一、Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较（论文文献综述）
李文桂,陈雅棠[1]（2019）在《重组Semliki森林病毒疫苗的研制现状》文中指出Semliki森林病毒引起的Semliki脑炎是一种自然疫原性疾病。该病毒可诱导感染的宿主产生细胞、体液和黏膜免疫应答,可通过分子生物学技术改造为理想的疫苗载体,从而表达病毒和细菌的多种蛋白。这些病原体包括流行性感冒病毒、马流感病毒、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、猪瘟病毒、罗氏病病毒、乙型肝炎病毒、猪园环病毒Ⅱ型、布鲁氏菌、肉毒梭菌等,本文对Semliki森林病毒介导的病原体疫苗的研制现状加以阐述。
张瑞环[2]（2020）在《流行性腹泻多表位复制子DNA疫苗的设计、制备及初步免疫评价》文中进行了进一步梳理由病原微生物感染引发的细菌性腹泻,是许多发展中国家常见的健康问题。特别是年龄在5岁以下的婴幼儿腹泻以及旅行者腹泻,目前并没有可用疫苗。临床研究数据显示单一致病菌疫苗,无法应对病原菌的多样性和多态性,导致无法引起对于细菌性腹泻的整体保护。因此我们的主要研究内容是开发新型安全,有效的联合腹泻疫苗制剂。核酸疫苗作为联合疫苗载体具有便于实现多抗原联合免疫、制备过程简便快速,可同时诱发体液免疫和细胞免疫等优势,但存在在大型动物以及人类中的免疫应答水平较低等缺点。因此本研究的目的为研发一种同时针对ETEC和Shigella两种病原菌的多价DNA疫苗,研究内容主要涉及多价DNA疫苗的设计和高效表达载体的选择,因此,本研究开展了如下的工作,并取得相应成效:首先,针对ETEC致病菌的主要致病因子LTB、CfaE、CssA,S.Sonnei致病菌的主要致病因子IPaB,应用生物信息学软件对其进行B和T细胞表位的筛选,选择16个优势表位包括线性B细胞表位（4个）、非线性B细胞表位（4个）、HTL表位（4个）以及CTL表位（4个）,理性设计MEG和MB多表位序列,通过3D结构模拟及抗原性预测,最终获得抗原指数高达0.94的多表位序列。其次,选择可高效表达外源蛋白的复制子载体pSFV,构建重组质粒pSFV-MEG和pSFV-MB作为DNA候选疫苗。在体外细胞中,对其进行免疫荧光和细胞凋亡能力的初步检测。结果表明,MEG和MB抗原蛋白可在真核细胞中正常表达。最后,利用脂质体-聚合物杂化纳米颗粒递送系统（PLNPs）,制备DNA疫苗制剂,并在BALB/C小鼠中进行免疫效果评价。实验结果显示,候选疫苗pSFV-MEG/PLNPs,以100μg/次的剂量,经三次免疫小鼠后,与PBS和空白PLNPs阴性对照组相比,可诱发小鼠血清中显着的IgG抗体水平（P<0.01）,且相较于普通疫苗载体,pSFV疫苗载体在血清中诱导产生更高的抗体水平,具有显着性差异（P<0.05）;小鼠脾脏T淋巴细胞中,CD4+T细胞比例增加,CD8+T细胞比例下降,CD4+T/CD8+T 比值增加,表明候选疫苗pSFV-MEG/PLNPs可激活机体的细胞免疫系统。因此证明pSFV-MEG/PLNPs可作为抗流行性腹泻的候选疫苗。综上,本研究利用生物信息学工具对流行性腹泻主要致病菌进行B细胞和T细胞抗原表位筛选,经过理性设计,构建复制子DNA疫苗表达载体（pSFV-MEG）,应用脂质体-聚合物杂化纳米颗粒递送系统,制备相应的DNA疫苗制剂,经过抗体水平及细胞免疫水平检测,实验结果表明pSFV-MEG/PLNPs疫苗可以诱发较强的体液免疫和细胞免疫,因此可作为有潜力的候选疫苗,为解决细菌性腹泻提供新的设计思路和研究基础。
邓瑶,管洁,殷霄,文波,陈红,王文,谭文杰[3]（2015）在《表达丙型肝炎病毒多个融合抗原的复制型DNA疫苗在小鼠体内免疫原性的研究》文中研究指明目的探索新型的基于丙型肝炎病毒（HCV）多个靶抗原的复制型DNA疫苗的免疫效果。方法本研究构建了两种表达基于HCV中国1b代表株（河北株）多个靶抗原的复制型DNA疫苗:pSCK-CE1E2Y（核心蛋白Core、包膜蛋白E1、E2抗原）和pSCK-H155（Core、E1、E2、非结构蛋白NS3融合抗原）,蛋白印迹试验分析靶抗原表达,皮内电转法免疫BAIB/c小鼠后评价其免疫应答,采用表达异型（JFH1,2a型）HCV多聚蛋白的重组痘苗病毒接种的小鼠攻击替代模型进行保护效果分析。结果蛋白印迹试验表明DNA疫苗中靶抗原体外可有效表达;两种DNA疫苗均可诱导多抗原特异的抗体反应及T细胞免疫应答;未检测到明显的交叉免疫保护。结论两种复制型DNA疫苗均可诱导针对多抗原的体液及细胞免疫应答,但不能诱导有效的交叉保护。本研究为HCV新型疫苗研制提供了一定参考。
付强,郭广君,程立坤,王艳[4]（2014）在《兔病毒性出血症DNA疫苗研究进展》文中研究指明兔病毒性出血症是养兔业最重要的疾病之一,其发病急,致死率高,可对养兔业造成巨大的经济损失,在疫苗研究方面,由于传统组织灭活疫苗存在诸多缺点,迫切需要研制新型疫苗。本文主要从兔病毒性出血症DNA疫苗的构建、免疫佐剂、临床免疫途径以及临床使用的效果等方面进行简要介绍。
李盼,张亮,王宇,朱晓明,张巍,徐元基,于继云,阎瑾琦[5]（2013）在《复制子荧光素酶表达质粒pSVK-luc的构建与应用》文中研究说明目的为研究复制子DNA疫苗在生物活体内的表达情况,构建含有荧光素酶报告基因的复制子表达质粒pSVK-luc。方法 PCR扩增荧光素酶报告基因,克隆入DNA复制子载体pSVK,酶切鉴定和测序分析筛选阳性重组质粒pSVK-luc;化学法转染人胚肾293T细胞,流式细胞术和免疫荧光法检测荧光素酶基因在293T细胞中的表达;利用基因电穿孔导入仪递送重组质粒至BALB/c小鼠股四头肌,活体成像仪动态观测荧光素酶基因在小鼠体内的表达。结果 pSVK-luc经相应酶切和测序鉴定,与预期设计完全一致。流式细胞术和免疫荧光检测均可见荧光素酶基因表达;同时活体成像仪也能检测到该基因在小鼠体内的表达。结论 pSVK-luc表达质粒的构建成功将为复制子DNA疫苗体内作用机制研究和体内电穿孔递送条件的优化奠定实验基础。
王春花,孙元,仇华吉[6]（2013）在《新型猪瘟疫苗研究进展》文中研究指明猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的一种急性、热性和高度接触性传染病。该病呈世界性分布,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前,疫苗接种仍然是防控猪瘟的主要手段。虽然传统的猪瘟弱毒疫苗（如C株）安全有效,但猪瘟的临床表现发生了很大变化,呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、隐性感染和持续感染并现,免疫失败的现象时有报道,且不能区分野毒感染和免疫接种。因此,研制安全、高效、能区分野毒感染和疫苗免疫动物（DIVA）的新型猪瘟疫苗极为必要。文中就近年来开发的核酸疫苗、病毒活载体疫苗、基于蛋白/肽的疫苗、基因缺失疫苗、嵌合瘟病毒疫苗等新型DIVA猪瘟疫苗作一综述。
王伟[7]（2013）在《新型可复制型广谱抗肿瘤双质粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究》文中指出研究背景：继预防性疫苗之后，伴随着免疫学、分子生物学和细胞生物学的不断深入发展，近年来治疗性疫苗发展迅速。通过重新唤起机体对靶抗原的免疫应答能力，治疗性疫苗可以在患病个体诱导特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治愈。治疗性疫苗已经成为防治恶性肿瘤术后复发转移的重要技术手段。由于DNA疫苗具有抗原性特异、应用安全及生产便捷的显着优点，作为一种特殊的高技术生物治疗药物，多种类型的DNA疫苗已经进入了临床前期及临床试验。针对恶性肿瘤治疗中的核心难题―免疫耐受‖，基于自主研发的可复制型DNA疫苗载体系统，本课题组开展了治疗性疫苗的免疫增效策略研究，并成功构建了新型双质粒可复制型抗肿瘤DNA疫苗。我们选择在多种实体肿瘤中广泛表达的两种肿瘤抗原HCG和Survivin，并选择与肿瘤血管新生关系密切的靶点VEGFR2，利用异种化抗原设计技术，构建了抗肿瘤多靶点异种同源基因复合抗原，可以有效打破肿瘤对自身抗原的免疫耐受，激活高效的细胞免疫和体液免疫反应，从而提高肿瘤临床治愈率。研究目的：在实验室前期坚实的工作基础之上，构建由CAVA及CAVE组成的可复制型双质粒DNA疫苗，通过肌肉注射联合电脉冲的方法将得到的双质粒疫苗递送到小鼠体内，观察疫苗的抑瘤效果并对其可能的免疫学机制进行初步的探讨。方法：1.利用胰蛋白酶灌注消化法分离收集人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical VeinEndothelial Cells, HUVEC），进一步采用肿瘤细胞HepG2培养上清液诱导HUVEC向肿瘤源性内皮细胞（Tumor derived-Endothelial Cells, Td-EC）分化增殖。通过形态学观察和荧光标记Ⅷ因子相关抗原,鉴定血管内皮细胞；利用RT-PCR检测Td-EC中肿瘤血管内皮标志物（TEM）的表达。2.将小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样区域（mVEGFR2D1-4）及人β-hcg全长基因分别克隆到原核表达载体pET-42a中，将得到的原核表达质粒分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态中并通过IPTG诱导表达，亲和层析法纯化融合蛋白，经SDS-PAGE分析，Western blot鉴定纯化后的目的蛋白，ELISA法检测纯化蛋白的抗原活性。3.利用前期成功构建的质粒pVAX1-mVEGFR2-GFc-hIL12及可复制型载体系统PSVK，构建以异种化的mVEGFR2D1-4为靶抗原的可复制型DNA疫苗，命名为CAVE。4.将DNA疫苗CAVE与前期构建好的CAVA采用电穿孔肌肉内注射的方式免疫小鼠，观察DNA疫苗的抑瘤效果，并对其相关的免疫学机制进行初步的研究：采用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异抗体滴度和血清中的细胞因子的水平；采用ELISPOT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞特异性IFN-γ的分泌；采用海藻酸盐包裹肿瘤细胞移植物评价抗血管生成情况；对肿瘤组织进行CD31免疫组化染色观察疫苗免疫后肿瘤毛细血管密度。结果：1.成功分离得到了HUVEC，并将其诱导成为具有良好生物学活性的具有肿瘤源内皮细胞特性的Td-EC。2.成功诱导并纯化出具有良好免疫原性的mVEGFR2D1-4/GST及人β-hcg/GST融合蛋白。3.成功构建了可复制型DNA疫苗CAVE，并通过Western Blot检测证实了其体外真核表达。4.观察联合应用与单独应用两种DNA疫苗免疫后的C57BL/6小鼠移植瘤生长趋势，发现与对照组相比疫苗免疫组小鼠肿瘤生长受到显着抑制，联合应用免疫组效果更为显着。疫苗免疫组小鼠血清内可检测到特异性抗Survivin、β-hcg及VEGFR2抗体，脾脏内可检测到特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞；海藻酸盐包裹肿瘤细胞移植物实验及肿瘤组织CD31免疫组化检测证实CAVE能够显着抑制肿瘤组织毛细血管生成。结论：本研究所构建的新型可复制型双质粒DNA疫苗与单独应用及对照组相比，在小鼠体内可以诱导产生更强的特异性细胞和体液免疫反应，能够抑制移植瘤的生长，为肿瘤的主动免疫治疗提供了一种新的选择。
李盼[8]（2013）在《乙肝可复制型DNA疫苗低电压电穿孔递送与免疫活性研究》文中进行了进一步梳理DNA疫苗在治疗性疫苗研究领域的地位至关重要。关于DNA疫苗体内递送的研究发展很快，从最初的直接注射到基因枪接种，再发展到新近出现的电穿孔技术，质粒DNA的体内递送效率显着提高，这为DNA疫苗快速发展和应用提供了有力的技术支持。其中电穿孔递送兼备高效、安全、操作简便和低成本等多项特质，成为DNA疫苗递送的首选方案，但关于电穿孔递送条件的深入研究目前还有待进步完善。当前文献报道电穿孔递送DNA疫苗的常用脉冲电压多集中在180v-900v的高压区。在实际应用中我们发现高电压递送DNA疫苗质粒，会对组织细胞造成定损伤；随着免疫接种次数的增多，DNA疫苗在局部坏死组织的体内递送量也会逐渐降低；而且临床试验时，患者对高电压也会产生定恐惧不利于DNA疫苗的推广应用；所以本研究拟进步探讨低电压下递送DNA疫苗的可行性。首先，本研究选取携带萤火虫荧光素酶报告基因的三种不同类型表达质粒，作为我们研究体内电穿孔递送的模式质粒。它们分别是：①pGL3-CMV，为本室前期保存，带有萤火虫荧光素酶报告基因的完整表达框，分子量约为5kb，可以作为小分子量质粒的代表；②pEE14.1-luc，为本研究自主构建，由于基础载体分子量较大约为11kb，该质粒构建成功后分子量可达12.5kb，可以作为大分子量质粒的代表；③pSVK-luc，也是本研究自主构建的表达质粒，载体pSVK是基于塞姆利基森林病毒Semliki Forestvirus （SFV）改构而成的可复制型表达载体，其表达特性与传统DNA质粒有显着不同，该质粒分子量约为13kb，可以作为复制子DNA疫苗质粒的代表。重组质粒pEE14.1-luc和pSVK-luc的构建，以质粒pGL3-CMV为模板扩增荧光素酶报告基因，然后克隆入pEE14.1和pSVK载体中构建而成，并采用Western blot、流式细胞术，免疫荧光和活体成像技术检测重组质粒在体内外的表达情况。结果显示重组质粒pEE14.1-luc和pSVK-luc在体内外均获得高效表达。其次，将pGL3-CMV、pEE14.1-luc和pSVK-luc作为模式质粒，以1μg和50μg两个剂量分别接种BALB/c小鼠左右腿部肌肉，再在低电压范围内选取30V、60V和120V三个脉冲电压进行刺激，接种后48h活体成像仪检测小鼠股四头肌内荧光素酶表达量。两次接种后，剥离不同脉冲电压刺激后的小鼠股四头肌肉组织进行HE染色观察肌肉组织的纤维结构。结果显示：①各质粒在高剂量50μg电穿孔递送时，60V和120V脉冲电压刺激下DNA递送量显着高于30V递送，但60V和120V的DNA递送量无显着性差异；在120V电压刺激后，HE染色检测发现肌肉组织纤维出现明显断裂，溶胀，而在较低电压组60V和30V的电压刺激下未出现明显组织纤维损伤，综合比较，初步推断60V低电压下递送三种类型质粒DNA的表达效果均较优，且局部组织细胞也无明显损伤；②各质粒在低剂量1μg电穿孔递送时，结果发现常规DNA质粒pGL3-CMV、pEE14.1-luc均未检测到荧光素酶基因表达，但可复制型大分子质粒pSVK-luc在60V、120V脉冲电压递送下可见荧光素酶表达，初步推论可复制型质粒在低剂量下接种存在定的优势。最后，为进步验证低电压下递送DNA疫苗在实际应用中的可行性，以本室前期构建的乙肝可复制型DNA疫苗pSVK-HBVA及常规小分子DNA疫苗pVAX1-HBVA为研究对象，分别设立两种疫苗的高（100μg）中（10μg）低（1μg）三个剂量组，免疫接种BALB/c小鼠，并在60v的低电压下进行电穿孔递送，分别检测两种DNA疫苗在小鼠体内的体液免疫和细胞免疫应答。结果显示：1、低电压（60V）递送乙肝DNA疫苗在体内激起较强的细胞与体液免疫应答;2、60V电压三次免疫接种过程顺利，未见BALB/c小鼠股四头肌肌肉组织僵硬现象，保证多次免疫递送的成功；3，虽抗体滴度呈定的剂量依赖即随着免疫剂量的升高，抗体滴度也逐步升高，但复制子DNA疫苗pSVK-HBVA在常规DNA疫苗1/100的剂量下，即可激活高效的细胞免疫应答，显示出良好应用潜质。综上所述，本研究以pGL3-CMV、pEE14.1-luc、pSVK-luc为模式质粒，初步验证低电压（60V）递送DNA疫苗可行，又以低脉冲电压（60V）递送本室前期构建乙肝可复制型DNA疫苗pSVK-HBVA和常规乙肝DNA疫苗pVAX1-HBVA，证实低电压电穿孔递送上述疫苗可激活体内高水平的免疫应答，且乙肝可复制子DNA疫苗在常规DNA疫苗1/100的剂量下，即可激活高效的细胞免疫应答，揭示了乙肝可复制型DNA疫苗的良好应用前景和潜质；同时，进步验证DNA疫苗电穿孔低电压体内递送的可行性，为DNA疫苗电穿孔免疫递送提供重要参考数据更为电穿孔技术的临床应用奠定实验基础。
梁欠欠[9]（2013）在《基于甲病毒复制子载体的猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的构建及免疫效力评价》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道疾病以及断奶仔猪高死亡率为特征的高度接触性传染病。目前世界上普遍用于预防PRRS的灭活苗和弱毒苗不能提供完全的保护或存在毒力返强和扩毒等风险。相比之下，复制子疫苗可高效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，诱导转染细胞凋亡，比常规的DNA疫苗具有更高的生物安全性。本实验通过复制子载体pSCA1，重点开展修饰后的PRRSV主要抗原基因的研究，成功构建出PRRS新型安全疫苗，并对其体外表达特性和小鼠体内免疫效力进行初步研究。我们首先通过RT-PCR从PRRSV FZ06A毒株中扩增出ORF3、ORF5和ORF6基因，并进行修饰，破坏ORF3的信号肽序列并连接VP22基因；删除ORF5的非中和表位A，突变N34、N43和N51糖基化位点，添加Kozak序列或连接VP22基因；ORF6连接VP22基因；连接VPm5和VP6；得到Km5、VPm3、VPm5、VP6和V56基因。将修饰后基因插入复制子载体pSCA1。成功构建了重组质粒pSCA-Km5、pSCA-VPm3、pSCA-VPm5、pSCA-VP6和pSCA-V56。转染BHK-21细胞，RT-PCR检测到目的基因的mRNA，IFA和Western显示，细胞中均能检测到目的蛋白。细胞凋亡试验中转染细胞发生核浓缩或裂解，说明复制子质粒能引起转染细胞凋亡。为后续检测需要，我们构建并表达了截短的GP3、GP5和M蛋白，并制备了GP5的单抗腹水和M蛋白的兔多抗。结果显示，纯化后的蛋白具有较好的反应原性，GP5单抗的效价可达1:105以上，M多抗效价可达1:256000以上。将复制子质粒pSCA-Km5、pSCA-VPm3、pSCA-VPm5、pSCA-VP6、pSCA-V56、pSCA-VPm5-PEI和PBS免疫BABL/c小鼠。监测免疫后血清中特异性抗体的水平、脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后分泌IL-4和IFN-γ的水平和增殖情况。结果显示，pSCA-VPm3和pSCA-VP6在细胞免疫方面有较好的效果；pSCA-Km5、pSCA-VPm5主要诱导体液免疫。pSCA-V56组在诱导体液免疫和细胞免疫方面都能有较好的效果，但其抗体水平较pSCA-VPm5组低。PEI能增强复制子疫苗免疫效力，但诱导的特异性抗体在首免后7w突然降低，猜测可能和PEI对细胞的毒性有关。综上所述，我们成功表达并纯化出具有良好免疫原性的m3JD、m5和MJD，并进行了GP5单抗腹水、MJD多克抗的制备和纯化。成功构建了复制子疫苗pSCA-Km5、pSCA-VPm3、pSCA-VPm5、pSCA-VP6、pSCA-V56，在细胞水平和动物水平对其表达特性和免疫效力进行了初步研究，为PRRSV新型疫苗的进一步研究奠定基础。
李娜,孙元,仇华吉[10]（2010）在《猪瘟DNA疫苗研究进展》文中研究说明自1990年DNA疫苗问世以来,已有许多研究者构建了不同类型的DNA疫苗。这些载体能诱发机体产生不同程度的特异性体液免疫和（或）细胞免疫。研究者们也在猪瘟DNA疫苗研究方面做出了很多努力并取得了一定的成果。以下从猪瘟DNA疫苗的构建和评价、佐剂在猪瘟DNA疫苗中的应用、猪瘟DNA疫苗与其他疫苗的联合应用以及目前猪瘟DNA疫苗存在的问题和解决途径等方面做了比较全面的阐述。
二、Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较（论文提纲范文）
（1）重组Semliki森林病毒疫苗的研制现状（论文提纲范文）
| 1 重组SFV抗正粘病毒 |
| 1.1 流行性感冒病毒 |
| 1.2 马流感病毒 |
| 2 重组SFV抗逆转录病毒 |
| 2.1 Ⅰ型人类免疫缺陷病毒 |
| 2.2 猴免疫缺陷病毒 |
| 3 重组SFV抗黄病毒 |
| 3.1 猪瘟病毒 |
| 3.2 罗氏病病毒 |
| 4 重组SFV抗其他病毒 |
| 4.1 乙型肝炎病毒 |
| 4.2 猪园环病毒Ⅱ型 |
| 5 重组SFV抗细菌 |
| 5.1 布鲁氏菌 |
| 5.2 肉毒梭菌 |
| 6 结 语 |
（2）流行性腹泻多表位复制子DNA疫苗的设计、制备及初步免疫评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细菌性腹泻 |
| 1.1.1 产肠毒素大肠杆菌(ETEC) |
| 1.1.2 志贺氏痢疾杆菌Shigella |
| 1.2 核酸疫苗 |
| 1.2.1 常规DNA疫苗 |
| 1.2.2 复制子DNA疫苗 |
| 1.3 纳米递送载体 |
| 1.3.1 聚合物纳米颗粒 |
| 1.3.2 脂质体纳米颗粒 |
| 1.3.3 脂质体-聚合物杂化纳米颗粒 |
| 1.4 研究目的与研究内容 |
| 第二章 抗原表位的筛选及疫苗设计 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 抗原表位的筛选流程图 |
| 2.2.2 基因序列和蛋白序列的获取 |
| 2.2.3 表位预测 |
| 2.2.4 疫苗设计 |
| 2.2.5 疫苗3D结构模拟(I-TASSER) |
| 2.2.6 多表位蛋白序列免疫原性分析 |
| 2.2.7 PAProC预测蛋白酶体切割位点 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 表位筛选结果 |
| 2.3.2 多表位氨基酸序列 |
| 2.3.3 免疫原性分析 |
| 2.3.4 蛋白酶体切割位点 |
| 2.3.5 3D结构 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 重组质粒的构建及体外活性检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 MEG基因合成序列 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.2.4 试剂与药品 |
| 3.2.5 试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组质粒构建 |
| 3.3.2 体外活性初步检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 细胞转染效率 |
| 3.4.3 目的蛋白检测 |
| 3.4.4 免疫荧光检测 |
| 3.4.5 细胞凋亡检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 DNA疫苗制剂制备及免疫评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 菌株及质粒 |
| 4.2.2 动物与饲养材料 |
| 4.2.3 试剂 |
| 4.2.4 实验仪器与设备 |
| 4.2.5 相关试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 PLNPs的制备(纳米沉淀法) |
| 4.3.2 PLNPs的表征 |
| 4.3.3 PLNPs抗DNase降解实验 |
| 4.3.4 PLNPs的体外释放 |
| 4.3.5 PLNPs细胞毒性检测(MTT法) |
| 4.3.6 PLNPs溶血实验 |
| 4.3.7 动物免疫 |
| 4.3.8 血清、脾细胞悬液的收集与处理 |
| 4.3.9 血清中特异性抗体的检测 |
| 4.3.10 脾T淋巴细胞亚群分布 |
| 4.3.11 统计学方法分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 PLNPs的制备与表征结果 |
| 4.4.2 PLNPs凝胶阻滞实验结果 |
| 4.4.3 PLNPs体外释放曲线 |
| 4.4.4 PLNPs细胞毒性检测 |
| 4.4.5 DNA疫苗免疫学评价 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）兔病毒性出血症DNA疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 兔瘟疫苗研发动态 |
| 2 DNA疫苗概述 |
| 3 DNA疫苗的载体 |
| 4 佐剂在兔瘟DNA疫苗中的应用 |
| 5 疫苗效力检测 |
| 6 小结 |
（6）新型猪瘟疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 核酸疫苗 |
| 1.1 DNA疫苗 |
| 1.2 甲病毒复制子载体DNA疫苗 |
| 2 病毒活载体疫苗 |
| 2.1 重组载体疫苗 |
| 2.2 嵌合病毒载体疫苗 |
| 3 基于蛋白/肽的疫苗 |
| 4 基于瘟病毒的疫苗 |
| 4.1 猪瘟病毒基因缺失弱毒疫苗 |
| 4.2 嵌合瘟病毒疫苗 |
| 5 问题与展望 |
（7）新型可复制型广谱抗肿瘤双质粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肿瘤源性血管内皮细胞的诱导培养及其细胞生物学特性鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小鼠 VEGFR2 胞外 1-4IgG 样结构域及β-hcg 蛋白的原核表达、纯化及活性鉴定 |
| 第一节 小鼠 VEGFR2 胞外 1-4IgG 样结构域的原核表达、纯化及活性鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 β-hCG 的原核表达、纯化及抗原活性检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 新型广谱抗肿瘤双质粒 DNA 疫苗抑瘤活性的初步研究 |
| 第一节 新型可复制型广谱抗肿瘤血管生成 DNA 疫苗 CAVE 的构建及体外表达验证 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 可复制型抗肿瘤 DNA 疫苗 CAVA 与 CAVE 联合应用抑瘤活性及免疫学作用机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录：英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（8）乙肝可复制型DNA疫苗低电压电穿孔递送与免疫活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 前言 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 第一章 荧光素酶表达质粒 pEE14.1-luc 和 pSVK-luc 的构建与表达 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与载体 |
| 1.1.2 化学试剂和酶 |
| 1.1.3 实验动物和主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 pSVK-luc、pEE14.1-luc 重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.2.1.1 pSVK-luc 重组质粒的构建 |
| 1.2.1.2 PCR 回收产物与 pMDl8-simple-T 载体的连接反应 |
| 1.2.1.3 大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞的制备 |
| 1.2.1.4 大肠杆菌(E. coil)DH5α的转化 |
| 1.2.1.5 重组质粒 pMD18-simple-T-luc 的筛选与鉴定 |
| 1.2.1.5.1 重组质粒 pMD18-simple-T-luc 的菌液 PCR 鉴定 |
| 1.2.1.5.2 重组质粒 pMD18-simple-T-luc 的酶切鉴定 |
| 1.2.1.5.3 重组质粒 pMD18-simple-T-luc 的 DNA 测序分析 |
| 1.2.1.6 重组质粒 pSVK-luc 的构建 |
| 1.2.1.6.1 基于塞姆利基森林病毒复制子载体 pSVK 空载体的酶切鉴定 |
| 1.2.1.6.2 重组质粒 pSVK-luc 构建 |
| 1.2.1.6.3 重组表达质粒 pSVK-luc 的转化和鉴定 |
| 1.2.2 重组质粒 pEE14.1-luc 的构建 |
| 1.2.2.1 荧光素酶基因片段（luc）的获得 |
| 1.2.2.2 荧光素酶基因（luc）片段与 pEE14.1 载体的连接 |
| 1.3 体外检测荧光素酶基因的表达 |
| 1.3.1 293T 细胞的培养与转染 |
| 1.3.1.1 293T 细胞的传代培养 |
| 1.3.1.2 293T 细胞的培养与转染 |
| 1.3.2 western blot 检测 pSVK-luc、pEE14.1-luc 在细胞内表达的检测 |
| 1.3.3 流式细胞术及免疫荧光法体外检测荧光素酶基因的表达 |
| 1.4 活体成像技术检测重组质粒 pSVK -luc、pEE14.1-luc 活体内表达 |
| 1.4.1 免疫用质粒 pSVK -luc、pEE14.1-luc、pGL3-CMV 的大量提取 |
| 1.4.2 动物免疫方案 |
| 2. 结果 |
| 2.1 荧光素酶基因 luc 的克隆 |
| 2.2 荧光素酶基因 luc 片段的回收 |
| 2.3 重组质粒 pMD18-sample-T-luc 的鉴定 |
| 2.3.1 重组质粒 pMD18-sample-T-luc 的 PCR 鉴定 |
| 2.3.2 重组 pMD18-sample-T-luc 载体的酶切鉴定 |
| 2.3.3 重组质粒 DNA pMD18-sample-T-luc 的测序分析 |
| 2.4 塞姆利基森林病毒复制子载体（pSVK 空载体）的酶切鉴定 |
| 2.4.1 重组质粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的鉴定 |
| 2.4.1.1 重组质粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的 PCR 鉴定 |
| 2.4.1.2 重组 pSVK-luc 载体的酶切鉴定 |
| 2.4.1.3 重组质粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 的测序鉴定 |
| 2.5 Western blot 体外检测荧光素酶基因的表达 |
| 2.6 流式细胞术、免疫荧光体外检测荧光素酶基因的表达 |
| 2.6.1 流式细胞术检测荧光素酶基因的表达 |
| 2.6.2 免疫荧光法体外检测荧光素酶基因的表达 |
| 2.7 活体成像技术检测重组质粒 pSVK-luc、pEE14.1-luc 体内表达 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 低电压电穿孔体内递送疫苗质粒条件的初步研究 |
| 1、材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、实验动物及主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 质粒的转化 |
| 1.2.2 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 质粒的大量提取 |
| 1.2.3 重组质粒 pGL3-CMV、pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 的酶切鉴定 |
| 1.2.4 动物实验分组及 DNA 免疫策略 |
| 1.2.5 Xenogen 成像系统检测萤光素酶在小鼠体内的表达 |
| 1.2.6 苏木精-伊红（HE）染色检测 BALB/c 小鼠大腿肌肉纤维结构 |
| 1.2.7 统计学处理 |
| 2.结果 |
| 2.1 重组质粒 pGL3-CMV，pSVK-luc 和 pEE14.1-luc 的酶切鉴定 |
| 2.2 荧光素酶基因小鼠股四头肌内的表达量检测 |
| 2.3 苏木精-伊红（HE）染色法检测 BALB/c 小鼠大腿肌肉纤维结构 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 低电压体内递送乙肝 DNA 疫苗的初步药效学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒及实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂及检测试剂盒 |
| 1.1.3 主要的仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 免疫用质粒的大量提取与纯化 |
| 2.2 实验动物分组及免疫策略 |
| 2.3 乙肝治疗性疫苗 pVAX-HBVA、pSVK-HBVA 的免疫活性研究 |
| 2.3.1 ELISA 定量检测 BALB/c 小鼠血清中抗 HBcAg 抗体 |
| 2.3.2 ELISPOT 检测 BALB/c 小鼠 IFN-γ分泌细胞数 |
| 2.3.2.1 免疫小鼠脾脏单细胞悬液的制备 |
| 2.3.2.2 ELISPOT 法检测免疫小鼠脾细胞 IFN-γ分泌细胞数 |
| 2.3.2.3 CCK-8 法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 ELISA 定量检测 BALB/c 小鼠血清中抗 HBcAg 抗体 |
| 3.2 ELISPOT 检测免疫小鼠 IFN-γ分泌细胞数 |
| 3.3 CCK8 检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 结论与展望 |
| 第四部分 附录 |
| 附录一 硕士期间参加的研究课题和发表论文 |
| 附录二 个人简历 |
| 致谢 |
（9）基于甲病毒复制子载体的猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的构建及免疫效力评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 |
| 1.1.1 病毒分类和理化性质 |
| 1.1.2 病毒基因组结构 |
| 1.1.3 病毒结构蛋白及其功能 |
| 1.1.4 病毒的生物学特性 |
| 1.1.6 HP-PRRSV |
| 1.1.7 病毒感染与免疫 |
| 1.1.8 PRRSV 疫苗研究进展 |
| 1.2 甲病毒复制子疫苗研究进展 |
| 1.2.1 概念 |
| 1.2.2 甲病毒复制子原理及特点 |
| 1.2.3 复制子疫苗引起细胞凋亡的机理 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PRRSV FZ06A 毒株 GP3、GP5 和 M 蛋白的截短表达及其抗体的制备 |
| 摘要 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌体、细胞和病毒 |
| 2.1.2 试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验试剂及配制方法 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 PRRSV FZ06A 病毒 RNA 的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR 扩增 GP3、GP5 和 M 蛋白基因 |
| 2.2.4 目的基因序列生物学初步分析 |
| 2.2.5 重组表达质粒的构建 |
| 2.2.6 阳性质粒的筛选与鉴定 |
| 2.2.7 转化至表达菌株 |
| 2.2.8 PRRSV GP3、GP5 和 M 蛋白的诱导表达和可溶性分析 |
| 2.2.9 Western blotting 鉴定重组蛋白 |
| 2.2.10 m3JD、m5、MJD 蛋白的纯化 |
| 2.2.11 GP5 蛋白单抗腹水的制备与纯化 |
| 2.2.12 M 蛋白多抗的制备与纯化 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 RT-PCR 扩增目的基因基因片段 |
| 2.3.2 目的基因序列分析 |
| 2.3.3 重组表达质粒的构建 |
| 2.3.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.5 Western blotting 鉴定结果 |
| 2.3.6 蛋白纯化结果 |
| 2.3.7 GP5 腹水制备及纯化 |
| 2.3.8 M 蛋白多抗制备及纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 基于甲病毒复制子的 PRRS DNA 疫苗的构建及体外表达特性研究 |
| 摘要 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌体、细胞和病毒 |
| 3.1.2 试剂及耗材 |
| 3.1.3 实验试剂及配制方法 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 目的基因的初步修饰 |
| 3.2.3 VP22 基因与目的基因的连接 |
| 3.2.4 VPm5 与 VPm6 基因的连接 |
| 3.2.5 含修饰后目的基因的质粒的构建 |
| 3.2.6 含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的自杀性复制子质粒的构建 |
| 3.2.7 大量提取构建的自杀性复制子质粒 |
| 3.2.8 杀性质粒最佳转染剂量及蛋白检测时间的确定 |
| 3.2.9 自杀性复制子质粒转染 BHK-21 细胞 |
| 3.2.10 转染细胞中目的基因 mRNA 的检测 |
| 3.2.11 Wstern blotting 检测转染细胞中目的蛋白 |
| 3.2.12 转染后细胞凋亡检测 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 基因修饰 |
| 3.3.2 添加 Kozak 序列 |
| 3.3.3 连接 VP22 基因 |
| 3.3.4 VPm5 与 VP6 基因的连接 |
| 3.3.5 含修饰后基因的复制子质粒的构建 |
| 3.3.6 pSCA- EGFP 的构建 |
| 3.3.7 最佳转染剂量和最佳检测时间的确定 |
| 3.3.9 转染细胞中目的基因 mRNA 的检测 |
| 3.3.10 IFA 检测转染细胞中蛋白表达水平 |
| 3.3.11 Western blotting 检测转染细胞中蛋白表达水平 |
| 3.3.12 转染后细胞凋亡检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 基于甲病毒复制子的 PRRSV DNA 疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答 |
| 摘要 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 质粒和试剂 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 试剂及配制方法 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验动物的选择和分组 |
| 4.2.2 复制子质粒的提取和定量 |
| 4.2.3 动物免疫前处理 |
| 4.2.4 动物免疫程序 |
| 4.2.5 免疫小鼠 T 淋巴细胞增殖实验 |
| 4.2.6 免疫小鼠 IFN-γ水平监测 |
| 4.2.7 免疫小鼠 IL-4 水平监测 |
| 4.2.8 免疫小鼠特异性抗体水平监测 |
| 4.2.9 免疫小鼠中和性抗体水平监测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 复制子质粒的提取和定量 |
| 4.3.2 免疫小鼠 T 淋巴细胞增殖实验 |
| 4.3.3 免疫小鼠 IFN-γ水平监测 |
| 4.3.4 免疫小鼠 IL-4 水平监测 |
| 4.3.5 免疫小鼠特异性抗体水平监测 |
| 4.3.6 免疫小鼠中和性抗体水平监测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）猪瘟DNA疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 DNA疫苗概述 |
| 2 猪瘟DNA疫苗的构建和评价 |
| 2.1 常规DNA疫苗 |
| 2.2 新型DNA疫苗 |
| 2.3 新型给药途径和递送工具 |
| 3 佐剂在猪瘟DNA疫苗中的应用 |
| 4 猪瘟DNA疫苗与其他疫苗的联合应用 |
| 5 目前猪瘟DNA疫苗存在的问题和解决途径 |
| 6 小结 |
四、Semliki森林病毒衍生的DNA疫苗与常规DNA疫苗的比较（论文参考文献）
- [1]重组Semliki森林病毒疫苗的研制现状[J]. 李文桂,陈雅棠. 国外医学(医学地理分册), 2019(03)
- [2]流行性腹泻多表位复制子DNA疫苗的设计、制备及初步免疫评价[D]. 张瑞环. 华东理工大学, 2020(01)
- [3]表达丙型肝炎病毒多个融合抗原的复制型DNA疫苗在小鼠体内免疫原性的研究[J]. 邓瑶,管洁,殷霄,文波,陈红,王文,谭文杰. 中华微生物学和免疫学杂志, 2015(03)
- [4]兔病毒性出血症DNA疫苗研究进展[J]. 付强,郭广君,程立坤,王艳. 湖北畜牧兽医, 2014(08)
- [5]复制子荧光素酶表达质粒pSVK-luc的构建与应用[J]. 李盼,张亮,王宇,朱晓明,张巍,徐元基,于继云,阎瑾琦. 细胞与分子免疫学杂志, 2013(07)
- [6]新型猪瘟疫苗研究进展[J]. 王春花,孙元,仇华吉. 生物工程学报, 2013(07)
- [7]新型可复制型广谱抗肿瘤双质粒DNA疫苗抑瘤活性的初步研究[D]. 王伟. 中国人民解放军医学院, 2013(08)
- [8]乙肝可复制型DNA疫苗低电压电穿孔递送与免疫活性研究[D]. 李盼. 新疆大学, 2013(S1)
- [9]基于甲病毒复制子载体的猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的构建及免疫效力评价[D]. 梁欠欠. 中国农业科学院, 2013(02)
- [10]猪瘟DNA疫苗研究进展[J]. 李娜,孙元,仇华吉. 生物工程学报, 2010(03)