要集中在天然生物材料、人工合成高分子材料和生物大分子复合材料方面。鉴于天然生物材料或多或少地受到其病原体携带风险和来源的限制、人工合成高分子材料还存在有生物相容性不理想等缺陷,学者们便逐渐将研究重点转移到生物大分子复合材料的研发方面。在生物大分子复合材料的研究中,胶原蛋白由于具有来源广泛、在进化上高度保守、免疫原性低且生物相容性理想等诸多优势,已被广泛用于各种载体支架材料的制备研究,且利用人胶原蛋白复合支架成功构建出了组织工程角膜,但遗憾的是,所制备出的胶原蛋白复合支架仍然存在有力学性能欠佳、体内降解速度过快和制备成本较高等缺陷。近年来,高效无毒交联剂及其交联技术的快速发展以及非酶解/完整分子鱼类胶原蛋白制备技术的建立,为利用鱼类胶原蛋白制备组织工程角膜载体支架创造了条件。本文在前期研究工作的基础上,首次利用本实验室自主分离纯化的非酶解/完整分子鱼类胶原蛋白启动了鱼类胶原蛋白支架的制备研究,进而以其为载体支架、以非转染无致瘤性的三种组织细胞系作为种子细胞进行了组织工程全层人角膜（TE-flHC）的体外构建研究,旨在建立鱼类胶原蛋白支架的制备与TE-flHC体外构建的技术工艺,获得形态结构、属性和功能蛋白表达正常的TE-flHC。为了利用鱼类胶原蛋白制备出生物相容性理想的载体支架,本文采用本实验室业已纯化的孔鳐鱼皮胶原蛋白,选用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）交联剂和自制模具,进行了鱼类胶原蛋白支架的制备和鉴定。鱼类胶原蛋白的鉴定结果显示,所纯化的孔鳐鱼皮胶原蛋白纯度高,在SDS-PAGE电泳中无杂带,存在形式分别为单股α链、双股α链和三股α链,单α链的分子量约为120 kDa, Gly含量约占总氨基酸含量的32.34%,符合胶原蛋白的分子量和氨基酸组成的基本特征,为未被降解的胶原蛋白完整分子,可用于鱼类胶原蛋白复合支架的制备。在对所纯化胶原蛋白进行鉴定之后,本文以所得鱼胶原蛋白为原料,采用自制装置并通过EDC/NHS交联改性制备出了鱼类胶原蛋白支架。含水量测定结果显示,60mg/mL、80 mg/mL和100mg/mL胶原蛋白支架的含水量分别为90.53%±0.06%、89.88%±0.03%和86.34.%±0.11%；透明度与透光率结果显示,上述三种胶原蛋白支架均具有良好的透明度,其透光率分别为91.15±2.36%、89.77±2.30%和86.09±2.31%；力学性能检测结果发现,增加胶原蛋白支架的抗拉强度和断裂伸长率随胶原蛋白的浓度升高而提高。冰冻切片HE染色和扫描电镜结果表明,100 mg/mL胶原蛋白支架相对于60 mg/mL和80 mg/mL胶原蛋白支架,其组织结构较为致密,胶原纤维连续,孔径大小均匀,内部结构最佳。以上结果说明,所制备的鱼类胶原蛋白支架具有良好的光学性能、力学性能和组织结构,可望用作TE-flHC体外构建的载体支架。为了获得足量的人角膜种子细胞,本文首先对业已建立的三种非转染人角膜组织细胞系进行了扩增培养和鉴定。形态观察和生长曲线的鉴定结果显示,HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞仍分别保持有上皮样、成纤维样和多角形内皮样的形态特征,其群体倍增时间分别为38.5h、37.6 h和36.2 h；染色体鉴定结果显示,这三种细胞的特征染色体数目均为2n=46条；免疫细胞化学检测结果发现,HCEP细胞仍保持有其标志蛋白——角蛋白3/12以及功能蛋白——紧密连接蛋白（ZO-1）,整联蛋白131、间隙连接蛋白-43、钠钾泵和乙醛脱氢酶的阳性表达；HCS细胞仍保持有其标志蛋白——波形蛋白以及功能蛋白——整联蛋白p1、间隙连接蛋白-43、钠钾泵和乙醛脱氢酶（ALDH）的阳性表达；HCS细胞仍保持有标志蛋白——血管内皮生长因子受体蛋白（FLK-1）以及功能蛋白——整联蛋白β5,紧密连接蛋白（ZO-1）,间隙连接蛋白-43和钠钾泵的阳性表达。这些结果表明,体外扩增培养的三种人角膜组织细胞在形态、增殖能力、染色体特征以及功能蛋白表达方面仍然具有典型的原有属性和发挥形成细胞连接和穿膜运输的潜能,可作为种子细胞用于TE-flHC的体外构建。为了验证所制备的鱼类胶原蛋白支架的生物相容性,本文在获得足量的人角膜种子细胞后,利用MTT法、RT-PCR和免疫组织化学等方法检测了支架对三种人角膜组织细胞的细胞活力、细胞的生长与增殖调控基因表达以及功能蛋白表达的影响作用。MTT实验结果发现,鱼类胶原蛋白支架浸提液对体外培养的HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞的细胞活力没有显着影响（P>0.05）。RT-PCR结果表明,支架对三种种子细胞生长和增殖基因的表达水平也没有显着影响（P>0.05）。免疫组织化学检测结果显示,HCEP细胞在接种于支架表面后仍能保持其标志蛋白——角蛋白3/12、细胞连接形成蛋白——整联蛋白p1、ZO-1和间隙连接蛋白-43以及功能蛋白——钠钾泵和ALDH的阳性表达；HCS细胞在接种于支架表面后仍能保持其标志蛋白——波形蛋白、细胞连接形成蛋白——整联蛋白β1和间隙连接蛋白-43、以及功能蛋白——钠钾泵和ALDH的阳性表达；HCE细胞在接种于支架表面后仍能保持其标志蛋白——FLK-1、细胞连接形成蛋白——整联蛋白β5、ZO-1和间隙连接蛋白-43、以及功能蛋白——钠钾泵的阳性表达。这些结果表明,所制备的鱼类胶原蛋白支架对三种人角膜组织细胞不仅没有毒性,而且对其生长增殖调控基因、标志蛋白及功能蛋白的表达没有任何影响作用,与三种人角膜组织细胞具有理想的生物相容性,可以作为载体支架用于TE-flHC的体外构建。在获得足量正常的三种人角膜组织细胞和生物相容性理想的鱼类胶原蛋白支架后,本文以三种人角膜组织细胞为种子细胞、以鱼类胶原蛋白支架为载体支架,进行了TE-flHC的体外构建和鉴定研究。我们在优化种子细胞的接种天数后,分别将HCS细胞、HCE细胞和HCEP细胞接种于鱼类胶原蛋白支架,通过浸没培养或液气-液界面培养数天后成功构建TE-flHC,并通过外观观察、透明度检测、冰冻切片HE染色、荧光标记物检测、茜素红染色、透射电镜、扫描电镜和免疫组织化学检测对其透光性能、组织结构及种子细胞的蛋白表达等方面进行鉴定。透光性能检测结果表明,构建的TE-flHC具有良好的透光率与透明度,具有类似正常角膜的高透光性能。荧光标记物检测与HE染色结果表明,三种人角膜细胞分界明显,HCEP细胞在支架表面形成5至8层复层上皮结构；HCS细胞均匀分布于支架内部；HCE细胞形成完整的细胞单层结构。茜素红染色结果表明,细胞密度为2750±260个/mm2,相当于30岁成年人的角膜内皮细胞数。超微结构观察结果表明,HCEP细胞具有丰富的微绒毛结构,角膜上皮细胞与鱼类胶原蛋白支架的连接处存在致密的基底膜,并且细胞-细胞、细胞-支架之间结合紧密；HCS细胞呈纤维样,形态伸展,与鱼类胶原蛋白支架连接紧密；HCE细胞平整连续,形成了由完整的单层结构,与正常角膜内皮层相似。以上结果说明构建的TE-flHC具有类似于正常角膜的解剖结构。免疫组织化学检测结果显示,三种人角膜组织细胞均能维持其原有属性,并且形成了紧密连接、锚定连接和通讯连接,具有正常角膜相似的进行膜泡运输和抗UV氧化损伤的功能。综上所述,本文利用孔鳐皮胶原蛋白制备出了光学性能、力学性能和组织结构良好且与HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞具有理想生物相容性的鱼类胶原蛋白支架,进而以胶原蛋白支架为载体支架,以属性正常、增殖能力旺盛及功能蛋白表达正常的非转染HCEP细胞、HCS细胞和HCE细胞为种子细胞,成功体外构建出了与正常角膜结构、属性与功能相似的组织工程全层角膜。本文研究结果,对于鱼类胶原蛋白在组织工程领域的高质化应用具有重要意义,为我国数百万、全世界有数千万角膜病盲患者早日通过TE-flHC移植重见光明带来希望。
庞鑫[7]（2015）在《组织工程人后板层半角膜体外构建的实验研究》文中认为角膜（Cornea）是位于眼球表面的一层透明组织,是维持正常视功能的重要结构,由于位于眼表的最外层,因而极易受到损伤和感染,致使角膜病是引起视力下降甚至致盲的主要因素,目前主要依赖于角膜移植手术进行治疗。据流行病学调查显示,我国现有角膜病盲患者300余万,均需要通过角膜移植进行治疗,但因捐献角膜数量有限和供体角膜老化,每年能接受手术治疗的患者只有1000余人,绝大多数患者因得不到可用的供体角膜而无法接受角膜移植和复明。目前,体外构建的组织工程角膜（Tissue-engineered human cornea）作为捐献角膜的替代物,是解决供体角膜匮乏的主要途径,已成为众多角膜病盲患者重见光明的希望。组织工程角膜体外构建的核心要素是种子细胞（Seeder cells）、载体支架（Carrier scaffold）和信号分子（Signaling molecules）。组织工程角膜的体外构建,要求种子细胞必须能够持续保持细胞固有的形态结构、旺盛的增殖能力、稳定的遗传性能和发挥固有功能的潜能,要求载体支架必须具有与天然角膜类似的光学性能、三维网架结构、生物相容性和机械强度。获得足量正常的种子细胞和生物相容性理想的的载体支架是开展组织工程角膜体外构建研究的前提条件。人角膜在组织结构上由上皮层（Epithelium）、前弹力层（Bowman’s membrane）、基质层（Stroma）、后弹力层（Descemet’ membrane）和内皮层（Endothelium）构成。其中,人角膜基质（Human cornea stroma, HCS）由交错排列的200-250个胶原板层结构和散在分布的HCS细胞组成,占角膜厚度的90%,在角膜厚度和透明度维持中具有关键作用；而人角膜内皮（Human cornea endothelium, HCE）位于角膜最内层、由连接紧密的单层HCE细胞镶嵌而成,是角膜和前房的天然屏障,通过泵-漏机制维持角膜透明度并为角膜供养/氧,在角膜厚度和透明度维持中具有决定性作用。在角膜受到深度创伤和感染时,往往会伤及深层HCS和HCE,即后板层半角膜,轻者引起角膜水肿和角膜内皮失代偿,重者甚至致盲。目前后板层半角膜的治疗方法主要是通过单层HCS和HCE的多次角膜移植手术,不仅增加了手术创伤和感染的风险,而且在角膜愈合和移植瘢痕残留方面也存在有诸多缺陷。因此,体外构建出可用于移植的组织工程人后板层半角膜（Tissue-engineered posterior hemicornea, TE-pHC）已成为学者们新的研究热点。本文研究目的就是利用本实验室自主建立的非转染、无致瘤性的HCE细胞系和HCS细胞系作为种子细胞,以带后弹力层的脱细胞猪角膜基质（acellular porcine corneal stromata with Descemet’ membrane, aPCS-DM）为载体支架,进行TE-pHC的体外构建研究,旨在获得与活体角膜后半层组织结构高度近似的TE-pHC。为了获得足量正常的TE-pHC种子细胞,本文首先对非转染无致瘤性HCS和HCE组织细胞系细胞进行了体外扩增培养,并对其形态结构、增殖活性、染色体属性以及细胞标志蛋白和功能蛋白的表达进行了鉴定。光镜观察结果发现,体外扩增培养的第1批65代HCE细胞形成汇合单层时呈多角形的六边形内皮样细胞形态,第28批63代HCS细胞形态呈梭型,仍然具有其原有细胞的形态特征；生长与增殖活性的检测结果显示,HCE细胞和HCS细胞的群体倍增时间分别为48.54 h和38.28 h,仍保持有旺盛的体外增殖能力；染色体组型分析结果发现,这两种细胞的特征性染色体数目均为2n=46条,仍具有人类染色体的特征；免疫细胞化学检测结果显示,HCE细胞和HCS细胞仍分别保持有HCE细胞标志蛋白——人血管内皮生长因子受体-2（FLK-1）和HCS细胞标志蛋白——波形蛋白的阳性表达,表明两种细胞仍保持有HCE细胞和HCS细胞的固有属性。对HCE细胞和HCS细胞功能蛋白的免疫细胞化学检测结果发现,HCE细胞仍保持有细胞连接形成蛋白——紧密连接蛋白1（ZO-1）、间隙连接蛋白-43（CX-43）和整联蛋白βv/β5以及膜运输蛋白——Na+/K+-ATPase的阳性表达,而HCS细胞保持有CX-43和整联蛋白β1以及Na+/K+-ATPase和乙醛脱氢酶3（ALDH3）的阳性表达,证明这两种细胞均仍然保持有形成细胞-细胞间、细胞-细胞外基质间细胞连接和执行膜运输功能的潜能,且HCS细胞保持有抗紫外损伤的潜能。上述鉴定结果证明,第65代HCE细胞和第63代HCS细胞在体外扩增培养中的形态、染色体属性和细胞属性正常,增殖能力旺盛,并依然保持有形成细胞连接和执行膜运输功能的潜能,符合作为组织工程角膜种子细胞的各项条件,可以被用于TE-pHC体外构建的种子细胞。为了获得形态结构与天然角膜类似的TE-pHC载体支架,本文以新鲜猪角膜为材料进行了aPCS-DM支架的制备和鉴定。我们利用冻融循环联合核酸酶消化的方法进行脱细胞处理,经核黄素交联及风干处理,获得了aPCS-DM载体支架。用于构建TE-pHC前,分别对光学性能、组织结构、理化性质和机械性能进行了检测和评价。光学性能检测结果显示,aPCS的透明度和透光率近似于天然角膜,具有良好的光学性能。组织学检查结果显示,经过脱细胞处理后aPCS胶原板层仍保持排列规则且结构致密,后弹力层完整且表面平整,异种细胞在处理过程中被去除；理化性质检测结果显示,含水量略高于天然角膜,aPCS中DNA残留量低且符合医用生物材料标准,糖胺聚糖分布与天然角膜相似。生物力学性能检测结果显示,aPCS在生物力学性能上与天然角膜无显着差异。上述结果表明,本文制备的aPCS-DM支架具有良好的光学性能,三维组织结构和理化性质与天然角膜高度近似,生物力学性能优良,满足作为构建TE-pHC的载体支架材料的要求。为了进一步检测载体支架与两种细胞的生物相容性,本文对aPCS支架进行了细胞毒性评价和接种细胞后的免疫组织化学检测。利用HCE细胞和HCS细胞进行MTT细胞毒性的检测结果显示,制备的aPCS无细胞毒性作用。接种HCS细胞和HCE细胞后aPCS的的免疫组织化学结果显示,细胞在载体支架内部和后弹力层表面均能阳性表达其标志蛋白、连接形成蛋白和功能蛋白。上述结果综合表明,aPCS支架不仅无细胞毒性,还能够为细胞的黏附、增殖和功能表达提供合适的三维空间结构,具备良好的生物相容性,是作为TE-pHC体外构建的理想支架材料。在已获得种子细胞和载体支架的前提下,为了构建具有功能的TE-pHC,本实验进行了TE-pHC的体外构建并对其进行了鉴定。本文通过比较HCE细胞和HCS细胞的不同接种方式和摸索细胞接种时间建赢了TE-pHC的构建技术路线：微量注射的方法将HCS细胞接种于aPCS支架的基质中,培养24 h后将接种过HCS细胞的植片后弹力层面向上直接法接种HCE细胞,继续培养至4天,从而构建出TE-pHC.对TE-pHC进行组织结构和功能检查,茜素红染色结果说明HCE细胞在后弹力层面形成连续的单层,细胞密度为2910±420个／mm2的密度,相当于健康成人30岁左右的内皮细胞密度；H&E染色结果显示HCS细胞在注射点附近支架黏附并伸展,向周围扩散分布,HCE细胞连续完整单层与后弹力层结合紧密; TE-pHC的电镜结果显示,HCE细胞在aPCS后弹力层上形成的单层细胞表面平整,细胞与细胞连接紧密,两种细胞与支架材料间均形成连接结构。免疫组织化学检测结果显示构建的TE-pHC中HCE细胞和HCS细胞标志蛋白、连接形成蛋白和功能蛋白表达均呈阳性。上述结果表明构建的TE-pHC在组织结构上近似于人角膜后板层,HCE细胞和HCS细胞功能蛋白正常表达,具有发挥后板层生物学功能的潜能。综上所述,本文利用在体外扩增培养中的形态、染色体属性和细胞属性正常,增殖能力旺盛的非转染HCE细胞和HCS细胞,以光学性能优良,组织结构和理化性质与天然角膜高度近似,生物相容性和机械力学性能良好的aPCS-DM为载体支架,经体外构建5天后即可获得形态组织结构和生物学性能与活体角膜后板层高度近似的TE-pHC,具有发挥其生物学功能的潜能。这些研究结果表明本实验在体外成功构建的TE-pHC,既可作为体外角膜实验的良好模型,又兼具后板层半角膜移植等效替代物的应用前景。TE-pHC体外构建技术的建立及形态结构正常TE-pHC的获得,为其替代捐献角膜用于后板层角膜异常病变的临床治疗创造条件,也可替代组织工程人全层角膜用于角膜缘完好的全层角膜异常患者的穿透性板层移植,不仅科学意义重大,社会意义和应用价值重大,为组织工程角膜的临床应用奠定了体外实验基础。
马西亚[8]（2014）在《组织工程人角膜内皮的体外重建及其动物移植试验》文中研究表明人角膜内皮层（HCE）由单层的六角形人角膜内皮细胞（HCE细胞）镶嵌而成，是前房房水和角膜基质之间的渗漏性屏障，HCE细胞质膜上所拥有的诸多膜运输蛋白通过发挥“泵”功能使整个角膜处于半脱水状态，在维持角膜正常厚度和其透明性进而保障眼睛发挥正常视功能方面具有不可替代的作用。遗憾的是，成人的HCE细胞丧失了增殖能力，而且数量还在逐年减少，HCE单层完整性的维持只能靠邻近HCE细胞的扩大和移行来实现。一旦受到病原体感染、机械损伤和非生理性胁迫等，HCE细胞死亡的速率更快，轻者会造成不可逆角膜病变——角膜内皮功能失代偿（corneal endothelial dysfunction），重者将会致盲——角膜内皮盲（primary corneal endotheliopathy），角膜内皮病盲在因角膜病变所导致的视力障碍中位于第二位。角膜移植是目前治疗角膜内皮病盲的唯一办法，因HCE异常仅仅是由于HCE细胞数量不足造成的，故绝大多数角膜内皮病盲患者均可通过角膜移植而治愈，但由于捐献角膜数量的高度匮乏，致使可用于角膜移植的供体角膜材料严重不足，众多角膜内皮病盲患者无法通过角膜移植重见光明。目前，组织工程人角膜内皮（tissue-engineered human corneal endothelium,TE-HCE）被公认为是治疗角膜内皮病盲的天然HCE的等效替代物，已成为广大角膜内皮病盲患者恢复视力和复明的唯一希望。但迄今为止，仍没有可用于临床HCE移植的TE-HCE产品问世。本文在前期研究工作的基础上，利用表型、核型和功能蛋白表达正常且没有致瘤性的人角膜内皮单克隆细胞株细胞（monoclonal human corneal endothelial cells, mcHCE细胞）为种子细胞，以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化去上皮层修饰羊膜（modifieddenuded-epithelium amniotic membrane, mdAM）为载体支架，在体外重建出了形态和组织结构正常的TE-HCE，并利用家猫和猕猴进行了动物角膜的穿透性后板层角膜移植试验，旨在获得可使移植动物角膜长期维持透明的TE-HCE，为可用于临床HCE移植的TE-HCE新产品的生产和临床应用奠定基础。用于TE-HCE体外重建的种子细胞为来自非转染无致瘤性HCE细胞系（utHCEC01）的第38代mcHCE细胞。在用作种子细胞开展TE-HCE体外重建之前，分别对其细胞属性、功能蛋白的表达以及致瘤性进行了检测和鉴定。检测结果显示，第38代mcHCE细胞呈近似六角形的多边形内皮样细胞形态，透明度高，形态大小均一，细胞群体倍增时间为41.07h，染色体数目为2n=46条，表明该细胞株细胞的生长状态良好，分裂增殖能力旺盛；第38代mcHCE细胞仍维持有标志蛋白——人血管内皮生长因子受体-2（Flk1）和人IV型胶原蛋白的阳性表达，表明该细胞株细胞保持有HCE细胞的固有属性；细胞连接蛋白的免疫荧光检测结果显示，第38代mcHCE细胞仍保持有紧密连接蛋白1（ZO-1）、N-钙粘蛋白（N-Cadherin）、间隙连接蛋白-43（CX-43）和整联蛋白αv/β5（Integrinαv/β5）的阳性表达，表明该细胞株细胞具有在细胞间以及细胞与细胞外基质间形成细胞连接的潜能；第38代mcHCE细胞还维持有细胞膜运输蛋白——人Na+/K+ATPase、人氯离子通道蛋白-2（hCLCN2）、 Na+/HCO3-协同转运蛋白（hSLC4）和人水孔通道蛋白-1（AQP1）的阳性表达，表明该细胞株细胞具有发挥正常膜运输功能的潜能；第38代mcHCE细胞在裸鼠皮下接种后没有肿瘤出现，证实该细胞株细胞没有致瘤性。综合上述检测和鉴定结果，证明第38代mcHCE细胞形态结构、属性和功能正常，且没有致瘤性，可以被用作TE-HCE体外重建的种子细胞。本文利用胰酶-EDTA倒置消化法对去上皮层羊膜进行薄化处理，再使用专用信号分子包被，制得薄化mdAM。在用作载体支架进行TE-HCE体外重建之前，分别对其进行理化性质、生物学性质以及其与第38代mcHCE细胞的生物相容性进行检测和评价。结果显示，薄化mdAM只有基底膜和致密层组成，且上皮面光滑平整；厚度均一，平均厚度约为28.47μm；透明度和透光率良好，可见光区的透光率在90%以上；重金属含量符合国家对可吸收植入型医用生物材料的要求。薄化mdAM无热源和眼刺激性；皮下植入后无炎症反应且降解速度比瑞济生物羊膜快；且与第38代mcHCE细胞具有良好的生物相容性。综上所述，薄化mdAM具有良好的理化和生物学性能，安全性高，且与mcHCE细胞生物相容性良好，可以被用作TE-HCE体外重建的载体支架。本文以上述mcHCE细胞为种子细胞、以薄化mdAM为载体支架，用含20%FBS的DMEM/F12（1:1）完全培养液，在37℃、5%CO2的培养条件下进行了TE-HCE的体外重建。每24h茜素红染色结果显示，重建96h后种子细胞便可在载体支架上形成完整连续的细胞层，细胞与细胞间着色清晰，细胞呈近似六角形内皮样形态，细胞密度为3487±99.04个/mm2；组织结构和超微结构鉴定结果显示，体外重建96h所得的TE-HCE具有完整连续的角膜内皮细胞单层，多角形细胞中具有一定数量的线粒体和内质网，细胞与细胞间、细胞与载体支架间具有多处细胞连接样结构，与正常HCE的组织结构和超微结构相似。免疫荧光检测结果显示，体外重建96h所得的TE-HCE仍维持有细胞紧密连接蛋白1（ZO-1）、N-钙粘蛋白（N-Cadherin）、间隙连接蛋白-43（CX-43）和整联蛋白αv/β5（Integrinαv/β5）的阳性表达，表明体外重建96h所得的TE-HCE具有形成紧密连接复合体进而形成前房房水与角膜基质间渗漏性屏障的潜能。综上所述，体外重建96h所得TE-HCE具有与正常HCE相似的形态特征、组织结构和超微结构，可以作为正常HCE的等效替代物，被认为可以用于角膜内皮病盲的临床治疗。为了进一步评价所重建的TE-HCE在体内是否具有正常HCE的生理功能。本文选用自身角膜内皮细胞没有增殖能力的家猫和猕猴作为实验动物。首先撕除实验眼的后弹力层和内皮层，然后进行带DiI荧光标记的TE-HCE和mdAM（对照组）的后板层角膜移植。移植后用裂隙灯显微镜、角膜测厚仪和眼压计跟踪观察其透明度、厚度和眼压的变化情况，并在家猫移植104天，猕猴移植181天时取材进行DiI荧光标记、茜素红染色及细胞密度、组织结构和超微结构的离体鉴定，此外家猫还进行了房水蛋白变化的鉴定。结果显示，家猫和猕猴TE-HCE移植眼的角膜均未出现水肿和排斥等不良反应，角膜厚度逐渐下降，并逐渐恢复透明；而mdAM实验眼，角膜水肿严重且不透明；但TE-HCE移植眼、mdAM移植眼和正常对照眼的眼压在观察期间均在上下波动，没有明显的相关性。离体检测结果显示，家猫和猕猴TE-HCE移植眼角膜中央移植区的内皮细胞均带有DiI荧光标记，且形态大小均一，多为六角形镶嵌内皮样形态，细胞密度分别为2573.33±0.59个/mm2和2780.00±0.77个/mm2，与他们各自正常对照眼的形态和细胞密度相近，而mdAM移植眼角膜中央移植区均没有内皮细胞，这表明，家猫和猕猴TE-HCE移植眼角膜中央移植区的内皮细胞均来自所植入的TE-HCE，且具有与正常对照眼相似的形态特征和细胞密度。家猫和猕猴TE-HCE移植眼角膜的组织结构和超微结构与正常对照眼角膜相似，但猕猴TE-HCE移植眼角膜在移植181天后HCE细胞仍没有分泌形成新的后弹力层。家猫TE-HCE移植眼和正常对照眼房水蛋白的二维电泳的分析结果显示，TE-HCE移植眼与正常对照眼房水蛋白分离斑点的重复性较好，匹配的Corr系数达到0.8以上。综上所述，TE-HCE在家猫和猕猴体内具有正常HCE的生理功能，能够维持家猫和猕猴移植角膜的正常厚度和长期透明性。综上所述，利用表型、核型和功能蛋白表达正常且没有致瘤性的mcHCE细胞为种子细胞，以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化mdAM为载体支架，在体外重建96h后即可获得形态特征和组织结构近似正常HCE的TE-HCE，且移植到自身角膜内皮细胞无增殖能力且撕除后弹力层和内皮层的家猫和猕猴角膜上后，能够重塑出形态特征、细胞密度、组织结构和超微结构与正常HCE基本一致的角膜内皮细胞单层，且能够维持家猫和猕猴移植角膜的正常厚度及长期透明性。这些研究结果表明该TE-HCE可以作为天然HCE的等效替代物，用于角膜内皮病盲的临床治疗，为众多角膜病盲患者重建光明带来希望，这在再生医学领域具有重要意义。
刁金美[9]（2014）在《基于脱细胞猪角膜基质的组织工程全层人角膜的体外重建、鉴定及其在动物移植中的作用研究》文中研究指明角膜是位于眼表的透明组织，主要行使屈光的功能。由于角膜直接与外界环境接触，因此极易受到机械外伤、热灼伤以及微生物的感染，导致角膜病的发生，严重者甚至失明。角膜移植是唯一的治疗方法。但是，目前所需的供体角膜数量严重匮乏，远远不能满足临床的需要。随着角膜组织工程的兴起与发展，组织工程人角膜（Tissue-engineered Human Cornea，TE-HC）有望成为捐献角膜的等效替代物，从而解决供体不足的问题，为角膜病盲患者带来复明的希望。TE-HC体外重建的核心要素主要包括两方面：一是能够获得足量的、形态结构及功能正常的人角膜种子细胞；二是制备出与种子细胞具有良好生物相容性的载体支架。目前用于TE-HC的种子细胞主要有胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、原代培养细胞、成体干细胞（adult stem cells,ASC）以及转染细胞系细胞； ESC应用引起的伦理问题、原代培养细胞的数量限制、ASC诱导分化率低以及转染细胞系细胞的潜在致瘤性风险，限制了这些细胞在角膜组织工程中的应用；载体支架主要有天然生物材料、天然高分子材料以及合成高分子材料。天然高分子材料构建的载体支架存在的机械性能缺陷、合成高分子材料的生物相容性较差限制了其作为组织工程角膜载体支架的应用。因此寻找理想的角膜种子细胞以及载体支架材料成为体外成功重建TE-HC的关键因素。本文采用的非转染、无致瘤性的HCEP（human corneal epithelium, HCEP）细胞、基质（human corneal stroma, HCS）细胞以及内皮（human corneal endothelium, HCE）细胞，具有角膜细胞的正常属性及功能，并且体外增殖能力强，短时间内即可获得大量的细胞，从而作为理想的种子细胞解决了TE-HC体外重建的种子细胞来源问题。而在载体支架方面，经本实验室前期的研究、探索及优化，制备出了具有透光率高、生物相容性好的脱细胞猪角膜基质（acellular porcine corneal stroma, aPCS），成为体外重建TE-HC的理想载体支架材料。为了进一步鉴定HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞的属性、功能蛋白的表达以及是否具有潜在的致瘤性，本文对第70代的HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞进行了复苏、扩增培养和鉴定。结果显示，复苏的第70代HCEP细胞和HCE细胞均呈典型上皮细胞型，而HCS细胞呈典型成纤维细胞型。HCEP细胞、HCE细胞的细胞与细胞之间紧密相靠、互相衔接，排列呈现“铺路石”状，具有连接成片的能力，而HCS细胞排列呈流线型。HCEP细胞、HCE细胞以及HCS细胞的群体倍增时间分别为39.6h、38.6h和36.5h，三种细胞的活力良好，增殖分裂旺盛，特征性染色体数目仍均为2n=46。功能蛋白的表达检测结果显示，HCEP细胞能够表达HCEP特异性标志蛋白---角蛋白3和12，以及钠钾泵和整联蛋白，表明该细胞仍具有角膜上皮的表型，且具有形成完整HCEP结构的潜能；HCS细胞能够表达HCS特异性标志蛋白---波形蛋白,以及乙醛酸脱氢酶ALDH3A1及整联蛋白，表明该细胞仍具有角膜基质细胞的潜能；而HCE细胞能够表达钠钾泵、紧密连接蛋白ZO-1及整联蛋白，表明该细胞仍具有角膜内皮的表型，且具有形成完整HCE结构的潜能。致瘤性检验结果显示，这三种角膜种子细胞安全性好，均无致瘤性。因此，HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞可作为体外重建TE-HC的理想种子细胞。为了获得理想的载体支架，本文以带后弹力层的猪角膜为研究材料，应用0.5%脱氧胆酸钠及0.04%原钒酸钠联合DNA-RNA酶对猪角膜进行脱细胞处理，通过风干的方法制备出理想的aPCS载体支架材料，并对其进行了形态功能鉴定和生物相容性研究。石蜡切片HE染色和冰冻切片DAPI染色结果显示，aPCS无任何细胞残留；阿利新兰染色结果显示胞外基质糖胺聚糖（GAG）的分布与对照相似；而扫描电镜结果显示aPCS后弹力层面及基质面光滑平整；透射电镜结果显示构成aPCS胶原板层的胶原纤维排列整齐规则。为了检测aPCS的生物相容性，我们制备了aPCS浸提液，并进行了浸提液对HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞的细胞活力及细胞毒性的检测，结果显示aPCS浸提液对三种细胞的生长均无影响，不影响细胞的增殖，也不引起细胞的凋亡，没有对细胞产生毒性。因此，aPCS可以作为体外重建TE-HC的理想载体支架。为了建立TE-HC体外规模化重建的技术工艺条件，在获得了理想的种子细胞和载体支架材料后，我们进行了TE-HC的体外重建研究。首先采用微量注射的方法将HCS细胞接种于aPCS支架的基质中，然后将其置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的DMEM/F12（1:1）培养液中，培养24h；其次，将接种过HCS细胞的植片放于插入式培养皿中，后弹力层面朝上，将HCE细胞接种于aPCS的后弹力层面，培养24h后反转植片，后弹力层朝下，接种HCEP细胞，采用气-液界面培养方法持续培养5d，从而重建出了TE-HC，并对其形态结构及细胞功能蛋白表达进行了鉴定。茜素红染色结果显示HCE细胞在后弹力层面形成了连续的细胞单层；石蜡切片HE染色结果显示aPCS支架内基质细胞伸展良好，与支架材料结合紧密；而HCEP细胞在aPCS支架基质层表面形成了6-7层的复层上皮结构，类似于正常角膜的结构；免疫组化染色结果显示TE-HC的HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞的标志性蛋白、功能蛋白表达均呈阳性，与正常细胞的表型和功能相同。上述结果表明以带后弹力层的aPCS为载体支架、以第70代HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞为种子细胞体外成功重建出了TE-HC，具有与活体角膜相似的组织结构，其种子细胞具有功能蛋白的阳性表达，表明可能具有全角膜的生物学功能。为了鉴定体外重建TE-HC的生物学功能，本文选用新西兰兔和比格犬进行了TE-HC的穿透性角膜移植实验，并通过过裂隙灯显微镜观察、角膜厚度以及眼压测定等方法来评估在体TE-HC的透明度、厚度和新生血管等特征。结果显示，新西兰兔术后前10d，角膜水肿，眼压偏高；第20d，水肿状况减轻，眼压恢复正常；第30d，角膜部分透明。比格犬移植实验结果显示，在术后前期，植片水肿，眼压升高，但是30d后，角膜重新上皮化，眼压恢复正常，角膜水肿减轻，但是还是未恢复到正常角膜厚度，目前我们已观察至270d，发现角膜新生血管情况好转，但是术眼角膜厚度还是高于正常角膜。综上所述，本文以具有正常属性和功能的第70代HCEP细胞、HCS细胞以及HCE细胞为种子细胞，以具有良好生物相容性的aPCS为载体支架，体外重建了形态结构和功能属性与活体角膜相似的TE-HC，并进行了新西兰兔和比格犬的穿透性角膜移植实验，虽然在体动物实验结果没有达到我们预想的理想情况，但是却为我们提供了后续TE-HC重建的参数，在此基础上，接下来我们将对TE-HC的重建方法进行进一步优化，从而最终能够实现成功重建出可应用于临床角膜移植的TE-HC。
刘杨[10]（2014）在《胶原基角膜修复材料的结构仿生构建与功能化研究》文中研究说明角膜移植是目前治疗角膜病致盲唯一有效的方法，角膜修复材料的匮乏极大地限制了角膜病治疗的普及和开展本论文致力于具有较好理化性能和生物学性能的胶原基角膜修复材料的研究此外，术后的细菌感染及炎症反应是导致角膜移植失败最主要的原因之一，因此研究在角膜修复的同时还具有广谱抗菌效果的功能化角膜修复材料也是本文的重点所在与常见的角膜修复材料相比，本文构建的结构仿生胶原基材料具有以下优点：优良的力学性能和光学性能合适的保湿性能易于营养物质透过的性能可控的孔洞和层状结构以及良好的体外和体内生物相容性等负载抗菌药物后的功能化角膜修复材料能够在一周内具有较好的抗革兰氏阴性细菌和阳性细菌的效果，并且能够较好地实现受损角膜组织的修复本文对胶原基角膜修复材料的结构仿生构建与抗菌功能化进行了深入的研究和探讨1胶原基角膜修复材料的结构仿生构建研究角膜修复材料需要具有较为合适的理化性能和生物学性能，而这些性能与材料的结构密切相关类似于天然角膜组织的仿生结构有利于材料较好较快地实现受损组织的修复本研究采用物理或化学手段经不同的制备工艺研制出了一系列的胶原基膜材料（1）胶原-明胶-透明质酸（CGH631）复合膜材料具有较好的抗张强度亲疏水性和生物相容性，但是不能耐受手术线缝合（2）通过离子沥滤技术在胶原膜材料内部引入了纳米级的孔洞，这些微孔的存在改变了胶原膜材料的内部结构，从而提高了材料的耐缝合性能；造孔剂含量在2.5%和5.0%之间的胶原膜材料具有较为合适的理化性能和生物学性能，可以作为胶原基角膜修复材料研究的基底材料（3）通过控制高分子溶液的成膜过程构建出具有不同层状仿生结构的胶原基角膜修复材料，结果显示这些材料具有类似于天然角膜的理化性能和生物相容性，具有不同层间结构的材料能够针对角膜组织的不同部位进行替代和修复（4）通过冷冻干燥技术在结构仿生膜的基础上构建了具有微粗糙表面结构的胶原基角膜修复材料（FD-Col膜），FD-Col膜比光滑膜材料表面具有更多的蛋白吸附和细胞结合位点，角膜上皮细胞在FD-Col膜表面的上皮化过程要快于自然风干膜的光滑表面；材料在兔眼表的上皮化过程在14天内基本完成，明显快于具有光滑表面结构的材料2胶原基角膜修复材料的抗菌功能化研究本研究创造性地通过化学交联的方法在胶原膜上负载了眼科手术中常用的光谱抗生素小分子Tobramycin，得到了能够在一周内具有药物缓释效果的抗菌功能化角膜修复材料胶原-妥布霉素膜（Col-Tob） Col-Tob膜保持了较好的光学性能，力学性能，保湿性能和生物相容性在PBS中浸泡了7天后的Col-Tob膜仍然对临床上常见的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和阴性细菌大肠杆菌具有很好的抗菌效果人角膜上皮细胞能够较好地在Col-Tob材料表面粘附铺展生长和增殖，一周后有23层细胞紧密地粘合在Col-Tob膜的表面动物实验结果表明Col-Tob膜能够耐受手术线的缝合，在植入后能够较好地与剩余正常角膜组织结合，眼表没有发生细菌感染和炎症反应；术后一个月后，伤口完全愈合，眼表完成角膜上皮化过程；Col-Tob膜材料板层移植三个月后没有出现明显的新生血管和圆锥形角膜现象，起到了较好的修复效果
二、组织工程技术体外重建角膜上皮层的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、组织工程技术体外重建角膜上皮层的实验研究（论文提纲范文）
（1）基于光交联水凝胶的体外角膜再生研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 角膜的结构 |
| 1.3 角膜的功能 |
| 1.4 角膜的损伤与修复 |
| 1.4.1 角膜的损伤与疾病 |
| 1.4.2 临床上的角膜修复方法 |
| 1.5 角膜组织工程概述 |
| 1.5.1 角膜组织工程适用的生物支架材料 |
| 1.5.2 角膜组织工程适用的种子细胞 |
| 1.5.3 角膜组织工程面临的挑战与应用前景 |
| 1.6 本论文的研究目的、意义及内容 |
| 第2章 甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)水凝胶的制备及其理化性能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.2.2 实验步骤 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 GelMA水凝胶的内部结构 |
| 2.3.2 平衡水含量和酶降解 |
| 2.3.3 力学表征 |
| 2.3.4 接触角和光学性质表征 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 GelMA水凝胶用于角膜基质再生的生物学性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要试剂和仪器 |
| 3.2.2 大鼠骨髓间充质干细胞(rBM-MSCs)的黏附 |
| 3.2.3 支架中rBM-MSCs的活力和形态 |
| 3.2.4 支架中rBM-MSCs的增殖 |
| 3.2.5 诱导分化rBM-MSCs |
| 3.2.6 qRT-PCR检测rBM-MSCs中角膜基质细胞标志物的表达 |
| 3.2.7 免疫荧光检测rBM-MSCs中Lumican的表达 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 rBM-MSCs对于GelMA水凝胶的黏附与存活 |
| 3.3.2 rBM-MSCs在GelMA水凝胶表面的形态 |
| 3.3.3 支架中rBM-MSCs的增殖情况 |
| 3.3.4 rBM-MSCs中的角膜基质细胞标志物的基因表达 |
| 3.3.5 rBM-MSCs中Lumican的表达 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 GelMA/HAMA双网络(DN)水凝胶用于角膜上皮再生的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 GelMA、HAMA的合成 |
| 4.2.3 核磁共振氢谱(~1H-NMR)和傅里叶红外光谱检测(FTIR) |
| 4.2.4 GelMA、HAMA和GelMA/HAMA双网络(DN)水凝胶的合成 |
| 4.2.5 DN水凝胶的理化性能检测 |
| 4.2.6 兔角膜上皮细胞(CEpCs)的培养 |
| 4.2.7 DN水凝胶生物学性能检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 GelMA和HAMA的~1H-MNR和FTIR的表征 |
| 4.3.2 GelMA/HAMA DN水凝胶的合成 |
| 4.3.3 GelMA/HAMA DN水凝胶的内部结构 |
| 4.3.4 GelMA/HAMA DN水凝胶的机械性能 |
| 4.3.5 GelMA/HAMA DN水凝胶的溶胀和保水性能 |
| 4.3.6 GelMA/HAMA DN水凝胶的光学性质和亲水性 |
| 4.3.7 GelMA/HAMA DN水凝胶的体外降解特性 |
| 4.3.8 CEpCs对于GelMA/HAMA DN水凝胶的增殖 |
| 4.3.9 CEpCs在GelMA/HAMA DN水凝胶上的生存力 |
| 4.3.10 CEpCs在GelMA/HAMA DN水凝胶上的形态 |
| 4.3.11 CEpCs在GelMA/HAMA DN水凝胶上CK3的表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）血浆纤维蛋白膜负载骨髓间充质干细胞与角膜上皮细胞用于大鼠角膜碱烧伤修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 角膜结构 |
| 2 角膜损伤 |
| 3 角膜损伤的治疗方式 |
| 4 干细胞 |
| 5 细胞支架 |
| 6 本课题设计思路与拟解决问题 |
| 第二章 大鼠BMSCs及角膜上皮细胞的分离培养与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试药 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 BMSCs的分离、培养与鉴定 |
| 2.2 角膜上皮细胞的分离、培养与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 BMSCs的形态学观察 |
| 3.2 BMSCs表面标记物的鉴定 |
| 3.3 角膜上皮细胞的形态学观察 |
| 3.4 角膜上皮细胞的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 角膜上皮细胞对接触共培养BMSCs的诱导分化 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试药 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 BMSCs与角膜上皮细胞共培养 |
| 3 结果 |
| 3.1 BMSCs与角膜上皮细胞不同比例接触共培养7天后,BMSCs中角膜细胞相关基因△Ct值结果 |
| 3.2 BMSCs与角膜上皮细胞不同比例接触共培养7天后,BMSCs中角膜上皮细胞相关基因的相对表达量 |
| 4 讨论 |
| 第四章 血浆纤维蛋白膜的制备与性能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试药 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 血浆纤维蛋白膜的制备 |
| 2.3 血浆纤维蛋白膜的超微结构表征 |
| 2.4 血浆纤维蛋白膜流变性检测 |
| 2.5 血浆纤维蛋白膜负载细胞 |
| 3 结果 |
| 3.1 血浆纤维蛋白膜的制备 |
| 3.2 血浆纤维蛋白膜形貌 |
| 3.3 血浆纤维蛋白膜流变学检测 |
| 3.4 血浆纤维蛋白膜负载细胞观察 |
| 4 讨论 |
| 第五章 负载BMSCs及角膜上皮细胞的血浆纤维蛋白膜片对大鼠角膜碱烧伤的治疗 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试药 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 制备负载BMSCs和角膜上皮细胞的细胞膜片 |
| 2.2 负载BMSCs与角膜细胞的血浆纤维蛋白膜片治疗大鼠角膜碱烧伤 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 荧光素钠染色观察上皮缺损恢复情况 |
| 3.2 HE染色观察角膜结构恢复情况 |
| 3.3 免疫荧光染色检测角膜损伤的治疗情况 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）复合改性胶原膜及间充质干细胞用于角膜修复的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 角膜组织与角膜病 |
| 1.2.1 角膜的结构与功能 |
| 1.2.2 角膜病 |
| 1.3 角膜损伤修复 |
| 1.3.1 角膜上皮的损伤修复 |
| 1.3.2 角膜基质的损伤修复 |
| 1.4 角膜再生修复替代材料 |
| 1.4.1 羊膜 |
| 1.4.2 角膜脱细胞基质 |
| 1.4.3 胶原 |
| 1.4.4 明胶 |
| 1.4.5 丝蛋白 |
| 1.5 MSCs的概述及其用于角膜损伤修复 |
| 1.5.1 MSCs的来源与特性 |
| 1.5.2 MSCs的培养与鉴定 |
| 1.5.3 MSCs的转分化作用 |
| 1.5.4 MSCs的免疫调节作用 |
| 1.5.5 MSCs的新生血管调节作用 |
| 1.6 本文的研究目的、意义以及内容 |
| 第二章 胶原基纤维素纳米晶复合膜的制备与表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.3 胶原基纤维素纳米晶复合膜的制备 |
| 2.3.1 胶原溶液的制备 |
| 2.3.2 胶原基纤维素纳米晶复合膜的制备 |
| 2.4 胶原基纤维素纳米晶复合膜的理化性能表征 |
| 2.4.1 形貌表征 |
| 2.4.2 粗糙度测定 |
| 2.4.3 溶胀性能测定 |
| 2.4.4 力学性能测定 |
| 2.4.5 透光性测定 |
| 2.4.6 体外降解速率测定 |
| 2.4.7 接触角测定 |
| 2.5 胶原基纤维素纳米晶复合膜的细胞生物学表征 |
| 2.5.1 角膜细胞的培养 |
| 2.5.2 角膜细胞的接种 |
| 2.5.3 角膜细胞的粘附 |
| 2.5.4 角膜细胞的形态 |
| 2.5.5 角膜细胞的增殖 |
| 2.5.6 角膜上皮细胞的体外划痕实验 |
| 2.5.7 角膜基质细胞向肌成纤维细胞分化研究 |
| 2.5.8 数据分析 |
| 2.6 结果与讨论 |
| 2.6.1 胶原基纤维素纳米晶复合膜的形貌 |
| 2.6.2 胶原基纤维素纳米晶复合膜的溶胀性能 |
| 2.6.3 胶原基纤维素纳米晶复合膜的力学性能 |
| 2.6.4 胶原基纤维素纳米晶复合膜的透光性能 |
| 2.6.5 胶原基纤维素纳米晶复合膜的体外降解速率 |
| 2.6.6 胶原基纤维素纳米晶复合膜的亲疏水性 |
| 2.6.7 角膜细胞的粘附 |
| 2.6.8 角膜细胞的形态 |
| 2.6.9 角膜细胞的增殖 |
| 2.6.10 角膜上皮细胞划痕实验 |
| 2.6.11 角膜基质细胞肌成纤维分化 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 改性胶原膜及BMSCs用于角膜损伤修复的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.3 BMSCs的分离培养鉴定与体外研究 |
| 3.3.1 BMSCs的原代及传代培养 |
| 3.3.2 BMSCs表面抗原的鉴定 |
| 3.3.3 BMSCs体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化 |
| 3.3.4 BMSCs体外共培养分化为角膜上皮样细胞 |
| 3.3.5 BMSCs体外共培养抑制肌成纤维细胞分化相关因子的分泌 |
| 3.3.6 数据分析 |
| 3.4 胶原基膜联合BMSCs用于角膜损伤修复 |
| 3.4.1 胶原基膜和BMSCs的制备 |
| 3.4.2 实验动物 |
| 3.4.3 角膜板层移植 |
| 3.4.4 裂隙灯观察 |
| 3.4.5 荧光素钠染色 |
| 3.4.6 OCT观察 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 BMSCs的形态观察 |
| 3.5.2 BMSCs表面抗原的鉴定 |
| 3.5.3 BMSCs体外诱导成骨细胞及脂肪细胞的分化 |
| 3.5.4 BMSCs体外共培养分化为角膜上皮样细胞 |
| 3.5.5 BMSCs共培养抑制肌成纤维细胞分化相关因子的分泌 |
| 3.5.6 白光拍照观察 |
| 3.5.7 裂隙灯观察 |
| 3.5.8 上皮化进程观察 |
| 3.5.9 OCT观察 |
| 3.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）兔角膜基质细胞及脱细胞猪角膜基质构建组织工程角膜移植的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）胶原膜表面图案化及其调控角膜细胞行为的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 角膜与角膜组织工程 |
| 1.3 角膜组织工程支架材料 |
| 1.3.1 脱细胞角膜基质 |
| 1.3.2 羊膜 |
| 1.3.3 胶原 |
| 1.3.4 明胶 |
| 1.3.5 丝蛋白 |
| 1.3.6 壳聚糖 |
| 1.3.7 其它人工合成高分子材料 |
| 1.4 表面图案化及其制备方法 |
| 1.4.1 光刻 |
| 1.4.2 软刻蚀 |
| 1.4.3 热压印 |
| 1.4.4 蘸笔纳米刻蚀 |
| 1.5 拓扑结构对角膜细胞的调控作用 |
| 1.5.1 拓扑结构对角膜上皮细胞的调控作用 |
| 1.5.2 拓扑结构对角膜基质细胞的调控作用 |
| 1.5.3 拓扑结构对角膜内皮细胞的调控作用 |
| 1.6 本文的研究目的、意义以及研究内容 |
| 第二章 微沟槽胶原膜的构建及理化性能表征 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.3 微沟槽胶原膜的制备 |
| 2.3.1 硅片模板的制备 |
| 2.3.2 PDMS模板的制备 |
| 2.3.3 胶原膜的制备 |
| 2.4 微沟槽胶原膜的理化性能表征 |
| 2.4.1 形貌观察 |
| 2.4.2 接触角测定 |
| 2.4.3 溶胀性能测定 |
| 2.4.4 透光性能测定 |
| 2.4.5 离子渗透性能测定 |
| 2.4.6 体外降解速率测定 |
| 2.4.7 力学性能测定 |
| 2.4.8 数据处理、统计与分析 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 微沟槽胶原膜的形貌 |
| 2.5.2 微沟槽胶原膜的接触角 |
| 2.5.3 微沟槽胶原膜的溶胀性能 |
| 2.5.4 微沟槽胶原膜的透光性能 |
| 2.5.5 微沟槽胶原膜的离子渗透性能 |
| 2.5.6 微沟槽胶原膜的体外降解速率 |
| 2.5.7 微沟槽胶原膜的力学性能 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 微沟槽胶原膜对角膜细胞行为的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.3 微沟槽胶原膜的细胞生物学表征 |
| 3.3.1 细胞的培养 |
| 3.3.2 细胞的接种 |
| 3.3.3 接种细胞后胶原膜的形貌观察 |
| 3.3.4 接种细胞后胶原膜的透光性能测定 |
| 3.3.5 细胞的形态及取向观察 |
| 3.3.6 细胞的增殖与粘附 |
| 3.3.7 细胞的迁移 |
| 3.3.8 标志基因的表达水平检测 |
| 3.3.9 标志蛋白的表达水平检测 |
| 3.3.10 数据处理、统计与分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 细胞生长对胶原膜形貌及透光性能的影响 |
| 3.4.2 角膜细胞的取向 |
| 3.4.3 角膜细胞的增殖 |
| 3.4.4 角膜细胞的粘附 |
| 3.4.5 角膜上皮细胞的迁移 |
| 3.4.6 角膜基质细胞的分化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 微点阵胶原膜对角膜细胞行为的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.3 微点阵胶原膜的制备 |
| 4.4 微点阵胶原膜的理化性能表征 |
| 4.4.1 形貌观察 |
| 4.4.2 接触角测定 |
| 4.4.3 表面粗糙度测定 |
| 4.4.4 溶胀性能测定 |
| 4.4.5 力学性能测定 |
| 4.5 微点阵胶原膜的细胞生物学表征 |
| 4.5.1 细胞的培养及接种 |
| 4.5.2 细胞的形态及取向观察 |
| 4.5.3 细胞的形态定量分析 |
| 4.5.4 细胞的增殖与粘附 |
| 4.5.5 数据处理、统计与分析 |
| 4.6 结果与讨论 |
| 4.6.1 微点阵胶原膜的形貌 |
| 4.6.2 微点阵胶原膜的粗糙度 |
| 4.6.3 微点阵胶原膜的亲疏水性 |
| 4.6.4 微点阵胶原膜的溶胀性能 |
| 4.6.5 微点阵胶原膜的力学性能 |
| 4.6.6 角膜细胞的形态观察 |
| 4.6.7 角膜细胞的粘附 |
| 4.6.8 角膜细胞的增殖 |
| 4.7 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）利用鱼类胶原蛋白支架体外构建组织工程全层人角膜的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 角膜的解剖学特征与生理功能 |
| 1.1 角膜的解剖学特征 |
| 1.1.1 上皮层 |
| 1.1.2 前弹力层 |
| 1.1.3 基质层 |
| 1.1.4 后弹力层 |
| 1.1.5 内皮层 |
| 1.1.6 角膜缘 |
| 1.2 角膜的生理功能 |
| 1.2.1 屏障功能 |
| 1.2.2 透光功能 |
| 1.2.3 屈光功能 |
| 2 角膜病变及治疗 |
| 3 组织工程角膜研究进展 |
| 3.1 组织工程角膜种子细胞的研究 |
| 3.1.1 角膜缘干细胞(limbal stem cells) |
| 3.1.2 间充质干细胞(mesenchymal stem cells) |
| 3.1.3 角膜上皮细胞(corneal epithelial cells) |
| 3.1.4 口腔黏膜上皮细胞(oral mucosa epithelial cell) |
| 3.1.5 角膜基质细胞(corneal stromal cells) |
| 3.1.6 角膜内皮细胞(corneal endothelial cells) |
| 3.2 组织工程角膜载体支架材料的研究 |
| 3.2.1 天然生物材料 |
| 3.2.2 人工合成高分子材料 |
| 3.2.3 生物大分子复合材料 |
| 3.3 组织工程全层角膜体外构建研究进展 |
| 4 本文的研究目的和意义 |
| 第二章 鱼类胶原蛋白支架的制备及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鱼胶原蛋白鉴定 |
| 2.1.1 鱼胶原蛋白分子量检测 |
| 2.1.2 鱼胶原蛋白氨基酸组成分析 |
| 2.2 交联条件优化 |
| 2.2.1 交联浓度优化 |
| 2.2.2 交联时间优化 |
| 2.2.3 冰冻切片 |
| 2.2.4 HE染色 |
| 2.3 鱼类胶原蛋白支架的制备 |
| 2.4 鱼类胶原蛋白支架理化性质检测 |
| 2.4.1 外观观察 |
| 2.4.2 透光率 |
| 2.4.3 含水量检测 |
| 2.4.4 力学性能检测 |
| 2.4.5 鱼类胶原蛋白支架组织结构检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 鱼胶原蛋白鉴定 |
| 3.1.1 分子量检测 |
| 3.1.2 氨基酸分析 |
| 3.2 EDC/NHS交联条件优化 |
| 3.2.1 交联浓度优化 |
| 3.2.2 交联时间优化 |
| 3.3 鱼类胶原蛋白支架的鉴定 |
| 3.3.1 透光性能检测 |
| 3.3.2 含水量检测 |
| 3.3.3 力学性能检测 |
| 3.3.4 鱼类胶原蛋白支架的组织结构 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 人角膜组织细胞的体外扩增培养及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的复苏及扩增培养 |
| 2.1.1 细胞的复苏 |
| 2.1.2 细胞的扩增培养 |
| 2.2 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的细胞生长曲线测定 |
| 2.3 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的染色体组型分析 |
| 2.4 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的免疫细胞化学检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的生长特性 |
| 3.2 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的染色体组型分析 |
| 3.2.1 HCEP细胞的染色体组型 |
| 3.2.2 HCS细胞的染色体计数与核型分析 |
| 3.2.3 HCE细胞的染色体计数与核型分析 |
| 3.3 HCEP细胞、HCS细胞及HCE细胞的免疫细胞化学检测 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 鱼类胶原蛋白支架的生物相容性研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鱼类胶原蛋白支架的制备和灭菌处理 |
| 2.1.1 鱼类胶原蛋白支架的制备 |
| 2.1.2 鱼类胶原蛋白支架的灭菌处理 |
| 2.2 鱼类胶原蛋白支架浸提液制备 |
| 2.3 人角膜细胞的体外培养与接种 |
| 2.3.1 人角膜细胞体外培养 |
| 2.3.2 接种前鱼类胶原蛋白支架的处理 |
| 2.3.3 HCEP细胞的CFSE标记与接种 |
| 2.3.4 HCS细胞的DiI标记与接种 |
| 2.3.5 HCE细胞的Celltrace标记与接种 |
| 2.4 生物相容性检测 |
| 2.4.1 细胞活力检测 |
| 2.4.2 RT-PCR检测 |
| 2.4.3 荧光标记物观察 |
| 2.4.4 免疫组织化学检测 |
| 2.5 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 鱼类胶原蛋白支架浸提液对种子细胞的细胞活力影响 |
| 3.2 鱼类胶原蛋白支架中种子细胞的生长及增殖基因的表达情况 |
| 3.3 鱼类胶原蛋白支架中种子细胞标志蛋白与功能蛋白表达情况 |
| 3.3.1 鱼类胶原蛋白支架中HCEP细胞标志蛋白与功能蛋白表达情况 |
| 3.3.2 鱼类胶原蛋白支架中HCS细胞标志蛋白与功能蛋白表达情况 |
| 3.3.3 鱼类胶原蛋白支架中HCE细胞标志蛋白与功能蛋白表达情况 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 体外构建组织工程全层人角膜的实验研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鱼类胶原蛋白支架的制备和火菌处理 |
| 2.1.1 鱼类胶原蛋白支架制备 |
| 2.1.2 鱼类胶原蛋白支架的灭菌处理 |
| 2.2 种子细胞接种天数的优化 |
| 2.2.1 接种前鱼类胶原蛋白支架的处理 |
| 2.2.2 HCEP细胞的CFSE标记与接种天数优化 |
| 2.2.3 HCS细胞的Dil标记与接种天数优化 |
| 2.2.4 HCE细胞的Celltrace标记与接种天数优化 |
| 2.2.5 冰冻切片与HE检测 |
| 2.2.6 细胞标记物荧光观察 |
| 2.3 TE-flHC的体外构建 |
| 2.4 体外构建的TE-flHC的鉴定 |
| 2.4.1 光学透明度与透光率 |
| 2.4.2 冰冻切片与HE检测 |
| 2.4.3 TE-flHC内皮的茜素红染色 |
| 2.4.4 细胞标记物焚光观察 |
| 2.4.5 扫描电镜检测 |
| 2.4.6 透射电镜检测 |
| 2.4.7 免疫组织化学检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 种子细胞接种大数的优化 |
| 3.1.1 HCEP细胞接种天数优化 |
| 3.1.2 HCS细胞接种天数优化 |
| 3.1.3 HCE细胞接种天数优化 |
| 3.2 TE-flHC的透光性能检测 |
| 3.3 TE-flHC组织结构观察 |
| 3.4 TE-flHC的超微结构观察 |
| 3.5 TE-flHC的生物学功能检测 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）组织工程人后板层半角膜体外构建的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 角膜基本结构 |
| 1.1 角膜上皮层 |
| 1.2 角膜前弹力层 |
| 1.3 角膜基质层 |
| 1.4 角膜后弹力层 |
| 1.5 角膜内皮层 |
| 2 组织工程角膜概述 |
| 3 组织工程角膜种子细胞的研究概述 |
| 3.1 原代或传代细胞 |
| 3.2 成体干细胞 |
| 3.3 胚胎干细胞 |
| 3.4 永生化细胞系 |
| 4 组织工程角膜载体支架的研究概述 |
| 4.1 天然材料 |
| 4.1.1 羊膜 |
| 4.1.2 脱细胞角膜基质 |
| 4.2 生物大分子材料 |
| 4.2.1 胶原 |
| 4.2.2 丝素蛋白 |
| 4.2.3 纤维蛋白 |
| 4.2.4 壳聚糖 |
| 4.3 人工合成高分子材料 |
| 4.4 细胞片技术 |
| 5 脱细胞角膜在组织工程角膜中的应用 |
| 5.1 脱细胞方法 |
| 5.1.1 物理方法 |
| 5.1.2 化学方法 |
| 5.1.3 渗透溶液法 |
| 5.1.4 生物方法 |
| 5.1.5 螫合剂 |
| 5.1.6 醇类 |
| 5.2 脱细胞角膜在组织工程角膜构建中的应用 |
| 5.2.1 角膜基质细胞的接种 |
| 5.2.2 角膜基质细胞的接种 |
| 6 本文研究目的及意义 |
| 第二章 人角膜内皮细胞和基质细胞的扩增培养及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HCE细胞和HCS细胞的复苏和体外扩增培养 |
| 2.1.1 HCE细胞和HCS的复苏 |
| 2.1.2 HCE细胞和HCS细胞的体外扩增培养 |
| 2.2 HCE细胞和HCS细胞的生长特性测定 |
| 2.3 HCE细胞和HCS细胞的染色体组型分析 |
| 2.4 HCE细胞和HCS细胞的免疫化学检测 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCE细胞的形态观察 |
| 3.2 HCE细胞和HCS细胞生长特性 |
| 3.3 HCE细胞和HCS细胞的染色体核型分析 |
| 3.4 HCE细胞和HCS细胞相关蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 脱细胞猪角膜基质支架的制备及鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 脱细胞猪角膜基质支架的制备 |
| 2.1.1 猪角膜的取材 |
| 2.1.2 猪角膜的脱细胞处理与保存 |
| 2.2 脱细胞猪角膜基质光学性能检查 |
| 2.2.1 形态观察 |
| 2.2.2 透光率检测 |
| 2.3 脱细胞猪角膜基质组织结构学检查 |
| 2.3.1 石蜡切片与H&E染色 |
| 2.3.1.1 石蜡切片制作 |
| 2.3.1.2 H&E染色 |
| 2.3.2 透射电镜观察 |
| 2.3.3 扫描电镜观察 |
| 2.4 脱细胞猪角膜基质成分分析 |
| 2.4.1 含水量测定 |
| 2.4.2 冰冻切片与DAPI染色 |
| 2.4.3 DNA含量检测 |
| 2.4.4 阿利新兰染色 |
| 2.5 脱细胞猪角膜基质生物力学性能测试 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脱细胞猪角膜基质的理化性质鉴定 |
| 3.1.1 外观观察 |
| 3.1.2 透光率 |
| 3.2 脱细胞猪角膜基质的组织结构检查 |
| 3.2.1 H&E染色结果 |
| 3.2.2 透射电镜观察结果 |
| 3.2.3 扫描电镜观察结果 |
| 3.3 脱细胞猪角膜基质的成分 |
| 3.3.1 含水量测定 |
| 3.3.2 脱细胞猪角膜基质DAPI染色结果 |
| 3.3.3 DNA定量检测结果 |
| 3.3.4 脱细胞猪角膜基质阿利新兰染色结果 |
| 3.4 脱细胞猪角膜基质的生物力学检查结果 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 脱细胞猪角膜基质支架的生物相容性研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 aPCS浸提液对HCE细胞及HCS细胞毒性检测 |
| 2.1.1 浸提液制备 |
| 2.1.2 形态学观察 |
| 2.1.3 增殖能力检测 |
| 2.2 接种于aPCS支架上的HCE细胞及HCS细胞免疫化学检测 |
| 2.2.1 HCS细胞的接种 |
| 2.2.2 HCS细胞免疫细胞化学检测 |
| 2.2.3 HCE细胞的接种 |
| 2.2.4 HCE细胞免疫细胞化学检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 aPCS浸提液对HCE细胞及HCS细胞活力影响作用分析 |
| 3.1.1 HCE细胞和HCS细胞形态学评价 |
| 3.1.2 增殖能力检测结果 |
| 3.2 接种于aPCS支架的HCE细胞及HCS细胞属性和功能蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 体外构建组织工程人角膜后板层的实验研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 组织工程人后板层半角膜接种HCE细胞条件摸索 |
| 2.1.1 HCE细胞的接种方法的比较 |
| 2.1.1.1 HCE细胞温敏培养板法 |
| 2.1.1.2 HCE细胞直接接种法 |
| 2.1.1.3 接种HCE细胞的aPCS茜素红染色 |
| 2.1.2 aPCS接种HCE细胞的培养时间摸索 |
| 2.2 组织工程人后板层半角膜接种HCS细胞条件摸索 |
| 2.2.1 HCS细胞的接种方法的比较 |
| 2.2.1.1 HCS细胞的DiI细胞标记 |
| 2.2.1.2 HCS细胞直接接种法 |
| 2.2.1.3 HCS细胞注射接种法 |
| 2.2.1.4 HCS细胞标记的荧光观察 |
| 2.2.2 aPCS接种HCE细胞的培养时间摸索 |
| 2.3 组织工程人后板层半角膜的体外构建 |
| 2.4 体外构建组织工程人后板层半角膜的鉴定 |
| 2.4.1 TE-pHC内皮的茜素红染色 |
| 2.4.2 冰冻切片的细胞荧光标记观察 |
| 2.4.3 石蜡切片H&E染色 |
| 2.4.4 TE-pHC的免疫组织化学检测 |
| 2.4.5 TE-pHC的透射电镜观察 |
| 2.4.6 TE-pHC的扫描电镜观察 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 aPCS接种HCE细胞的摸索 |
| 3.1.1 HCE细胞接种方式的比较 |
| 3.1.2 HCE细胞在后弹力层面形成单层情况 |
| 3.1.3 HCE细胞的分布与定位 |
| 3.2 aPCS接种HCS细胞的摸索 |
| 3.2.1 HCS细胞接种方式的比较 |
| 3.2.2 HCS细胞在aPCS支架中的分布情况 |
| 3.3 体外构建TE-pHC的鉴定 |
| 3.3.1 TE-pHC的内皮单层茜素红染色 |
| 3.3.2 细胞荧光标记观察和H&E染色 |
| 3.3.3 TE-pHC的免疫组织化学检测 |
| 3.3.4 TE-pHC的扫描电镜检测 |
| 3.3.5 TE-pHC的透射电镜检测 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在校期间发表论文 |
（8）组织工程人角膜内皮的体外重建及其动物移植试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 组织工程人角膜内皮的研究综述 |
| 1 角膜内皮与角膜内皮异常 |
| 1.1 角膜内皮的形态特征及超微结构 |
| 1.2 角膜内皮的细胞密度 |
| 1.3 角膜内皮细胞的增殖能力 |
| 1.3.1 不同物种的角膜内皮细胞增殖力 |
| 1.3.2 不同年龄段的角膜内皮细胞增殖力 |
| 1.3.3 角膜中央和周边的内皮细胞增殖力 |
| 1.3.4 角膜内皮细胞增殖力的体内调控 |
| 1.4 角膜内皮的生理功能 |
| 1.4.1 角膜内皮的渗漏屏障功能 |
| 1.4.2 角膜内皮的主动液泵功能 |
| 1.5 角膜内皮异常 |
| 2 组织工程人角膜内皮的诞生 |
| 3 组织工程人角膜内皮种子细胞的研究概述 |
| 3.1 成体干细胞（前体细胞） |
| 3.2 永生化人角膜细胞系 |
| 3.3 非转染的人角膜内皮细胞 |
| 4 组织工程人角膜内皮载体支架的研究概述 |
| 4.1 天然生物膜 |
| 4.1.1 脱细胞角膜基质 |
| 4.1.2 后弹力层膜 |
| 4.1.3 晶状体前囊膜 |
| 4.1.4 羊膜 |
| 4.2 生物大分子 |
| 4.2.1 明胶 |
| 4.2.2 胶原 |
| 4.2.3 丝素蛋白 |
| 4.3 合成材料 |
| 4.4 生物大分子与合成材料共混膜 |
| 4.5 细胞片层 |
| 5 组织工程人角膜内皮结构和功能的评价方法 |
| 5.1 组织工程人角膜内皮结构的体外评价方法 |
| 5.2 组织工程人角膜内皮功能的体外评价方法 |
| 5.3 组织工程人角膜内皮功能的在体评价方法 |
| 5.3.1 移植动物模型的选择 |
| 5.3.2 移植后在体评价方法 |
| 5.3.3 移植后离体评价方法 |
| 6 组织工程角膜内皮体外重建中的问题与难点 |
| 7 本文的研究目的与意义 |
| 第二章 组织工程人角膜内皮种子细胞的培养及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.5 常用溶液的配方 |
| 1.5.1 D-Hanks 平衡盐溶液 |
| 1.5.2 PBS 缓冲液 |
| 1.5.3 胰酶-EDTA 消化液 |
| 1.5.4 吉姆萨染液（母液） |
| 2 方法 |
| 2.1 单克隆人角膜内皮细胞的体外培养 |
| 2.1.1 单克隆人角膜内皮细胞的复苏 |
| 2.1.2 单克隆人角膜内皮细胞的体外扩增培养 |
| 2.2 单克隆人角膜内皮细胞的生长特性检测 |
| 2.3 单克隆人角膜内皮细胞的染色体标本制作与组型分析 |
| 2.4 单克隆人角膜内皮细胞的免疫化学检测 |
| 2.5 单克隆人角膜内皮细胞的致瘤性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 单克隆人角膜内皮细胞的形态特征 |
| 3.2 单克隆人角膜内皮细胞的生长特性 |
| 3.3 单克隆人角膜内皮细胞的染色体核型 |
| 3.4 单克隆人角膜内皮细胞标志蛋白的表达 |
| 3.5 单克隆人角膜内皮细胞功能蛋白的表达 |
| 3.5.1 单克隆人角膜内皮细胞连接蛋白的表达 |
| 3.5.2 单克隆人角膜内皮细胞膜运输蛋白的表达 |
| 3.6 单克隆人角膜内皮细胞的致瘤性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 薄化去上皮层修饰羊膜载体支架的制备及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 常用溶液的配方 |
| 1.4.1 PBS 缓冲液（见第二章） |
| 1.4.2 D-Hanks 平衡盐溶液（见第二章） |
| 1.4.3 胰酶-EDTA 消化液（见第二章） |
| 1.4.4 5 mg/mL MTT 溶液 |
| 1.4.5 浸提液Ⅰ |
| 1.4.6 浸提液Ⅱ |
| 1.4.7 0.2%茜素红液 |
| 1.4.8 石蜡切片及 HE 染色所需溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 新鲜羊膜的制备与保存 |
| 2.1.1 胎盘的取材 |
| 2.1.2 新鲜羊膜的剥离及清洗 |
| 2.1.3 新鲜羊膜的保存 |
| 2.2 去上皮层羊膜的制备 |
| 2.3 去上皮层羊膜的薄化处理 |
| 2.4 薄化去上皮层羊膜的修饰 |
| 2.5 薄化去上皮层修饰羊膜的理化性质检测 |
| 2.5.1 厚度检测 |
| 2.5.2 透明度检测 |
| 2.5.3 透光率检测 |
| 2.5.4 重金属检测 |
| 2.6 薄化去上皮层修饰羊膜的生物学性质检测 |
| 2.6.1 薄化去上皮层修饰羊膜的石蜡切片及 HE 染色 |
| 2.6.2 薄化去上皮层修饰羊膜的热源性检测 |
| 2.6.3 薄化去上皮层修饰羊膜的细菌内毒素检测 |
| 2.6.4 薄化去上皮层修饰羊膜的眼刺激试验 |
| 2.6.5 薄化去上皮层修饰羊膜的皮下植入实验 |
| 2.7 薄化去上皮层修饰羊膜与单克隆人角膜内皮细胞的生物相容性研究 |
| 2.7.1 薄化去上皮层修饰羊膜浸提液的细胞毒性检测 |
| 2.7.2 薄化去上皮层修饰羊膜与单克隆人角膜内皮细胞直接接触的实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 薄化去上皮层修饰羊膜的制备与修饰 |
| 3.2 薄化去上皮层修饰羊膜的理化性质 |
| 3.2.1 薄化去上皮层修饰羊膜的厚度 |
| 3.2.2 薄化去上皮层修饰羊膜的透明度 |
| 3.2.3 薄化去上皮层修饰羊膜的透光率 |
| 3.2.4 薄化去上皮层修饰羊膜的重金属含量 |
| 3.3 薄化去上皮层修饰羊膜的生物学评价 |
| 3.3.1 薄化去上皮层修饰羊膜的组织结构 |
| 3.3.2 薄化去上皮层修饰羊膜的热源性 |
| 3.3.3 薄化去上皮层修饰羊膜的细菌内毒素含量 |
| 3.3.4 薄化去上皮层修饰羊膜的眼刺激实验 |
| 3.3.5 薄化去上皮层修饰羊膜的大鼠皮下植入实验 |
| 3.4 薄化去上皮层修饰羊膜与单克隆人角膜内皮细胞的生物相容性研究 |
| 3.4.1 薄化去上皮层修饰羊膜浸提液的细胞毒性 |
| 3.4.2 薄化去上皮层修饰羊膜与单克隆人角膜内皮细胞的直接接触实验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 组织工程人角膜内皮的体外重建及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 常用溶液的配方 |
| 1.4.1 PBS 缓冲液（见第二章） |
| 1.4.2 D-Hanks 平衡盐溶液（见第二章） |
| 1.4.3 胰酶-EDTA 消化液（见第二章） |
| 1.4.4 0.2%茜素红液（见第三章） |
| 2 方法 |
| 2.1 组织工程人角膜内皮种子细胞的扩增培养 |
| 2.2 薄化去上皮层修饰羊膜的制备与修饰 |
| 2.3 组织工程人角膜内皮的体外重建 |
| 2.4 组织工程人角膜内皮的鉴定 |
| 2.4.1 形态观察 |
| 2.4.2 茜素红染色和细胞密度计数 |
| 2.4.3 免疫荧光化学检测 |
| 2.4.4 石蜡切片及 HE 染色 |
| 2.4.5 扫描电镜检测 |
| 2.4.6 透射电镜检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 形态特征 |
| 3.2 茜素红染色 |
| 3.3 细胞密度 |
| 3.4 石蜡切片及 HE 染色结果 |
| 3.5 免疫荧光检测 |
| 3.6 扫描电镜检测 |
| 3.7 透射电镜检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 组织工程人角膜内皮的家猫移植 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 常用溶液的配方 |
| 1.4.1 DiI 工作液 |
| 2 方法 |
| 2.1 组织工程人角膜内皮的体外重建 |
| 2.2 组织工程人角膜内皮的家猫后板层角膜内皮移植 |
| 2.3 移植家猫的护理和观察 |
| 2.4 移植家猫术后的在体检测 |
| 2.5 移植家猫术后的离体检测 |
| 2.5.1 DiI 荧光标记检测 |
| 2.5.2 茜素红染色 |
| 2.5.3 石蜡切片切片及 HE 染色 |
| 2.5.4 扫描电镜检测 |
| 2.5.5 透射电镜检测 |
| 2.5.6 房水的二维电泳检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 体外重建的组织工程人角膜内皮 |
| 3.2 移植家猫术后的在体检测 |
| 3.2.1 裂隙灯显微镜检测 |
| 3.2.2 角膜厚度检测 |
| 3.2.3 眼压检测 |
| 3.4 移植家猫术后的离体鉴定 |
| 3.4.1 DiI 荧光标记检测 |
| 3.4.2 茜素红染色 |
| 3.4.3 石蜡切片及 HE 染色 |
| 3.4.4 扫描电镜检测 |
| 3.4.5 透射电镜检测 |
| 3.4.6 房水二维电泳检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第六章 组织工程人角膜内皮的猕猴移植 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 常用溶液的配方 |
| 1.4.1 DiI 工作液 |
| 2 方法 |
| 2.1 组织工程人角膜内皮的体外重建 |
| 2.2 组织工程人角膜内皮的猕猴后板层角膜内皮移植 |
| 2.3 移植猕猴的护理和观察 |
| 2.4 移植猕猴术后的在体检测 |
| 2.5 移植猕猴术后的离体检测 |
| 2.5.1 DiI 荧光标记检测 |
| 2.5.2 茜素红染色 |
| 2.5.3 石蜡切片切片及 HE 染色 |
| 2.5.4 扫描电镜检测 |
| 2.5.5 透射电镜检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 体外重建的组织工程人角膜内皮 |
| 3.2 移植猕猴术后的在体检测 |
| 3.2.1 裂隙灯显微镜检测 |
| 3.2.2 角膜厚度检测 |
| 3.2.3 眼压检测 |
| 3.3 移植猕猴术后的离体检测 |
| 3.3.1 DiI 荧光标记 |
| 3.3.2 茜素红染色 |
| 3.3.3 石蜡切片及 HE 染色 |
| 3.3.4 扫描电镜检测 |
| 3.3.5 透射电镜检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文及专利 |
（9）基于脱细胞猪角膜基质的组织工程全层人角膜的体外重建、鉴定及其在动物移植中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 组织工程角膜的研究概述 |
| 1 角膜的结构与功能 |
| 1.1 角膜的解剖结构 |
| 1.2 角膜的生理功能 |
| 1.2.1 屏障功能 |
| 1.2.2 屈光功能 |
| 1.3 角膜疾病及治疗 |
| 2 组织工程学概述 |
| 2.1 组织工程学的建立与发展 |
| 2.2 组织工程的基本原理 |
| 2.3 组织工程的研究方向 |
| 2.3.1 组织工程种子细胞研究 |
| 2.3.2 组织工程支架材料研究 |
| 3 组织工程角膜的研究进展 |
| 3.1 组织工程角膜种子细胞的研究进展 |
| 3.1.1 胚胎干细胞研究 |
| 3.1.2 成体干细胞研究 |
| 3.1.3 其他类型细胞研究 |
| 3.2 组织工程角膜载体支架材料 |
| 3.2.1 天然材料 |
| 3.2.2 合成材料 |
| 4 本文的研究目的和意义 |
| 第二章 组织工程人全层角膜种子细胞的体外培养及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验药品 |
| 1.5 溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的复苏及扩增培养 |
| 2.1.1 细胞的复苏 |
| 2.1.2 细胞的扩增培养 |
| 2.2 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的细胞生长曲线测定 |
| 2.3 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的染色体组型分析 |
| 2.4 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的免疫荧光染色 |
| 2.5 细胞的致瘤性检验 |
| 2.6 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的生长特性 |
| 3.2 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的染色体计数与核型分析 |
| 3.3 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的免疫细胞化学检测 |
| 3.4 HCEP 细胞、HCS 细胞及 HCE 细胞的致瘤性检验 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 脱细胞猪角膜基质的制备及其鉴定 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验药品 |
| 1.5 主要溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 aPCS 的制备 |
| 2.2 aPCS 理化性能的检测 |
| 2.2.1 透光率检测 |
| 2.2.2 含水量检测 |
| 2.2.3 冰冻及石蜡切片 |
| 2.2.4 HE 染色 |
| 2.2.5 DAPI 染色 |
| 2.2.6 阿利新兰染色 |
| 2.2.7 电镜观察超微结构 |
| 2.3 aPCS 与角膜种子细胞的生物相容性研究 |
| 2.3.1 浸提液制备 |
| 2.3.2 细胞活力检测 |
| 2.3.3 细胞毒性检测 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 aPCS 外观 |
| 3.2 aPCS 理化性能 |
| 3.3 aPCS 与种子细胞的生物相容性 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 体外重建组织工程人全角膜的实验研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验药品 |
| 1.5 常用溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TE-HC 的体外重建 |
| 2.1.1 TE-HC 载体支架 aPCS 的制备 |
| 2.1.2 TE-HC 种子细胞的扩增培养 |
| 2.1.3 TE-HC 种子细胞的收集 |
| 2.1.4 TE-HC 的体外重建 |
| 2.2 体外重建 TE-HC 的鉴定 |
| 2.2.1 TE-HC 的光学透明度 |
| 2.2.2 TE-HC 内皮的茜素红染色 |
| 2.2.3 石蜡切片 HE 染色 |
| 2.2.4 TE-HC 的免疫细胞化学检测 |
| 2.2.5 TE-HC 的电镜观察 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TE-HC 的光学透明度 |
| 3.2 TE-HC 内皮的茜素红染色 |
| 3.3 石蜡切片 HE 染色 |
| 3.4 TE-HC 的电镜超微结构 |
| 3.5 TE-HC 的免疫组织化学检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 组织工程全层人角膜的动物移植研究 |
| 1 材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验药品 |
| 1.5 常用溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TE-HC 的体外重建 |
| 2.1.1 TE-HC 载体支架 aPCS 的制备 |
| 2.1.2 TE-HC 种子细胞的扩增培养 |
| 2.1.3 TE-HC 种子细胞的收集 |
| 2.1.4 TE-HC 种子细胞的标记 |
| 2.1.5 TE-HC 的体外重建 |
| 2.2 穿透性角膜移植及检测 |
| 2.2.1 穿透性角膜移植手术 |
| 2.2.2 术后护理 |
| 2.2.3 术后在体检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 标记种子细胞的 TE-HC 的体外重建 |
| 3.2 角膜厚度 |
| 3.3 眼压 |
| 3.4 裂隙灯观察 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文 |
（10）胶原基角膜修复材料的结构仿生构建与功能化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 角膜组织的结构和功能 |
| 1.1.1 角膜的结构 |
| 1.1.2 角膜的功能 |
| 1.2 组织工程化人工角膜 |
| 1.2.1 以羊膜为载体的组织工程化人工角膜 |
| 1.2.2 以人工合成聚合物材料为载体的组织工程化人工角膜 |
| 1.2.3 以天然高分子生物材料为载体的组织工程化人工角膜 |
| 1.2.4 以脱细胞角膜为载体的组织工程化人工角膜 |
| 1.2.5 摒弃支架材料的细胞片工程技术 |
| 1.3 胶原的性能及其在组织工程材料中的应用 |
| 1.3.1 胶原的性能 |
| 1.3.2 胶原在组织工程材料中的应用 |
| 1.4 常见的角膜移植手术 |
| 1.4.1 穿透性角膜移植术 |
| 1.4.2 板层角膜移植术 |
| 1.4.3 治疗性角膜移植术 |
| 1.4.4 其他角膜移植联合手术 |
| 1.5 本论文研究目的和意义以及研究内容 |
| 第二章 胶原-明胶-透明质酸复合膜的制备及其性能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和实验方法 |
| 2.2.1 主要实验材料与设备 |
| 2.2.2 胶原-明胶-透明质酸复合膜的制备 |
| 2.2.3 胶原-明胶-透明质酸复合膜的性能表征 |
| 2.2.4 胶原-明胶-透明质酸复合膜的细胞实验 |
| 2.2.5 兔眼角膜板层移植实验 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 交联反应机理 |
| 2.3.2 CGH 膜的力学性能 |
| 2.3.3 CGH 膜的亲疏水性 |
| 2.3.4 CGH 膜的吸水性能 |
| 2.3.5 CGH 膜在 PBS 溶液中的形貌变化 |
| 2.3.6 营养物质在 CGH631 膜中的透过率 |
| 2.3.7 CGH631 膜在 PBS 溶液和甘油中的透光率 |
| 2.3.8 角膜上皮细胞在 CGH631 膜上的生长与形貌 |
| 2.3.9 CGH631 膜的毒性试验 |
| 2.3.10 CGH631 膜的角膜板层移植实验 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 具有良好韧性的多孔胶原膜修复材料的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和实验方法 |
| 3.2.1 实验材料与主要设备 |
| 3.2.2 多孔胶原膜的制备 |
| 3.2.3 多孔胶原膜的性能表征 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 多孔胶原膜的力学性能分析 |
| 3.3.2 SEM 分析 |
| 3.3.3 离子和小分子在多孔胶原膜的扩散系数 |
| 3.3.4 多孔胶原膜的饱和吸水率 |
| 3.3.5 多孔胶原膜的光学性能 |
| 3.3.6 多孔胶原膜的生物相容性 |
| 3.3.7 多孔胶原膜的组织学切片观察 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 负载妥布霉素的胶原基抗菌角膜修复材料的制备及理化性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和实验方法 |
| 4.2.1 实验材料与主要设备 |
| 4.2.2 抗菌功能化胶原膜的制备 |
| 4.2.3 抗菌功能化胶原膜的理化性能表征 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 化学交联载药 |
| 4.3.2 Col 和 Col-Tob 膜的 XPS 分析 |
| 4.3.3 Col 和 Col-Tob 膜的红外光谱分析 |
| 4.3.4 Col 和 Col-Tob 膜的吸水率 |
| 4.3.5 Col 和 Col-Tob 膜的透光率 |
| 4.3.6 Col 和 Col-Tob 膜的力学性能 |
| 4.3.7 妥布霉素的负载量与缓释过程 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 负载妥布霉素的胶原基角膜修复材料的抗菌性能及生物相容性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验材料与主要设备 |
| 5.2.2 载药胶原膜的抗菌性能研究 |
| 5.2.3 载药胶原膜的体外细胞实验研究 |
| 5.2.4 载药胶原膜的体内动物实验研究 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 金黄色葡萄球菌在 Col 和 Col-Tob 膜上的生长 |
| 5.3.2 抗金黄色葡萄球菌定量结果 |
| 5.3.3 大肠杆菌在 Col 和 Col-Tob 膜上的生长 |
| 5.3.4 抗大肠杆菌定量结果 |
| 5.3.5 角膜上皮细胞在 Col-Tob 膜上的生长与形貌 |
| 5.3.6 Col-Tob 膜上的细胞毒性实验 |
| 5.3.7 Col-Tob 膜的组织学切片观察 |
| 5.3.8 Col-Tob 膜在兔眼表的板层移植手术 |
| 5.3.9 板层角膜移植的术后观察 |
| 5.3.10 术后三个月裂隙灯观察 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 层状结构仿生胶原角膜修复材料的制备与研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与实验方法 |
| 6.2.1 主要实验材料与设备 |
| 6.2.2 层状结构胶原膜的制备 |
| 6.2.3 层状结构胶原膜的性能表征 |
| 6.2.4 层状结构胶原膜的体内动物实验研究 |
| 6.3 层状结构胶原膜的性能表征结果 |
| 6.3.1 胶原溶液凝胶化过程中的气泡 |
| 6.3.2 胶原膜的表面和截面结构观察 |
| 6.3.3 吸水厚度变化与吸水率 |
| 6.3.4 光学性能 |
| 6.3.5 力学性能 |
| 6.3.6 营养物质在 Col CC91 CC82 和 CC73 膜中的透过率 |
| 6.3.7 人角膜上皮细胞在 Col CC91 CC82 和 CC73 膜上的生长 |
| 6.3.8 人角膜上皮细胞在 Col CC91 CC82 和 CC73 膜上的增殖试验 |
| 6.3.9 人角膜基质细胞在 Col CC91 CC82 和 CC73 膜上的增殖试验 |
| 6.3.10 疏松 Col 膜和致密 CC73 膜的组织学切片 |
| 6.3.11 兔眼表 Col 膜的层间移植和 CC73 膜的板层移植过程 |
| 6.3.12 兔眼表 Col 膜的层间移植术后观察 |
| 6.3.13 兔眼表 CC73 膜的板层移植术后观察 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 具有微粗糙表面结构的胶原角膜修复材料的研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与实验部分 |
| 7.2.1 主要实验材料与主要设备 |
| 7.2.2 具有微粗糙表面结构的胶原膜的制备 |
| 7.2.3 具有微粗糙表面结构的胶原膜的性能表征 |
| 7.3 实验结果与讨论 |
| 7.3.1 AD-Col 和 FD-Col 膜的表面结构 |
| 7.3.2 AD-Col 和 FD-Col 膜的吸水率与吸水厚度变化 |
| 7.3.3 AD-Col 和 FD-Col 膜的光学性能 |
| 7.3.4 AD-Col 和 FD-Col 的力学性能 |
| 7.3.5 离子和小分子在 AD-Col 和 FD-Col 膜中的扩散系数 |
| 7.3.6 人角膜上皮细胞在 AD-Col 和 FD-Col 膜上的生长 |
| 7.3.7 人角膜上皮细胞在 AD-Col 和 FD-Col 膜上的增殖试验 |
| 7.3.8 FD-Col 膜在兔眼表的板层移植 |
| 7.3.9 FD-Col 膜板层角膜移植的术后观察 |
| 7.3.10 FD-Col 移植后两个月裂隙灯观察 |
| 7.4 本章小结 |
| 结论 |
| 论文创新性 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、组织工程技术体外重建角膜上皮层的实验研究（论文参考文献）
- [1]基于光交联水凝胶的体外角膜再生研究[D]. 延亚云. 太原理工大学, 2021(01)
- [2]血浆纤维蛋白膜负载骨髓间充质干细胞与角膜上皮细胞用于大鼠角膜碱烧伤修复的实验研究[D]. 杨雪. 山东大学, 2020(04)
- [3]复合改性胶原膜及间充质干细胞用于角膜修复的研究[D]. 覃岚凤. 华南理工大学, 2020
- [4]兔角膜基质细胞及脱细胞猪角膜基质构建组织工程角膜移植的研究[D]. 张璐. 昆明医科大学, 2019(06)
- [5]胶原膜表面图案化及其调控角膜细胞行为的研究[D]. 熊思佳. 华南理工大学, 2019
- [6]利用鱼类胶原蛋白支架体外构建组织工程全层人角膜的研究[D]. 袁晓龙. 中国海洋大学, 2015(07)
- [7]组织工程人后板层半角膜体外构建的实验研究[D]. 庞鑫. 中国海洋大学, 2015(07)
- [8]组织工程人角膜内皮的体外重建及其动物移植试验[D]. 马西亚. 中国海洋大学, 2014(01)
- [9]基于脱细胞猪角膜基质的组织工程全层人角膜的体外重建、鉴定及其在动物移植中的作用研究[D]. 刁金美. 中国海洋大学, 2014(01)
- [10]胶原基角膜修复材料的结构仿生构建与功能化研究[D]. 刘杨. 华南理工大学, 2014(01)