一、肉鸡IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达（论文文献综述）
宋世斌[1]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定》文中研究表明干扰素（Interferon,IFN）是机体细胞受到病毒等生物诱导剂刺激而产生的一类分泌型糖蛋白类细胞因子,而白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一种具有促炎作用的细胞因子,由机体活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生,能诱导IFN-γ等细胞因子的分泌,具有促进T细胞增殖、增强Th1型细胞、NK细胞及CTL细胞的细胞毒效应,与临床自身免疫性疾病及心血管系统疾病等多种疾病的发生发展呈现相关性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生虫和细菌感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。因此,本实验开展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相关研究,采用分子克隆和基因工程等技术获得了3个基因,体外制备了藏獒犬3个基因的重组蛋白,验证了其生物学活性,并开展了临床相关实验,丰富了犬细胞因子的知识,对犬疾病的检测和防控以及保障人类健康有着重要的意义,在犬疾病的防控上有着广阔的应用前景。第一,从藏獒犬血液中分离淋巴细胞,利用脂多糖（LPS）与植物血凝素（PHA）联合刺激淋巴细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全长片段,将扩增到的基因分别克隆到pGEM-T-easy载体,经酶切、测序鉴定,结果表明:所克隆的IFN-γ基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达99.6%,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸（AA）,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码143个AA,分子量为17.2 kD;克隆的IFN-α基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达96.0%,其开放阅读框为564 bp,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码164个AA,推测的分子量为19.0 kD;克隆的IL-18基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达100%,其开放阅读框为582 bp,编码193个AA,N端36个AA为信号肽,成熟蛋白编码157个AA,推测的分子量为18.1 kD。第二,根据克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因阅读框序列,设计3个基因去掉信号肽的表达引物,克隆去信号肽后的目的片段,构建原核表达质粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,转化大肠杆菌后诱导表达。经优化诱导条件后,3个重组菌都能够在温度为37℃,浓度为0.5 mM IPTG的诱导条件下成功的表达,3个重组菌在诱导后主要以包涵体形式表达,其中pET-30a-IFN-γ重组蛋白在上清中也有一定量的表达;经SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表达的蛋白分别约为23 kD、25kD和24 kD,表达的蛋白大约占菌体蛋白30%35%。第三,用镍琼脂糖凝胶纯化层析柱纯化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重组蛋白,纯度达到90%以上,通过梯度透析复性法复性蛋白。利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物学活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用强于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的浓度范围内有作用,在高于或低于这个浓度范围时发挥的效果一般;利用MTS法检测重组藏獒犬IL-18重组蛋白的生物学活性,纯化的重组IL-18具有诱导淋巴细胞增殖的能力,说明表达的蛋白具有生物学活性。第四,通过对总数为128只犬病毒性传染病病例（包括犬细小病毒病、犬冠状病毒病及犬瘟热3类宠物常见病）的IFN治疗组和对照治疗组的比较分析结果显示:IFN治疗组中3类疾病总计67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,对照治疗组中3类疾病总计61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本实验获得的IFN-α重组蛋白治疗宠物犬病毒性传染病,能显着提高治愈率,有较好的临床治疗病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并应用分子生物学软件对序列进行生物信息学分析;首次成功的表达了3个基因,纯化、复性了重组蛋白,发现IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有较高的生物学活性,可以开发利用;通过藏獒犬IFN-α重组蛋白的临床病毒性犬病的治疗,验证了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中国特有的大型犬种,本研究为犬基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的检测及防治奠定了理论基础。
王建荣[2]（2019）在《Thermomyces dupontii脂肪酶高效制备及应用研究》文中提出研究表明Thermomyces dupontii脂肪酶（简称TDL）在洗涤、生物柴油、油脂改性等领域具有很好的应用潜力,而天然菌T.dupontii培养过程复杂,脂肪酶发酵活力低,限制了TDL产业化应用。要使TDL实现产业化,必须通过高效制备技术降低其生产成本。除了发酵酶活,温度特性也是工业领域关注的技术指标,TDL在低温条件下相对酶活性低,在高温条件下热稳定性差,因此若想将TDL广泛应用到不同工业领域,需要优化其温度特性。本论文针对限制TDL产业化应用的难点,通过五个方面（启动子优化、信号肽优化、组合策略高效表达、温度理性设计以及TDL及其突变体应用）对TDL进行系统的研究,为TDL的产业化奠定基础。本论文的主要研究内容及结果如下:（1）不同启动子对重组TDL在毕赤酵母表达的影响:研究了15种甲醇诱导型启动子和9种组成型启动子对TDL在毕赤酵母重组表达的影响,在15种甲醇诱导型启动子中,启动子PFLD1效果最好,其次为PAOX1和PDAS1,这三种不同启动子重组菌在5 L发酵罐最高酶活分别为27076 U/mL,24159 U/mL和22342U/mL。在所选的9种组成型启动子中,启动子PGCW14效果最好,其次为P0472和PGAP,这三种组成型启动子重组菌在5 L发酵罐最高酶活分别为17353 U/mL,15046 U/mL和14276 U/mL。（2）不同信号肽对重组TDL在毕赤酵母表达的影响:在最佳启动子PFLD1的基础上研究了7种异源信号肽、8种同源信号肽、2种密码子优化α-MF信号肽以及8种α-MF信号肽突变体对TDL表达的影响。在这25种信号肽中,D57-74效果最好,其次为Fre和D57-70,在摇瓶培养条件下D57-74,Fre以及D57-70重组菌的发酵酶活分别比对照提高了12.9%、9.1%和8.1%。D57-74重组工程菌在5 L发酵罐最高酶活为31137 U/mL,比对照菌提升了15%。（3）组合策略提升TDL在毕赤酵母的表达:在最佳启动子和最佳信号肽的基础上,通过组合策略（基因多拷贝、分子伴侣共表达和高密度发酵条件优化）进一步提升重组TDL在毕赤酵母的表达量。首先研究了基因拷贝数对TDL表达的影响,在216个转化子中多拷贝重组菌X33-T23（拷贝数为3）发酵酶活最高,在摇瓶培养和5 L发酵罐条件下分别比单拷贝重组菌提升了47.4%和26.8%。其次以X33-T23为宿主,共表达单分子伴侣蛋白能够有效提升重组TDL的表达量,在12种分子伴侣蛋白中,PDI效果最好,其次为KAR2,HAC1和ERO1,这四种分子伴侣蛋白共表达重组菌在5 L发酵罐条件下的发酵酶活分别为57521U/mL,54280 U/mL,54234 U/mL和48156 U/mL。以重组菌X33-T23-PDI为宿主,再分别转入分子伴侣蛋白发现双分子伴侣蛋白共表达不能进一步提升重组TDL的表达量。最后优化了高密度发酵的诱导温度和pH,在最佳诱导条件下重组菌X33-T23-PDI在5 L、50 L和30立方发酵罐的最高酶活分别达到81203U/mL、81062 U/mL和56121 U/mL。（4）理性设计优化TDL温度特性:通过去糖基化提高了TDL在低温条件下的酶活性,突变体N55D的最适反应温度为50℃（比TDL降低了10℃）,N55D在30℃和40℃的相对酶活分别比TDL提升了28%和31%。通过增加二硫键和点突变提升了TDL在高温条件下的稳定性。首先通过引入二硫键提高TDL的热稳定性,二硫键突变体F12C/K237C和G66C/S121C在75℃水浴处理10分钟后,残留酶活分别是TDL的1.9倍和1.3倍。其次通过筛选获得点突变体42/45、98/100和103/104。在70℃水浴处理10分钟后,点突变体42/45、98/100和103/104残留酶活分别比TDL提高11%、13%和8%。最后通过组合二硫键突变体和点突变体进一步提升重组TDL的热稳定性,以二硫键突变体F12C/K237C为出发模板,通过组合突变获得7个热稳定性显着提升的组合突变体,其中组合突变体5效果最好。组合突变体5在75℃和80℃水浴处理20分钟后,残留酶活分别是TDL的6.9倍和4.6倍。（5）TDL及其温度突变体的应用研究:将TDL和N55D应用于造纸脱墨领域,TDL和N55D均能有效提升造纸脱墨效果,在30℃至50℃条件下,N55D的应用效果要好于TDL。将TDL和组合突变体5应用于肉鸡养殖领域,在玉米豆粕型饲料中添加TDL和组合突变体5均能提升肉鸡的日增重、粗脂肪消化利用率和养分表观利用率。相同添加量的情况下,组合突变体5的应用效果要好于TDL。本论文的研究结果为TDL的产业化应用奠定基础,此外也为脂肪酶的高效制备、温度理性设计以及在造纸脱墨和肉鸡养殖领域的应用提供技术参考。
杨润时[3]（2019）在《动物源肠杆菌中碳青霉烯耐药基因blaNDM的流行分布及分子传播机制研究》文中研究指明碳青霉烯类抗菌药物被认为是目前用于治疗多重耐药革兰阴性杆菌最有效的抗菌药物之一,而随着该类药物的广泛使用,碳青霉烯类耐药菌株的检出率呈快速上升的趋势,这已经成为威胁公共卫生安全的重要议题。碳青霉烯类药物并未批准用于兽医临床,而现有的研究表明,动物源中耐碳青霉烯菌株的检出率越来越高,存在着在动物源中全面流行的可能和趋势。因此本研究对耐碳青霉烯菌株在我国动物源中的流行分布情况和分子传播机制进行系统性的调查和研究,探求不同来源中重要碳青霉烯耐药基因及其质粒之间的相关性,以期为控制重要耐药基因以及耐药菌的扩散传播和减缓耐药性发展提供科学依据。本研究2015～2017年从全国21个省或直辖市共采集动物源样品6302份,包括食品动物源2771份,候鸟源3188份,宠物源343份。采用含美罗培南的加药培养基筛选出碳青霉烯不敏感菌株2255株,分离自1791份样品,样品阳性率为28.4%（1791/6302）,其中食品动物源样品阳性数654份,候鸟源1067份,宠物源70份。通过改良型Carba NP实验检测碳青霉烯不敏感菌株产碳青霉烯酶的能力,结果显示能够产碳青霉烯酶的菌株为1002株,对应分离自850份样品,分离率为13.5%（850/6302）。其中食品动物源产酶阳性样品数为208份,候鸟源为619份,宠物源23份,分离率分别为7.5%（208/2771）、19.4%（619/3188）和6.7%（23/343）。对产酶阳性菌株进行碳青霉烯酶耐药基因检测并对耐药基因阳性菌株进行菌种鉴定,结果显示检出593株bla NDM阳性大肠杆菌,10株bla VIM阳性恶臭假单胞菌,4株bla VIM阳性嗜麦芽寡养单胞菌和2株bla IMP阳性大肠杆菌。食品动物及其环境源和宠物源中所分离出的主要为大肠杆菌,候鸟及其环境源中分离得到的菌株则以克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌和变形杆菌为主。这609株阳性菌株的药敏结果显示其多重耐药现象严重,除了对头孢类和碳青霉烯类耐药率为100%外,对四环素、复方新诺明、氟苯尼考和庆大霉素的耐药率超过或接近80%,同时食品动物源菌株对阿米卡星,氨曲南,磷霉素,黏菌素和环丙沙星的耐药率明显高于候鸟源。采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对89株食品动物源、235株候鸟源和6株宠物源,共330株bla NDM阳性肠杆菌进行菌株分子分型,分析菌株间亲缘关系。结果显示食品动物源和宠物源中携带bla NDM基因肠杆菌之间相互亲缘关系较远,食品动物源中分离到的bla NDM阳性大肠杆菌有4组、每组2株菌间存在较高的亲缘关系,除此以外69株bla NDM阳性大肠杆菌各自属于不同的种系进化群,宠物源分离到的6株bla NDM阳性大肠杆菌被分为五个不同的种系进化群。候鸟源菌株的分型结果显示,230株阳性克雷伯氏菌分为5个种系进化群,其中202株归属于B群,这表明候鸟源中存在优势克隆群,bla NDM基因可能是通过优势克隆群进而在鸟群中传播。通过接合转移研究上述330株携带bla NDM基因肠杆菌的水平转移能力,结果显示动物源中携带bla NDM基因菌株的接合成功率较高,食品动物源、候鸟源和宠物源中成功率都达到了85%以上,显示其可转移能力较强。采用质粒复制子分型、S1-PFGE、Southern杂交等方法进一步分析携带bla NDM基因的质粒特征,发现动物源中介导bla NDM基因传播的主要载体是Inc X3型质粒。这表明虽然不同来源的NDM阳性菌亲缘关系较远,但因bla NDM基因能够通过Inc X3型质粒在不同菌株间传播,这或许是导致该基因在我国动物源中分布广泛的重要原因。选取78株食品动物源、46株候鸟源和2株宠物源,共130株bla NDM阳性菌株进行全基因组测序并分析,结果显示,食品动物源中bla NDM阳性菌携带率较高的耐药基因为四环素类、磺胺类、氨基糖苷类以及酰胺醇类,候鸟源中则是β-内酰胺酶、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类和磺胺类。MLST分型结果显示食品动物源bla NDM阳性大肠杆菌中比较流行的克隆群为ST48、ST165、ST405和ST34,候鸟源bla NDM阳性克雷伯菌中则是ST1697,该优势克隆群是K.pneumoniae subsp.pneumoniae与K.quasipneumoniae subsp.similipneumoniae重组后所形成的杂合菌株。介导我国动物源bla NDM基因传播的基因环境有四种,以IS26-tat-trp F-ble MBL-bla NDM-ISAba125-IS3000-△Tn2的结构为主。除此以外,发现宠物源中一株原菌及其接合子中存在一个Inc X3和Inc X4质粒杂合以后所形成的质粒,杂合后的质粒同时携带bla NDM-5和mcr-1两个耐药基因,能够同时介导对碳青霉烯类和黏菌素的耐药。综上所述,我国动物源中耐碳青霉烯菌株和产碳青霉烯酶菌株的流行较广,bla NDM-5基因是介导其产碳青霉烯酶并耐药的主要原因,且阳性菌株在不同来源菌株之间传播方式有一定差异,Inc X3型质粒是动物源中介导bla NDM基因传播的重要载体。本研究首次发现同时携带bla NDM-5和mcr-1基因的Inc X3-X4型杂合质粒,同时首次报道候鸟中携带NDM-5,且其优势克隆株由克雷伯氏菌中两个亚种之间杂合形成,暗示了耐药基因的水平转移、质粒和菌株间的重组在耐药基因的传播以及细菌的进化上起着重要的作用。
樊倩[4]（2017）在《四个乳酸菌素的原核表达及plnK对黄羽肉鸡肠道菌群的影响》文中提出肠道菌群对动物的健康至关重要,具有多种生理功能,一旦菌群失调就可能会导致疾病的发生。在这种情况下,大多都是使用抗生素来解决。但是,随着抗生素的大量使用和滥用,抗生素产生了很多的副作用,这问题引起了广泛的关注。乳酸菌素是由某些乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性的多肽或前体多肽,其具有无毒、无副作用、无残留、对环境无污染的特点,在畜禽生产中,可作为饲料添加剂替代抗生素。但由于野生乳酸菌分泌的乳酸菌素产量低和乳酸菌素分离纯化困难,给规模化生产乳酸菌素带来了极大的麻烦。因此,本试验采用基因工程技术,体外表达乳酸菌素,并通过体外抑菌试验初步验证乳酸菌素的抑菌作用,最后,通过饲养试验来探讨乳酸菌素plnK对肉鸡肠道微生物菌群和黏膜免疫功能的影响。具体内容如下:1.四个乳酸菌素的原核表达。方法:针对乳酸菌素plnE、plnF、plnJ和plnK编码框序列,设计四对特异性引物,进行PCR扩增,将这四个PCR扩增产物,分别与原核表达载体pET-32a（+）连接构建重组表达质粒,经PCR、双酶切及测序等进行鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达以及诱导条件优化,并进行Western blot鉴定,对重组表达蛋白进行Ni-NTA亲和层析法纯化。结果:PCR、双酶切及测序等进行鉴定结果表明,pET-32a（+）-plnE、pET-32a（+）-plnF、pET-32a（+）-plnJ和pET-32a（+）-plnK四个重组原核表达质粒均被构建成功。将其转化到E.coli BL21（DE3）感受态细胞内,SDS-PAGE分析结果显示,经过IPTG诱导表达的这四个重组蛋白大小分别为26.2ku、25.7ku、26.0ku和26.2ku,与预期的结果都一致。重组蛋白的诱导条件优化结果表明,pET-32a（+）-plnE蛋白的诱导表达条件为12h、37℃和1.0 mmoL/L;pET-32a（+）-plnF蛋白的诱导表达条件为12h、37℃和0.6mmoL/L;pET-32a（+）-plnJ 蛋白的诱导表达条件为 12h、37℃和 1.2 mmoL/L;pET-32a（+）-plnK蛋白的诱导表达条件为12h、37℃和0.4 mmoL/L。Western blot结果表明,重组的四个乳酸菌素都被正确表达。Ni-NTA亲和层析纯化结果表明,pET-3 2a（+）-plnE蛋白、pET-32a（+）-plnJ蛋白、pET-32a（+）-plnK蛋白这三个重组蛋白在280mM的咪唑浓度洗脱效率最高,而pET-32a（+）-plnF蛋白在200mM的咪唑浓度洗脱效率最高。2.乳酸菌素体外抑制试验。方法:以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌为指示菌,牛津杯法检测四个重组乳酸菌素不同浓度下的抑菌效果;分别添加1uL、10uL、50uL和100uL的0.50mg/mL重组乳酸菌素,筛选出最佳的抑菌浓度;最后比较分析了 plnE+plnF、plnJ+plnK、plnE、plnF、plnJ、plnK抑菌效果。结果:四个重组乳酸菌素在添加量为50uL（终浓度为2.5×10-2mg/mL）时抑菌效果最好;乳酸菌素plnE、乳酸菌素plnF单独和组合的抑菌效果一致,乳酸菌素plnJ、乳酸菌素plnK单独和组合的抑菌效果一致,都达到了良好的抑菌效果;从牛津杯抑菌试验结果可以知道,这四个乳酸菌素在蛋白浓度为2.5×10-2mg/mL时,可以看到明显的抑菌圈。表明四个重组乳酸菌素具有广谱抗菌活性。3.乳酸菌素plnK对黄羽肉鸡肠道菌群和黏膜免疫的影响。方法:选取300羽4日龄健康黄羽肉公鸡,分成5个组,每组设置5个重复,每个重复12羽。Ⅰ组为空白对照组,Ⅱ组为乙酸对照组,Ⅲ组为 5.00×10-3mg/mL 乳酸菌素 plnK 组,Ⅳ组为 2.50×1 0-3mg/mL 乳酸菌素plnK组,V组为1.25×10-3mg/mL乳酸菌素plnK组。试验期为28d,分别于饲喂后1周、2周、4周称重,记录采食量,计算料重比。采集各处理组肉鸡十二指肠,ELISA法测定各处理组SIgA含量;荧光定量PCR法检测各处理组肉鸡十二指肠黏膜免疫细胞因子（MDA5、IFN-α、IFN-β、TLR3、IFITM10、IFITM3 基因）的表达量;最后应用高通量测序分析各处理组肉鸡盲肠内容物菌群。结果:饲喂1周,Ⅳ组的平均日增重、平均日采食量、十二指肠黏膜SIgA含量显着高于 Ⅰ组（P<0.05）,Ⅳ组的 MDA5、IFN-α、IFN-β、TLR3、IFITM10、IFITM3基因的表达量极显着高于Ⅰ组（P<0.01）;高通量测序结果表明,饲喂1周,Ⅲ组出现特有的菌科:双歧杆菌科,且Ⅳ组、V组瘤胃球菌属UCG-013的丰度显着高于Ⅰ组（P<0.05）;Ⅲ组、Ⅳ组、V组乳杆菌属丰度高于Ⅰ组（P>0.05）;饲喂2周,Ⅳ组出现特有的菌科:酸杆菌科,Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组放线菌门的丰度小于Ⅰ组,V组粪球菌属的丰度显着高于Ⅰ组（P<0.05）,Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组乳杆菌属的丰度高于Ⅰ组（P>0.05）;饲喂4周,Ⅳ组、V组乳杆菌属的丰度高于Ⅰ组（P>0.05）。综上所述,本试验成功构建了 pET-32a（+）-plnE、pET-32a（+）-plnF、pET-32a（+）-plnJ和pET-32a（+）-plnK重组质粒,并成功在体外表达,获得了四个重组乳酸菌素,四个重组乳酸菌素均具有广谱抗菌活性;饲喂2.50×10-3mg/mL乳酸菌素plnK 2周提高了肉鸡十二指肠黏膜SIgA的含量,刺激免疫细胞因子的表达;提高了肉鸡肠道内酸杆菌门、软壁菌门、芽孢菌科、乳杆菌属等的丰度,从而促进肉鸡的生长。
贾如[5]（2016）在《枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶的分离纯化、基因克隆及表达》文中研究指明试验一目的是通过高效液相色谱法对我国不同年份、季节和地区饲料及饲料原料中黄曲霉毒素（AF）的分布规律及玉米生长和贮存过程中AF含量变化规律进行研究,为饲料生产企业及养殖企业提供数据参考。调查结果显示,1)2013-2015年北京地区12种饲料原料和6种饲料中AF污染普遍存在,2013年饲料与饲料原料中AF污染率和平均含量最高,2014年次之,2015年最低。三年内,DDGS和青贮中AF平均含量和超标率均高于其他饲料原料,污染严重。2)季节和地区不同,饲料原料中AF含量不同。冬夏两季玉米相比,夏季玉米更容易受AF污染;同期调研我国东北、华北、西南和南方地区玉米受AF污染情况发现:我国西南和南方地区玉米中AF的含量高于东北和华北地区。3)调研玉米中AF含量受生长环境和贮存条件的影响时发现:玉米在生长过程中更易受到AF的污染。试验二运用蛋白分离纯化技术和LC-MS技术对枯草芽孢杆菌（Bacillus subitilis）ANSB060分泌的枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶（Bacillus subtilis aflatoxin degradation enzyme,BADE）进行粗提、分离、纯化和鉴定。ANSB060发酵上清液乙醇沉淀粗酶经两次阴离子层析和疏水层析后,在SDS-PAGE电泳上显示单一蛋白条带,其表观分子量约为32.0 kDa。BADE经多步分离纯化后被纯化了约193倍,产率为35.4%,比活为75.25 ×103 U/mg。经过胶内酶解和LC-MS检测后,得到了 BADE的21段特征氨基酸序列。试验三目的是对产自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的黄曲霉毒素降解酶（B.subtilis aflatoxin degradation enzyme,BADE）进行基因克隆和原核外源表达。本试验通过试验二中特征氨基酸序列的信息设计引物,通过PCR扩增,进行同源基因的克隆。最终得到一条870 bp大小的全长序列,870 bp全长序列中含终止密码子TAA,共编码289个氨基酸,且此氨基酸序列与试验二中特征肽段的已知氨基酸序列比对,相似度为100%,认为基因克隆结果正确。将289个氨基酸编码的蛋白质经过生物信息学分析预测,推测BADE蛋白分子量为33.3 kDa,理论等电点为5.29,N端含有一段信号肽,剪切位点在第29位和30位氨基酸残基之间,无糖基化位点,有3个丝氨酸（Ser）和1个苏氨酸（Thr）磷酸化位点,二级结构中以a螺旋和随机卷曲为主。同时,将降解酶BADE基因在大肠杆菌中进行外源表达。首先将BADE基因和大肠杆菌表达载体pET30a经BamH I和Xho I双酶切后,体外连接,构建了重组原核表达载体pET30a-BADE,然后将重组载体转化入大肠杆菌E.coli Rosseta（DE3）中。通过加入IPTG诱导,重组蛋白被成功表达,主要以包涵体形式存在。最佳诱导表达条件为:IPTG浓度为0.3 mM,诱导时间2 h。1L重组大肠杆菌工程菌发酵能获得1 370 mg rBADE蛋白,降解AFB1的总活性为450 000 U,rBADE的酶比活为 328.5 U/mg。试验四对重组大肠杆菌黄曲霉毒素降解酶（rBADE）酶学特性进行了初步研究,同时分析了该重组酶与AFB1作用108 h后,降解产物的毒性。研究发现rBADE在温度为25～35℃,pH为6.0～8.5之间有较高的酶活,其中最佳酶活反应条件是温度30℃,pH为6.5;Km为 1.55×10-5 mol/L,具有良好的酶动力学特性。AFB1经rBADE降解生成的产物为致突变阴性,属低毒或无毒性物质。证明:rBADE是一种安全的AF降解剂。试验五目的是研究枯草芽孢杆菌ANSB060和ANSB01G制成的霉毒素生物降解剂,对采食AF和玉米赤霉烯酮（ZEA）污染日粮蛋鸡产蛋性能、蛋品质及鸡蛋中毒素残留量的影响。试验选用18周龄的“京红1号”蛋鸡336只,随机分为7个处理,每个处理8个重复,每个重复6只鸡。试验分为两个阶段,第一阶段（18-23周）为攻毒期,第二阶段为恢复期（24-29周）。在攻毒期,将18周龄蛋鸡随机分为7个处理,分别饲喂7种不同的试验组日粮,C组（正对照组）为正常玉米-花生粕型基础日粮:AF组是用21%的霉变花生粕等量替代C日粮中的正常花生粕;ZEA组是57.7%的霉变玉米等量替代C日粮中的正常玉米;AF+ZEA组是分别用21%霉变花生粕和57.7%霉变玉米等量替代C日粮中的正常花生粕和玉米;AH 000、ZEA1 000和AF+ZEA1 000组分别在AF、ZEA和AF+ZEA组中添加1 000 g/t的毒素降解剂。在恢复期,所有组都换成无毒的对照组日粮。结果表明:1)攻毒期,蛋鸡采食被AF或AF+ZEA同时污染的自然霉变日粮后,其产蛋率、采食量、饲料转化效率、蛋壳厚度显着（P<0.05）低于对照组,鸡蛋中毒素残留量显着（P<0.05）高于对照组;添加降解剂改善了蛋鸡产蛋性能和蛋品质,降低蛋中毒素残留量,使其与正常对照组差异不显着（P>0.05）2)AF和ZEA具有协同毒害作用,可协同降低蛋鸡生产性能、蛋品质,增加蛋中毒素的残留量。3)停止饲喂毒素日粮6周后,AF+ZEA同时污染组中,蛋鸡产蛋率和饲料转化率仍显着（P<0.05）低于对照组。
詹湉湉[6]（2016）在《黄羽肉鸡胰蛋白酶原的原核表达及体内分布研究》文中认为目的:胰蛋白酶原（Trypsinogen,TRY）是动物消化蛋白质不可或缺的一种酶。近年来有研究发现胰蛋白酶原不仅具有消化功能,它还扮演着其它功能。为更好的了解TRY的功能,本试验对TRY进行了基因克隆分析,原核表达及其在黄羽肉鸡体内的表达和分布情况的研究,研究结果可为肉鸡消化吸收功能研究提供理论基础。方法:（1）采用分子克隆技术克隆黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因,并运用生物信息学软件对黄羽肉鸡TR蛋白质结构和功能进行预测和分析。（2）采用原核表达技术,进行目的蛋白表达;利用亲和层析法纯化目的蛋白,将纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗TRY多克隆抗体。（3）利用免疫组织化学法、反转录PCR技术和荧光定量PCR技术分析TRY基因在黄羽肉鸡体内的分布情况,及不同生长发育阶段黄羽肉鸡胰腺组织中TRY基因表达的情况。结果:本试验成功克隆了黄羽肉鸡TRY基因,该基因开放阅读框全长747bp,由248个氨基酸残基组成,其中包含15个氨基酸的信号肽（MKFLVLVAFLGVA VA）和10个氨基酸（FPISDEDDDK）的激活肽;该蛋白的分子量为26.1ku,属于疏水性蛋白,不存在跨膜区,不含糖基化位点,有11个磷酸化位点。氨基酸序列比对结果显示:黄羽肉鸡TRY具有丝氨酸蛋白酶的保守结构特征,如含有催化三联体氨基酸（组氨酸-64,天冬氨酸-110和丝氨酸-203）;具有构成6个二硫键所需的12个半胱氨酸残基等。序列一致性分析发现,黄羽肉鸡TRY与原鸡的同源性最高,高达98.8%。经反转录PCR、酶切和测序分析表明,黄羽肉鸡TRY基因原核表达重组质粒构建成功。将构建好的重组质粒转染至BL21感受态细胞,采用SDS-PAGE电泳检测分析显示,重组蛋白诱导表达成功,最佳诱导条件为:37℃,200r/min,IPTG=0.8 mmol/L,诱导时间24h。通过亲和层析法纯化蛋白,梯度咪唑进行洗脱,结果表明160mM浓度的咪唑洗脱效果最好。利用免疫组化、反转录PCR和荧光定量PCR法探讨TRY基因在黄羽肉鸡体内分布情况,结果表明:（1）TRY基因在消化系统、神经系统、免疫系统、生殖系统等均有分布,以胰腺表达量最高,且雌雄黄羽肉鸡均有此分布特点。（2）TRY基因不仅具有组织分布的广泛性,还具有性别差异性与组织差异性。利用免疫组化、反转录PCR和荧光定量PCR法对胰腺组织RY基因与黄羽肉鸡生长发育的关系进行了研究探索。结果表明:（1）雌雄黄羽肉鸡存在相似的表达特点,TRY基因在1日龄即开始表达,且随着黄羽肉鸡的生长发育,其表达量也随之增加,在14日龄时,其表达量极显着提高。（2）胰腺组织TRY基因具有性别差异性。2周龄后,雄性黄羽肉鸡的表达量高于雌性的表达量。其中,14日龄差异显着（P<0.05）,35日龄和56日龄差异极显着（P<0.01）。结论:1.本试验成功克隆了黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因,通过体外表达获得了肉鸡TRY蛋白,并成功制备了高效价的兔抗鸡胰蛋白酶原多克隆抗体。2.黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因在消化系统、神经系统、免疫系统、生殖系统等均有分布,以胰腺表达量最高。3.黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因在1日龄即开始表达,其表达量随日龄增加而提高。4.黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因表达量与性别有关。2周龄后,雄性黄羽肉鸡表达量显着高于雌性黄羽肉鸡表达量。
毛娅卿[7]（2014）在《禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析》文中指出禽白血病（Avian leukosis）是制约养禽业发展的主要禽类传染病,以垂直传播为主,免疫污染禽白血病病毒（Avian leukosis virus, ALV）的活疫苗也是引发该病的重要原因之一。目前主要通过定期对鸡群进行ALV血清学监测,采取淘汰净化的方法控制该病。我国开展ALV血清学监测通常使用美国IDEXX等公司的检测试剂盒,检测成本高、推广范围窄。因此,研究开发具有自主知识产权的ALV检测试剂盒,降低ALV检测成本,扩大鸡群检测范围,对我国防控本病有重要的实际应用意义。另外,ALV-J在临床上自报道以来一直处于不断的变异中,当前尚无确切证据证明ALV-J在我国鸡群中致病作用有多样性的机制,而病毒准种的多样性很有可能是ALV-J致病作用多样性的机制之一。因此,开展ALV准种研究对于从分子水平上解析ALV-J在我国不同鸡群中致病作用的多样性具有重要的理论意义。本研究通过原核表达ALV p27蛋白,制备抗p27蛋白多克隆抗体,建立了ALV抗原ELISA检测方法和ALV抗体ELISA检测方法。试验结果表明,建立的两种检测方法与禽常见传染病病毒或其阳性血清、大肠杆菌阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性；两种方法的批内、批间重复性试验变异系数均小于10%,具有良好的可重复性；ALV抗原ELISA检测方法与IDEXX公司的ALV抗原检测试剂盒敏感性相当,符合率达到98.9%；ALV抗体ELISA检测方法比IDEXX公司的ALVA/B和J亚群抗体检测试剂盒相对于间接免疫荧光试验（IFA）有更高的符合率。利用本研究建立的抗原ELISA检测方法对918批不同疫苗进行了ALV检测,结果检测出63批外源性ALV污染疫苗。从2006年-2009年间污染的FPV. NDV和IBDV活疫苗中分别分离和鉴定到三株ALV,并对这三株ALV进行全基因组序列测定与分析。结果显示,三株ALV的gp85氨基酸序列与A亚群ALV参考毒株的gp85氨基酸序列同源性最高,为88.3%-97.7%,并且他们的全基因组整体同源性均较高；三株ALV与2009年分离自海兰褐祖代鸡的A亚群ALV中国分离株SDAU09C3同源性最高,显示它们很可能有共同的来源,也说明疫苗ALV污染是导致临床上鸡群发病的原因之一。从山东省某地方品系鸡疑似白血病发病鸡群分离到自然感染的血管瘤型ALV-J,并采用本研究建立的ALV抗原／抗体ELISA检测方法进行了抗原和抗体验证,同时选取LY1201株对其env基因进行了比较分析。结果证明ALV-J单一病毒株中存在差异极大的不同准种,发现gp85在氨基酸位点210-219发生10个连续的氨基酸缺失的准种,该缺失在此前我国ALV-J野毒株中均未发现,该研究说明可通过gp85序列测定进行ALV准种分析研究。在此基础上,将ALV-J LY1201株在DF-1细胞上连传3代后,扩增其gp85基因并对其20个阳性克隆子进行测序和准种分析,结果发现在20个克隆中gp85缺失的突变准种已经完全消失,原来的优势准种比例由33.3%上升为85.0%成为绝对优势准种。这表明ALV-J在适应细胞复制过程中病毒的准种组成是不断变化的,且发生突变的准种只有其复制能力高于原优势准种才可能具备竞争性优势。综上所述,本研究建立的ALV抗原/抗体ELISA检测方法,可用于ALV病毒检测和血清学监测,对于控制我国禽用病毒类活疫苗质量,加强禽白血病防控和净化具有重要的意义。目前本研究建立的ALV抗原ELISA检测方法已作为国家标准用于禽用病毒类活疫茁外源病毒检验。从禽用病毒类活疫苗中分离到污染的ALV,提示加强疫苗中ALV等外源病毒监测的重要性。同时,本研究建立的ALV-J准种分析方法,对于解析ALV-J在我国不同鸡群中致病作用的多样性提供了理论与技术支持。
刘栋[8]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中研究指明在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
韩清林[9]（2010）在《天府肉鸭α干扰素的原核表达及抗病毒活性研究》文中研究指明本文对天府肉鸭的干扰素进行如下系列研究：对天府肉鸭Ⅰ型干扰素基因IFN-αORF进行克隆、鉴定和序列分析；构建IFN-αORF基因原核表达载体；IFN-α原核表达及其生物学活性研究；利用DEF-VSV系统,对稀释复性后的天府肉鸭IFN-α成熟蛋白抗病毒活性进行了研究,获得以下结果：1.天府肉鸭IFN-αORF基因克隆、序列比对分析和蛋白结构预测应用Oligo6.0软件设计了两对加入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点的特异性引物,从经过5μg/ml PHA诱导培养的天府肉鸭外周血单核细胞中提取RNA,采用RT-PCR的方法,扩增得到天府肉鸭α干扰素ORF基因的DNA片段。构建了pMD18-T-DuIFNα克隆载体并测序,对测序结果采用DNAStar7.0软件进行序列分析以及与鸭、鸡、鹅等GenBank上α干扰素序列进行了比较。结果显示天府肉鸭与鸭（X84764）ORF基因序列十分相似,其核苷酸同源性达到99.5%,氨基酸同源性为98.4%。与鹅（AY524422）核苷酸及氨基酸同源性分别为96.2%,92.15%；与鸡（NM205427）的核苷酸及氨基酸同源性分别为73.4%、51.3%。同时对该基因所推测的蛋白进行了分析,结果表明天府肉鸭干扰素有2个潜在糖基化位点,8个潜在的磷酸化位点,信号肽切割位点28-29位ANA和FS氨基酸之间,存在跨膜区。2.天府肉鸭IFN-α成熟蛋白基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备构建天府肉鸭IFN-α成熟蛋白基因的重组原核表达载体pET-32a（+）-mDuIFNα,将其转化入大肠杆菌BL21 （DE3）pLysS表达菌株,利用IPTG进行诱导表达,得到大小约为35 kDa的重组融合蛋白,与预期表达的蛋白大小相一致,主要以包涵体的形式存在。最佳表达优化条件为0.2 mmol/L的IPTG,37℃下诱导3～4 h。利用纯化的重组蛋白制备兔抗高免血清,琼脂糖扩散试验效价为1：32。兔抗鸭IFN-α成熟蛋白IgG经硫酸铵盐析和High-Q阴离子交换层析纯化具特异性强的优点。3.天府肉鸭α干扰素成熟蛋白基因原核表达产物的复性及抗病毒活性研究对纯化后的天府肉鸭IFN-α成熟蛋白包涵体采用稀释复性的方法复性,采用DEF-VSV系统初步检测抗病毒活性,干扰素的抗病毒活性约为256U/ml,比活力为646.4U/mg。结果发现,表达的干扰素具有抑制病毒增殖的生物学活性。
陈斌[10]（2008）在《鸭α干扰素原（真）核表达及其生物学活性研究》文中研究说明本文对四川省内地方品种四川麻鸭的干扰素进行如下系列研究:对四川麻鸭Ⅰ型干扰素基因IFN-αORF进行克隆、鉴定和序列分析;构建IFN-αORF基因原核表达载体和真核表达载体;IFN-α原核表达及其生物学活性研究;利用雏鸭为模型,应用免疫组织化学方法研究pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒在鸭体内的动态表达分布规律;同时对作为免疫佐剂的pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒免疫调节活性进行研究,获得以下结果:1.四川麻鸭IFN-αORF基因克隆、序列比对分析和蛋白结构预测应用Oligo6.0软件设计了两对加入EcoRI和BamHI两个酶切位点的特异性引物对,采用PCR和nest-PCR的方法,从鸭肝脏组织基因组DNA扩增得到大小两个完全包含麻鸭α干扰素ORF基因的DNA片段。其中小片段更适合用于表达,并将其进行pGEM-T载体克隆与测序,对测序结果采用ClustalX软件进行序列分析以及与北京鸭、鸡、鹅等NCBI上序列进行了比较。结果显示四川麻鸭与北京鸭ORF基因序列十分相似,其核苷酸同源性达到99.13%,氨基酸同源性为98.96%。与鸡的核苷酸及氨基酸同源性分别为71.8%、49.97-50.47%,与鹅的核苷酸同源性为96%。同时用BioEdit、NetNGlyc、TreeView软件对该基因所推测的蛋白进行了分析,结果表明四川麻鸭有2个潜在糖基化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylation）和1个酪蛋白激酶Ⅲ磷酸化位点（Casein kinaseⅢphosphorylation site）,信号肽切割位点28-29位ANA和FS氨基酸之间,成熟的鸭α干扰素有5个疏水区,无跨膜区。2.SDIFN-αORF基因原核表达载体pBV220-SDIFN-α的构建及表达产物的抗病毒活性采用BamHI和EcoRI酶切,通过定向粘末段连接法,构建了原核表达载体pBV220-SDIFN-α质粒。并将质粒转化到原核表达菌株DH5α中进行表达,采用温度诱导的方式,对诱导后的菌液进行SDS-PAGE检测。结果显示工程菌进行了表达,产生的包涵体蛋白分子量为40KD左右。对纯化后的包涵体采用稀释复性的方法复性,采用VSV/DEF系统初步检测抗病毒活性,干扰素的抗病毒活性约为150U/ml,比活力为440U/mg。应用FQ-PCR检测方法,动态监测体内抑制DHBV和体外抑制DPV病毒核酸。结果发现,表达的干扰素具有强烈的病毒复制抑制作用,具有明显的生物学活性。3.SDIFN-αORF基因真核表达载体pcDNA-SDIFN-α的构建及鉴定利用合成在引物两端的EcoRI、BamHI酶切位点,将目的基因成功地从pGEM-T载体克隆重组体中切下,并通过粘端连接的方法,连接到pUC18定向位置上,然后用EcoRI和XbaI双酶切真核表达载体pcDNA3.1（+）和pUC18-SDIFN-α,实现了SDIFN-α定向克隆到pcDNA3.1（+）载体上。四川麻鸭IFN-α真核表达重组质粒pcDNA-SDIFN-α经BamHI、EcoRI和XbaI三种酶切验证,并测序证明四川麻鸭IFN-α的真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α构建正确。4.免疫组织化学检测真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α在鸭体内表达方法的建立及动态表达规律的研究以pcDNA-SDIFN-α真核质粒免疫鸭,分时间段采集鸭16种不同组织,建立了免疫组织化学检测方法,并应用该方法检测干扰素在体内的动态表达规律。pcDNA-SDIFN-α免疫鸭后,持续表达时间长达9周。能在肺脏细胞、心肌细胞、肝细胞、脾细胞、肠腺和肠绒毛细胞、肌肉细胞、皮肤内检测到表达产物,在14d-35d进行了高峰表达。胸腺、胰腺、法氏囊和哈德氏腺未检测到阳性黄色颗粒,肺脏、免疫部位最早出现阳性颗粒,脑组织细胞中阳性颗粒数量随时间变化较小。其中基因枪免疫鸭后,各组织中的含量和表达量呈现的总体规律为6μg组＞3μg组＞1μg组。肌肉注射免疫鸭后,各组织中的含量和表达量呈现的总体规律为200μg组＞100μg组＞50μg组,都具有一定的剂量相关性。基因枪轰击法较肌肉注射法IFN-α基因表达出现的时间早,3h就可以检测到表达产物。同时,相对于肌肉注射法免疫,基因枪轰击法所用的表达质粒用量更少。5.真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α在鸭体内免疫调节剂活性的初步研究以pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒为免疫调节剂,研究对DPV/DVH弱毒苗免疫活性调节作用。分不同时间段采血,采用MTT法测定鸭外周血T淋巴细胞转化效果、CD3+T淋巴细胞数量变化和特异性DPV中和抗体IgG水平。结果表明,一定剂量的pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒作为免疫调节剂在一定时间内能促进和提高细胞免疫和体液免疫应答,发挥着有效的正向免疫调节作用。
二、肉鸡IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肉鸡IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
（1）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 犬干扰素研究进展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分类 |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因组成 |
| 1.3 IFN的空间结构及受体研究 |
| 1.4 IFN生物学活性及作用机制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬长效IFN研究 |
| 3 犬IFN临床应用 |
| 3.1 治疗犬病毒性传染病 |
| 3.2 治疗犬皮肤性疾病 |
| 3.3 治疗眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN应用展望 |
| 第二章 白细胞介素18研究进展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的发现、结构、特性 |
| 1.2 IL-18受体及信号传导途径 |
| 1.3 IL-18结合蛋白 |
| 2 IL-18生物学作用 |
| 2.1 IL-18抗肿瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫调节作用 |
| 3 IL-18与临床疾病的关系 |
| 3.1 IL-18与自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18与心血管系统疾病的关系 |
| 3.3 IL-18与神经系统疾病的关系 |
| 3.4 IL-18与肿瘤疾病的关系 |
| 3.5 IL-18与糖尿病等其他疾病的关系 |
| 4 IL-18应用展望 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR扩增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重组质粒的酶切及PCR鉴定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列测定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表达、纯化及活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白纯化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性检测 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性检测 |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表达及生物学活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列测定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比较分析及进化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重组蛋白表达及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物学活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
（2）Thermomyces dupontii脂肪酶高效制备及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脂肪酶简介 |
| 1.2 微生物脂肪酶 |
| 1.2.1 细菌脂肪酶 |
| 1.2.2 真菌脂肪酶 |
| 1.3 脂肪酶异源表达概述 |
| 1.3.1 脂肪酶在大肠杆菌的重组表达 |
| 1.3.2 脂肪酶在毕赤酵母的重组表达 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统概述 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达元件简介 |
| 1.4.3 毕赤酵母表达宿主简介 |
| 1.4.4 酵母表达系统蛋白胞外分泌途径 |
| 1.4.5 外源蛋白在毕赤酵母高效表达策略 |
| 1.5 脂肪酶温度优化 |
| 1.5.1 提升脂肪酶热稳定性 |
| 1.5.2 提升脂肪酶在低温条件下的酶活性 |
| 1.6 脂肪酶应用研究进展 |
| 1.6.1 造纸领域 |
| 1.6.2 畜禽养殖领域 |
| 1.6.3 结构脂领域 |
| 1.6.4 生物柴油领域 |
| 1.6.5 手性拆分合成生物医药中间体 |
| 1.7 本论文的研究背景、意义和内容 |
| 1.7.1 研究背景和意义 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第二章 不同启动子对TDL在毕赤酵母表达的影响 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 主要实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 培养基及溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 毕赤酵母X33 基因组提取 |
| 2.2.2 大肠杆菌Top10 感受态细胞制备 |
| 2.2.3 不同启动子表达载体构建 |
| 2.2.4 毕赤酵母感受态细胞的制备 |
| 2.2.5 重组酵母工程菌种的构建及筛选 |
| 2.2.6 重组工程菌的高密度发酵 |
| 2.2.7 分析检测方法 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.3.1 TDL在不同甲醇诱导型启动子下的表达 |
| 2.3.2 TDL在不同组成型启动子下的表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 不同信号肽对TDL在毕赤酵母表达的影响 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 主要实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.1.3 培养基及溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 毕赤酵母X33 基因组提取 |
| 3.2.2 大肠杆菌Top10 感受态细胞制备 |
| 3.2.3 不同异源信号肽表达载体构建 |
| 3.2.4 同源信号肽表达载体构建 |
| 3.2.5 α-MF信号肽及其突变体表达载体构建 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 TDL在异源信号肽下的表达 |
| 3.3.2 TDL在同源信号肽下的表达 |
| 3.3.3 α-MF信号肽密码子优化对TDL表达的影响 |
| 3.3.4 α-MF信号肽删减突变 |
| 3.3.5 α-MF增加序列突变 |
| 3.3.6 优化信号肽蛋白酶Kex2 切割位点 |
| 3.3.7 综合摇瓶比较分析 |
| 3.3.8 重组菌D57-74高密度发酵 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 组合策略提升重组TDL在毕赤酵母的表达 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 主要实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 |
| 4.1.3 培养基及溶液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 多拷贝重组TDL工程菌构建及筛选 |
| 4.2.2 分子伴侣蛋白共表达 |
| 4.2.3 高密度发酵条件优化 |
| 4.2.4 重组工程菌大规模发酵 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 TDL多拷贝重组工程菌构建及筛选 |
| 4.3.2 单分子伴侣蛋白共表达 |
| 4.3.3 双分子伴侣蛋白共表达 |
| 4.3.4 高密度发酵优化 |
| 4.3.5 大规模高密度发酵培养 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 理性设计优化TDL温度特性 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 主要实验材料 |
| 5.1.2 主要仪器与设备 |
| 5.1.3 培养基及溶液的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 TDL结构分析及分子建模 |
| 5.2.2 去糖基化降低TDL最适反应温度 |
| 5.2.3 去二硫键降低TDL最适反应温度 |
| 5.2.4 增加二硫键突变体提升重组TDL热稳定性 |
| 5.2.5 点突变提升重组TDL热稳定性 |
| 5.2.6 组合突变提升重组TDL热稳定性 |
| 5.3 结果和讨论 |
| 5.3.1 TDL结构分析及分子建模 |
| 5.3.2 去糖基化降低重组TDL最适反应温度 |
| 5.3.3 去二硫键降低重组TDL最适反应温度 |
| 5.3.4 理性设计二硫键提升TDL热稳定性 |
| 5.3.5 定点突变提升重组TDL热稳定性 |
| 5.3.6 组合突变 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 TDL及其突变体初步应用研究 |
| 6.1 材料与仪器 |
| 6.1.1 主要实验材料 |
| 6.1.2 主要仪器与设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 TDL及其突变体N55D在造纸脱墨的初步应用 |
| 6.2.2 TDL及其组合突变体5 在肉鸡养殖的初步应用 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 TDL及其突变体N55D在造纸脱墨的初步应用 |
| 6.3.2 TDL及其组合突变体5 在肉鸡养殖的初步应用 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、本研究的创新点 |
| 三、前景与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）动物源肠杆菌中碳青霉烯耐药基因blaNDM的流行分布及分子传播机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 碳青霉烯类抗生素 |
| 1.1.2 碳青霉烯类抗生素的耐药机制 |
| 1.1.3 金属 β-内酰胺酶NDM研究进展 |
| 1.2 研究的目的和意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第二章 动物源产碳青霉烯酶肠杆菌的流行情况及其特点 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 碳青霉烯不敏感菌株的分离结果 |
| 2.3.2 产碳青霉烯酶菌株的检测结果 |
| 2.3.3 碳青霉烯类耐药基因的检测 |
| 2.3.4 碳青霉烯耐药基因阳性菌的鉴定 |
| 2.3.5 药物敏感度实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 碳青霉烯不敏感菌株的分离、流行与分布情况 |
| 2.4.2 碳青霉烯耐药基因的检测情况 |
| 2.4.3 动物源耐药情况 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 动物源肠杆菌中bla_(NDM)基因分子传播机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 PFGE结果 |
| 3.3.2 接合转移实验结果 |
| 3.3.3 接合子质粒酶切图谱分析 |
| 3.3.4 接合子质粒复制子分型结果 |
| 3.3.5 S1-PFGE结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 PFGE分析 |
| 3.4.2 携带bla_(NDM)基因质粒分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 动物源bla_(NDM)阳性肠杆菌基因组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 基因组DNA片段化结果 |
| 4.3.2 待测序菌株DNA文库构建 |
| 4.3.3 食品动物源bla_(NDM)阳性肠杆菌测序分析 |
| 4.3.4 候鸟源bla_(NDM)阳性肠杆菌测序分析 |
| 4.3.5 宠物源bla_(NDM)阳性肠杆菌测序分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文讨论与结论 |
| 5.1 全文讨论 |
| 5.2 全文结论 |
| 5.3 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 发表文章及参加的相关学术会议 |
| 附录B 攻读博士期间所获奖项 |
（4）四个乳酸菌素的原核表达及plnK对黄羽肉鸡肠道菌群的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 乳酸菌的概况 |
| 1.1 乳酸菌定义及分类 |
| 1.2 乳酸菌的特性 |
| 1.3 乳酸菌在畜牧业上的应用 |
| 2 乳酸菌素 |
| 3 乳酸菌素的分类 |
| 3.1 羊毛硫细菌素(Class Ⅰ) |
| 3.2 非羊毛硫氨基酸的热稳定小分子多肽(ClassⅡ) |
| 3.3 大分子热不稳定肽(Class Ⅲ) |
| 4 影响乳酸菌素产量的因素 |
| 5 乳酸菌素的抑菌作用 |
| 6 乳酸菌素的应用 |
| 6.1 乳酸菌素在食品保鲜中的应用 |
| 6.2 乳酸菌素在医疗中的应用 |
| 6.3 乳酸菌素在动物生产中的应用 |
| 6.4 乳酸菌素在动物疾病中的应用 |
| 7 乳酸菌素的研究趋势 |
| 8 宏基因组学 |
| 8.1 宏基因组学概念 |
| 8.2 宏基因组学的研究方法 |
| 8.3 宏基因组学在肠道微生物上的研究进展 |
| 9 本项目研究的目的和意义 |
| 第二章 乳酸菌素plnE、plnF、plnJ、plnK的原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 plnE蛋白的原核表达 |
| 2.2 plnF蛋白的原核表达 |
| 2.3 plnJ蛋白的原核表达 |
| 2.4 plnK蛋白的原核表达 |
| 2.5 四个重组蛋白浓度测定结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 四个重组乳酸菌素体外抑菌效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同浓度的pET-32a(+)-plnE重组乳酸菌素对指示菌的抑菌结果 |
| 2.2 不同浓度的pET-32a(+)-plnF重组乳酸菌素对指示菌的抑菌结果 |
| 2.3 不同浓度的pET-32a(+)-plnJ重组乳酸菌素对指示菌的抑菌结果 |
| 2.4 不同浓度的pET-32a(+)-plnK重组乳酸菌素对指示菌的抑菌结果 |
| 2.5 pET-32a(+)-plnE和pET-32a(+)-plnF重组乳酸菌素组合对指示菌的抑菌结果 |
| 2.6 pET-32a(+)-plnJ和pET-32a(+)-plnK重组乳酸菌素组合对指示菌的抑菌结果 |
| 2.7 牛津杯法检测四个乳酸菌素对指示菌的抑菌结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 乳酸菌素plnK对黄羽肉鸡肠道菌群的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1试验动物及材料 |
| 1.2 试验设计 |
| 1.3 测定指标及方法 |
| 1.4 数据处理分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳酸菌素plnK对黄羽肉鸡生长性能的影响 |
| 2.2 乳酸菌素plnK对肉鸡十二指肠黏膜SIgA含量及免疫细胞因子表达量的影响 |
| 2.3 乳酸菌素plnK对肉鸡肠道菌群的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乳酸菌素plnK对黄羽肉鸡生长性能的影响 |
| 3.2 乳酸菌素plnK对黄羽肉鸡肠道黏膜免疫功能的影响 |
| 3.3 乳酸菌素plnK对黄羽肉鸡肠道菌群的影响 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 常用英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶的分离纯化、基因克隆及表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词表(Abbreviations) |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 国内外研究现状 |
| 3 本课题的研究内容和技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 饲料及饲料原料中黄曲霉毒素污染情况调查研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 试验二 枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶的分离纯化及鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 试验三 枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果与分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 试验四 重组大肠杆菌黄曲霉毒素降解酶(rBADE)酶学特性及降解产物致突变性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 试验五 枯草芽孢杆菌降解剂对采食黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮污染日粮蛋鸡的作用效果 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 结论与建议 |
| 1 本研究的主要结论 |
| 2 本论文的创新点 |
| 3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）黄羽肉鸡胰蛋白酶原的原核表达及体内分布研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 禽类消化酶的影响因素 |
| 2 胰蛋白酶原与胰蛋白酶 |
| 2.1 胰蛋白酶的结构 |
| 2.2 胰蛋白酶的分离纯化 |
| 2.3 胰蛋白酶(原)的分子克隆 |
| 2.3.1 真菌胰蛋白酶(原)基因 |
| 2.3.2 无脊椎动物胰蛋白酶(原)基因 |
| 2.3.3 脊椎动物胰蛋白酶(原)基因 |
| 2.4 胰蛋白酶的应用研究 |
| 2.4.1 胰蛋白酶在医药工业中的应用 |
| 2.4.2 胰蛋白酶在食品工业中的应用 |
| 2.4.3 胰蛋白酶在现代分子生物学中的应用 |
| 2.4.4 胰蛋白酶在畜牧业方面的应用 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因的克隆 |
| 1 序言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 载体和感受态细胞 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 cDNA的合成及PCR扩增 |
| 2.2.3 黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因cDNA的克隆 |
| 2.2.4 胰蛋白酶原基因序列比较及生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 目的基因反转录PCR扩增、克隆和酶切鉴定 |
| 3.2 胰蛋白酶原基因的基本信息 |
| 3.3 黄羽肉鸡TRY氨基酸序列预测及蛋白质性质分析 |
| 3.3.1 胰蛋白酶原基因信号肽预测结果 |
| 3.3.2 胰蛋白酶原基因糖基化位点预测结果 |
| 3.3.3 胰蛋白酶原基因磷酸化位点预测结果 |
| 3.3.4 胰蛋白酶原疏水性、亲水性及跨膜结构域预测结果 |
| 3.3.5 胰蛋白酶原二级结构预测分析 |
| 3.3.6 氨基酸序列比对结果分析 |
| 3.3.7 氨基酸序列同源性分析 |
| 3.3.8 胰蛋白酶原遗传系统进化树构建 |
| 4 讨论 |
| 试验二 肉鸡胰蛋白酶原基因原核表达与多克隆抗体制备 |
| 1 序言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 载体和感受态细胞 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 黄羽肉鸡TRY基因原核表达载体 |
| 2.2.3 重组质粒的转化 |
| 2.2.4 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.5 重组质粒pET-32a-TRY诱导表达时间优化 |
| 2.2.6 重组质粒pET-32a-TRY诱导表达 |
| 2.2.7 融合蛋白的ProteinIsoTM Ni-NTA Resin亲和层析纯化 |
| 2.2.8 目的蛋白免疫印迹鉴定 |
| 2.2.9 多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TRY基因反转录PCR扩增结果 |
| 3.2 重组表达质粒的鉴定结果 |
| 3.3 重组质粒在大肠杆菌中的的诱导表达结果分析 |
| 3.4 融合蛋白诱导表达时间优化结果 |
| 3.5 重组质粒pET-32a-TRY亲和层析纯化 |
| 3.6 目的蛋白Western-blot鉴定结果 |
| 3.7 多克隆抗体血清效价检测结果 |
| 3.8 多克隆抗体鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 黄羽肉鸡TRY原核表达载体的构建及重组蛋白的表达、纯化 |
| 4.2 兔抗鸡胰蛋白酶原阳性血清的制备及蛋白免疫印迹 |
| 试验三 黄羽肉鸡胰蛋白酶原的组织分布研究 |
| 1 序言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 试验设计 |
| 2.2.3 饲养管理 |
| 2.2.4 样品采集与处理 |
| 2.2.5 免疫组化法定位研究 |
| 2.2.6 反转录PCR检测胰蛋白酶原组织分布 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 胰蛋白酶原在黄羽肉鸡体内分布免疫组化初步定位 |
| 3.2 反转录PCR法检测胰蛋白酶原的组织分布情况 |
| 3.3 荧光定量PCR检测胰蛋白酶原的组织分布情况 |
| 3.3.1 引物特异性分析 |
| 3.3.2 标准曲线的建立结果 |
| 3.3.3 荧光定量PCR结果分析 |
| 4 讨论 |
| 试验四 不同发育阶段黄羽肉鸡胰蛋白酶原基因表达研究 |
| 1 序言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 试验设计 |
| 2.2.3 饲养管理 |
| 2.2.4 样品采集与处理 |
| 2.2.5 免疫组化法定位研究 |
| 2.2.6 反转录PCR法检测胰蛋白酶原组织分布 |
| 2.2.7 荧光定量PCR法检测胰蛋白酶原组织分布 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 免疫组化法初步定位黄羽肉鸡发育过程中胰蛋白酶原基因在胰腺中的表达 |
| 3.2 反转录PCR法检测黄羽肉鸡发育过程中胰蛋白酶原基因的表达 |
| 3.3 荧光定量PCR检测胰蛋白酶原的表达结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第三章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 致谢 |
（7）禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 插图与附表清单 |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1 禽白血病概况 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床特征和病理变化 |
| 1.4 禽白血病的检测和诊断 |
| 1.5 预防和控制 |
| 2. 病毒的准种及其演变 |
| 2.1 准种的特性 |
| 2.2 准种的作用 |
| 2.3 准种的研究方法 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 禽白血病病毒P27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR扩增结果 |
| 2.2 重组克隆载体的构建与鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒的双酶切鉴定 |
| 2.4 P27蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.5 表达蛋白的纯化 |
| 2.6 表达蛋白的WESTERN-BLOTTING鉴定 |
| 2.7 兔抗P27蛋白抗体的效价测定 |
| 2.8 兔抗P27蛋白抗体的纯化 |
| 2.9 兔抗P27抗体的酶标化结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 禽白血病病毒抗原ELISA检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 双抗体夹心ELISA相关试验条件的确定 |
| 2.2 阴阳性临界值的确定 |
| 2.3 特异性试验 |
| 2.4 敏感性试验 |
| 2.5 重复性试验 |
| 2.6 符合率试验 |
| 2.7 保存期试验 |
| 2.8 临床试验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 间接ELISA相关试验条件的确定 |
| 2.2 阴阳性临界值的确定 |
| 2.3 特异性试验结果 |
| 2.4 敏感性试验结果 |
| 2.5 重复性试验结果 |
| 2.6 符合率试验结果 |
| 2.7 保存期实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 禽弱毒疫苗中ALV的分离鉴定及其全基因组序列分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 三种活疫苗中ALV的分离鉴定 |
| 2.2 三株ALV全基因组的克隆测序 |
| 2.3 分离毒株GP85基因的序列分析与亚群鉴定 |
| 2.4 分离毒株与不同亚群参考毒株主要基因区域的同源性比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 血管瘤病鸡中AIV-J的分离鉴定及其准种分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2 血清抗体检测 |
| 2.3 ALV-J的准种多样性 |
| 2.4 氨基酸序列同源性比较 |
| 2.5 细胞传代前后准种比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 第八章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（9）天府肉鸭α干扰素的原核表达及抗病毒活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 干扰素概述 |
| 2 干扰素的种类及结构 |
| 3 干扰素的生物学活性及其机制 |
| 3.1 干扰素的抗病毒作用机理 |
| 3.2 干扰素的免疫调节机理 |
| 3.3 干扰素抗肿瘤作用及机理 |
| 3.4 干扰素与神经内分泌之间的相互作用 |
| 4 病毒对干扰素的抵抗 |
| 5 禽类干扰素研究进展 |
| 6 研究目的及意义 |
| 第二章 天府肉鸭α干扰素基因的T克隆及生物信息学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株/载体/实验动物 |
| 1.2 主要试剂及配制 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 鸭外周血有核细胞的分离培养及细胞总RNA的提取 |
| 2.3 鸭IFN-α基因的扩增 |
| 2.4 扩增产物的纯化 |
| 2.5 PCR纯化产物与克隆载体的连接 |
| 2.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.7 转化 |
| 2.8 鸭IFN-α基因阳性重组子的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 鸭IFN-α基因的扩增 |
| 3.2 鸭IFN-α基因克隆质粒pMD18-T-DuIFNα的鉴定 |
| 3.3 生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNA提取 |
| 4.2 生物信息学分析 |
| 4.3 密码子偏嗜性分析 |
| 第三章 鸭IFN-α基因的原核表达及抗病毒活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株/毒株/载体/试验动物 |
| 1.2 主要试剂及配制 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鸭IFN-α基因的亚克隆 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.3 鸭IFN-α成熟蛋白的纯化 |
| 2.4 多克隆抗体的制备及效价检测 |
| 2.5 免疫兔血清的Western Blotting检测 |
| 2.6 抗体IgG的粗提和纯化 |
| 2.7 重组鸭α干扰素包涵体溶解蛋白的复性 |
| 2.8 重组鸭α干扰素活性测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 天府肉鸭IFN-α基因的亚克隆 |
| 3.2 重组蛋白在大肠杆菌中的表达及条件优化 |
| 3.3 鸭IFN-α成熟蛋白的纯化 |
| 3.4 兔抗鸭α干扰素成熟蛋白多克隆抗体效价检测 |
| 3.5 抗体IgG的粗提和纯化 |
| 3.6 天府肉鸭α干扰素成熟蛋白的抗病毒活性研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 表达载体、宿主菌的选择和融合表达的意义 |
| 4.2 重组蛋白的表达、纯化 |
| 4.3 天府肉鸭α干扰素成熟蛋白的复性 |
| 4.4 天府肉鸭α干扰素成熟蛋白的抗病毒活性研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）鸭α干扰素原（真）核表达及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 干扰素研究进展 |
| 一、干扰素的种类和结构 |
| 二、干扰素生物学特点 |
| 三、禽类干扰素研究进展 |
| 四、兽医领域基因工程干扰素的应用研究 |
| 第二章 佐剂及遗传佐剂研究进展 |
| 一、协同刺激分子(共刺激分子)佐剂 |
| 二、CpG DNA序列和脂质体 |
| 三、细胞因子佐剂 |
| 四、影响遗传佐剂效果的其他因素 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 四川麻鸭α干扰素基因的克隆及序列分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 麻鸭 |
| 1.2 酶及试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 SDIFN-αORF基因的克隆 |
| 2.2 目的基因的序列测定与分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 PCR扩增产物 |
| 3.2 nest-PCR扩增产物 |
| 3.3 PCR和nest-PCR产物比较 |
| 3.4 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.5 重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 3.6 IFN-α序列 |
| 3.7 序列分析 |
| 3.8 糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点分析 |
| 3.9 信号肽预测 |
| 3.10 疏水性分析 |
| 3.11 跨膜区和高级结构分析 |
| 3.12 同源性分析和进化比较 |
| 4.讨论 |
| 4.1 引物设计 |
| 4.2 基因扩增 |
| 4.3 T载体克隆 |
| 4.4 生物信息学分析 |
| 5、小结 |
| 第四章 鸭α干扰素基因原核表达载体构建及其表达产物的抗病毒活性 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 四川麻鸭IFN-α原核表达质粒的构建技术路线 |
| 2.2 SDIFN-α原核表达质粒的构建 |
| 2.3 重组质粒的鉴定 |
| 2.4 pBV220-SDIFN-α原核表达菌株的初步表达 |
| 2.5 鸭α-IFN包涵体纯化及复性 |
| 2.6 采用细胞病变抑制法(DEF/VSV系统)初步测定干扰素抗病毒活性 |
| 2.7 FQ-PCR检测干扰素抗病毒活性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株PCR扩增鉴定结果 |
| 3.2 pBV220-SDIFN-α质粒酶切鉴定结果 |
| 3.3 pBV220-SDIFN-α序列测定 |
| 3.4 pBV220-SDIFN-α的原核表达情况 |
| 3.5 表达产物抗病毒活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于表达系统及表达质粒的选择 |
| 4.2 关于感受态细胞的制备与转化 |
| 4.3 关于重组质粒的鉴定 |
| 4.4 关于基因表达 |
| 4.5 关于表达产物抗病毒活性测定 |
| 5 小结 |
| 第五章 四川麻鸭α干扰素基因(SDIFN-α)真核表达载体构建 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 四川麻鸭IFN-α真核表达质粒的构建 |
| 2.2 pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒的单双酶切鉴定 |
| 2.3 pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒序列测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 四川麻鸭IFN-α基因的获取 |
| 3.2 pUC-SDIFN-α酶切鉴定结果 |
| 3.3 pcDNA-SDIFN-α酶切鉴定结果 |
| 3.4 pcDNA-SDIFN-α序列测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 构建SDIFN-α的真核表达重组体的意义 |
| 4.2 四川麻鸭IFN-α的真核表达载体的克隆 |
| 5、小结 |
| 第六章 免疫组织化学检测鸭α干扰素方法的建立及鸭α干扰素真核表达质粒在免疫鸭体内的表达规律研究 |
| 1 实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α的大量提取 |
| 2.2 质粒的纯化 |
| 2.3 含pcDNA-SDIFN-α的基因枪子弹的制备 |
| 2.4 实验鸭免疫分组设计 |
| 2.5 采样时间与部位 |
| 2.6 兔抗鸭IFN高免血清的制备及其IgG提取纯化 |
| 2.7 兔抗鸭IFN-IgG的检测及分析 |
| 2.8 免疫组织化学法方法的建立 |
| 2.9 免疫组织化学结果判定 |
| 3、结果与分析 |
| 3.1 表达质粒纯化及检测 |
| 3.2 原核表达产物SDIFN—a抗原的制备 |
| 3.3 SDIFN—a蛋白的纯化 |
| 3.4 琼扩检测及分析 |
| 3.5 ELISA检测及分析 |
| 3.6 Western-Blotting检测及分析 |
| 3.7 免疫组织化学方法检测及真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α体内动态表达规律 |
| 4、讨论 |
| 4.1 质粒提取及纯化。 |
| 4.2 抗原抗体反应的检测 |
| 4.3 免疫组织化学检测表达规律。 |
| 5、小结 |
| 第七章 鸭α干扰素真核表达质粒pCDNA-SDIFN-α免疫调节剂研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 质粒的制备及纯化 |
| 2.2 基因枪子弹的制备 |
| 2.3 动物分组和免疫 |
| 2.4 血样的采集和处理 |
| 2.5 淋巴细胞转化试验 |
| 2.6 CD3+T淋巴细胞数量的检测 |
| 2.7 血清IgG的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 质粒pcDNA-SDIFN-α以不同途径、不同剂量与DPV/DVH弱毒作用后鸭外周血T淋巴细胞转化效果 |
| 3.2 质粒pcDNA-SDIFN-α以不同途径、不同剂量与DVH弱毒作用鸭后激发外周血CD3+T淋巴细胞数量的动态变化 |
| 3.3 质粒pcDNA-SDIFN-α以不同途径、不同剂量与DPV弱毒作用鸭后血清抗体水平的动态变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 质粒pcDNA-SDIFN-α作用鸭后对弱毒苗激发鸭外周血T淋巴细胞转化能力的影响 |
| 4.2 质粒pcDNA-SDIFN-α作用鸭后对疫苗免疫鸭的外周血CD3+T淋巴细胞数量的影响 |
| 4.3 质粒pcDNA-SDIFN-α免疫途径、剂量、时间对疫苗免疫效果的影响 |
| 4.4 a-干扰素抗病毒活性与免疫调节的关系 |
| 5、小结 |
| 第三部分 结论: |
| 参考文献 |
| 附表 免疫组织化学检测结果 |
| 附图 免疫组织化学检测图谱 |
| 致谢 |
| 发表论文及作者简介 |
四、肉鸡IFN-alpha基因的克隆、序列分析以及在大肠杆菌中的表达（论文参考文献）
- [1]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定[D]. 宋世斌. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [2]Thermomyces dupontii脂肪酶高效制备及应用研究[D]. 王建荣. 华南理工大学, 2019(06)
- [3]动物源肠杆菌中碳青霉烯耐药基因blaNDM的流行分布及分子传播机制研究[D]. 杨润时. 华南农业大学, 2019
- [4]四个乳酸菌素的原核表达及plnK对黄羽肉鸡肠道菌群的影响[D]. 樊倩. 福建农林大学, 2017(01)
- [5]枯草芽孢杆菌黄曲霉毒素降解酶的分离纯化、基因克隆及表达[D]. 贾如. 中国农业大学, 2016(04)
- [6]黄羽肉鸡胰蛋白酶原的原核表达及体内分布研究[D]. 詹湉湉. 福建农林大学, 2016(04)
- [7]禽白血病病毒抗原/抗体ELISA检测方法的建立及准种分析[D]. 毛娅卿. 中国农业大学, 2014(08)
- [8]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [9]天府肉鸭α干扰素的原核表达及抗病毒活性研究[D]. 韩清林. 四川农业大学, 2010(04)
- [10]鸭α干扰素原（真）核表达及其生物学活性研究[D]. 陈斌. 四川农业大学, 2008(01)