一、氟对体外培养的小鼠成骨细胞增殖活力的影响（论文文献综述）
贾凌璐[1]（2021）在《PSAT1对牙周膜干细胞成骨分化的促进作用及机制研究》文中研究表明背景与目的先天畸形、外伤、肿瘤、牙周病等都可能造成口腔骨组织缺损,给患者带来极大的痛苦。近年来,口腔骨组织工程技术飞速发展,它将种子细胞、支架材料、生长因子三大要素有机结合,尽量避免了传统治疗方法的痛苦大、疗程长、治疗效果有限等弊端,促使已丧失的口腔骨组织进行修复与再生,是极具潜力的骨组织再生新方法。具有自我更新与多向分化能力的干细胞是口腔骨组织工程种子细胞的主要候选细胞。近年来,口腔组织来源的间充质干细胞如牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）、牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）、牙龈间充质干细胞（gingivalmesenchymal stemcells,GMSCs）等,因可以在医疗废物中获取、具有较强的成骨分化能力而备受关注。特别是PDLSCs,被证实具有优良的增殖、成骨分化、抗凋亡、免疫调控等能力,且在组织来源上与牙槽骨、颌骨联系更加紧密,因而在口腔骨组织工程中更具有应用优势。目前,基于PDLSCs开展的骨再生研究已经在犬、猪、鼠等动物的口腔骨缺损模型及人牙槽骨缺损病例中取得了一定的新骨形成效果,但不可否认的是其距临床期望仍有一定差距。因此,进一步增强PDLSCs的成骨分化能力、提高PDLSCs介导的骨组织再生效果,是口腔骨组织工程研究的关键问题。阐明PDLSCs成骨分化的内在分子调控机制,可以为深入理解干细胞的生命活动特征、靶向增强PDLSCs的成骨分化能力提供理论基础。除了经典的成骨分化调控因子外,越来越多的新蛋白、长链非编码RNA、microRNA等被证实参与了成骨分化调控网络;还有学者指出口腔组织来源的干细胞由于其发育的特殊性,可能存在与其他部位来源的干细胞不同的成骨分化调控机制。总之,目前人们对干细胞成骨分化调控网络的了解依然有限,有必要进一步深入探究PDLSCs成骨分化的分子调控机制,从而为靶向增强PDLSCs介导的骨组织再生效果提供新思路。为此,本研究前期利用基因芯片技术和生物信息学分析手段,对PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化前后差异表达的基因进行了综合分析及比较,再经过初步的功能验证后,筛选出可能在PDLSCs的成骨分化过程中发挥调控作用的基因 PSAT1。基因PSAT1编码的蛋白为磷酸丝氨酸转氨酶1（phosphoserinetransaminase 1,PSAT1）,是一种具有酶活性的蛋白质,催化丝氨酸的生物合成反应。近年来的研究发现,除了影响丝氨酸合成外,PSAT1还参与了机体多项生命活动的调控,如影响小鼠体细胞胰岛素敏感性、影响肺细胞的胶原合成、调控肿瘤细胞的增殖与侵袭等。近期的几项研究证实了 PSAT1与小鼠胚胎干细胞的分化时机调控和小鼠成骨细胞的生物矿化有关,这提示PSAT1可能对干细胞这一特殊细胞类群有调控作用。然而,目前关于PSAT1对干细胞成骨分化调控作用及机制的报道寥寥无几。基于以上事实及前期基因芯片的结果,本研究推测PSAT1可能对PDLSCs的成骨分化有调节作用,拟对该问题进行深入的探究及验证。综上所述,本研究前期利用基因芯片技术及生物信息学手段,分析、筛选可能参与口腔来源的PDLSCs、DPSCs、GMSCs的成骨分化调控的基因;在此基础之上,深入探究PSAT1对PDLSCs的增殖、迁移、成骨分化等与骨组织工程密切相关的生物学行为的影响,重点阐释PSAT1对PDLSCs成骨分化的调控作用及调控机制,以期为阐明间充质干细胞成骨分化的分子生物学调控机制提供理论基础,也为靶向提升PDLSCs成骨分化能力、增强PDLSCs介导的骨组织再生效果提供新思路。研究方法1、PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化调控基因的生物信息学分析分离、培养、鉴定PDLSCs、DPSCs及GMSCs;收集经普通培养基培养7 d及成骨诱导液培养7d的PDLSCs、DPSCs及GMSCs（每种细胞三个样本重复）用于基因芯片检测;利用qRT-PCR技术验证基因芯片结果;使用GO分析、KEGG分析等生物信息学手段预测差异表达基因的潜在功能及相互关系;基于所有基因芯片及生物信息学分析结果,筛选出多个可能调控成骨分化的候选基因;使用siRNA在PDLSCs中沉默候选基因的表达,而后检测成骨诱导后PDLSCs碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）活性的变化,以初步选择最有可能调控成骨分化的基因用于后续研究。2、探究PSAT1对PDLSCs在体外培养环境中增殖、迁移、分化能力的调控通过慢病毒感染技术在PDLSCs中稳定过表达及敲减PSAT1,并检测过表达及敲减效率;通过CCK-8实验、EdU实验、细胞周期检测等分析过表达及敲减PSAT1后PDLSCs增殖能力的变化;通过划痕实验分析PDLSCs的迁移能力;通过ALP活性分析、ALP染色、茜素红染色、矿化结节定量分析、成骨相关因子COL1、ALP、RUNX2的蛋白及mRNA表达检测等分析PDLSCs的成骨分化能力;通过油红O染色及成脂相关因子表达检测分析PDLSCs的成脂分化能力。3、探究PSAT1对PDLSCs介导的体内骨组织再生的调控构建大鼠下颌骨骨缺损模型,将过表达及敲减PSAT1的PDLSCs与Bio-Oss骨粉混合后移植于骨缺损处,覆盖屏障膜;8w后,通过micro-CT分析骨缺损处新骨生成情况,通过石蜡切片苏木素-伊红染色及Masson染色分析新生骨组织形态学特征,通过免疫组化染色分析新生骨的成骨相关因子ALP、RUNX2的表达情况。构建裸鼠皮下移植模型,将过表达及敲减PSAT1的PDLSCs与骨粉混合后移植于裸鼠皮下;6 w后,通过石蜡切片苏木素-伊红染色及Masson染色分析移植组织的形态学特征。4、探究PSAT1促进PDLSCs成骨分化的分子机制从两个角度探究PSAT1调控PDLSCs成骨分化的分子机制:（1）探究PSAT1是否通过影响Akt-GSK3β-β-catenin信号通路调控成骨分化:通过Western Blot检测过表达及敲减PSAT1后Akt-GSK3β-β-catenin信号通路中关键因子的磷酸化水平及蛋白量变化;使用抑制剂LY294002处理过表达PSAT1的细胞,或用激活剂SC79处理敲减PSAT1的细胞,而后通过Western Blot检测Akt-GSK-3β-β-catenin信号通路中关键因子的磷酸化水平及蛋白量变化,通过ALP活性分析、ALP染色、茜素红染色、矿化结节定量分析、成骨相关因子的蛋白及mRNA表达检测等方法检测细胞成骨分化能力的变化。（2）探究PSAT1是否通过影响其催化的代谢反应的下游产物丝氨酸或α酮戊二酸调控成骨分化:使用siRNA分别沉默丝氨酸生物合成反应中的上游酶PHGDH和下游酶PSPH,或用丝氨酸处理敲减PSAT1的细胞,而后检测成骨诱导后PDLSCs的ALP活性;检测过表达及敲减PSAT1后细胞内α酮戊二酸的含量;通过CCK-8实验分析一定浓度梯度的外源性α酮戊二酸二甲酯（dm-αKG）处理对PDLSCs增殖活性的影响;通过ALP活性分析、ALP染色、茜素红染色、矿化结节定量分析、成骨相关因子的蛋白及mRNA表达检测等方法分析一定浓度梯度的dm-αKG对PDLSCs成骨分化的影响;使用dm-αKG处理敲减PSAT1的PDLSCs,而后检测成骨诱导后PDLSCs成骨分化能力的变化;通过Western Blot检测dm-αKG对PDLSCs中Akt-GSK3β-β-catenin信号通路关键因子的磷酸化水平及蛋白量的影响。5、探究PDLSCs成骨分化过程中转录因子ATF4对PSAT1的调控通过qRT-PCR及Western Blot检测ATF4及PSAT1在PDLSCs成骨分化后的mRNA及蛋白表达水平变化;构建过表达质粒及siRNA,对PDLSCs中的ATF4进行过表达及沉默,而后检测PSAT1的表达变化;使用JASPAR数据库、GTRD数据库分析ATF4与基因PSAT1启动子区域的潜在结合位点;使用Ch1P-PCR实验,验证ATF4与基因PSAT1启动子预测位点的结合。结果1、PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化调控基因的生物信息学分析成功分离、培养及鉴定PDLSCs、DPSCs及GMSCs;基因芯片分析获得了成骨诱导后113个在PDLSCs、DPSCs及GMSCs三种细胞中均差异表达的基因,及188、94、144个分别仅在PDLSCs、DPSCs、GMSCs中差异表达的基因;qRT-PCR实验证实基因芯片结果可信;通过GO分析及KEGG分析对差异基因进行了功能分析;使用siRNA沉默初步选出的8个候选基因,证实沉默基因PSAT1导致成骨诱导后PDLSCs的ALP活性下降最显着,因而确定PSAT1为后续实验的研究对象。2、PSAT1对体外培养环境中PDLSCs在增殖、迁移、分化能力的调控使用慢病毒成功在PDLSCs中稳定过表达及敲减PSAT1;CCK-8实验、EdU实验、细胞周期分析实验的结果表明过表达PSAT1促进PDLSCs的增殖,而敲减PSAT1抑制PDLSCs的增殖;划痕实验结果显示过表达及敲减PSAT1对PDLSCs的迁移能力没有显着影响;成骨分化检测结果显示,过表达PSAT1促进了 PDLSCs的成骨分化,而敲减PSAT1抑制了 PDLSCs的成骨分化;成脂分化检测结果表明,过表达PSAT1促进了 PDLSCs的成脂分化,而敲减PSAT1抑制了 PDLSCs的成脂分化。3、PSAT1对PDLSCs介导的体内骨组织再生的调控构建大鼠下颌骨骨缺损模型后,micro-CT结果显示过表达PSAT1组与对照组相比形成的新骨的骨量更多,而敲减PSAT1组的新骨骨量减少、骨小梁相对稀疏;石蜡切片苏木素-伊红染色及Masson染色显示,过表达PSAT1组形成的新骨比对照组骨量多、矿化程度高,敲减PSAT1组的新骨骨量少、矿化程度低;免疫组化染色结果表明,过表达PSAT1组的成骨相关因子ALP、RUNX2的表达量更高,而敲减PSAT1组的表达量降低。构建裸鼠皮下移植模型后,石蜡切片苏木素-伊红染色及Masson染色结果显示,PDLSCs在裸鼠皮下形成了类牙周膜/骨样组织,过表达PSAT1组与对照组相比形成的胶原更致密、局部骨基质沉积增加,而敲减PSAT1组形成的胶原变得稀疏、局部骨基质沉积减少。4、PSAT1促进PDLSCs成骨分化的分子机制研究实验结果显示PSAT1通过两条途径调控PDLSCs的成骨分化:第一,过表达及敲减PSAT1后PDLSCs中Akt-GSK3 β-β-catenin信号通路关键因子的激活水平相应升高及降低;LY294002抑制了 Akt的磷酸化激活,并逆转了过表达PSAT1对Akt-GSK3β-β-catenin信号通路的活化作用,且逆转了过表达PSAT1对PDLSCs成骨分化的促进作用;激活剂SC79促进了 Akt的磷酸化激活,逆转了敲减PSAT1对Akt-GSK3β-β-catenin信号通路的抑制作用,挽救了敲减PSAT1造成的PDLSCs成骨分化水平降低。上述结果表明,PSAT1可以通过Akt-GSK3β-β-catenin信号通路调控PDLSCs的成骨分化。第二,siRNA沉默PHGDH后PDLSCs的ALP活性下降,而沉默PSPH后PDLSCs的ALP活性不变;向培养基中添加丝氨酸没有逆转敲减PSAT1造成的PDLSCs的ALP活性下降,如此初步排除了丝氨酸的调控作用;过表达及敲减PSAT1后细胞内α酮戊二酸的水平相应升高及降低;浓度小于等于3mM的dm-αKG对PDLSCs的增殖能力没有显着影响,对PDLSCs的成骨分化有显着促进作用;3 mM dm-αKG处理挽救了敲减PSAT1后PDLSCs成骨分化能力的降低;3 mM dm-αKG对PDLSCs中Akt-GSK3β-β-catenin信号通路关键因子的磷酸化水平没有显着影响。上述结果表明,PSAT1可以通过影响其催化的代谢反应的下游产物α酮戊二酸调控PDLSCs的成骨分化。5、PDLSCs成骨分化过程中PSAT1的表达受转录因子ATF4调控qRT-PCR及Western Blot结果显示,PDLSCs成骨分化后ATF4和PSAT1的mRNA及蛋白表达水平皆下降;在PDLSCs中过表达及沉默ATF4后,PSAT1的mRNA及蛋白表达水平相应升高及降低;过表达ATF4后,成骨诱导后原本降低的PSAT1表达水平被提升;JASPAR数据库预测了 ATF4与基因PSAT1启动子区域的潜在结合位点为Ch9:78296092-78296101;ChIP-PCR实验表明ATF4可以与预测位点结合;GTRD数据库分析验证了 ATF4与基因PSAT1启动子区域存在结合峰。结论1、PSAT1可以正向调控PDLSCs在体外培养环境中的增殖和成骨分化能力,并促进PDLSCs在体内环境中介导的骨组织再生。2、PSAT1可能通过两条途径调控PDLSCs的成骨分化:一是PSAT1可以影响成骨相关信号通路Akt-GSK3β-β-catenin活性,二是PSAT1通过影响细胞中重要化合物α酮戊二酸的水平来调控成骨分化。3、PDLSCs成骨分化过程中PSAT1的表达受转录因子ATF4调控。
俞超楠[2]（2021）在《原花青素减轻NaF所致小鼠MLO-Y4骨细胞损伤研究》文中研究指明目的 氟是人体必需的微量元素之一,适量的氟对人体骨骼、牙齿的生长和形成具有促进作用。然而当氟摄入平衡失调时,机体代谢和生理功能都会受到影响,尤其是高剂量氟会引发氟中毒,并导致氟斑牙和氟骨症。骨细胞是成熟骨组织中的主要细胞,由骨母细胞转化而来。研究表明,骨细胞通过影响破骨细胞和成骨细胞的分化和成熟来完成骨重塑的过程,是骨重构的核心调控者。目前与氟中毒有关的基础研究主要集中在成骨和破骨细胞,而关于氟化物对骨细胞功能影响的研究相对较少。与此同时,研究表明抗氧化剂可显着促进骨形成并抑制骨吸收过程,具有修复因过量氟化物所致骨组织细胞损伤的潜力。原花青素具有很强的抗氧化活性,且对许多急性和慢性疾病具有预防和控制作用。本论文以氟化钠（NaF）诱导损伤MLO-Y4骨细胞,模拟高剂量氟导致的氟中毒,建立氟中毒症体外细胞模型,并利用该模型探究原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞损伤的保护机制。方法 1.将不同浓度NaF（0.2、0.5、1.0、2.5和5 mM）作用于MLO-Y4骨细胞48 h后,利用相差显微镜观察NaF对骨细胞形态的影响;钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein-AM）染色和细胞计数试剂（CCK-8）法检测NaF对MLO-Y4骨细胞活性的影响;经自噬检测试剂（CYTO-ID）和吖啶橙（AO）染色并采用流式细胞术检测骨细胞自噬和酸性自噬泡水平;采用碘化丙啶（PI）染色并经流式细胞术检测NaF对骨细胞的细胞周期和细胞增殖的影响;采用蛋白质印迹法（Western Blot）测定NaF对MLO-Y4骨细胞自噬相关Beclin-1,轻链3（LC3）,核孔糖蛋白（P62）,磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）蛋白信号通路和细胞增殖相关的增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白信号表达的影响。2.MLO-Y4骨细胞采用原花青素（1、3、10、30、100μM）预保护2h后,再与2.5 mM NaF共孵育48 h,随后采用如前所述方法检测原花青素对NaF所致骨细胞细胞活性、自噬和细胞增殖改变的影响。结果 1.形态学观测结果显示:1 mM以上的NaF能显着改变MLO-Y4骨细胞形态。CCK-8实验结果表明,1 mM以上的NaF呈剂量依赖性显着抑制MLO-Y4骨细胞的活性。流式细胞术结果表明NaF显着诱导MLO-Y4骨细胞自噬水平上调和细胞内酸性自噬泡数量增加,并显着抑制骨细胞增殖。Western Blot实验结果显示,与对照组相比,2.5 mM NaF诱导Beclin-1,LC3,p62,p-mTOR蛋白表达上调,mTOR蛋白表达下调;此外,2.5 mM NaF还导致PCNA蛋白表达下调。进一步提示NaF染毒可导致骨细胞自噬流受损和增殖抑制。2.给予不同浓度原花青素（1、3、10、30、100μM）干预后,形态学观测结果显示:与2.5 mM NaF模型组相比,3 μM、10 μM和30μM原花青素对MLO-Y4骨细胞的保护有一定效果,活细胞数有上升趋势;CCK-8实验结果表明,3 μM、10μM和30μM原花青素能显着提升NaF所致的MLO-Y4骨细胞细胞活性,其中10 μM原花青素的保护作用最为显着;流式细胞术结果表明原花青素能显着抑制NaF诱导的MLO-Y4骨细胞自噬流受阻,且对NaF所致的细胞增殖抑制有显着促进作用。Western Blot实验结果表明,与2.5mMNaF模型组相比,原花青素使Beclin-1,LC3,p62,p-mTOR蛋白表达下调,mTOR蛋白表达上升;此外,原花青素使PCNA蛋白表达上升。提示原花青素对NaF诱导的骨细胞自噬流受阻和增殖抑制有修复作用。结论 NaF可以诱导MLO-Y4骨细胞数量和细胞活性下降,造成细胞自噬流阻滞并抑制细胞增殖,对MLO-Y4骨细胞造成损伤。原花青素可减轻NaF所致的MLO-Y4骨细胞损伤,其机制可能与其减轻自噬流受损和缓解细胞增殖抑制相关。
乔婷婷[3]（2021）在《氟对胚胎大鼠胫骨生长、矿化及骺软骨糖原水平影响的研究》文中研究说明目的:氟作为人体必需微量元素之一,以化合物形式广泛分布于自然界。机体摄入适量氟可降低龋齿发生率,有利于钙、磷吸收,增加骨骼硬度。但摄入过量可引起以氟骨症和氟斑牙为主要特征的慢性全身性疾病,即地氟病。地氟病作为我国重要的公共卫生问题,严重影响人群健康。为了更好地防治地氟病,需对其发病机制进行深入研究。研究发现,氟抑制长骨的生长发育。本研究通过建立体外胫骨器官培养模型,观察染氟对胫骨纵向生长及矿化的影响,测量骨形态计量学指标,检测软骨细胞糖原储存情况以及成骨标志物的变化,探讨氟对大鼠长骨生长发育的影响。实验方法:分离胚胎第20天SD大鼠后肢胫骨,以左侧胫骨为对照组,右侧胫骨为10-4MF-组。常规培养于ɑMEM培养基（含0.2%牛血清白蛋白、0.05mg/ml抗坏血酸、1mmol/Lβ甘油磷酸钠,1×105U/L青、链霉素）,5%CO2、37℃培养7天,隔天换液。体式显微镜采集图像并测量胫骨全长及矿化区长度,计算相对纵向生长率。胫骨固定、脱钙及石蜡包埋,制作5μm切片,进行H&E、甲苯胺蓝、番红固绿和PAS染色,分析骺软骨各区形态计量学指标,采用Osteo Measure骨测量软件测量骨小梁形态学指标。采用免疫组织化学染色法检测:Ⅰ型胶原（TypeⅠcollagen,Col1a1）、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）、糖原合成酶（Glycogen Synthase,GYS1）、糖原磷酸化酶（Glycogen Phosphorylase,PYGL）、糖原合成酶激酶-3β（Glycogen Synthase Kinase-3β,GSK-3β）的蛋白表达情况。SPSS 17.0统计软件进行统计分析,组间差异采用两组独立样本t-test进行分析。结果:染氟组胫骨纵向生长率低于对照,染氟第7天纵向生长率显着低于对照组（P<0.01）。染氟组胫骨矿化区纵向生长率在第3天（P<0.05）、第5天和第7天均显着低于对照组（P<0.01）。骺软骨形态计量学显示,与对照组相比,染氟组胫骨骺软骨总长度（P<0.05）、静息区（P<0.05）和增殖区厚度（P<0.01）均显着降低,肥大区厚度显着增加（P<0.05）。PAS染色发现,染氟组胫骨软骨增殖区（P<0.05）和肥大区（P<0.01）糖原储存较对照均显着增加。免疫组织化学染色结果显示染氟组软骨细胞GYS1表达显着高于对照（P<0.01）,GSK-3β和PYGL表达显着降低（P<0.01）。与对照组相比,染氟组胫骨骨小梁减少且稀疏、变细,定量结果显示,染氟组组骨小梁参数:骨体积分数（P<0.01）、骨小梁数量（P<0.05）和骨小梁厚度（P<0.01）均显着低于对照组,骨小梁间隙与对照组相比显着升高（P<0.05）。免疫组织化学染色结果显示:成骨标志物Col1a1（P<0.05）和OPN（P<0.01）表达均降低。结论:1、氟抑制大鼠体外胫骨纵向生长,抑制成骨标志物表达;2、染氟后骺软骨总长度变短,增殖区厚度变薄,肥大区厚度增加,软骨细胞各区比例失衡;3、氟通过抑制软骨细胞糖原合成酶激酶的表达,从而减弱其对糖原合成酶的抑制作用,糖原合成酶表达增加促进糖原合成;另一方面,氟通过抑制软骨细胞糖原磷酸化酶的表达,抑制糖原分解,使软骨细胞糖原蓄积。
马瑞[4]（2021）在《氟通过PHD2/HIF1α信号通路抑制SW1353软骨细胞糖酵解》文中进行了进一步梳理目的:氟是一种人体生长发育所必需的微量元素。氟对机体具有双重影响,适量摄入氟能增强牙齿抗龋能力,促进骨骼钙磷吸收,而长期过量摄入氟则会导致氟中毒。氟对骨骼有极强的亲和力,因而氟中毒最具代表性的症状是氟骨症和氟斑牙,软骨损伤是氟骨症的基本表现之一。软骨细胞是生长板软骨的重要构成细胞,维持软骨细胞合成与分解代谢平衡是软骨生长发育的基础条件。葡萄糖是所有活细胞重要的代谢原料,在软骨细胞中,葡萄糖不仅能为软骨细胞提供能量来源,还是软骨细胞合成蛋白多糖的结构前体,对细胞外基质的合成十分重要。由于生长板软骨是一种无血管的结缔组织,其含氧量极低,软骨细胞主要以糖酵解方式供能。缺氧诱导因子HIF1α能感知和适应低氧环境,是调控糖酵解的关键因子。然而,氟是否通过PHD2/HIF1α信号通路调控软骨细胞糖酵解,进而改变其合成、分解代谢的稳态尚未见报道。为此,我们通过体外胫骨培养检测氟对HIF1α表达的影响,并以SW1353细胞为研究对象,探讨氟是否通过调控PHD2/HIF1α信号通路改变SW1353细胞糖酵解,进而影响合成代谢和分解代谢间的平衡。方法:本研究选取胚胎第20天的大鼠胫骨,采取左右配对方式,分为对照组和10-4M Na F组,培养于含0.2%牛血清蛋白、0.05 mg/ml Vc、1m Mβ-甘油磷酸钠的α-MEM培养基中。7天后,胫骨经固定、脱钙、石蜡包埋并切片,免疫组织化学方法检测胫骨HIF1α蛋白的表达。SW1353细胞培养于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的L-15培养基中。采用CCK8法检测SW1353细胞活性,以确定染氟剂量和时间;阿利新蓝染色检测蛋白多糖合成情况;用ATP、乳酸检测试剂盒测定ATP、乳酸产量;GOD-POD法检测葡萄糖消耗;细胞免疫荧光染色法检测HIF1α的细胞定位和表达强度;实时荧光定量PCR和Western blot检测软骨细胞合成与分解代谢标志因子（Aggrecan、Col2a1、Col10a1、MMP13）、HIF1α信号通路（PHD2、HIF1α）和糖酵解相关因子（Glut1、HK2、PKM、ENO1、LDHA、MCT4）的m RNA和蛋白表达情况;并用Co Cl2上调HIF1α的表达,检测上述相关因子的表达变化。结果:1、氟能降低体外胫骨肥大软骨细胞HIF1α的表达:染氟组胫骨HIF1α表达显着低于对照组（P<0.05）。2、氟对SW1353细胞活性的影响:5×10-4M Na F处理SW1353细胞时,细胞活力显着下降,且72小时下降最明显（P<0.001）。3、氟对SW1353细胞合成代谢的影响:阿利新蓝染色检测氟对SW1353细胞蛋白多糖合成的影响,结果发现染氟组阿利新蓝染色强度较对照组弱,用盐酸胍溶解阿利新蓝进行定量分析,染氟组蛋白多糖生成显着低于对照组（P<0.05）;氟处理显着抑制Aggrecan、Col2a1和Col10a1等软骨细胞合成代谢标志因子的表达（P<0.05）。4、氟对SW1353细胞分解代谢的影响:较对照组而言,氟促进MMP13的表达,差异有统计学意义（P<0.05）。5、氟对糖酵解的影响:染氟组中ATP、乳酸产量和葡萄糖消耗均显着低于对照组（P<0.05）。6、氟对PHD2/HIF1α信号通路及糖酵解相关因子的影响:与对照组相比,染氟组HIF1α免疫荧光染色信号变弱;氟在m RNA和蛋白水平均上调PHD2的表达,下调HIF1α的表达（P<0.05）;在染氟组中,糖酵解相关因子Glut1、HK2、PKM、ENO1、LDHA和MCT4的表达均降低（P<0.05）。7、Co Cl2通过抑制PHD2的表达来上调HIF1α及其下游因子表达:染氟组中PHD2表达显着高于对照组,HIF1α表达低于对照组;与对照组相比,Co Cl2组PHD2的表达受到抑制,HIF1α表达显着增加;在Na F+Co Cl2组中,较染氟组而言,PHD2表达显着降低,HIF1α显着增加（P<0.05）。8、氟通过抑制HIF1α降低SW1353细胞糖酵解:染氟组中,细胞ATP、乳酸的产量和葡萄糖消耗均低于对照组,糖酵解相关因子的表达均降低;与对照组相比,Co Cl2组ATP、乳酸产量和葡萄糖消耗增加,糖酵解相关因子的表达上调;在Na F+Co Cl2组中,与染氟组相比,细胞ATP生成、乳酸产量、葡萄糖消耗和糖酵解相关因子的表达均显着增加。9、氟通过抑制HIF1α降低SW1353细胞合成代谢,加速其分解代谢:与对照组相比,染氟组Col2a1和Col10a1表达降低,MMP13的表达升高;较对照组而言,Co Cl2组上调Col2a1和Col10a1的表达,下调MMP13的表达;在Na F+Co Cl2组中,与染氟组相比,Col2a1和Col10a1表达增加,MMP13的表达下降（P<0.05）。结论:1、氟抑制SW1353细胞合成代谢,加速其分解代谢,破坏细胞合成与分解代谢的平衡。2、氟通过增加PHD2的表达下调HIF1α,进而抑制其下游靶基因表达。3、氟通过PHD2/HIF1α信号通路降低SW1353细胞糖酵解,从而影响其合成分解代谢。
蒋宁宁[5]（2020）在《氟对骨细胞调控成骨作用的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:氟元素对人体健康不可或缺,但摄入过量的氟可引起人体生理及病理的变化,从而对身体造成损害。地方性氟中毒是我国流行最为广泛、病情最为严重的地方病之一。氟主要侵犯骨组织,氟斑牙和氟骨症是地方性氟中毒的特征性损害。成年人体内99%的氟化物都存在于钙化组织（主要是骨骼）中,过量氟暴露引起的氟骨症与代谢性骨转换密切相关。研究者已经证明了氟骨症病变在不同条件下也会有活跃进展时期或相对静止时期;就其进展时期而言,无疑是处于高骨转换状态骨代谢的主要形式或骨重建循环,即破骨细胞通过分泌酸性物质溶解旧骨,从而发挥骨吸收功能;成骨细胞通过分泌、合成以及矿化骨基质来形成新骨,从而发挥骨形成功能。大量研究表明骨细胞直接参与骨形成和骨重建过程,其通过影响破骨细胞和成骨细胞的分化成熟来影响骨重建过程。近年来,有关氟骨症的基础研究热点多在于氟化物对成骨、破骨的调控机制上,对骨细胞的研究相对较少,而氟化物对骨细胞如何调控成骨作用的研究更是少见。甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）是由甲状旁腺细胞所分泌的能够调控机体内钙稳态的一种活性多肽类激素。大量研究证实,PTH能够通过影响成骨细胞和骨细胞来参与骨转换过程。因此本实验利用骨组织的三种主要类型细胞进行染氟实验研究,旨在探究氟化物在骨细胞调控成骨机制中的作用,并进一步分析PTH在其中的地位,从而为进一步深入研究氟骨症的发病机制提供理论基础。实验方法:1.单独培养的骨组织细胞染氟实验研究:我们选取骨组织的三种类型细胞,即成骨细胞选择其祖细胞（BMSCs）和前体细胞系（MC3T3-E1）、破骨细胞前体（RAW264.7）和骨细胞（IDG-SW3）作为实验对象,进行以下实验:（1）利用小鼠的股骨来分离成骨细胞祖细胞,经流式细胞仪鉴定其表面受体,得到确认其为BMSCs细胞;利用核因子κB受体活化因子配体（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）诱导破骨细胞前体7天后,进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）染色,确认其分化为TRACP阳性、多核的破骨细胞样细胞;利用矿化诱导液培养IDG-SW3细胞1442天后,采用Western Blot法检测到SOST蛋白表达阳性,确认其骨细胞特征;利用矿化诱导液培养成骨前体细胞728天,使其分化为成熟的成骨细胞;（2）利用浓度为0.00132 mg/L的氟离子处理成骨细胞、破骨细胞前体和骨细胞7天后,采用噻唑蓝（MTT）法检测骨组织中三种类型细胞的增殖活性。（3）利用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子联合其他条件处理三种细胞7天后,进行细胞的凋亡率分析。用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH（1-34）处理骨细胞7天;用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 ng/mL转化生长因子β1（TGF-β1）处理破骨细胞前体7天;用浓度为0.5、4、16 mg/L氟离子或相同氟浓度联合10 nmol/L PTH或相同氟浓度联合10 ng/mL TGF-β1处理成骨细胞祖细胞7天。各个实验结束后,采用美国BD公司的Annexin V-FITC凋亡试剂盒进行检测,观察骨组织三种细胞的凋亡情况。（4）利用明显影响细胞活性的,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理成骨细胞7天后,采用Western Blot法检测不同处理条件下,成骨细胞中Wnt10b、β连环蛋白（β-catenin）、Smad3、磷酸化Smad3、甲状旁腺素1受体（PTH1R）、核心结合因子2（Runx2）蛋白的表达变化;（5）利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10nmol/L的PTH处理骨细胞12天后,采用Western Blot法检测不同处理条件下,骨细胞中Smad3、磷酸化Smad3、硬化蛋白（SOST）、Dickkopf相关蛋白1（DKK1）、Wnt10b、β-catenin蛋白的表达变化。2.利用Transwell共培养骨组织细胞的染氟实验研究:利用孔径为3.0μm Polyester Membrance Transwell小室组成共培养系统,进行以下共培养实验:（1）将成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,利用明显影响破骨细胞活性,浓度为4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞7天。采用实时定量PCR法,检测两种共培养系统中骨细胞所分泌的SOST、DKK1、RANKL、骨保护素（OPG）基因的表达变化。（2）将成骨细胞祖细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体（比例为2:1）混合培养在下层。利用明显影响成骨细胞活性,浓度为0.5 mg/L的氟离子处理下层骨细胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation转染质粒激活骨细胞中SOST蛋白表达48 h后。采用Diff-Quick Stain试剂盒进行染色,观察上层成骨细胞祖细胞增殖数量的变化。（3）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体（比例为2:1）混合培养在下层。利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞7天。上层成骨细胞通过碱性磷酸酶（ALP）染色检测其分化情况;下层骨细胞采用Western Blot法检测不同条件处理7天后,骨细胞内调控成骨相关信号通路蛋白的表达变化。（4）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞28天。上层成骨细胞通过茜素红染色检测其矿化结节形成情况;下层骨细胞采用Western Blot法检测不同条件处理28天,骨细胞内调控成骨相关信号通路蛋白的表达变化。（5）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层。利用明显影响细胞活性,浓度为0.5、4 mg/L的氟离子,以及相同氟浓度联合10 nmol/L的PTH处理下层骨细胞,并用50 nM SOST siRNA降低骨细胞中SOST蛋白表达48 h。采用实时定量PCR法,检测上层成骨细胞和下层骨细胞内相关基因的表达变化。实验结果:1.单独培养的骨组织细胞染氟实验结果:（1）流式细胞仪鉴定成骨细胞祖细胞（BMSCs）表现为CD34/CD44双阳性信号,证明成骨细胞祖细胞具有成骨分化的潜能;破骨细胞前体（RAW264.7）经RANKL诱导7天后进行TRACP染色,破骨细胞前体表现为三核或多核的TRACP阳性细胞,表明其已诱导成为破骨细胞样细胞;IDG-SW3细胞经矿化培养液诱导1442天,采用Western Blot法检测骨细胞标志物SOST蛋白的表达情况。实验结果表明,IDG-SW3细胞从21天开始表达骨细胞标志物硬化蛋白,直至42天仍表达硬化蛋白,证明其分化成为骨细胞。后续均选取矿化28天的IDG-SW3细胞进行实验研究。（2）细胞活性实验表明:氟对成骨细胞祖细胞作用范围窄,抑制作用较显着;破骨细胞前体对氟化物的作用比较敏感;成骨细胞活性整体呈现“倒U型”趋势,即随着氟浓度增加,成骨细胞活性逐渐增加,达到峰值后又逐渐下降;与其他骨组织细胞类型比较,骨细胞对氟离子的耐受性较强。（3）细胞凋亡实验表明:高剂量的氟显着促进骨组织中三种主要类型细胞的凋亡,氟联合PTH显着促进骨细胞的凋亡,TGF-β1轻度提高了破骨细胞前体的凋亡率,但PTH和TGF-β1对成骨细胞祖细胞的促凋亡作用不明显。（4）染氟或染氟联合PTH处理成骨细胞7天,蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟、染氟联合PTH不同程度的抑制了Wnt10b、β-catenin以及Runx2蛋白的表达,氟联合PTH处理与单独氟处理相比较,上面各因子的变化相类似。另外,染氟能够促进成骨细胞的Smad3蛋白的磷酸化。（5）染氟或染氟联合PTH处理骨细胞12天,蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟、染氟联合PTH处理,不同程度的下调SOST蛋白的表达,而上调DKK1蛋白表达。低剂量氟可以不同程度的促进Wnt10b、β-catenin、Smad3和P-Smad3蛋白的表达。氟联合PTH作用与单独氟处理相比较,Wnt10b和β-catenin蛋白的变化相类似。2.利用Transwell共培养骨组织细胞的染氟实验结果:（1）成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别与骨细胞进行共培养,染氟或染氟联合PTH处理下层成骨细胞7天,基因表达水平分析的结果显示:成骨细胞祖细胞与骨细胞共培养组中,骨细胞表达的SOST基因由染氟组轻度下降,到染氟联合PTH组显着下降,而DKK1基因的表达量正好与之相反,由染氟组轻度上升,到染氟联合PTH组显着上升。破骨细胞前体与骨细胞共培养组中,骨细胞表达的SOST基因由染氟组轻度下降,到染氟联合PTH组显着上升。而DKK1基因显着下降。另一方面,成骨细胞祖细胞与骨细胞共培养组中,骨细胞中RANKL/OPG的比值在单独染氟或染氟联合PTH处理条件下均显着下降。破骨细胞前体与骨细胞共培养组中,骨细胞中RANKL/OPG的比值由染氟组轻度上升,到染氟联合PTH组显着上升。（2）利用氟处理下层骨细胞,并用Caspase-Cas9 Sclerostin Activation转染质粒激活骨细胞中SOST蛋白表达48 h,上层成骨细胞祖细胞的迪夫染色结果显示:Transwell小室上层的成骨细胞祖细胞的个数,在氟处理骨细胞与破骨细胞混合培养组最低。其余各阳性激活SOST组,包括染氟的骨细胞或骨细胞与破骨细胞前体混合培养组,成骨细胞祖细胞的细胞数量也呈下降趋势。（3）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞或骨细胞破骨细胞前体混合培养在下层,染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞7天或28天,上层成骨细胞的碱性磷酸酶、茜素红染色结果显示:单独氟化物处理,刺激骨细胞诱导成骨细胞分化和成熟;而氟联合PTH处理,显着降低了成骨细胞的ALP活性,但刺激骨细胞诱导成骨细胞成熟。骨细胞与破骨细胞前体混合培养,单独染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞,上层成骨细胞分化趋势不明显。（4）将成骨细胞种植在Transwell小室上层,骨细胞种植在下层,染氟或染氟联合PTH处理下层骨细胞7天和28天,下层骨细胞在蛋白表达水平分析的结果显示:单独染氟处理7天和28天,均显着促进骨细胞中β-catenin蛋白表达的以及Smad3蛋白的磷酸化,均抑制了骨细胞标志物SOST蛋白的表达。单独染氟或染氟联合PTH处理7天,不同程度促进骨细胞内Wnt10b和DKK1蛋白的表达。对比之下,单独染氟或染氟联合PTH处理28天,对骨细胞DKK1蛋白的表达影响不大。单独染氟28天,骨细胞中Wnt10b蛋白的表达量下降,而染氟联合PTH作用进一步抑制了Wnt10b蛋白的表达。（5）染氟和染氟联合PTH处理下层骨细胞,并用50 nM SOST siRNA技术降低骨细胞中SOST蛋白表达48 h,基因表达水平分析的结果显示:Transwell小室下层骨细胞SOST表达干扰成功,表现为各处理组骨细胞的SOST基因水平明显下降。单独氟化物处理,以及氟联合PTH处理骨细胞内DKK1基因的表达量上升,也不同程度促进RANKL和OPG基因的表达。与空白对照组比较,Tranwell上层成骨细胞在单独染氟处理组成骨细胞的标志物Runx2基因成轻度下降趋势,而成骨细胞中Smad3和Wnt10b基因的表达量上升,并且β-catenin基因的表达增加较为显着。低剂量氟联合PTH处理骨细胞,成骨细胞内成骨标志物ALP和Runx2基因的表达量显着增加,同时成骨细胞中的Smad3、wnt10b基因的表达量也是升高的。结论:本研究表明氟虽然不能直接刺激成骨细胞内Wnt10b/β-catenin以及Runx2的蛋白表达,但可以介导骨细胞内SOST和Wnt10b蛋白来发挥作用。SOST在氟化物影响骨细胞调控成骨细胞分化方面扮演着重要角色,其中Smad3蛋白磷酸化、Wnt10b/β-catenin等因子参与了氟对骨细胞调控成骨细胞分化的机制。PTH不仅影响SOST,而且可以调节骨细胞内其他因子来发挥刺激成骨的作用。
陈庆真[6]（2020）在《补肾中药调控ERα-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖、分化的研究》文中研究表明目的:1.亚硫酸氢盐处理后测序（BSP）技术检测绝经后骨质疏松患者血液中ER α甲基化情况,探索基因甲基化对成骨细胞增殖和分化影响及其分子机制;2.探索ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞增殖和分化影响;3.探索补肾中药有效成分牛膝甾酮对ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路影响及其对成骨细胞作用机制。方法:1.ER α基因甲基化对骨质疏松的影响收集2017年6月份～2018年12月份研究对象血液样本43例,包括14例女性健康人群血液样本,14例绝经后骨质疏松人群和15例绝经后非骨质疏松人群血液样本,BSP测序检测患者ESR1（雌激素受体alpha,ER alpha）甲基化频率,RT-qPCR技术验证ESR1 mRNA表达水平。ELISA检测患者血清中雌二醇和ESR1含量变化。2.体外验证ER α DNA甲基化对成骨分化影响体外培养小鼠成骨细胞MC3T3E1-colon24（MC3T3E1-24）,设计合成特异性DNMT1 siRNA干预成骨细胞DNMT1表达和DNA甲基化,RT-qPCR和Western blot技术检测目标基因ER α,p-ER α,成骨分化指标OPG和RANKL,验证ESR1基因甲基化对成骨细胞分化影响,茜素红染色和ALP活性检测进一步验证ESR1基因甲基化对成骨细胞成熟影响,MTT技术检测成骨细胞活性情况,验证ESR1基因甲基化对成骨细胞增殖影响。3.ER α调节AMPK α和Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞活性为验证ER α对AMPK α的调节作用,运用在线网站PROMO和GPMiner预测ER α作为转录因子在AMPK α基因的结合位点。进一步验证ER α对成骨细胞活性的调节作用和分子机制,构建合成ESR1 shRNA和过表达慢病毒载体,无处理的和阴性慢病毒载体干预的MC3T3E1-24细胞作为对照组,RT-qPCR 和 Western blot 技术检测ER α,AMPK α 1/2,p-AMPK α 1/2,检测Wnt/β-catenin 通路重要分子 frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin,phspho-β-catenin表达变化,检测成骨分化指标OPG,以及ALP表达变化,ALP活性检测进一步验证ESR1基因表达对成骨细胞成熟影响,MTT技术检测成骨细胞活性情况。4.AMPK α介导Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞活性上一步验证了 ER α调节AMPK α表达和活化影响成骨细胞活性,为进一步验证AMPK α对成骨细胞调节作用和机制,本研究用AMPK激动剂AICAR处理体外小鼠成骨细胞,无药物处理的MC3T3E1-24细胞作为对照组,RT-qPCR和Western blot技术检测 AMPK α,p-AMPK α,检测 Wnt/β-catenin 通路重要分子 frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin,phspho-β-catenin表达变化,检测成骨分化指标OPG以及ALP表达变化,茜素红染色和ALP活性检测进一步验证ESR1基因表达对成骨细胞成熟影响,MTT技术检测成骨细胞活性情况。5.牛膝甾酮介导ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞活性牛膝甾酮（10 ng/μL）干预 MC3T3E1-24 细胞 48h,RT-qPCR 技术检测 ER α、AMPKα,frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin转录水平变化,探索牛膝甾酮对ER-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路影响;RT-qPCR检测成骨分化指标OPG以及ALP表达变化,茜素红染色和ALP活性检测观察成骨细胞钙化情况,验证牛膝甾酮对成骨细胞分化的促进作用,MTT技术检测成骨细胞活性情况,流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况,验证牛膝甾酮对成骨细胞增殖影响。结果:1.ERα DNA甲基化诱导骨质疏松临床血液样本进行BSP测序,结果发现绝经后骨质疏松患者血液中ER α甲基化频率较健康人（P<0.01）和绝经后非骨质疏松人群（P<0.01）高,差异有统计学意义。另外,RT-qPCR检测发现与健康人（P<0.05）和绝经后非骨质疏松人群（P<0.01）相比较,绝经后骨质疏松患者血液样本中ERα转录水平显着增高,然而ELISA检测血清样本中雌二醇（E2）（P<0.01）和ER α（P<0.05）表达降低,差异有统计学意义。2.抑制体外成骨细胞DNA甲基化水平可促进成骨分化绝经后骨质疏松与ERα DNA高甲基化水平相关,其可能通过抑制ER α蛋白表达导致患者骨量减少。体外培养MC3T3E1-24细胞,并通过DNMT1 siRNA干预细胞DNA甲基化水平,结果发现抑制DNA甲基化水平,可促进OPG和ALP的mRNA和蛋白表达,抑制RANKL表达。茜素红染色结果表明,与对照组相比较,DNMT1 siRNA干预组细胞钙化水平显着较高（P<0.05）。MTT结果显示,与空白对照组和阴性siRNA干预组相比较,DNMT1 siRNA干预组细胞活性较强（P<0.05）。3.ER α磷酸化介导AMPK和Wnt/β-catenin信号通路的激活,促进成骨细胞分化和增殖1)ER α与AMPK转录结合位点预测ER α作为转录因子,可调控靶基因转录激活和转录表达水平。PROMO和GPMiner在线网站预测结果发现,ER α在编码AMPK α的基因PRKAA2的启动区域有结合位点。2)ER α磷酸化对AMPK和Wnt/β-catenin信号通路影响和成骨细胞影响。ERα shRNA慢病毒载体抑制MC3T3E1-24细胞中ER α转录水平和蛋白表达。另外,RT-qPCR和WB技术检测结果表明,与空白对照组和阴性慢病毒载体组比较,AMPK α和p-AMPK α水平降低,差异有统计学意义;Wnt/β-catenin信号通路中,frizzled,GSK 3β,LRP5,β-catenin表达降低;与此同时,骨形成指标OPG和ALP表达降低;ALP活性检测结果进一步显示与对照组比较,ERα低表达组的成骨细胞钙化水平降低,差异有统计学意义,MTT结果展示成骨细胞活性也显着降低。3)ERα过表达慢病毒载体促进MC3T3E1-24细胞中ER α蛋白表达和磷酸化,RT-q PCR和WB技术检测结果表明,与空白对照组和阴性慢病毒载体组比较,AMPK α 1/2水平提高,差异有统计学意义;frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin转录表达显着增多,Wnt/β-catenin信号通路被激活;检测成骨指标发现,OPG和ALP表达与对照组比较显着增多,差异有统计学意义,ALP活性检测和MTT检测结果进一步表明,ER α高表达组的成骨细胞钙化和增殖水平显着增高。4)AMPK对Wnt/β-catenin信号通路影响和成骨细胞影响。AICAR激活AMPK通路后,MC3T3E1细胞中AMPK转录表达提高,蛋白活化水平也增多,RT-qPCR和WB结果也表明,Wnt/β-catenin信号通路中frizzled,GSK3 β,LRP5,β-catenin表达显着增多,phspho-β-catenin表达降低;OPG和ALP表达也显着增多;ALP活性检测和MTT检测结果表明,与对照组比较,AMPK过表达组成骨细胞钙化和增殖水平增多,差异有统计学意义。4.牛膝甾酮发挥促进ER α磷酸化作用,激活AMPK和Wnt/β-catenin信号通路,从而促进成骨细胞分化和增殖牛膝甾酮孵育48h后,RT-qPCR和WB检测MC3T3E1-24细胞中ER α-AMPK-Wnt/β-cat enin信号通路相关基因表达,结果发现,ER α,p-ER α,AMPK α,p-AMPK α,frizzl ed,GSK3 β,LRP5,β-catenin表达与无药物处理组比较均显着增多,表明ER α-AMP K-Wnt/β-catenin信号通路被激活,OPG和ALP表达也显着增多,组间差异有意义,表明成骨细胞分化能力增强,茜素红染色和ALP活性检测结果表明,牛膝甾酮促进骨细胞钙化水平,TUNEL检测细胞凋亡情况和MTT检测细胞增殖,结果发现与对照组比较,牛膝甾酮组细胞凋亡和增殖率均无显着差异。结论:1.ER α基因高甲基化促进骨质疏松的发生;2.ERα低表达抑制OPG和ALP表达,促进RANKL表达,成骨分化受到抑制,成骨细胞活性降低;3.ER α激活后促进AMPK α活化,上调Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达,从而促进成骨细胞分化和增殖;4.牛膝甾酮通过激活ER α-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化发挥促进骨形成作用。
张瑞雪[7]（2020）在《氟通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制ATDC5细胞增殖和分化》文中提出目的:氟是一种人体必需微量元素,适量氟能够维持机体正常生理功能,过量氟则会引起氟中毒。流行病学调查显示,高氟地区儿童骨龄延迟,身高、体重、胸围均低于正常同龄儿童。本课题组前期动物实验和器官培养实验发现氟通过抑制软骨内成骨过程损害长骨纵向生长。软骨内成骨是骨形成的主要方式,此过程受到全身激素、细胞因子和局部产生的信号因子共同作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一种广泛存在于生物细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞生长、增殖、分化、存活和自噬的中心调控因子。然而,氟是否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制软骨内成骨尚未见报道。为此,我们通过体外器官培养胚胎大鼠胫骨和体外培养源于畸胎瘤细胞的小鼠软骨发生细胞ATDC5细胞模拟软骨细胞分化,观察氟是否通过调控PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制软骨细胞的增殖和分化。本研究为阐明氟抑制长骨生长的机制提供线索,为氟骨症的防治提供依据。实验方法:本研究选取胚胎第20天的胎鼠胫骨,采用左右配对的方法分为两组,左侧胫骨为对照组,右侧胫骨为染氟组（10-4M NaF）,培养于含0.2%牛血清蛋白、0.05mg/ml Vc、1m Mβ-甘油磷酸钠的α-MEM培养基中。7天后,胫骨经固定、石蜡包埋并切片,免疫组织化学方法检测胫骨PCNA和p-S6的蛋白表达,观察氟对软骨细胞增殖和mTOR活性的影响。ATDC5细胞培养于含有5%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素和1?ITS的DMEM培养基中,分别予以染氟3、5、7、14和21天。采用CCK8方法检测ATDC5细胞活力并在倒置显微镜下观察细胞形态的变化;阿利新蓝染色检测聚集蛋白多糖（Aggrecan）的合成及软骨结节的形成情况;Western blot和实时荧光定量PCR分别检测软骨细胞分化相关基因（Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X）和PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因（PI3K、AKT、mTOR、S6K1、4EBP1、LC3II/I、Beclin1、P62）的mRNA和蛋白表达,应用m TOR激动剂MHY1485和mTOR抑制剂Rapamycin,探讨PI3K/AKT/mTOR信号通路在氟致软骨损伤中的作用。结果:1.氟对胫骨软骨细胞增殖和m TOR活性的影响:染氟组胫骨中PCNA和p-S6阳性细胞率显着低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）。2.氟对小鼠ATDC5细胞活力及细胞形态的影响:染氟浓度为10-3M时,细胞活力显着低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.001）;对照组细胞生长状态良好,基本保持着原有的细胞结构;染氟组细胞培养液内细胞碎片颗粒物增多,细胞生长缓慢,收缩变形,多伪足。3.氟对小鼠ATDC5细胞分化的影响:在ITS的作用下,ATDC5细胞快速增殖融合成单层,融合后的细胞形成软骨结节,软骨结节形态随培养时间增加逐渐扩大,软骨结节数量逐渐增多;对照组细胞阿利新蓝染色强度随培养时间增加而增强,染氟组细胞染色强度低于对照组、软骨结节数量少于对照组;与对照组比较,染氟组细胞Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X mRNA表达和Sox9、Col II蛋白表达均显着下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.氟对软骨细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响:染氟组细胞mTOR、S6K1和4EBP1 mRNA表达和PI3K、AKT、mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达均显着低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.氟对ATDC5细胞自噬相关基因表达的影响:与对照组相比,染氟组细胞Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表达显着增加,P62蛋表达白显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。6.mTOR激动剂MHY1485上调氟抑制的p-mTOR、p-S6K1和p-4EBP1的表达:染氟组细胞中mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显着低于对照组,mTOR激动剂MHY1485组中细胞mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显着高于对照组。染氟+m TOR激动剂MHY1485组细胞mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显着高于染氟组,差异具均有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,染氟+mTOR激动剂MHY1485组细胞中mTOR、S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达无明显差异,mTOR抑制剂Rapamycin组细胞中mTOR,S6K1和4EBP1磷酸化蛋白表达显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。7.氟通过抑制mTOR的磷酸化诱导ATDC5细胞自噬:与对照组比较,染氟组细胞中P62的蛋白表达显着下调,mTOR激动剂MHY1485组细胞中P62的蛋白表达显着上调。与染氟组比较,染氟+m TOR激动剂MHY1485组细胞中P62的蛋白表达显着上调,差异具均有统计学意义（P<0.05）。Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表达结果与P62的蛋白表达结果相反。与对照组比较,染氟+m TOR激动剂MHY1485组细胞中P62,Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表达无显着差异。mTOR抑制剂Rapamycin组细胞中P62蛋白表达显着下调,Beclin1和LC3II/LC3I的蛋白表达显着上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。8.氟通过下调m TOR的磷酸化抑制ATDC5细胞分化:染氟组细胞中Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表达显着低于对照组,mTOR激动剂MHY1485组细胞中Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表达显着增加。染氟+mTOR激动剂MHY1485组细胞Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表达显着高于染氟组,差异均具有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较,染氟+mTOR激动剂MHY1485激动剂组细胞分化相关基因mRNA表达均无显着差异。mTOR抑制剂Rapamycin组中Aggrecan、Sox9、Col II、Ihh、PTHrP和Col X的mRNA表达显着降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）,Sox9和Col II的蛋白表达结果与mRNA表达结果一致。结论:1.氟下调PI3K/AKT/m TOR信号通路,抑制其下游因子S6K1和4EBP1的磷酸化,进而抑制软骨细胞增殖和分化。2.氟下调PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进软骨细胞自噬的发生。
赫佳[8]（2019）在《EPCs和BMSCs促进骨再生修复的机制研究》文中研究说明[目 的]探讨内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞促进骨再生修复的作用及其分子机制。[方法]1、从大鼠股骨和胫骨采集骨髓,从骨髓中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）和内皮祖细胞（EPCs）;体外培养镜下观察两种细胞形态;采用成脂分化和成骨分化诱导培养基诱导BMSCs分化。油红O染色和茜素红S染色检测BMSCs的分化能力,流式细胞仪和免疫荧光法分别检测BMSCs与EPCs表面分子标记;体外培养成管试验检测EPC细胞血管形成能力;RT-qPCR检测EPCs标记基因表达;Western blot检测成骨相关基因的表达水平。2、体外构建EPC+BMSC共培养体系;RT-qPCR和Western blot检测骨生成相关基因mRNA和蛋白的表达水平;茜素红染色检测BMSCs细胞钙化结节的形成;CCK-8检测BMSCs增殖活力;ALP活性检测试剂盒定量ALP活性;免疫组化检测ALP表达和分布;扫描电镜（SEM）观察BMSCs骨生成。3、以方法2中的共培养体系为对象,CCK-8实验检测EPC增殖活力;免疫荧光检测内皮细胞标志蛋白在EPC的表达;RT-qPCR和Westernblot分析内皮细胞相关基因mRNA的表达、Transwell检测EPC细胞的迁移能力;体外培养检测EPC血管形成能力。4、制备EPC和BMSC单培条件培养基上清（CM-S）,用EPC-CM-S处理BMSC;用BMSC-CM-S处理EPC;用BMSC-CM-S处理后的EPC来源的EPC-CMS再处理BMSC;ELISA检测各单独培养组细胞和共培养体系中BMP2与VEGF的分泌水平;RT-qPCR和Western blot检测骨生成相关基因mRNA和蛋白的表达水平;免疫组化检测BMSC细爬片ALP水平;免疫荧光检测测BMSC细胞中成骨分化相关转录因子Runx2、Osterix（Osx）表达。5、培养并分离EPC-外泌体,透射电子显微镜观察外泌体的形态,Western blotting检测外泌体表面标志物表达;将EPC-外泌体与BMSCs细胞共培养,探究EPC外泌体体来源miR-212-3p通过Smad-7对BMSCs成骨分化的影响。CCK-8和Transwell分别检测BMSC细胞增殖活力和迁移能力;ALP试剂盒检测ALP活性,RT-qPCR和Westernblot分别检测成骨分化相关基因的表达;茜红素染色检测BMSC钙化结节形成;双荧光素酶报告基因验证miR-212-3p与Smad-7的靶向关系。6、lncRNA-seq芯片检测共培养体系EPCs细胞中差异表达的lncRNA;CCK-8实验检测EPC细胞的增殖活力;Transwell实验检测EPCs细胞的迁移能力;RT-qPCR和Western blot检测内皮细胞标志基因和蛋白的表达水平;体外成管实验检测EPC细胞血管形成能力。[结果]1、从大鼠骨髓中成功分离到EPCs和BMSCs的细胞。与单独培养BMSCs细胞相比,EPCs+BMSCs共培养体系显着促进BMSCs细胞的增殖活力、ALP活性、成骨相关基因表达水平、钙结节形成。与单独培养EPCs细胞相比,EPCs+BMSCs共培养体系显着促进EPCs细胞的增殖活力、迁移能力、内皮细胞标志蛋白的表达水平、体外成管能力。2、单独培养的EPCs不分泌VEGF-A和BMP-2,单独培养的BMSCs不分泌BMP-2,但分泌VEGF-A,共培养体系中的VEGF-A和BMP2均具高分泌。EPCs条件上清不能启动和促进BMSCs的成骨分化。BMSCs激活的EPCs细胞通过分泌BMP-2促进BMSCs的成骨分化。3、EPCs外泌体处理后的BMSCs细胞中miR-212-3p异常高表达,敲降miR-212-3p显着降低BMSCs的成骨分化水平;EPCs外泌体miR-212-3p通过下调SMAD7促进BMSCs细胞增殖、迁移、和成骨分化。4、lncRNAMALAT1、lncRNAMEG3、lncRNA-ATB、lncRNAHULC 在共培养体系的EPCs细胞中高表达,且lncRNAMALAT1的上调水平最高。敲降LncRNAMALAT1显着将低共培养体系EPCs细胞细胞的增殖、迁移、内皮细胞分化和成管能力。本研究表明,共培养体系显着促进了 EPCs细胞中lncRNA-MALAT1的表达上调,并通过降低miR-124-3p对SOX7的负调控作用而促进EPCs细胞的增殖、迁移、内皮细胞分化和血管形成。[结论]1、EPC与BMSC共培养能够显着促进骨再生过程中的成骨分化和血管内皮细胞分化。2、共培养体系中BMSC细胞分泌VEGF-A刺激和激活EPC细胞,激活后的EPC细胞分泌MBP2促进BMSC细胞的成骨分化;这是一种“BMSC-EPC-BMSC循环反馈”的调控模式。3、共培养体系中EPC与BMEC的交互作用或互相调控,主要通过两种方式:直接分泌关键细胞因子调控成骨或血管生成;一种细胞以胞外分泌囊泡的方式转移核酸类或蛋白类调控因子而影响另一种细胞的分化或生物学行为。4、miR-212-3p、Smad-7、LncRNAMALAT1、miR-124-3p 和 SOX7 可能是骨再生和血管形成过程中的潜在标志分子。
孙静[9]（2019）在《蛇床子素促成骨作用及代谢多态性研究》文中研究指明目的:目前临床应用的抗骨质疏松药物带来治疗作用的同时副作用不容忽视,有效低毒的新药研发仍在进行中。文献报道传统中草药蛇床子及其活性成分蛇床子素具有用于骨质疏松的治疗作用,本论文通过研究蛇床子素与骨调节靶点的结合情况,对成骨细胞调节的机制以及代谢酶多态性相关作用的研究,明确蛇床子素作为新型治疗骨质疏松药物的特点及可能性。方法:1.计算机模拟蛇床子素和多靶点骨调节信号因子的分子对接。2.应用细胞增殖实验观察蛇床子素对人成骨样MG-63细胞增殖能力的影响。应用磷酸苯二钠实验法测定蛇床子素对人成骨样MG-63细胞分化功能的影响。应用DAPI染色法观察蛇床子素对凋亡诱导剂诱导的人成骨样MG-63细胞凋亡的影响。应用半定量RT-PCR和Western Blot技术观察蛇床子素对人成骨样MG-63细胞OPG、RANKL、Osterix表达的影响。测定蛇床子素对P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白时间表达的影响。3.应用雌激素受体阻断剂ICI 182780,MEK抑制剂PD 98059,PI3K抑制剂Wortmannin和Wnt抑制剂DKK-1检测其对蛇床子素调节作用的阻断。检测阻断剂对蛇床子素对OPG、RANKL和Osterix调节的阻断。测定阻断剂对蛇床子素P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白调节作用的阻断。4.建立LC-MS/MS的CYP2C9经典探针底物双氯芬酸、CYP2D6经典探针底物右美沙芬代谢物测定方法并进行方法学验证,测定蛇床子素对不同代谢酶基因型药物代谢的影响。结果:1.对接结果表明,蛇床子素和骨代谢调节相关的多个靶点具有不同程度的结合能力,从微观机制展示了多靶标作用的可能性。2.蛇床子素的促成骨作用主要表现为促分化,小剂量蛇床子素能够促进MG-63细胞增殖,抑制细胞凋亡,提高细胞中OPG/RANKL的mRNA及蛋白比率,上调Osterix mRNA和蛋白的表达,促使细胞内P-ERK、P-AKT表达增多,细胞浆内β-catenin蛋白降低,细胞核内β-catenin蛋白升高。3.ICI 182780、PD98059、Wortmannin和DKK-1均可部分阻断蛇床子素的促增殖分化作用,部分阻断蛇床子素对OPG、RANKL、Osterix的mRNA及蛋白表达的调节。提示该四种信号通路在蛇床子素调节成骨细胞中均参与发挥作用。4.蛇床子素对3种CYP2C9、4种CYP2D6基因型药物代谢酶的半数抑制浓度分别为:CYP2C9*1,91.51μM;CYP2C9*2,104.5μM;CYP2C9*3,120.4μM;CYP2D6*1,61.86μM;CYP2D6*2,74.09μM;CYP2D6*10,47.95μM;CYP2D6*39,56.99μM。结论:蛇床子素的促成骨作用涉及多靶点、多条信号通路,对常见存在多态性的代谢酶作用弱。由于骨质疏松需要长期用药,蛇床子素具有多靶点、相互作用少的特点,和现有的抗骨质疏松药物相比,具有作为一个新型治疗骨质疏松药物的良好前景。
陈欣玮[10]（2019）在《乳铁蛋白通过IGF-1信号通路促进衰老成骨细胞增殖和分化》文中认为目的:通过提取SD大鼠原代成骨细胞连续传代培养至细胞衰老,探究乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）对于衰老成骨细胞的改善作用,及通过RNA干扰（RNA interfere,RNAi）探究胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factors-1,IGF-1）信号通路在其中发挥的作用。方法:（1）提取Sprague-Dawley（SD）大鼠原代成骨细胞,连续传代培养至第10代,进行相关生物学指标检测,如MTT法检测细胞增殖活性、pNPP法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）法检测骨代谢相关基因Igf-1,骨保护素（osteoprotegerin,Opg）,核因子-κb配体受体激活剂（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,Rankl）,骨钙素（Bone gla protein,Bglap）,和衰老相关基因（p16,p21）表达情况,检测氧化应激相关指标超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）水平和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量的变化情况。（2）用乳铁蛋白干预衰老成骨细胞,采用透射电镜观察细胞亚显微结构、检测细胞增殖活性、ALP活性、骨代谢相关基因以及衰老相关基因表达的变化,观察氧化应激损伤指标的改变,探究乳铁蛋白对衰老成骨细胞的影响。（3）构建IGF-1 shRNA慢病毒载体,利用RNAi技术下调细胞内IGF-1的表达,乳铁蛋白干预转染了IGF-1慢病毒载体的衰老成骨细胞,检测上述指标的改变,以及Western blot法检测IGF-1及其下游信号通路的改变,以明确乳铁蛋白在改善骨代谢过程中IGF-1信号系统发挥的作用。结果:（1）成功提取大鼠原代成骨细胞,培养至第10代,随着细胞传代次数的增加,细胞增殖活力、ALP活性、骨代谢相关基因（Igf-1,Opg,Rankl,Bglap）表达水平下降;衰老相关基因（p16,p21）表达水平上升;SOD的活力下降,MDA的含量增加,氧化应激损伤加剧。（2）100μg/mL浓度干预3 d时,乳铁蛋白对衰老成骨细胞作用最佳,它可改善成骨细胞亚显微结构,减少次级溶酶体数量;增加成骨细胞增殖活力、ALP活性以及骨代谢相关基因表达水平;降低衰老相关基因表达水平;减轻氧化应激损伤,提高SOD的活力,降低MDA的含量;（3）用IGF-1 shRNA慢病毒干预后,衰老成骨细胞的IGF-1表达下调,乳铁蛋白促进其增殖的作用减轻,ALP活性下降,促进骨代谢相关基因水平表达的作用减轻,氧化应激损伤加剧,下游p-PI3K,p-Akt蛋白表达水平下降。结论:乳铁蛋白可促进衰老成骨细胞的增殖与分化,其作用可能与IGF-1/PI3K/Akt信号转导途径有关。
二、氟对体外培养的小鼠成骨细胞增殖活力的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、氟对体外培养的小鼠成骨细胞增殖活力的影响（论文提纲范文）
（1）PSAT1对牙周膜干细胞成骨分化的促进作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、骨组织工程技术是实现口腔骨组织再生的重要方法 |
| 二、口腔来源的牙周膜千细胞是口腔骨组织工程研宄的优势种子细胞 |
| 三、深入阐释牙周膜干细胞成骨分化的内在分子调控机制有助于促进其介导的骨再生 |
| 四、PSAT1可能对牙周膜干细胞的成骨分化有调控作用 |
| 课题相关文献回顾 |
| 一、现阶段常用口腔骨纲修复摊 |
| 二、口腔杂织工触 |
| 三、干细胞概述 |
| 四、口腔组织来海干细胞在口腔骨组织工程中的应用 |
| 五、干细胞成骨分化调控基因及信号通路 |
| 六、PSAT1研宄现状 |
| 第一部分 PDLSCs、DPSCs、GMSCs成骨分化调控基因的生物信息学分析 |
| 1.1背景 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 PSAT1对体外培养环境中PDLSCs增殖、迁移、分化能力的调控 |
| 2.1背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 PSAT1对PDLSCs介导的体内骨组织再生的调控 |
| 3.1背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四部分 PSAT1促进PDLSCs成骨分化的分子机制研究 |
| 4.1背景 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五部分 PDLSCs成骨分化过程中PSAT1的表达受转录因子ATF4调控 |
| 5.1背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文目录 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）原花青素减轻NaF所致小鼠MLO-Y4骨细胞损伤研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 NaF对MLO-Y4骨细胞的损伤研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 细胞 |
| 2. 主要实验试剂 |
| 3. 主要仪器设备 |
| 4. 主要试剂配制 |
| (二) 实验方法 |
| 1.细胞常规培养 |
| 2.NaF诱导MLO-Y4骨细胞损伤模型的建立 |
| 3.倒置显微镜下观察不同浓度NaF对MLO-Y4骨细胞形态的影响 |
| 4.钙黄绿素乙酿甲酯（Calcein-AM)染色法观察不同浓度NaF对MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| 5.细胞计数试剂（CellCountingKit-8, CCK-8)法测定NaF对MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| 6.自嗤检测试剂（Green detection reagent, CYTO-ID)染色法流式细胞术检测NaF对骨细胞自噬作用 |
| 7.吖啶橙（Acridine Orange, AO)荧光染色法流式细胞术检测NaF对骨细胞的酸性囊泡细胞器（acidic vesicle organelles，AVO)的作用 |
| 8.碘化丙啶（Propidiumlodide，PI)染色法流式细胞术检测NaF对骨细胞的细胞周期和细胞增殖的作用 |
| 9.蛋白质印迹（Western Blot)法测定NaF对MLO-Y4骨细胞损伤在细胞自噬、増殖相关通路的影响 |
| 10. 统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一) 光学显微镜观察不同浓度NaF对MLO-Y4骨细胞形态的影响 |
| (二) Calcein-AM染色法荧光显微镜观察不同浓度NaF对MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| (三) CCK-8法测定不同浓度NaF对MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| (四) 不同浓度NaF对MLO-Y4骨细胞自噬作用的影响 |
| (五) 不同浓度NaF对MLO-Y4骨细胞AVO数量的影响 |
| (六) 不同浓度NaF对MLO-Y4骨细胞增殖作用的影响 |
| (七) 不同浓度NaF对MO-Y4骨细胞自噬、增殖相关蛋白信号通路的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| 第二部分 原花青素对NaF所致MLO-Y4骨细胞损伤的保护作用及其机制 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 细胞 |
| 2. 主要实验试剂 |
| 3. 主要仪器设备 |
| 4. 主要试剂配制 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. CCK-8法测定不同浓度原花青素对MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| 3. 倒置显微镜下观察不同浓度原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞形态的影响 |
| 4. Calcein-AM染色法观察不同浓度原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| 5. CCK-8法测定不同浓度原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| 6. CYTO-ID染色法流式细胞术检测原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞自噬的作用 |
| 7. PI染色法流式细胞术检测原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞细胞周期和细胞增殖的作用 |
| 8. Westem Blot法测定原花青素对NaF所致MLO-Y4骨细胞损伤在细胞自噬、增殖相关通路的影响 |
| 9. 统计方法 |
| 二、实验结果 |
| (一) 不同浓度原花青素对MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| (二) 光学显微镜观察不同浓度原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞形态的影响 |
| (三) Calcein-AM染色法荧光显微镜观察不同浓度原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| (四) 不同浓度原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞活性的影响 |
| (五) 不同浓度原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞自噬作用的影响 |
| (六) 不同浓度原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞增殖作用的影响 |
| (七) 不同浓度原花青素对NaF诱导MLO-Y4骨细胞在自噬、增殖相关蛋白信号通路的影响 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、不足与展望 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 原花育素对地方性振中毒症作用的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）氟对胚胎大鼠胫骨生长、矿化及骺软骨糖原水平影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器及试剂 |
| 2.1.1 主要药品试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 体外胫骨培养模型建立 |
| 2.3.2 大鼠胫骨总长度、矿化区长度测量 |
| 2.3.3 石蜡切片制作 |
| 2.3.4 甲苯胺蓝染色 |
| 2.3.5 苏木素-伊红染色 |
| 2.3.6 番红固绿染色 |
| 2.3.7 PAS染色 |
| 2.3.8 骨小梁参数测量 |
| 2.3.9 免疫组织化学染色 |
| 2.3.10 图像采集 |
| 2.3.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 氟对体外培养大鼠胫骨纵向生长的影响 |
| 3.2 氟对体外培养大鼠胫骨组织形态计量学的影响 |
| 3.3 氟对体外培养大鼠胫骨成骨相关蛋白表达的影响 |
| 3.4 氟对体外培养大鼠胫骨骺软骨形态计量学的影响 |
| 3.5 氟对体外培养大鼠胫骨骺软骨糖原蓄积的影响 |
| 3.6 氟对体外培养大鼠胫骨骺软骨糖原代谢酶的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 软骨细胞和成骨细胞能量代谢 |
| 参考文献 |
| 社会实践 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）氟通过PHD2/HIF1α信号通路抑制SW1353软骨细胞糖酵解（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器及试剂 |
| 2.1.1 主要药品试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 体外胫骨器官培养 |
| 2.2.2 胫骨石蜡包埋及切片 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 CCK8(Cell Counting kit-8)实验检测细胞活力 |
| 2.2.6 阿利新蓝染色 |
| 2.2.7 ATP释放检测 |
| 2.2.8 乳酸生成测定 |
| 2.2.9 葡萄糖消耗检测 |
| 2.2.10 细胞免疫荧光染色 |
| 2.2.11 RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR |
| 2.2.12 蛋白提取 |
| 2.2.13 Western blot免疫印迹检测蛋白表达 |
| 2.2.14 数据处理和统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 氟抑制胫骨软骨细胞 HIF1α 蛋白表达 |
| 3.2 氟对SW1353 细胞活力的影响 |
| 3.3 氟对SW1353 细胞合成分解代谢及糖酵解的影响 |
| 3.3.1 氟对SW1353 细胞蛋白多糖表达的影响 |
| 3.3.2 氟对SW1353 细胞合成分解代谢标志因子表达的影响 |
| 3.3.3 氟对SW1353 细胞糖酵解的影响 |
| 3.4 氟对SW1353 细胞PHD2/HIF1α信号通路及糖酵解相关因子的影响 |
| 3.4.1 氟对SW1353 细胞PHD2/HIF1α信号通路的影响 |
| 3.4.2 氟抑制SW1353 细胞HIF1α蛋白的表达 |
| 3.4.3 氟对SW1353 细胞糖酵解相关因子表达的影响 |
| 3.5 HIF1α激活剂CoCl_2通过抑制PHD2 上调HIF1α的表达 |
| 3.5.1 CoCl_2对SW1353 细胞活性的影响 |
| 3.5.2 CoCl_2通过抑制PHD2 上调HIF1α的表达 |
| 3.6 氟通过下调HIF1α表达抑制SW1353 细胞糖酵解 |
| 3.7 氟通过抑制HIF1α使 SW1353 细胞合成代谢降低,分解代谢增加 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 葡萄糖代谢在软骨内成骨中的作用 |
| 参考文献 |
| 社会实践 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 个人简历 |
（5）氟对骨细胞调控成骨作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 代谢性骨病 |
| 1.1 代谢性骨病发病机制 |
| 1.2 代谢性骨病——骨质疏松症 |
| 1.3 代谢性骨病——侏儒症 |
| 1.4 代谢性骨病——骨软化症 |
| 第2章 骨细胞在代谢性骨病中的作用 |
| 2.1 骨细胞 |
| 2.2 骨细胞参与骨的生理性重建 |
| 第3章 氟骨症的机制研究进展 |
| 3.1 氟元素与氟骨症 |
| 3.2 氟骨症发病机理 |
| 第4章 成骨细胞在氟骨症中的作用 |
| 4.1 成骨细胞与骨形成 |
| 4.2 成骨细胞在氟骨症发病机制中的作用 |
| 第5章 研究设想及意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第1章 单独培养骨组织细胞染氟实验研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验细胞株 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验器械 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 骨组织细胞的诱导培养及鉴定 |
| 1.2.1.1 小鼠骨髓成骨细胞祖细胞(BMSCS)的分离、培养及鉴定 |
| 1.2.1.2 IDG-SW3 细胞的矿化诱导培养及检测 |
| 1.2.1.3 RAW264.7 细胞的诱导培养及检测 |
| 1.2.1.4 MC3T3-E1 细胞的诱导培养 |
| 1.2.2 MTT法检测骨组织细胞的增殖活性 |
| 1.2.3 流式细胞仪检测骨组织细胞的凋亡率 |
| 1.2.4 Western Blot法检测成骨细胞内相关蛋白的表达 |
| 1.2.5 Western Blot法检测骨细胞内相关蛋白的表达 |
| 1.2.6 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 骨组织中BMSCs、IDG-SW3和RAW264.7 细胞的鉴定 |
| 1.3.1.1 BMSCs细胞上表面抗原的测定 |
| 1.3.1.2 IDG-SW3 细胞经矿化诱导成为骨细胞的测定 |
| 1.3.1.3 RAW264.7 细胞经RANKL诱导成为破骨细胞样细胞的测定 |
| 1.3.2 染氟不同时间不同浓度对骨组织中细胞增殖活性的影响 |
| 1.3.3 染氟不同浓度对骨组织中细胞凋亡的影响 |
| 1.3.4 染氟成骨细胞内特征性蛋白的表达变化 |
| 1.3.4.1 染氟成骨细胞内Smad3/P-Smad3以及Wnt10b/β-catenin蛋白的表达 |
| 1.3.4.2 染氟成骨细胞内Runx2和PTH1R蛋白的表达 |
| 1.3.5 染氟骨细胞内调控成骨和破骨相关蛋白的表达 |
| 1.3.5.1 染氟骨细胞内SOST、 DKK1、以及Wnt10b/β-catenin蛋白的表达 |
| 1.3.5.2 染氟骨细胞内Smad3/P-Smad3 蛋白的表达 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 共培养骨组织细胞染氟实验研究 |
| 2.1 共培养实验材料 |
| 2.1.1 共培养实验细胞株 |
| 2.1.2 共培养实验仪器 |
| 2.1.3 共培养实验试剂 |
| 2.1.4 共培养实验器材 |
| 2.2 共培养实验方法 |
| 2.2.1 PCR法检测成骨细胞祖细胞、破骨细胞前体分别与骨细胞共培养系统中下层骨细胞特定基因的表达变化 |
| 2.2.2 激活骨细胞的SOST对成骨细胞祖细胞增殖的影响 |
| 2.2.3 成骨细胞与骨细胞共培养7 天 |
| 2.2.4 成骨细胞与骨细胞共培养28 天 |
| 2.2.5 干扰骨细胞中的SOST对成骨细胞活性的影响 |
| 2.2.5.1 筛选siRNA最适浓度 |
| 2.2.5.2 实验流程 |
| 2.2.6 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 成骨细胞祖细胞和破骨细胞前体对骨细胞内成骨、破骨调控基因表达的影响 |
| 2.3.1.1 成骨细胞祖细胞对骨细胞内成骨、破骨调控基因表达的影响 |
| 2.3.1.2 破骨细胞前体对骨细胞内成骨、破骨调控基因表达的影响 |
| 2.3.2 激活骨细胞中SOST经迪夫染色观察成骨细胞祖细胞的增殖 |
| 2.3.3 染氟骨细胞对共培养系统中成骨细胞分化的影响 |
| 2.3.3.1 通过碱性磷酸酶染色观察Transwell小室上层成骨细胞分化的情况 |
| 2.3.3.2 Transwell小室下层染氟7 天骨细胞内调控成骨相关信号通路因子的变化 |
| 2.3.4 染氟骨细胞对共培养系统中成骨细胞矿化成熟的影响 |
| 2.3.4.1 通过茜素红染色观察Transwell小室上层成骨细胞矿化结节形成的情况 |
| 2.3.4.2 Transwell小室下层染氟28 天骨细胞内调控成骨相关信号通路因子的变化 |
| 2.3.5 干扰骨细胞表达SOST对骨细胞内调控成骨、破骨相关因子的影响 |
| 2.3.5.1 siRNA最适浓度 |
| 2.3.5.2 干扰染氟骨细胞中SOST的表达对共培养系统中骨细胞内调控成骨、破骨基因表达的影响 |
| 2.3.5.3 干扰染氟骨细胞中SOST的表达对共培养系统中成骨细胞内相关因子表达的影响 |
| 2.4 小结 |
| 第三篇 讨论与结论 |
| 第四篇 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）补肾中药调控ERα-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖、分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1 中医学关于骨质疏松症病因病机的认识 |
| 1.1 中医学对骨质疏松症的认识 |
| 1.2 骨质疏松的病因病机 |
| 2 中医药治疗骨质疏松症的现状 |
| 2.1 常用的补肾类方剂 |
| 2.2 单味补肾中药及其活性成分与骨质疏松研究进展 |
| 2.3 补肾中药牛膝及牛膝单体与PMOP研究进展 |
| 3 现代医学对OP、PMOP的认识 |
| 3.1 OP和PMOP流行病学研究进展 |
| 3.2 雌激素和雌激素受体与PMOP研究进展 |
| 3.3 AMPK信号通路与PMOP的研究进展 |
| 3.4 Wnt/β-catenin信号通路与PMOP的研究进展 |
| 第二章 临床与实验研究部分 |
| 1 血清中ER α甲基化检测对PMOP临床研究意义 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2 DNA甲基化对体外成骨细胞增殖和成熟影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 ERα调控AMPK α活化对成骨细胞分化影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 ERα调控Wnt-β-catenin信号通路对成骨细胞分化影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 牛膝甾酮调控ERα -AMPKα-Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞分化的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第三章 结语 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 不足 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
（7）氟通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制ATDC5细胞增殖和分化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.1.1 主要药品试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胫骨器官培养 |
| 2.2.2 胫骨石蜡包埋及切片 |
| 2.2.3 免疫组织化学检测蛋白表达 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 细胞活力测定 |
| 2.2.6 细胞形态学观察 |
| 2.2.7 ATDC5细胞分化及处理 |
| 2.2.8 阿利新蓝染色 |
| 2.2.9 RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR检测mRNA表达 |
| 2.2.10 蛋白提取、蛋白定量和Western blot免疫印迹检测蛋白表达 |
| 2.2.11 数据处理和统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 氟抑制胫骨软骨细胞增殖和mTOR活性 |
| 3.1.1 氟对胫骨软骨细胞增殖的影响 |
| 3.1.2 氟对胫骨软骨细胞mTOR活性的影响 |
| 3.2 氟对小鼠ATDC5细胞活力及细胞形态影响 |
| 3.2.1 氟对ATDC5细胞活力的影响 |
| 3.2.2 氟对ATDC5细胞形态的影响 |
| 3.3 氟对小鼠ATDC5细胞分化的影响 |
| 3.3.1 ITS诱导ATDC5 细胞分化 |
| 3.3.2 氟对ATDC5细胞分化过程中蛋白多糖合成的影响 |
| 3.3.3 氟对ATDC5细胞分化标志基因表达的影响 |
| 3.4 氟对小鼠ATDC5 细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响 |
| 3.4.1 氟对ATDC5 细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路以及下游因子表达的影响 |
| 3.4.2 氟对ATDC5细胞自噬相关基因表达的影响 |
| 3.5 mTOR激动剂MHY1485 上调氟抑制的p-mTOR,p-S6K1和p-4EBP1 的表达 |
| 3.6 氟通过抑制mTOR的磷酸化诱导ATDC5 细胞自噬 |
| 3.7 氟通过下调mTOR的磷酸化抑制ATDC5 细胞分化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 实践报告 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）EPCs和BMSCs促进骨再生修复的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验一 BMSC与EPC的分离、鉴定及BMSC-EPC共培养对成骨和血管生成的作用研究 |
| 1 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 实验二 共培养体系中成骨的作用的启动机制研究 |
| 1 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 实验三 EPC外泌体通过miR-212-3p下调BMSC细胞中Smad-7表达促进BMSC的成骨分化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 实验四 共培养体系EPC细胞中LncRNA MALAT1上调通过miR-124-3p/SOX7分子轴促进EPC细胞增殖、迁移、内细胞分化和血管生成 |
| 1 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结与讨论 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 BMSC在骨组织工程成骨作用中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）蛇床子素促成骨作用及代谢多态性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、蛇床子素与骨调节靶点相互作用的分子模拟研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 分子对接 |
| 1.1.2 治疗靶点数据库 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果及讨论 |
| 1.3 小结 |
| 二、蛇床子素对人成骨样MG-63 细胞的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验相关试剂制备 |
| 2.1.3 细胞培养 |
| 2.1.4 细胞体外增殖能力的测定 |
| 2.1.5 蛇床子素对细胞碱性磷酸酶活性影响的测定 |
| 2.1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.1.7 RT-PCR |
| 2.1.8 免疫印迹细胞实验 |
| 2.1.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 蛇床子素对MG-63 细胞增殖能力的影响 |
| 2.2.2 蛇床子素对MG-63 细胞分化能力的影响 |
| 2.2.3 蛇床子素对细胞凋亡的影响 |
| 2.2.4 蛇床子素对OPG,RANKL,Osterix表达的影响 |
| 2.2.5 蛇床子素对P-ERK/ERK,P-AKT/AKT,β-catenin蛋白表达的调节 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、阻断剂对蛇床子素调节作用的阻断 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂的配制 |
| 3.1.3 细胞培养 |
| 3.1.4 细胞体外增殖能力的测定 |
| 3.1.5 碱性磷酸酶活性的测定 |
| 3.1.6 RT-PCR |
| 3.1.7 免疫印迹细胞实验 |
| 3.1.8 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 阻断剂对蛇床子素增殖分化作用的阻断 |
| 3.2.2 阻断剂对蛇床子素调节OPG,RANKL,Osterix表达的阻断 |
| 3.2.3 阻断剂对蛇床子素调节的信号蛋白表达的阻断 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、蛇床子素对3种CYP2C9 基因型及4种CYP2D6 基因型药物代谢的影响 |
| 前言 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 样品配制 |
| 4.1.4 探针底物的LC-MS/MS方法测定 |
| 4.1.5 酶反应研究 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 探针药物的LC-MS/MS方法测定及验证 |
| 4.2.2 酶反应条件确定 |
| 4.2.3 代谢物标准曲线 |
| 4.2.4 蛇床子素对底物酶代谢的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 总结和展望 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 蛇床子素药理作用研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）乳铁蛋白通过IGF-1信号通路促进衰老成骨细胞增殖和分化（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 乳铁蛋白对衰老成骨细胞增殖和分化的影响 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 成骨细胞的培养与鉴定 |
| 3.2 不同代数成骨细胞生物学特性的比较 |
| 3.3 乳铁蛋白对第10代成骨细胞增殖和分化的影响 |
| 4.讨论 |
| 第二部分 乳铁蛋白对衰老成骨细胞增殖和分化影响的机制研究 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 慢病毒载体的构建及转染实验 |
| 3.2 乳铁蛋白对IGF-1基因沉默后第10代成骨细胞增殖和分化影响的机制研究 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 课题综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
四、氟对体外培养的小鼠成骨细胞增殖活力的影响（论文参考文献）
- [1]PSAT1对牙周膜干细胞成骨分化的促进作用及机制研究[D]. 贾凌璐. 山东大学, 2021(12)
- [2]原花青素减轻NaF所致小鼠MLO-Y4骨细胞损伤研究[D]. 俞超楠. 浙江中医药大学, 2021(02)
- [3]氟对胚胎大鼠胫骨生长、矿化及骺软骨糖原水平影响的研究[D]. 乔婷婷. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]氟通过PHD2/HIF1α信号通路抑制SW1353软骨细胞糖酵解[D]. 马瑞. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]氟对骨细胞调控成骨作用的研究[D]. 蒋宁宁. 吉林大学, 2020(08)
- [6]补肾中药调控ERα-AMPK-Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖、分化的研究[D]. 陈庆真. 广州中医药大学, 2020(06)
- [7]氟通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制ATDC5细胞增殖和分化[D]. 张瑞雪. 中国医科大学, 2020(01)
- [8]EPCs和BMSCs促进骨再生修复的机制研究[D]. 赫佳. 昆明医科大学, 2019
- [9]蛇床子素促成骨作用及代谢多态性研究[D]. 孙静. 天津医科大学, 2019(02)
- [10]乳铁蛋白通过IGF-1信号通路促进衰老成骨细胞增殖和分化[D]. 陈欣玮. 福建医科大学, 2019(07)