一、裸鼠人子宫内膜异位症模型建立与病灶血管形成相关检测（论文文献综述）
孙瑞英[1]（2021）在《补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠JAK2/STAT3信号通路相关因子的影响》文中研究指明目的:本课题将JAK2/STAT3信号通路引入到EM肾虚血瘀型大鼠研究中,并用补肾温经汤干预,以此来探讨JAK2/STAT3信号通路在EM肾虚血瘀型大鼠中的作用机制以及补肾温经汤治疗EM的药物靶点,以期为EM临床规范选用方药提供可靠的依据。方法:从SPF级雌性未孕健康105只SD大鼠中随机选取10只为空白组,余采用复合因素法构建肾虚血瘀型大鼠模型,造模成功后随机抽取10只为假手术组,仅开腹,不缝内膜,余采用自体内膜移植法构建EM肾虚血瘀型大鼠模型。从造模成功的56只大鼠中随机选取50只大鼠随机分为模型组、达那唑组(63 mg·kg-1)以及补肾温经汤低、中、高剂量组(5,10,20 g·kg-1),每组10只,每日灌胃1次,连续28 d。测量治疗前后各造模组异位灶长（D1）,宽（D2）,高（D3）,并计算异位灶体积（V=0.52×D1×D2×D3）;取各组大鼠在位、异位内膜组织进行HE染色,观察组织病理变化。ELISA检测各组大鼠血清中IL-10,IL-17含量。IHC检测各组大鼠在位、异位内膜组织JAK2,STAT3,p-STAT3,Caspase-8,TNF-α,VEGF,TSP-1,MMP-9,E-cadherin,N-cadherin表达水平;WB检测Caspase-8,TNF-α,VEGF,TSP-1,MMP-9,E-cadherin以及N-cadherin蛋白表达水平。RT-PCR检测Caspase-8,TNF-α,MMP-9,E-cadherin以及N-cadherin基因表达水平。结果:治疗前,各模型组异位灶肉眼可见典型囊状水泡,镜下可见子宫内膜结构完整,呈子宫腔状或环形封闭式结构,内有囊肿形成,上皮为立方状或柱状上皮,大部分上皮细胞有分泌现象,间质致密,基质呈少许纤维化,血管增生密集。治疗后达那唑组与补肾温经汤低、中、高剂量组异位灶体积显着减小（P<0.01）,子宫内膜上皮层均有不同程度的变薄,甚至萎缩呈线状排列,细胞排列不紧密,多数内膜脱落,间质细胞减少且表现为小而稀疏状,血管明显减少。经IHC检测:与空白组、假手术组比较,模型组在位与异位内膜组织中JAK2,STAT3,p-STAT3蛋白表达均显着升高（P<0.05）。与模型组比较,补肾温经汤低剂量组在位与异位内膜组织中JAK2蛋白表达显着降低（P<0.05）,达那唑组与补肾温经汤中、高剂量组在位与异位内膜组织中JAK2,STAT3,p-STAT3蛋白表达均显着降低（P<0.05）。经ELISA检测:与空白组、假手术组比较,模型组血清中IL-10含量显着降低（P<0.01）,IL-17含量显着升高（P<0.01）;与模型组比较,达那唑组与温经汤加味低、中、高剂量组血清中IL-10含量显着升高（P<0.01）,IL-17含量显着降低（P<0.01）。经IHC和WB检测:与空白组、假手术组比较,模型组在位与异位内膜组织中Caspase-8,TSP-1,E-cadherin蛋白表达均显着降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01）;TNF-α,VEGF,MMP-9,N-cadherin蛋白表达均显着升高（P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01）;与模型组比较,达那唑组与补肾温经汤中、高剂量组在位与异位内膜组织中Caspase-8,TSP-1,E-cadherin蛋白表达显着升高（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,TNF-α,VEGF,MMP-9,N-cadherin蛋白表达显着降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01）。经PCR检测:与空白组、假手术组比较,模型组在位与异位内膜组织中Caspase-8,E-cadherin基因表达显着降低（P<0.01）,TNF-α,MMP-9,N-cadherin基因表达显着升高（P<0.01）,与模型组比较,达那唑组与补肾温经汤中、高剂量组在位与异位内膜组织中Caspase-8,E-cadherin基因表达显着升高（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,达那唑组与补肾温经汤中、高剂量组在位与异位内膜组织中MMP-9基因表达显着降低（P<0.01,P<0.05,P<0.01）,达那唑组与补肾温经汤中、高剂量组在位与异位内膜组织中TNF-α,N-cadherin基因表达显着降低（P<0.05）。结论:1.补肾温经汤具有抑制EM肾虚血瘀型大鼠异位灶侵袭的作用,其具体作用机制可能与调控JAK2/STAT3信号通路过度激活所介导的免疫抑制以及阻断微血管新生功能有关。2.STAT3被JAK2激活,使得STAT3过度磷酸化,导致JAK2/STAT3信号通路在EM肾虚血瘀型大鼠中处于异常活化状态。3.JAK2/STAT3信号通路的异常活化状态表现为上调IL-17,TNF-α,VEGF,MMP-9,N-cadherin表达水平,下调IL-10,Caspase-8,TSP-1,E-cadherin表达水平而引起EM肾虚血瘀型大鼠免疫失衡以及大量微血管新生,导致EM发生、发展。
韦佳慧[2]（2020）在《基于Wnt通路的内异消抑制异体移植子宫内膜异位症的作用机制研究》文中进行了进一步梳理背景子宫内膜异位症是指具有活性的内膜细胞生长在子宫内膜以外部位所引起的疾患,属于中医血瘀证范畴,治法当以活血化瘀为主。内异消来源于中医经典妇科名方“佛手散”,是本实验室创制的抗子宫内膜异位症的中药新药,由川芎嗪、阿魏酸配以延胡索乙素组成,我们前期发现内异消对自体移植子宫内膜异位症有一定的疗效,但在异体移植模型上的作用尚未阐明。结合网络药理学方法,有利于系统地分析内异消对子宫内膜异位症的作用机制。侵袭转移被认为是子宫内膜异位症发生的重要步骤之一,上皮间质转化与侵袭转移密切相关,而Wnt通路能促进上皮间质转化。因此,本研究首先观察了内异消对异体移植子宫内膜异位症的疗效,然后从调控Wnt通路、上皮间质转化和侵袭转移的角度探讨其作用机制。最后运用网络药理学方法,进一步挖掘内异消抑制子宫内膜异位症的潜在作用机制,为内异消治疗子宫内膜异位症提供依据。目的在荧光异体移植子宫内膜异位症模型上验证内异消是否具有抑制子宫内膜上皮间质转化,进而抑制内膜侵袭转移的作用,且其作用机制是否与Wnt通路相关,并运用网络药理学方法进一步挖掘内异消作用于子宫内膜异位症的潜在靶点。方法1.荧光异体移植子宫内膜异位症模型的改进选取处于动情期的8～10周龄雌性C3H tdTomato小鼠,取双侧子宫,剪成4 mm2大小的组织块移植于裸鼠的腹部皮下,手术后每5 d肌肉注射2 mg·kg-1苯甲酸雌二醇一次。造模28 d后,于活体成像系统下检测异位病灶的荧光强度,游标卡尺测量并根据公式:体积=0.52×长×宽×高,计算异位病灶的体积,然后构建异位病灶荧光强度与体积的关系曲线,HE染色观察异位病灶的组织结构,免疫组化检测异位病灶中子宫内膜异位蛋白ENDO-I的表达。2.内异消抑制子宫内膜异位症的药效学研究在造模28 d后,将造模成功的动物根据荧光强度随机分为模型组、内异消低、中、高剂量组和孕三烯酮组,另设正常雌性C3H tdTomato小鼠为空白对照组,空白对照组和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠混悬液,内异消低、中、高剂量组分别给予90、180、360 mg·Kg-1内异消,孕三烯酮组给予2 mg·Kg-1孕三烯酮,连续28 d每天灌胃给药一次。给药结束后,检测异位病灶的荧光强度和体积,HE染色观察异位内膜组织结构的变化,ELISA法检测血清中E2和PROG水平的变化。3.内异消抑制异位内膜侵袭转移及上皮间质转化的机制研究取空白对照组子宫内膜、模型组以及内异消各组异位组织,提取RNA和蛋白,用RT-qPCR法检测侵袭转移MMP-2、MMP-9、TIMP-1基因和上皮间质转化E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist、Snail、Slug、ZEB1基因的表达,Western blot法检测侵袭转移MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白及上皮间质转化E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表达。4.内异消调控异位内膜Wnt通路的机制研究取空白对照组子宫内膜、模型组以及内异消各组异位组织,提取RNA和蛋白,用RT-qPCR法检测Wnt通路APC、GSK3β、β-catenin、c-Myc、CyclinD1基因的表达,Western blot法检测Wnt3a、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、c-Myc蛋白的表达。5.内异消抑制子宫内膜异位症的网络药理学研究运用TCMID、TCMSP和SEA数据库收集内异消各成分的作用靶点,OMIM、DisGeNET和GEO数据库收集子宫内膜异位症的靶点。通过Cytoscape 3.5.0软件构建“内异消成分-靶点”和“内异消靶点-子宫内膜异位症靶点”网络,运用Network Analyzer插件分析网络的拓扑参数,计算出所有靶点的度及中介中心性的平均值,筛选出网络中的关键节点,通过DAVID及PANTHER数据库对关键靶点进行GO及通路富集分析,运用Sybyl-X 2.1.1软件将内异消各成分与部分关键靶点进行分子对接验证。结果1.荧光异体移植子宫内膜异位症模型的改进造模28 d后,裸鼠腹部皮下的异位病灶可见较强荧光,荧光强度≥9.58E+6,开腹后肉眼可见病灶呈透明的囊状,表面有丰富的血管形成,内有积液,积液高度≥1 mm,异位病灶体积≥4 mm3。异位病灶荧光强度与体积的线性关系公式为y=862154x+6.13E+6,R2=0.9005。HE染色显示,异位病灶中有子宫内膜上皮细胞、腺体及间质的生长,免疫组化结果表明,在异位内膜间质细胞的胞浆可见ENDO-I蛋白的表达,说明荧光异体移植子宫内膜异位症模型改进成功。2.内异消能抑制子宫内膜异位症给药28 d后发现,模型组给药前后,异位病灶的荧光强度和体积没有显着变化（P>0.05）。与给药前相比,内异消各组异位病灶的荧光强度和体积均显着降低（P<0.05）,孕三烯酮也能显着减小异位病灶的荧光强度和体积（P<0.01）。HE染色结果显示,模型组异位内膜具有与正常子宫内膜相似的结构,单层上皮细胞呈柱状排列,且内膜壁较厚,腺体数较多,血管丰富,有炎性细胞的浸润。给予360mg·Kg-1内异消后,异位内膜壁明显变薄,腺体及血管的数量明显减少,炎性细胞的浸润也减少。ELISA结果表明,与空白对照组相比,模型组血清中E2、PROG含量显着升高（P<0.05）,与模型组相比,内异消能显着降低血清中E2及PROG水平（P<0.05）。以上结果表明,内异消对子宫内膜异位症具有较好的疗效。3.内异消抑制侵袭转移和上皮间质转化（1）RT-qPCR结果表明,与空白对照组相比,模型组MMP-2、MMP-9 mRNA水平显着升高（P<0.01）,TIMP-1 mRNA水平显着降低（P<0.05）。与模型组相比,内异消显着下调MMP-2、MMP-9基因的表达（P<0.05）,显着上调TIMP-1基因的表达（P<0.05）。Western blot结果表明,与空白对照组相比,模型组MMP-2、MMP-9蛋白的表达显着增加（P<0.05）,TIMP-1蛋白的表达显着减少（P<0.05）。与模型组相比,内异消显着抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表达（P<0.05）,显着增加TIMP-1蛋白的表达（P<0.05）。（2）RT-qPCR结果显示,与空白对照组相比,模型组E-cadherin mRNA水平显着下降（P<0.01）,N-cadherin、Vimentin、Twist、Slug、Snail、ZEB1 mRNA水平显着上升（P<0.05）。与模型组相比,内异消显着上调E-cadherin基因的表达（P<0.05）,显着下调N-cadherin、Vimentin、Twist、Slug、Snail、ZEB1基因的表达（P<0.05）。Western blot结果显示,与空白对照组相比,模型组E-cadherin蛋白水平显着降低（P<0.05）,N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白水平显着升高（P<0.05）。与模型组相比,内异消显着促进E-cadherin蛋白的表达（P<0.05）,显着抑制N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表达（P<0.05）。4.内异消调控Wnt通路RT-qPCR结果表明,与空白对照组相比,模型组APC、GSK3β基因的表达显着减少（P<0.05）,β-catenin、c-Myc、CyclinD1基因的表达显着增加（P<0.05）。与模型组相比,内异消显着升高GSK3β、APC mRNA水平（P<0.05）,显着降低β-catenin、c-Myc、CyclinD1 mRNA水平（P<0.05）。Western blot结果表明,与空白对照组相比,模型组GSK3β、p-β-catenin蛋白的水平显着下调（P<0.05）,Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin、c-Myc蛋白的水平显着上调（P<0.05）。与模型组相比,内异消显着上调GSK3β、p-β-catenin蛋白的表达（P<0.05）,显着下调Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin、c-Myc蛋白的表达（P<0.05）。5.内异消抑制子宫内膜异位症的网络药理学研究通过数据库收集得到内异消靶点275个,子宫内膜异位症靶点401个,二者共同靶点22个,构建了“内异消成分-靶点”和“内异消靶点-子宫内膜异位症靶点”网络,由22个共同靶点及其邻居节点构成的核心蛋白质-蛋白质相互作用网络,分析得到66个关键靶点。GO分析结果显示,66个关键靶点主要参与凋亡过程的负调节、DNA模板化、代谢等生物过程,主要存在于核、细胞质、细胞膜中,并具有蛋白质结合、酶结合、信号转换等分子功能。通路富集分析结果显示,关键靶点主要参与调控PI3K-Akt signaling pathway,Estrogen signaling pathway,TNF signaling pathway,Apoptosis signaling pathway,Wnt signaling pathway,VEGF signaling pathway等。分子对接结果显示,阿魏酸与IL6、MMP-2具有较好的结合活性,与TP53、MMP-9及VEGFA具有一定的结合活性;延胡索乙素与MMP-2、IL8具有较好的结合活性,与VEGFA、TIMP-1具有一定的结合活性;川芎嗪与各靶点的对接得分值均较低,无结合活性。结论综上所述,体内实验表明,在荧光异体移植子宫内膜异位症模型中,构建了异位病灶荧光强度与体积的关系曲线,R2=0.9005。内异消能显着降低异位病灶的荧光强度和体积,改善异位内膜组织结构的病理变化,降低血清中E2和PROG含量,其作用机制可能与内异消调节Wnt通路,影响上皮间质转化,进而抑制子宫内膜发生侵袭转移有关。网络药理学研究也表明,内异消作用于子宫内膜异位症的关键靶点有66个,其中包含了侵袭转移靶点MMP-2、MMP-9和TIMP-1,并可参与调控包括Wnt通路在内的多个信号通路过程,内异消中阿魏酸、延胡索乙素与包括侵袭转移因子在内的多个关键靶点有结合活性。
林翔[3]（2020）在《缺氧调控的细胞粘附和细胞周期在子宫内膜异位症发病中的作用》文中进行了进一步梳理子宫内膜异位症（Endometriosis,EM）,简称内异症,是指子宫内膜组织（腺体和间质）在子宫腔被覆内膜及子宫以外的部位粘附、生长、周期性出血,继而形成包块或结节,引发疼痛、不孕等症状。虽然是育龄期妇女的常见病,内异症的发病机制至今不明且众说纷纭,目前仍以Sampson的经血逆流-种植学说为主导,该学说认为随经血逆流入盆腔的子宫内膜碎片经历粘附、增殖、血管新生等过程,形成异位囊肿或结节。但种植学说并不能解释为什么90%的女性发生经血逆流,而仅10%左右的育龄期妇女罹患内异症。这也提示我们内异症不仅与月经逆流相关,盆腔微环境引起的异位内膜生物学改变在内异症发病中的作用也不可忽视。月经期子宫内膜功能层螺旋小动脉持续性收缩,子宫内膜缺血缺氧,剥脱出血,形成月经,现有研究已证明随经血逆流的子宫内膜碎片在异位组织粘附生长前处于相对缺氧的状态。缺氧状态下缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）的表达升高,介导内异症细胞克服缺氧环境并启动异位粘附-增殖-浸润等生物学行为。粘附被认为是异位病灶形成的第一步,有研究表明转化生长因子-β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）、粘附分子整合素Integrins家族在内异症粘连中发挥重要作用,但起关键作用的Integrins并未被阐明,HIF-1α、TGF-β1与内异症细胞异位粘附的具体关系也尚无报道。内异症细胞异位粘附之后仍然长期受到缺氧的应激,其在子宫腔外氧化应激环境下持续存活、复制的机制还不明确。Micro RNA-210（miR-210）是缺氧处理后上调最为显着的HIF-1α相关micro RNA,miR-210常通过其靶基因参与细胞周期进展、氧化应激（oxidative stress,OS）下的细胞分裂增殖、DNA损伤修复、血管新成及能量代谢转换等多项生物学过程,被认为是缺氧标志性的micro RNA。现有文献表明内异症异位病灶存在过度氧化应激,但异位病灶氧化/抗氧化失衡的机制不明。我们在前期缺氧促进子宫内膜间质细胞（ESCs）异位粘附的研究中发现长期慢性缺氧会导致子宫内膜间质细胞及上皮细胞发生DNA损伤,同时发现缺氧相关miR-210-3p在异位病灶的子宫内膜间质细胞和上皮细胞中表达均升高。目前,内异症细胞在异位粘附之后克服氧化应激压力持续存活、异常分裂增殖的机制尚不明确。我们应用Target Scan,RNA-hybrid和miRanda数据库预测到BARD1是miR-210-3p的靶基因。BARD1（BRCA1 associated RING domain 1,BRCA1相关环结构域）通过指环区与BRCA1相连形成异二聚体复合物,在细胞中发挥DNA损伤修复和激活细胞周期检测点的功能,且BARD1蛋白已被证明决定了BRCA1蛋白的稳定性及BRCA1/BARD1异二聚体复合物在细胞周期调控、DNA损伤应答、癌症进展中的功能,但目前尚无miR-210-3p及其靶基因参与内异症发病的报道。本研究基于经血逆流-种植学说,探讨了缺氧在内异位症发病三部曲之——异位粘附、异常增殖中的作用,证明了缺氧不但能够通过激活TGF-β1/p-Smad2/p-Smad3/Smad4/Integrins信号通路增加子宫内膜间质细胞的异位粘附能力,启动内异症的发生;缺氧上调的miR-210-3p还能通过靶向抑制BARD1的表达,促进BRCA1蛋白的降解,使BRCA1/BARD1蛋白复合物无法发挥正常的DNA损伤应答及细胞周期检测点功能,内异症细胞逃逸氧化应激损伤、细胞周期持续进展、细胞在宫腔外不断复制增殖,从而促进内异症的发展。本研究旨在阐明缺氧及其相关分子（HIF-1α、miR-210-3p等）在内异症异位病灶形成、生长中的具体作用机制及寻找内异症治疗的潜在靶点。目的:明确在内异症异位病灶形成中起关键作用的Integrins及其与缺氧的关系。方法:（1）收集15例非内异症患者的正常增生期子宫内膜,15例行宫腹联合手术的内异症患者的异位病灶和同期的在位子宫内膜,通过免疫组织化学（immunohistochemistry assay,IHC）分析标本中HIF-1α及Integrins的表达情况;（2）收集13例月经周期的增生期行宫腔镜手术的内异症患者的在位子宫内膜,提取内异症在位子宫内膜间质细胞（eutopic endometrial stromal cells,ESCs）,建立稳定的内异症原代间质细胞提取、纯化、鉴定、编号及培养体系;（3）对新鲜提取的13例ESCs（编号为:ESC-1、ESC-2、ESC-3、ESC-4、ESC-5、ESC-6、ESC-7、ESC-8、ESC-9、ESC-10、ESC-11、ESC-12、ESC-13）进行常氧（21%O2）、缺氧（1%O2）处理及细胞粘附能力、迁移能力分析;（4）提取缺氧处理0、48小时后的ESCs的m RNA和蛋白进行实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR,RT-q PCR）及免疫印迹分析（western blot,WB）,检测缺氧对HIF-1α及Integrins表达的影响。结果:（1）IHC结果表明:与正常增生期子宫内膜相比,内异症患者异位病灶及配对的增生期在位子宫内膜的上皮细胞、间质细胞中均异常高表达HIF-1α,但仅间质细胞中特异性高表达整合素家族中的Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5;（2）功能实验表明:缺氧培养显着提高ESCs的粘附能力、迁移能力;（3）缺氧培养增加ESCs中HIF-1α、Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的m RNA和蛋白表达。结论:HIF-1α在内异症异位病灶的间质细胞和上皮细胞中表达升高,且异位病灶间质细胞上Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的特异性高表达参与了ESCs的异位粘附和异位病灶的形成,缺氧培养可能通过上调整合素的表达促进ESCs的粘附能力,但缺氧上调Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的具体机制不明。目的:探索缺氧促进ESCs异位粘附的具体机制及小鼠内异症模型的异位病灶形成初期HIF-1α、TGF-β1及Integrins的表达情况。方法:（1）IHC检测内异症患者异位病灶及在位内膜中TGF-β1、TGF-β受体2（TGF-βreceptor II）的表达情况;（2）酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测缺氧培养后13种ESCs细胞上清液中TGF-β1的表达情况;（3）常氧培养时添加TGF-β1、缺氧培养下添加TGF-β1特异性抑制剂（SB431542）,利用粘附实验、Transwell迁移实验检测TGF-β1对ESCs粘附能力、迁移能力的影响;（4）RT-q PCR,WB,免疫荧光（Immunofluorescence assay,IF）检测经典的TGF-β1/p-Smad2/p-Smad3/Smad4信号通路激活情况;（5）SB431542预处理、HIF-1α的特异性RNA干扰病毒感染细胞后,通过RT-q PCR,WB检验HIF-1α在TGF-β1/Smads信号通路激活及整合素表达上调中的作用;（6）通过将内异症患者增生期的在位子宫内膜组织植入8周龄的雌性C57BL/6小鼠腹腔,构建11只小鼠内异症模型,在植入0、48小时后取出病灶并通过IHC检测异位病灶中HIF-1α、TGF-β1、Integrin-α5、Integrin-αV、Integrin-β3和Integrin-β5的表达情况。结果:（1）IHC结果表明:TGF-β1及TGF-βreceptor II在内异症患者异位病灶间质细胞中显着高表达;（2）缺氧培养显着增加ESCs中TGF-β1蛋白的分泌;（3）IF结果表明:缺氧培养ESCs促进p-Smad2由细胞浆进入细胞核,且缺氧处理后4小时、8小时,p-Smad2蛋白在核内表达明显升高;（4）WB结果显示:缺氧培养下p-Smad2,p-Smad3,Smad4及整合素Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的蛋白表达均增加;（5）TGF-β1特异性抑制剂SB431542有效抑制Smads信号通路的激活,且显着降低缺氧上调的整合素水平;敲降HIF-1α显着抑制缺氧培养下TGF-β1的分泌、Smads信号通路的激活及整合素表达的上调;（5）动物实验的IHC结果表明,异位病灶形成初期（内膜植入48小时）,子宫内膜间质细胞中HIF-1α、TGF-β1及Integrins的表达均增加,与体外实验结果一致。结论:缺氧刺激ESCs分泌TGF-β1,TGF-β1与TGF-βreceptor II结合后磷酸化Smad2、Smad3,增加p-Smad2入核,激活p-Smad2/p-Smad3/Smad4信号通路,进而增加下游整合素Integrin-α5,Integrin-αV,Integrin-β3和Integrin-β5的表达及ESCs的粘附能力,且此过程依赖于HIF-1α。目的:评估缺氧环境对内异症细胞DNA的影响,明确缺氧标志性miRNA-210-3p在内异症患者异位病灶中的定位和表达情况。方法:（1）收集27例非内异症患者来源的正常增生期子宫内膜、57例配对的内异症异位病灶和同期在位子宫内膜,IHC检测组织中HIF-1α和氧化应激诱导的DNA损伤标志蛋白8-OHd G的表达情况;（2）对新鲜提取的另外5例原代ESCs（编号为ESC-14、ESC-15、ESC-16、ESC-17、ESC-18）及购买的人子宫内膜腺癌上皮细胞系Ishikawa进行缺氧培养,利用单细胞凝胶电泳实验（碱性彗星实验）检测缺氧处理0天、28天后ESCs和Ishikawa的DNA双链损伤情况;（3）对缺氧处理后的原代ESCs进行高通量测序,筛选出显着变化的micro RNAs并进行RT-q PCR验证;（4）通过荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridisation analysis,FISH）和免疫荧光双染色检测5例正常增生期子宫内膜组织、5例配对的异位病灶、在位内膜组织,明确miR-210-3p在异位病灶中的定位情况;再通过RT-q PCR对15例正常增生期子宫内膜组织,15例配对的异位病灶、在位内膜组织中miR-210-3p的表达情况进行定量分析。结果:（1）IHC结果表明:与正常子宫内膜相比,内异症患者异位病灶及配对在位子宫内膜的上皮细胞及间质细胞中均异常高表达8-OHd G,且趋势与HIF-1α的表达情况一致,提示内异症细胞存在DNA损伤,且缺氧可能参与了该过程;（2）碱性彗星实验结果显示:缺氧培养28天显着增加彗星的尾长（Tail length）、彗星尾部荧光强度（Tail DNA%）及彗星尾矩（Tail olive moment）,说明慢性缺氧诱发了ESCs和Ishikawa的DNA损伤;（3）高通量测序及组织RT-q PCR结果表明:缺氧培养显着上调ESCs和Ishikawa中miR-210-3p的表达水平,且内异症患者异位病灶组织中miR-210-3p的表达也显着高于在位内膜和正常子宫内膜;（4）FISH及免疫荧光双染色结果显示:异位病灶中高表达的miR-210-3p定位于子宫内膜的间质细胞和上皮细胞。结论:慢性缺氧是诱发内异症细胞氧化应激性DNA损伤的原因之一,但内异症细胞逃逸氧化应激压力,持续在宫腔外存活、增殖的机制不明,异位病灶间质细胞和上皮细胞中显着高表达的miR-210-3p可能通过表观遗传调控参与了该过程,但是具体机制有待探究。目的:探索缺氧上调的miR-210-3p在内异症细胞逃逸氧化应激性DNA损伤及异位存活、增殖中的作用及具体分子机制。方法:（1）在常氧、缺氧培养下,利用慢病毒特异性敲除miR-210-3p,并对ESCs和Ishikawa进行细胞增殖实验、流式细胞检测（Flow cytometric analysis,FCM）及WB,分析miR-210-3p在常氧、缺氧环境下对细胞增殖及细胞周期分布的影响;（2）为减少原代ESCs带来的个体差异,先对商品化的人子宫内膜异位症在位子宫内膜永生化间质细胞系h EM15A进行miR-210-3p的过表达,然后进行高通量测序、生物信息学分析及双荧光素酶报告基因分析（Luciferase assays）以寻找miR-210-3p参与的主要生物学过程和miR-210-3p的靶基因;（3）利用RT-q PCR、WB等技术验证靶基因BARD1及其下游效应蛋白BRCA1在过表达、敲降miR-210-3p的ESCs及Ishikawa中的表达情况;（4）对第三部分中验证miR-210-3p表达情况的15例正常增生期子宫内膜、15份配对的异位病灶组织和同期在位子宫内膜进行RT-q PCR分析,并对15份异位病灶组织中miR-210-3p和BARD1 m RNA的表达水平进行相关性分析;（5）IHC检测27例正常增生期子宫内膜、57对配对的异位病灶组织和同期在位子宫内膜中BARD1和BRCA1的表达情况;（6）常氧、缺氧培养下敲降miR-210-3p或过表达BARD1,利用WB分析下游功能分子BRCA1、p-BRCA1、p53,p21,Cyclin B1及Cdc2的表达情况,并利用流式细胞术分析缺氧条件下miR-210-3p、BARD1对细胞周期分布的影响。结果:（1）缺氧培养下敲降miR-210-3p导致ESCs和Ishikawa发生细胞周期的G2/M期阻滞,且使缺氧上调的Cyclin B1、Cdc2蛋白及缺氧下调的p53、p21蛋白水平得到恢复,但常氧培养下敲降miR-210-3p对细胞周期分布、细胞周期调节蛋白无影响;（2）高通量测序、生物信息学及荧光素酶报告基因分析显示:过表达miR-210-3p影响h EM15A的细胞周期调控过程,如有丝分裂、染色体定位、细胞分裂、微管运动、纺锤体和着丝点微管组装等;软件预测和Luciferase assays结果证明miR-210-3p通过直接结合BARD1的3’-UTR区域靶向抑制BARD1的表达;（3）RT-q PCR及WB结果表明:过表达miR-210-3p下调ESCs及Ishikawa中BARD1的m RNA表达,干扰miR-210-3p则增加BARD1的m RNA表达,且过表达和敲降miR-210-3p后BARD1、BRCA1在蛋白水平上表现出与BARD1 m RNA一样的变化趋势;（4）IHC结果表明:异位病灶、在位内膜的间质细胞及上皮细胞中BARD1的表达均显着低于其在正常增生期子宫内膜中的表达;RT-q PCR结果显示异位病灶组织BARD1的m RNA表达与组织中miR-210-3p的表达显着负相关;（5）WB和功能实验结果表明:缺氧抑制的BRCA1蛋白表达能被miR-210-3p的干扰病毒逆转,BARD1过表达则能逆转BRCA1蛋白在miR-210-3p过表达的ESCs和Ishikawa细胞中的表达下降,且缺氧条件下过表达BARD1导致G2/M期阻滞,BRCA1、p-BRCA1、p53、p21表达升高,Cyclin B1、Cdc2蛋白表达下降。结论:缺氧虽诱发内异症细胞的DNA损伤,但缺氧上调的miR-210-3p又能通过靶向抑制BARD1的表达,促进BRCA1蛋白的泛素化降解,扰乱DNA损伤修复复合物BRCA1/BARD1发挥正常的细胞周期检测点功能,使细胞周期不阻滞,内异症细胞逃逸氧化应激压力而持续在宫腔外生长、增殖。目的:利用小鼠内异症模型研究miR-210-3p抑制剂、抗氧化剂维生素C（Vitamin C）在体内对异位囊肿生长的作用。方法:（1）构建50只C57BL/6小鼠子宫内膜异位症模型:每天根据体重用200ug/kg雌激素处理供体鼠7天,将供体鼠双侧子宫沿其最长轴切开,并剪成0.5×0.3cm大小,然后将子宫内膜面贴紧肠系膜缝入去势后的8周龄受体C57BL/6小鼠腹腔,术后隔天给予200ug/kg雌激素维持,直至4周后实验结束;（2）随机选取16只内异症小鼠,均分为两组,利用体内传送系统（in vivo-jet PEI?delivery agent）将对照组试剂（Negative control,NC）、miR-210-3p抑制剂（In-210）注射入小鼠腹腔,4周后取出异位病灶,测量病灶体积,IHC分析BARD1、BRCA1在异位病灶的间质细胞和上皮细胞中的表达情况;（3）剩余33只内异症小鼠随机分三组,每组11只,PBS组正常饲养,隔日腹腔注射等体积PBS（约100u L）,口服维生素C组（OIVC组）将饮用水更换为2.5g/L维生素C水溶液,维生素C注射组（IPIVC组）根据小鼠体重隔天腹腔注射500mg/kg维生素C并正常给予饮水和食物;4周后取出异位病灶,测量病灶体积;IHC分析HIF-1α、8-OHd G、BARD1及BRCA1表达情况。结果:（1）同种异体移植法能有效构建小鼠子宫内膜异位症模型,成功率为49/50,且异位病灶可见典型的子宫内膜间质细胞和上皮细胞;（2）利用in vivo-jet PEI?delivery agent体内敲降miR-210-3p显着缩小内异症模型中异位病灶的体积,且增加BARD1、BRCA1蛋白在异位病灶间质细胞和上皮细胞中的表达;（3）抗氧化剂Vitamin C口服、腹腔给药均能抑制小鼠内异症模型异位病灶的生长,IHC结果显示腹腔注射Vitamin C显着抑制异位病灶间质细胞和上皮细胞中HIF-1α、8-OHd G蛋白的表达,增加间质细胞和上皮细胞中BARD1、BRCA1蛋白表达。结论:体内敲降miR-210-3p可能通过上调内异症细胞中BARD1蛋白表达,引起BRCA1蛋白的累积,激活DNA的损伤修复,从而抑制内异症细胞周期进展和异位病灶的生长;而抗氧化剂Vitamin C腹腔注射不仅增加BARD1、BRCA1蛋白表达,也有效抑制异位病灶中HIF-1α及8-OHd G的表达,提示维生素C可能通过减轻异位病灶整体的氧化应激水平,恢复氧化/抗氧化平衡,抑制异位病灶的生长,抗氧化剂为内异症的临床辅助治疗提供了新的思路。
刘阳[4]（2020）在《LncRNA MEG3-210在子宫内膜异位症中的作用及相关机制研究》文中指出子宫内膜异位症（Endometriosis,内异症）是指子宫内膜样组织出现在子宫腔及肌层以外的部位,引起不孕、痛经、性交痛等症状,严重影响女性生活质量。其在育龄期妇女中的发病率高且易复发,给社会医疗体系造成巨大负担。尽管内异症的研究持续数十年,但是它的具体发病机制尚不明了。目前的主流学说有“经血逆流学说”、“体腔上皮化生学说”、“免疫学说”等,其中“经血逆流学说”备受推崇,然而任何一种学说都不能完美的解释所有类型的内异症。在“经血逆流学说”的基础上,由国内学者郎景和教授提出的“在位内膜决定论”指出子宫内膜本身的生物学特性决定了内异症的发生。随着测序和组学的发展,越来越多的结果表明内异症患者的在位内膜和正常子宫内膜之间在表观遗传学、RNA水平、蛋白水平上有着明显差异,而这些差异可能造成了子宫内膜细胞功能的不同。如何通过机制的研究,找到对内异症诊断、治疗的新方法是当下研究的热点。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是指长度超过200个碱基且不具有蛋白质编码功能的RNA。Lnc RNA可以通过和DNA、RNA、蛋白质的相互作用从转录、翻译和翻译后修饰等层面调控多种重要生理过程。母系表达基因3（maternally expressed gene 3,MEG3）被认为是“抑癌分子”广泛表达于多种正常组织、细胞中,它的表达降低或者缺失可以促进肿瘤的发生和进展。MEG3具有多个转录本,有研究指出不同转录本之间的功能活性有所差异,因此有必要选择一种或者一类转录本进行细致且深入的探索分析。目前尚未见MEG3在内异症中的相关报道,而我们的前期测序结果表明MEG3-210作为MEG3的一个转录本,在内异症患者的在位内膜中表达降低,提示MEG3-210可能与内异症的发生发展相关。半乳糖凝集素-1（Galectin-1）通过糖识别结构域结合β-半乳糖蛋白残基,参与细胞的增殖、迁移、凋亡等。Galectin-1在内异症患者的在位内膜和异位内膜组织中表达增加,且在小鼠内异模型中阻断Galectin-1作用可以缩小病灶并抑制血管生成。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPK）通路是介导细胞外信号向细胞内传递的重要信号转导通路。3ˊ,5ˊ-环腺苷酸（3’,5’-cyclic adenosine,c AMP）依赖性的蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）是连接钙离子信号通路和c AMP信号通路的中心分子。肌浆网/内质网钙ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2,SERCA2)通过将细胞内Ca2+泵向肌浆网中,控制胞内Ca2+浓度,维持细胞内钙平衡。MEG3-210在内异症中的调控机制尚不可知,通过对其调控关系的研究可能有助于探索疾病的发病机制。本研究通过对前期测序数据的再分析,确定MEG3-210在内异症的表达差异,通过对MEG3-210沉默和过表达后检测子宫内膜间质细胞（ESCs）的功能变化探索其对内异症发生发展的作用,而后通过生物信息学分析和分子机制相关实验发现Galectin-1和p38 MAPK及PKA/SERCA2信号通路参与了MEG3-210对ESCs的功能调控,根据通路间的交互作用绘制MEG3-210在内异症中的调控网络图,为内异症的新型诊断和治疗提供分子基础。第一部分MEG3-210在内膜间质细胞中的作用目的:研究MEG3-210在内异症患者和非内异症患者在位内膜组织和间质细胞中的表达水平差异;探索MEG3-210对内膜间质细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法:对5对内异症患者和非内异症患者的子宫内膜组织二代测序结果进行再分析;收集内异症患者在位内膜40例（EU,n=40）,非内异症患者子宫内膜39例（NE,n=39）,分离培养在位内膜间质细胞19例（Eu ESCs,n=19）,对照内膜间质细胞18例（Ne ESCs,n=18）,并进行间质细胞鉴定。q RT-PCR检测MEG3-210在组织和细胞中的表达水平。在Ne ESCs中转染MEG3-210 si RNA来抑制MEG3-210表达,在Eu ESCs中转染MEG3-210过表达质粒来促进MEG3-210表达,采用CCK-8、transwell、流式细胞术检测细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。结果:1.内异症患者和非内异患者的子宫内膜组织测序共鉴定出26种MEG3转录本,仅MEG3-210和MEG3-202转录本在两组间的差异具有统计学意义。2.MEG3-210在内异症患者的在位内膜组织和间质细胞中表达水平降低3.MEG3-210表达下调后,Ne ESCs迁移、侵袭能力增强,而凋亡减弱,增殖能力无明显影响。4.MEG3-210表达上调后,Eu ESCs迁移、侵袭能力减弱,凋亡增加,增殖能力无明显影响。结论:1.组织验证结果和测序结果一致,测序结果可靠。2.MEG3-210可调控ESCs迁移、侵袭和凋亡,而对增殖无明显作用。3.MEG3-210下调可促进内异症的发生发展第二部分MEG3-210通过p38 MAPK和PKA/SERCA2信号通路调控ESCs迁移、侵袭和凋亡目的:探索参与MEG3-210对子宫内膜间质细胞调控的信号通路。方法:利用生物信息学分析提取与MEG3共表达的基因列表并对其进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。Western blot验证目标信号通路中相关分子的蛋白水平变化。拯救实验确定该通路参与MEG3-210对ESCs功能的调控。结果:1.根据生信分析结果,与MEG3存在共表达关系的基因可富集出26条主要的信号通路,其中环磷酸腺苷（c AMP）、钙离子和MAPK三条信号通路上富集的基因数最多。2.MEG3-210下调后,p38、ATF2磷酸化水平升高,Bcl-2和MMP2蛋白水平升高,PKA、SERCA2蛋白水平下降。3.联合MEG3-210 si RNA处理,p38 MAPK信号抑制剂SB203580加入后Ne ESCs迁移、侵袭能力部分减弱,凋亡能力恢复。4.联合MEG3-210 si RNA处理,SERCA2过表达后,Ne ESCs迁移、侵袭和抗凋亡能力的均明显抑制。5.联合MEG3-210过表达质粒处理,SERCA2下调后,Eu ESCs的迁移、侵袭能力增强,而细胞凋亡减少。6.SERCA2下调后,p38和ATF2磷酸化水平升高,SB203580加入后,SERCA2蛋白水平下降。结论:1.MEG3-210下调可激活p38 MAPK信号通路并抑制PKA/SERCA2信号。2.p38 MAPK通路的激活和PKA/SERCA2信号的抑制可部分解释MEG3-210下调对ESCs迁移、侵袭和凋亡能力的调控。3.p38 MAPK和PKA/SERCA两条信号通路之间存在交互作用,协同促进内异症的发生发展。第三部分Galectin-1介导MEG3-210对ESCs的作用和机制研究目的:探索与MEG3-210结合的蛋白,以及MEG3-210在内异症中的调控机制方法:构建MEG3-210 RNA探针,通过RNA-pull down质谱分析、RIP、共定位等实验确定Galectin-1与MEG3-210的结合关系。通过western blot确定Galectin-1对p38 MAPK和PKA/SERCA2信号的调控。通过western blot和ELISA检测Galectin-1的表达水平。利用Galectin-1过表达质粒和MEG3-210 si RNA联合转染Ne ESCs后,采用transwell、流式细胞术检测细胞的迁移、侵袭和凋亡。结果:1.RNA-pull down联合质谱分析鉴定出与MEG3-210存在潜在结合的蛋白质。2.MEG3-210探针结合MEG3同时可捕获Galectin-1;Galectin-1抗体沉淀Galectin-1同时可捕获MEG3-210。3.MEG3-210和Galectin-1在ESCs中分布一致。4.Galectin-1过表达后p38磷酸化水平升高,PKA和SERCA2蛋白水平下降。5.Galectin-1在内异症患者的在位内膜组织、间质细胞和血清中表达水平升高。6.Galectin-1下调后,Ne ESCs迁移、侵袭能力下降,凋亡增加。结论:1.MEG3-210与Galectin-1之间存在结合互作关系。2.Galectin-1介导了MEG3-210对ESCs迁移、侵袭和凋亡的调控。3.Galectin-1过表达可激活p38 MAPK信号通路并抑制PKA/SERCA2信号。4.Galectin-1可与其他指标联合用于内异症血清学诊断模型。第四部分MEG3-210和Galectin-1在内异症在体模型中的作用目的:建立内异症动物模型,探索MEG3-210和Galectin-1对在体病灶的作用。方法:利用人源子宫内膜组织和裸鼠构建裸鼠腹腔内异病灶和皮下内异病灶模型,评价病灶的活力,病理检查病灶组织结构。构建sh-MEG3-210腺病毒颗粒,转染组织后观察MEG3-210下调后对在体病灶的作用。活体注射Galectin-1 si RNA,观察Galectin-1下调后对病灶的作用。免疫组化检测病灶中Galectin-1表达水平。结果:1.人源子宫内膜组织可成功构建裸鼠腹腔内异病灶和皮下病灶,但是皮下病灶活性较好。2.腺病毒sh-MEG3-210处理组中的裸鼠病灶体积增加。3.Galectin-1 si RNA联合sh-MEG3-210处理组中的裸鼠病灶体积较sh-MEG3-210处理组中的明显缩小。结论:1.腺病毒能有效地转染子宫内膜组织。2.MEG3-210下调可促进裸鼠皮下内异病灶的生长。3.抑制Galectin-1表达可缩小由MEG3-210下调引起的病灶体积增加。
范为之[5]（2017）在《加味芍药甘草汤对子宫腺肌病裸鼠miR-27a调控的P53/EGFR/STAT3通路的干预机制》文中认为背景:子宫腺肌病（adenomyosis,AM）是子宫内膜腺体和间质侵入到子宫肌层内定植并增生而形成的一种雌激素依赖性疾病,近年来其发病率呈不断上升趋势,已成为妇科常见疑难病。渐进性痛经、不孕为其最主要的临床表现,痛经发生率高达77.8%,严重影响患者生活、工作等。根治疗法目前仅有全子宫切除术,但不易被患者所接受,尤其是年轻且有生育要求的患者;西医药物治疗副作用大,服药期间不能孕育,停药后痛经等症状容易复发,因此寻求一种有效疗法迫在眉睫,而中医药在缓解或消除痛经症状、提高患者生存质量和生育能力、副作用小、远期疗效稳定等方面显示了独特的优势。多年来,众多学者和专家探索运用中医药治疗子宫腺肌病,在理论创建和临床实践方面多有建树,为后来的研究者提供了良好的基础。目的:1.建立人来源型子宫腺肌病裸鼠模型,为深入研究子宫腺肌病发病机制、病理特点以及探索有效的治疗方案提供理想的动物模型。2.本课题拟通过动物实验观察加味芍药甘草汤影响下miR-27a对裸鼠病灶组织中P53/EGFR/STAT3信号通路相关因子的调控作用,以期阐明加味芍药甘草汤治疗子宫腺肌病的深层作用机理,对深入了解子宫腺肌病的病因病理,指导临床辨证用药,为子宫腺肌病新药研发提供科学依据。研究方法:1.采用腹腔移植法建立人来源性子宫腺肌病裸鼠模型,并运用HE染色及免疫组织化学法检测波形蛋白及角蛋白鉴定造模结果。2.运用人来源性子宫腺肌病裸鼠模型,建立手术对照组模型作为对照。将实验裸鼠随机分为手术对照组、模型组、米非司酮组、加味芍药甘草汤高剂量组、加味芍药甘草汤中剂量组、加味芍药甘草汤低剂量组分别用药干预,3周后取材。3.测量各组裸鼠病灶组织最大直径（L）及最大横径（W）,计算病灶体积（V）,V=L×W2/2,比较各组体积差异;4.采用免疫组化法检测各组裸鼠病灶组织p53蛋白表达差异;5.采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组裸鼠病灶组织p53-273H、c-Src、LIF、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、C0X-2 的表达差异;6.采用RT-qPCR技术检测各组裸鼠病灶组织p53-273HmRNA、miR-27a、EGFR mRNA、LIFR mRNA的表达差异。结果:1.使用腹腔种植法建立人来源性子宫腺肌病裸鼠模型外观、体积、组织病理学以及波形蛋白、角蛋白的表达情况,均符合子宫腺肌病的特征,可以认为人来源性子宫腺肌病裸鼠模型建立成功。2.各组间的裸鼠腹腔内移植组织体积的比较,差异有统计学意义（P<0.05）。模型组裸鼠的腹腔内移植组织体积较其余各组大（P<0.05）;米非司酮组与加味芍药甘草汤各剂量组之间均无明显统计学意义（P＞0.05）。3.采用免疫组织化学法检测加味芍药甘草汤对各组间的裸鼠腹腔内移植组织中P53蛋白的表达的影响,差异有统计学意义（P＜0.01）,手术对照组裸鼠移植组织内P53表达量低于其余各组（P<0.01）;模型组裸鼠移植组织内P53表达高于其余各组（P<0.05）。4.采用Western Blot法检测各组间的裸鼠腹腔内移植组织中p53-273H、c-Src、LIF、EGFR、p-EGFR、STAT3、p-STAT3、C0X-2蛋白的表达量,均有统计学意义。模型组中P53-273H蛋白表达量高于其余各组（P＜0.05）。模型组中LIF表达较其余各组高（P＜0.05）;手术对照组中EGFR表达较其余各组低（P＜0.05）;模型组中P-EGFR高于其余各组（P＜ 0.05）;模型组中c-Src表达量高于其余各用药组（P＜0.05）,手术对照组中P-STAT3表达较其余各用药组低（P＜0.05）。P53-273H、c-Src、STAT3、P-STAT3蛋白米非司酮组及加味芍药甘草汤各剂量组之间无明显统计学差异（P＞0.05）。5.RT-qPCR法检测各组间的裸鼠腹腔内移植组织中p53-273HmRNA、miR-27a、EGFR mRNA、LIFRmRNA的相对表达量,差异均有统计学意义（P＜0.05）。米非司酮组中miR-27amRNA的相对表达量最高,差异有统计学意义（P＜0.05）。加味芍药甘草汤高剂量组及加味芍药甘草汤中剂量组的EGFR mRNA表达量低于模型组（P＜ 0.05）。加味芍药甘草汤低剂量组中P53-273HmRNA的相对表达量较米非司酮组低（P＜0.05）,模型组中P53-273H mRNA的相对表达量高于其它各组（P＜0.05）。模型组中LIFR表达较其余各用药组高（P<0.05）。6.通过mmiR-27a对P53/EGFR/STAT3信号通路的调控作用机制相关性分析,P53-273H基因与miR-27a中度负相关,miR-27a与其他基因都呈轻度负相关,而P53-273H与其他基因都轻度相关。结论:1.腹腔种植法建立人来源性子宫腺肌病裸鼠模型,该造模方法稳定性良好,可重复性高,且能够模拟子宫腺肌病病灶在腹腔内自然生长过程以及腹腔微环境的变化,是一种提高子宫腺肌病建模成功率、符合人体机制的新方法,能够为探索子宫腺肌病病理生理机制以及治疗方法提供理想的动物模型。2.加味芍药甘草汤能够有效缩小人来源型子宫腺肌病裸鼠模型腹腔内病灶组织的体积,并且降低病灶组织内P53、EGFR、P-EGRG、STAT3、P-STAT3、C0X-2蛋白的表达,能够抑制子宫腺肌病细胞的增殖,减少病灶组织内血管的新生。因此,临床运用加味芍药甘草汤治疗子宫腺肌病可以限制或延缓子宫腺肌病的发展和侵袭。3.加味芍药甘草汤各剂量组对于miR-27a均有上调作用,对P53/EGFR/STAT3通路中各基因及蛋白均具有抑制作用。加味芍药甘草汤作为一个多靶点的复方汤剂,其复杂的药效机制对于多个基因及蛋白的表达均有影响,本研究为进一步研发加味芍药甘草汤提供了一定的理论基础和科学依据。
倪惠娟[6]（2016）在《Warburg效应标志物在改良子宫内膜异位症裸鼠模型中表达的探究》文中研究说明第一章人子宫内膜异位症裸鼠皮下模型的构建目的:改良人子宫内膜异位症裸鼠模型,分析皮下移植后切口缝合与否的建模效果。材料及方法:选取我院符合入选标准的病人的子宫内膜组织,并将内膜组织种植在符合标准的裸鼠皮下（裸鼠由浙江大学附属邵逸夫医院动物房提供）。18只裸鼠随机分为2组,一组皮下移植后皮肤不予缝合（a组）,另一组皮下移植后皮肤予缝合（b组）。收集两组模型的成功率（肿块体积=肿块长径×宽径×厚径>27mm3）、皮肤创面的炎症反应率（创面炎症率=炎症反应只数/该组总只数,排除死亡数）及累积存活率（累积存活率=建模期间存活只数/该组总只数）。分析对皮下组织块移植后切口两种不同处理后的建模效果。结果:（1）一般情况:a组均成活,b组1只死亡。a组伤口于术后第3d甲级愈合;b组伤口外缝线于2～4d自行脱落,甲级愈合。a组的7d组有1只未见病灶,b组1只种植后Id因腹胀死亡,b组的14d组有1只未见病灶。其余小鼠相对应时间病灶形成均无差异。大体观察:7d病灶皮肤呈单个球形约黄豆大小,切开后见清亮多囊小水泡样突起,淡粉红色,病灶周围包绕丰富新生血管;14d病灶转为单个大水泡样突起,粉色,周围血管较前略减少;21d病灶转为囊实性突起,灰白色,体积较14d时缩小。（2）HE染色:两组建模后1、2、3周均可见典型的腺体结构和间质组织结构,腺体呈增殖期改变,间质内见含铁血黄素。实验前留取的内膜组织行HE染色,常规病理提示子宫内膜呈增殖期改变。（3）病灶生长情况:a组建模后1周病灶累积成模率及裸鼠累积存活率分别为2/3、3/3,2周分别为3/3、3/3,3周分别为3/3、3/3。b组建模后1周病灶累积成模率及裸鼠累积存活率分别为2/3、2/3,2周分别为2/3、3/3,3周分别为3/3、3/3。统计两组总的成模率a组为8/9,b组为7/9,存活率a组为9/9,b组为8/9,差异无统计学意义。伤口愈合两组无明显差异。结论:（1）皮下移植是一种理想的方式,操作简便,对裸鼠创伤小,对内膜体外运输与储存要求较低,并更能精确地计算异位灶的大小,方便进行动态观察。（2）皮下不缝合组与缝合组在我们观察的三个指标均无统计学意义,但是不进行伤口缝合减少了实验步骤,缩短了操作时间,故在实验中值得推广。第二章 Warburg效应标志物在子宫内膜异位症动物模型中表达的探究目的:在体外实验中,Warburg效应（无氧糖酵解）被报道参与子宫内膜异位症的发生,但其是否也在体内实验（子宫内膜异位症动物模型）中发挥作用,目前并不明确。在改良的人子官内膜异位症裸鼠模型上,检测缺氧引起的糖代谢相关标志物的表达水平,证实子官内膜异位症发病初期存在Warburg效应的改变。材料及方法:选取我院临床14例符合入选标准的病人的子宫内膜组织,并建立改良的子官内膜异位症模型。将裸鼠内异症模型异位病灶行实时荧光定量核酸扩增检测系统（Quantitative Real-time PCR Detecting System,qRT-PCR）及免疫组织化学检查,比较DO（移植前）、D1、D7、D14的Warburg效应标志物包括缺氧诱导因子α（HIF1α）、血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运蛋白（GLUT1）、乳酸脱氢酶（LDHA）、丙酮酸脱氢酶激酶（PDK1）等的表达水平。结果:以人在位子宫内膜作为对照组织（实验初直接从女性获取的子官内膜组织,记为0d）,获取移植后1天、7天、14天的小鼠皮下子宫内膜异位组织作为研究组（分别记为1d、7d、14d）。通过qRT-PCR和免疫组化检测Warburg效应标志物水平变化。qRT-PCR结果显示HIF-1α、VEGF、GLUT1、LDHA和PDK1在组织移植后1天或7天的表达显着高于0天。在14天,大多数基因表达基本恢复到了 0天的水平。同时免疫组化结果显示,腺体及间质细胞的HIF-1α、VEGF、GLUT1、LDHA以及PDK1的蛋白表达水平在第1天和第7天也显着高于第0天的水平,而第14天表达也基本恢复至第0天的水平,与qRT-PCR结果一致。结论:我们的研究证实,在子宫内膜异位症动物模型中Warburg效应标志物在子宫内膜异位症的发生初期呈现先高表达后降低的规律,提示Warburg效应参与了内异症的发生。阐明内异症发病初期病灶内的代谢途径有利于为内异症的病因治疗提供理论依据。
赵采云[7]（2014）在《周细胞在子宫内膜异位症血管生成中作用的研究》文中认为目的：本实验通过测定子宫内膜异位症（EMs, endometriosis）患者异位、在位、正常内膜及不同时相的裸鼠异位病灶中周细胞数目（PN, Pericytes number）、微血管密度（MVD, microvessel density）以及PN/MVD：北值,研究探讨周细胞在EMs血管生成中的作用。方法：选取EMs患者异位内膜20例（异位组）、在位内膜40例（增殖期、分泌期各20例）（在位组）及非子宫内膜异位症患者子宫内膜40例（增殖期、分泌期各20例）（对照组）。利用异体移植方法建立40只裸鼠人EMs模型,并随机平均分为A组、B组、C组、D组,分别于建模后7天、14天、21天、28天时处死并获取异位病灶。观察裸鼠异位病灶肉眼及镜下组织学形态,并采用免疫组化法检测三组人子宫内膜及四组裸鼠异位病灶中PN、MVD的表达,并对二者的比值（PN/MVD）进行比较。结果：（1）裸鼠EMs模型成功率达100%；（2）人异位内膜MVD值高于正常内膜和在位内膜（P<0.05）,在位内膜无论增殖期还是分泌期与相应的正常内膜相比差异均无统计学意义,在位内膜及正常内膜组内比较均分泌期高于增殖期（P<0.05）；（3）人异位内膜PN值低于正常内膜和在位内膜（P<0.05）,在位内膜无论增殖期还是分泌期与相应的正常内膜相比差异均无统计学意义,在位内膜及正常内膜组内比较均增殖期高于分泌期（P<0.05）；（4）人异位内膜PN/MVD值低于正常内膜和在位内膜,在位内膜无论增殖期还是分泌期均低于相应的正常内膜（P<0.05）,在位内膜及正常内膜组内比较均增殖期高于分泌期（P<0.05）；（5）A组裸鼠开腹探查见异位病灶呈清亮水疱状,镜下可见点簇状新生血管形成,MVD=35.70±3.16, B组裸鼠开腹探查见异位病灶呈红色囊泡状,表面可见血管走形,镜下可见腺体增生,间质中血管生成明显,MVD=68.60±9.07, C组裸鼠开腹探查见异位病灶呈暗红色囊状或结节状,欠新鲜,镜下可见腺体丰富、呈增殖期子宫内膜表现,间质新生血管数目减少、血管壁结构完整,MVD=53.50±3.57, D组裸鼠开腹探查见异位病灶呈黄白色囊状或结节状、质稍硬,镜下可见腺体数目减少,部分腺体及间质纤维化,间质新生血管数目进一步减少,可见部分血管结构破坏；MVD=48.00+4.99；四组裸鼠异位病灶MVD值差异具有统计学意义（P<0.05）；（6）A-D组裸鼠异位病灶中PN与MVD的变化趋势平行,分别为（27.30+2.50）、（79.40±10.68）、（64.70±4.64）、（38.30±4.50）,差异均有统计学意义（P<0.05）；（7）A-C组裸鼠PN/MVD值呈上升趋势,在C组裸鼠异位病灶中达到峰值,D组裸鼠异位病灶中PN/MVD值同C组比较呈下降趋势,但仍高于A组裸鼠,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：（1）采用异体移植方法可在裸鼠体内较完整地复制人类子宫内膜异位症,可实现对EMs发展过程的动态观察及相关实验研究,方法可行、成功率高,所得结果具有参考价值；（2）四组裸鼠异位病灶中PN值随着病灶中血管的生长、消退发生相应的改变,与相应内膜中MVD值变化趋势相一致,提示周细胞在EMs血管生成中起着重要作用；（3）EMs患者异位内膜中PN/MVD值低于在位和正常内膜,C组裸鼠异位病灶中PN/MVD值达峰值,结合肉眼与镜下所见,提示EMs病灶中周细胞覆盖率与血管稳定性高度一致性；（4）EMs患者在位内膜无论增殖期还是分泌期中的PN/MVD值均低于相应的正常内膜,进一步佐证了“在位内膜决定论”,在位子宫内膜中周细胞覆盖率低可能是EMs发病的因素之一；（5）周细胞在EMs血管生成中的作用机制还有待进一步研究。
郭蕊萌[8]（2013）在《CD146在异位及在位子宫内膜中的表达及意义》文中提出目的：本研究取子宫内膜异位症（EMs, endometriosis）患者在位、异位内膜及子宫肌瘤患者正常子宫内膜,同时利用异体移植法将正常子宫内膜接种于裸鼠体内,建立裸鼠EMs模型。通过测定人在位、异位、正常内膜及裸鼠异位病灶中CD146表达情况及微血管密度（MVD, microvessel density）,探讨CD146在EMs发生、发展中的作用。方法：取EMs患者在位内膜（在位组）和异位内膜（异位组）各30例,在位组内膜中增殖期16例,分泌期14例；取子宫肌瘤患者子宫内膜30例（对照组）,其中增殖期13例,分泌期17例。利用异体移植方法将30只裸鼠接种对照组正常子宫内膜,建立EMs模型,并随机平均分为A组、B组、C组。A组、B组、C组裸鼠分别于建模后5天、10天、30天时处死并获取异位病灶。观察裸鼠异位病灶肉眼及镜下组织学形态。采用免疫组化法检测三组人子宫内膜及三组裸鼠异位病灶中CD146表达情况及MVD值。结果：（1）裸鼠EMs模型成功建立,成模率100%。（2）人在位组、异位组内膜中MVD值均高于对照组（P<0.05）,但在位组、异位组内膜之间相比无统计学差异（P>0.05）。（3）在位组分泌期内膜MVD值高于增殖期内膜（P<0.01）,而对照组内此差异无统计学意义（P>0.05）。（4）A组裸鼠开腹探查见接种组织粘于裸鼠组织表面,底部发红,镜下可见异位病灶周围有新生血管形成,MVD=6.90±0.98；B组裸鼠开腹探查见接种组织与裸鼠组织完全融合,呈红色囊泡状,镜下见腺体增生、数目增加、腺腔扩大,部分有乳头状增生,腺上皮呈柱状或立方形,异位病灶内部及周围可见血管生成明显,MVD=21.30±0.67；C组裸鼠开腹探查见异位病灶色白,不新鲜,镜下见子宫内膜腺体萎缩、数目减少、结构有破坏,间质新生血管数目减少,MVD=16.13±1.06；三组裸鼠异位病灶MVD值差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）人在位组、异位组内膜中CD146阳性率均高于对照组（P<0.05）,但在位组、异位组内膜之间相比无统计学差异（P>0.05）。（6）在位组分泌期内膜CD146阳性率高于增殖期内膜（P<0.01）,而对照组内此差异无统计学意义（P>0.05）。（7）A组、B组、C组裸鼠异位病灶中CD146阳性率分别为（9.88±1.12）%、（20.92±1.34）%、（16.18±1.27）%,差异具有统计学意义（P<0.05）。（8）三组人子宫内膜CD146阳性率分别与相应组别的MVD值呈正相关（rs=0.477、0.819、0.897,P<0.01）。（9）三组裸鼠异位病灶CD146阳性率分别与相应组别MVD值呈明显正相关（rs=0.929、0.711、0.903,P<0.05）。结论：采用异体移植方法将人子宫内膜接种于裸鼠体内,可实现对EMs发展过程的动态观察,并进行相关的实验研究,方法可靠,成功率高,所得实验结果具有参考价值。EMs患者在位及异位内膜CD146阳性率较正常子宫内膜明显增高；裸鼠异位病灶中CD146的表达情况随着病灶的生长、萎缩发生相应的改变；且无论是三组人子宫内膜中CD146阳性率,还是三组裸鼠异位病灶中CD146阳性率均与相应内膜中MVD值呈明显正相关,提示CD146的过表达通过影响血管形成进而促进EMs发生、发展。EMs患者在位分泌期内膜MVD值和CD146阳性率均高于增殖期内膜,而正常子宫内膜内却未表现出此差异,提示分泌期内膜CD146的过表达可能在EMs发生、进展中起了更重要的作用。CD146在EMs中的作用机制还有待进一步研究。
林敏[9]（2012）在《组织因子及蛋白酶激活受体2在子宫内膜异位症的表达及ENMD-1068治疗子宫内膜异位症的动物实验研究》文中进行了进一步梳理背景子宫内膜异位症（endometriosis, EMs）指具有生长功能的子宫内膜出现在宫腔被覆黏膜以外部位的一种疾病，主要表现为不孕及慢性盆腔疼痛，严重影响育龄妇女的生活质量。目前发病率呈上升趋势，约为6%10%，发病机制未明确。通常所使用的手术与药物结合的治疗方法效果不理想，2年复发率高达40%以上。因此，探索EMs更有效的治疗措施成为当今妇科及生殖研究的热点。研究发现，组织因子（Tissue Factor, TF）不仅启动凝血级联反应，而且通过激活下游受体蛋白酶激活受体-2（proteinase activated receptors, PAR-2）介导细胞信号传导，调节恶性肿瘤的血管、炎症微环境生成，促进恶性肿瘤的发生发展。而EMs具有类似恶性肿瘤的某些生物学特征，如血管生成、侵袭、局部远处转移等。近年来，研究发现EMs的异位、在位内膜中的TF蛋白及在位内膜的PAR-2蛋白表达显着升高。国外学者提出TF/PAR-2信号通路可能参与EMs的发病过程。PAR-2基因敲除鼠模型的研究也表明，该动物模型可明显抑制EMs的发展。由于TF/PAR-2信号通路在EMs上研究较少，研究TF及PAR-2在EMs中的表达及其与月经周期的关系如何，有助于进一步了解EMs的发病机制及寻找治疗EMs的新靶点。探索利用该靶点行特异性抗体靶向治疗EMs的可行性，为EMs的抗血管、炎症生成抗体治疗提供理论和实验研究。目的临床研究EMs异位、在位内膜中TF、PAR-2的表达及TF/PAR-2信号与月经周期的关系，探讨TF/PAR-2信号在EMs发病中的作用。构建及利用可视化EMs裸鼠荧光模型，探索PAR-2拮抗剂ENMD-1068治疗EMs的作用及其可能的机制，为发展靶向性、特异性的抗体治疗EMs提供理论和实验依据。（一）组织因子及蛋白酶激活受体2在子宫内膜异位症的表达及意义方法1.资料的收集及标本的获取选择2010年9月至2011年7月于广州医学院第三附属医院、南方医科大学珠江医院42例EMs腹腔镜手术治疗的患者，术中及术后病理证实为EMs，其中留取异位内膜40例及在位内膜20例；同期20例因单纯性卵巢囊肿行腹腔镜手术治疗的患者为对照组，留取其宫腔内膜组织。所有患者均排除子宫肌瘤、子宫腺肌病等雌激素相关性疾病，术前6个月未使用激素类药物及宫腔内放置节育器（如促性腺激素释放激素，口服避孕药等）。本研究经两院伦理委员会批准，所有内膜提供者均知情同意。2.检测各组内膜组织的TF、PAR-2表达利用免疫组化法检测各组内膜组织的TF蛋白、PAR-2蛋白表达，根据阳性率和表达强度进行量化评分（Hscore评分）；实时荧光定量PCR法检测TF mRNA及PAR-2mRNA表达水平。结果1. EMs异位、在位内膜TF、PAR-2的蛋白表达均主要位于腺上皮细胞的胞膜和胞浆中，少数病例见间质表达。与正常人子宫内膜组比较，异位、在位内膜组TF及PAR-2的总蛋白及总mRNA水平均显着升高（P<0.05）。异位内膜组TF、PAR-2的总蛋白及总mRNA表达与在位内膜组比较差异无统计学意义（P>0.05）。2.增殖期与分泌期中，异位内膜组TF、PAR-2的蛋白及mRNA的表达量和在位内膜组TF蛋白及mRNA的表达量均显着高于正常子宫内膜组（P<0.05）。分泌期中，在位内膜组PAR-2的蛋白及mRNA的表达量高于正常子宫内膜组（P<0.05），而其在增殖期的表达量与正常内膜组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。三组内膜TF、PAR-2的蛋白及mRNA在增殖期中的表达量与同组分泌期比较，统计无差异（P>0.05）。结论1. EMs异位、在位内膜TF及PAR-2的蛋白及mRNA的异常表达可能与EMs的发生发展有关，他们可能是研究分子靶向治疗EMs新的靶点。2.在位内膜分泌期中TF及PAR-2的异常表达提示在位内膜原发性功能异常，在位内膜异常的TF/PAR-2信号可能与EMs的发病有关，为我们进一步研究EMs发病机制提供新的理论依据。（二）ENMD-1068治疗子宫内膜异位症的动物实验研究方法1.子宫内膜组织标本的获取与内膜的准备收集2011年8月至2011年10月于广州医学院第三附属医院、南方医科大学珠江医院腹腔镜下18例EMs患者分泌期的在位内膜，纳入标准同上。无菌PBS漂洗后，培养皿内剪成1mm32mm3碎块。2.编码红色荧光蛋白慢病毒（LV-CMV-RFP）转染5个组织块置于48孔板的1个孔内，加入整合了增强型红色荧光蛋白的慢病毒颗粒（LV-CMV-RFP），终浓度为1×108PFU/mL，37℃、5%CO2培养箱环境下感染24h后将子宫内膜组织收集，PBS冲洗。3.荧光人EMs裸鼠模型制作与观察（1）选取68周龄BABL/C雌性裸鼠，随机腹腔内种植1012块LV-CMV-RFP的组织。种植后连续3天肌注苯甲酸雌二醇0.02mg/d促进内膜生长，青霉素1000U/d预防感染。810天后活体成像系统下拍照或开腹观察成瘤情况。（2）预实验9只：建模成功鼠建模术后第1012d（手术当天不算）予随机分3组：即NS组=生理盐水（NS）0.2ml/d；PAR-2拮抗剂ENMD-1068：E0.5组=ENMD-10680.5mg/d；E1.0组=ENMD-10681.0mg/d。药物腹腔注射后分别于第1，3，5d，NS组、E0.5及E1.0组各取1只小鼠予颈椎脱臼法处死，取出病灶。初步判断是否成瘤及疗效观察。预实验组每组3只，分笼饲养。（3）实验组25只（其中1只建模失败）：成模鼠24只，建模术后第1012d予随机分3组（手术当天不算），每组8只。每天腹腔注射药物剂量同预实验，即NS组=NS0.2ml/d×5d；E0.5组=ENMD-10680.5mg/d×5d；E1.0组=ENMD-10681.0mg/d×5d。每周称裸鼠体重。每天观察裸鼠进食、毛色、活动情况。4.在末次腹腔注射药物后第6d即内膜植入术后第1618d处死小鼠，测量异位病灶体积及无菌收集，立刻放入0.5ml无菌、无抗生素M199培养液（pH=7.4）中，置于37℃温箱培养2h，收集组织培养液，ELISA检测白介素（IL）-6，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）。5.免疫组化法检测血管内皮生长因子（VEGF）、核转录因子-kB（NF-kB）、Ki-67。6. TUNEL细胞凋亡检测。7. HE染色检测裸鼠重要脏器心、肝、脾、肺、肾、子宫及卵巢的形态学改变。结果1.成功构建人子宫内膜异位症可视化动物模型：（1）实验组腹腔种植鼠共25只：成模24只（96%）（即24只裸鼠，每只裸鼠通过活体成像系统观察或开腹探查病灶，病理证实异位子宫内膜），成活率100%。其中，建模第810d体外荧光探测见荧光病灶鼠12只（48%）（图2-2），无荧光鼠予开腹探测见肉眼病灶12只（48%），无荧光、无肉眼病灶鼠1只为建模失败（4%）。（2） NS组（图2-3A、B），E0.5组（图2-3D）各约13处病灶不等，分布于前腹膜、侧腹膜，脂肪（膀胱旁）、盆腔深部，少数见肠管表面生长（图2-3D）。移植内膜与裸鼠盆腹腔组织牢固粘附，隆起明显，血管网在黏附区域发育良好，病灶与其周旁组织呈融合状态，与肠管轻度粘连能够分离（图2-3C）。E1.0组异位病灶萎缩成近扁平的斑块状物或粗糙面痕迹，未见显着粘连（图2-3E）。（3）镜下观察E0.5（图2-4B）、E1.0组（图2-4C）较NS组（图2-4A）腺体数目减少，腺腔变窄，细胞稀疏呈萎缩状态，部分间质伴有不同程度的炎症及坏死。2.异位病灶体积比较：E0.5、E1.0组裸鼠的异位病灶平均体积较NS组显着降低（P<0.05），且体积改变呈剂量依赖性，E0.5与NS组，E1.0与NS组，E1.0与E0.5组的病灶体积比较有显着性意义（P<0.05）（图2-5）。3. ELISA检测： E0.5、 E1.0组裸鼠异位内膜组织培养液IL-6、MCP-1浓度（pg/mg/2h）较NS组显着降低（P<0.05）。 E1.0组异位内膜组织培养液IL-6的浓度（pg/mg/2h）较E0.5组降低（P<0.05）（图2-6）。4. E0.5、E1.0组异位内膜VEGF、NF-kB和Ki-67表达均明显低于NS组（图2-7，2-8）（P<0.05）。E1.0组异位内膜NF-kB和Ki-67的表达弱于E0.5组，差异有统计学意义（P<0.05）。5. TUNEL法检测细胞凋亡率：E0.5、E1.0组异位内膜细胞凋亡率较NS组显着升高，E1.0组异位内膜细胞凋亡率显着高于E0.5组（P<0.05）（图2-9，2-10）。6. ENMD-1068对全身重要脏器的影响：给药后第6天，对E0.5、E1.0组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、子宫及卵巢组织进行显微镜下观察，未见缺血、坏死和炎症反应改变（图2-11）。结论1.采用编码红色荧光蛋白的慢病毒（LV-CMV-RFP）转染人子宫内膜，采用腹腔种植法建立的EMs裸鼠模型具有可视化、无创损伤、模拟人类EMs的发病特点，为EMs治疗研究提供有效实验工具。2.采用PAR-2拮抗剂ENMD-1068明显抑制EMs裸鼠模型异位病灶的生长并诱导其凋亡而缩小病灶，且这种作用呈剂量依赖。下调VEGF、NF-kB、Ki-67的表达及抑制炎症介质IL-6，MCP-1的表达可能为ENMD-1068治疗EMs的分子机制之一。3. ENMD-1068对EMs裸鼠重要脏器如心、肝、脾、肺、肾及子宫、卵巢无影响，但其引起的过敏反应或毒性作用尚需进一步研究。PAR-2拮抗剂可能成为EMs抗体靶向治疗的新选择。
孙俊杰,尹利荣[10]（2012）在《子宫内膜异位症裸鼠模型的建立与血管生成研究进展》文中研究说明子宫内膜异位症（EMs）的发病机制和治疗一直是困扰妇科医师的难题。由于伦理学问题,不能直接在人体上进行实验研究,更不能反复地进行有创性检查监测疾病的进展,限制了EMs的研究。裸鼠模型是EMs理想的动物模型,能够准确地再现疾病的特点,并能反映疾病的发展变化,尤其在研究血管形成等因素在EMs中的作用和抗血管生成治疗的应用方面更具有价值。
二、裸鼠人子宫内膜异位症模型建立与病灶血管形成相关检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、裸鼠人子宫内膜异位症模型建立与病灶血管形成相关检测（论文提纲范文）
（1）补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠JAK2/STAT3信号通路相关因子的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药材 |
| 1.3 药品与试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 EM肾虚血瘀型大鼠模型制备 |
| 2.2 EM肾虚血瘀型大鼠模型评价标准 |
| 2.3 分组及给药 |
| 2.4 观察大鼠造模情况 |
| 2.5 观察大鼠一般情况 |
| 2.6 标本采集与处理 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 EM肾虚血瘀型模型大鼠造模情况 |
| 3.2 补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠一般情况的影响 |
| 3.3 补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠异位灶体积变化的影响 |
| 3.4 补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠在位、异位子宫内膜组织病理变化的影响 |
| 3.5 IHC法检测补肾温经汤对各组大鼠在位、异位内膜组织中JAK2,STAT3,p-STAT3蛋白表达的影响 |
| 3.6 ELISA法检测补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠血清中IL-10,IL-17含量的影响 |
| 3.7 补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠在位、异位内膜组织中Caspase-8,TNF-α蛋白及基因表达的影响 |
| 3.8 补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠在位、异位内膜组织中VEGF,TSP-1蛋白表达的影响 |
| 3.9 补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠在位、异位内膜组织中MMP-9,E-cadherin,N-cadherin蛋白及基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EM的发病机制 |
| 4.2 JAK2/STAT3信号通路 |
| 4.3 EM病理机制的探讨 |
| 4.4 补肾温经汤治疗 EM 肾虚血瘀型作用机制探讨 |
| 5 结论 |
| 6 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 子宫内膜异位症动物模型制备方法研究概括 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于Wnt通路的内异消抑制异体移植子宫内膜异位症的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| Abbreviation |
| 前言 |
| 第一章 荧光异体移植子宫内膜异位症模型的改进及内异消的治疗作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 小鼠性周期检测及异位病灶荧光强度与体积之间的关系 |
| 3.2 异位病灶的组织结构及ENDO-I蛋白的表达 |
| 3.3 内异消显着降低异位病灶的荧光强度 |
| 3.4 内异消显着减小异位病灶的体积 |
| 3.5 内异消改善异位组织结构的病理变化 |
| 3.6 内异消显着减少血清中E2和PROG的含量 |
| 4 小结 |
| 第二章 内异消抑制异位内膜侵袭转移及上皮间质转化的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 内异消显着抑制子宫内膜侵袭转移 |
| 3.2 内异消显着抑制子宫内膜上皮间质转化 |
| 4 小结 |
| 第三章 内异消调控异位内膜Wnt通路的作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 内异消调节Wnt通路相关基因的表达 |
| 3.2 内异消调控Wnt通路相关蛋白的表达 |
| 4 小结 |
| 第四章 内异消抑制子宫内膜异位症的网络药理学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 靶点的收集 |
| 2.2 网络的构建与分析 |
| 2.3 GO 及通路富集分析 |
| 2.4 分子对接 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 “内异消成分-靶点”网络的构建与分析 |
| 3.2 “内异消靶点-EMS靶点”网络的构建与分析 |
| 3.3 关键靶点的GO及通路富集分析 |
| 3.4 内异消成分与靶点的分子对接 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 创新点与意义 |
| 思考与展望 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间科研工作汇报 |
| 附图 |
（3）缺氧调控的细胞粘附和细胞周期在子宫内膜异位症发病中的作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 一、子宫内膜异位症 |
| 二、子宫内膜异位症与缺氧 |
| 三、子宫内膜异位症与整合素依赖的异位粘附 |
| 四、缺氧与整合素依赖的异位粘附 |
| 五、子宫内膜异位症与DNA损伤 |
| 六、miRNAs的概述 |
| 七、缺氧相关miR-210的概述 |
| 八、MiR-210-3p与子宫内膜异位症 |
| 第1章 HIF-1α和Integrins内异症中的表达及作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第2章 缺氧促进子宫内膜间质细胞ESCs粘附的机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 缺氧诱发内异症细胞DNA损伤并上调miR-210-3p的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 MiR-210-3p保护内异症细胞免受氧化应激损伤及促进其细胞周期进程的机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 体内敲降miR-210-3p、抗氧化剂维生素C对小鼠内异症模型异位病灶生长的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 缺氧在子宫内膜异位症发病机制中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得科研成果 |
（4）LncRNA MEG3-210在子宫内膜异位症中的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 MEG3-210在内膜间质细胞中的作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 参考文献 |
| 附表 1 子宫内膜捐献者临床信息总结 |
| 第二部分 MEG3-210 通过p38 MAPK和 PKA/SERCA2 信号通路调控ESCs |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 Galectin-1 介导MEG3-210对ESCs的作用和机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四部分 MEG3-210和Galectin-1 在内异症在体模型中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 4.6 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 长链非编码 RNA 在子宫内膜异位症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（5）加味芍药甘草汤对子宫腺肌病裸鼠miR-27a调控的P53/EGFR/STAT3通路的干预机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 现代医学对子宫腺肌病研究概况 |
| 1.1.1 子宫腺肌病的定义 |
| 1.1.2 子宫腺肌病的流行病学研究 |
| 1.1.3 子宫腺肌病的病因及危险因素 |
| 1.1.4 子宫腺肌病的发病机制 |
| 1.1.5 现代医学对子宫腺肌病的诊断 |
| 1.1.6 现代医学对子宫腺肌病的治疗 |
| 1.2 中医学对子宫腺肌病研究概况 |
| 1.2.1 子宫腺肌病的中医病因病机 |
| 1.2.2 子宫腺肌病的中医治疗进展 |
| 1.2.3 导师李坤寅教授应用加味芍药甘草汤治疗子宫腺肌病 |
| 1.3 加味芍药甘草汤及相关研究进展 |
| 1.3.1 加味芍药甘草汤的来源及主治病症 |
| 1.3.2 加味芍药甘草汤及主要化学成分的机理研究 |
| 1.4 子宫腺肌病的实验模型研究进展 |
| 1.4.1 子宫腺肌病的细胞模型研究进展 |
| 1.4.2 子宫腺肌病的动物模型研究进展 |
| 1.5 子宫腺肌病的研究问题与研究展望 |
| 第二章 裸鼠人来源性子宫腺肌病模型的建立和鉴定 |
| 2.1 目的和意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 造模后裸鼠生存及一般情况 |
| 2.3.2 移植标本造模前后外观观察 |
| 2.3.3 移植标本造模前后体积变化 |
| 2.3.4 移植标本的HE染色观察 |
| 2.3.5 移植物标本的免疫组化标志蛋白的表达观察 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 动物模型经验总结 |
| 2.4.2 裸鼠人来源性子宫腺肌病模型造模成功的鉴定 |
| 第三章 加味芍药甘草汤对人来源性子宫腺肌病裸鼠的治疗作用及机制 |
| 3.1 目的和意义 |
| 3.2 实验一:加味芍药甘草汤对腺肌病裸鼠体重、移植组织体积及P53表达的影响 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计方法 |
| 3.2.4 实验结果 |
| 3.3 实验二:WESTERN BLOT法检测P53/EGFR/STAT3通路中相关蛋白的表达 |
| 3.3.1 实验材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 统计方法 |
| 3.3.4 实验结果 |
| 3.4 q-PCR法检测P53/EGFR/STAT3通路中相关蛋白的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（6）Warburg效应标志物在改良子宫内膜异位症裸鼠模型中表达的探究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写、术语表 |
| 第一章 人子宫内膜异位症裸鼠皮下模型的构建 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 WARBURG效应标志物在子宫内膜异位症动物模型中表达的探究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| References |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（7）周细胞在子宫内膜异位症血管生成中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（8）CD146在异位及在位子宫内膜中的表达及意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（9）组织因子及蛋白酶激活受体2在子宫内膜异位症的表达及ENMD-1068治疗子宫内膜异位症的动物实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 组织因子及蛋白酶激活受体 2 在子宫内膜异位症的表达及意义 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 ENMD-1068 治疗子宫内膜异位症的动物实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文结论 |
| 本研究创新点的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（10）子宫内膜异位症裸鼠模型的建立与血管生成研究进展（论文提纲范文）
| 1 EMs裸鼠模型的建立 |
| 1.1 不同取材的子宫内膜对造模的影响 |
| 1.1.1 不同月经周期的内膜对造模的影响 |
| 1.1.2 不同部位的内膜对造模的影响 |
| 1.2 取材内膜的处理对造模的影响 |
| 1.3 不同的移植方法对造模的影响 |
| 1.3.1 腹腔种植法 |
| 1.3.2 腹腔注射法 |
| 1.3.3 皮下种植法 |
| 1.3.4 皮下注射法 |
| 1.4 外源性的女性激素对造模的影响 |
| 1.5 是否行卵巢去势对造模的影响 |
| 2 EMs裸鼠模型的移植病灶血管形成特点 |
| 3 EMs血管生成机制的研究 |
| 4 EMs抗血管生成治疗的应用 |
| 5 结 语 |
四、裸鼠人子宫内膜异位症模型建立与病灶血管形成相关检测（论文参考文献）
- [1]补肾温经汤对EM肾虚血瘀型大鼠JAK2/STAT3信号通路相关因子的影响[D]. 孙瑞英. 山西中医药大学, 2021(09)
- [2]基于Wnt通路的内异消抑制异体移植子宫内膜异位症的作用机制研究[D]. 韦佳慧. 西南大学, 2020(01)
- [3]缺氧调控的细胞粘附和细胞周期在子宫内膜异位症发病中的作用[D]. 林翔. 浙江大学, 2020(01)
- [4]LncRNA MEG3-210在子宫内膜异位症中的作用及相关机制研究[D]. 刘阳. 浙江大学, 2020(01)
- [5]加味芍药甘草汤对子宫腺肌病裸鼠miR-27a调控的P53/EGFR/STAT3通路的干预机制[D]. 范为之. 广州中医药大学, 2017(11)
- [6]Warburg效应标志物在改良子宫内膜异位症裸鼠模型中表达的探究[D]. 倪惠娟. 浙江大学, 2016(06)
- [7]周细胞在子宫内膜异位症血管生成中作用的研究[D]. 赵采云. 天津医科大学, 2014(01)
- [8]CD146在异位及在位子宫内膜中的表达及意义[D]. 郭蕊萌. 天津医科大学, 2013(02)
- [9]组织因子及蛋白酶激活受体2在子宫内膜异位症的表达及ENMD-1068治疗子宫内膜异位症的动物实验研究[D]. 林敏. 广州医学院, 2012(08)
- [10]子宫内膜异位症裸鼠模型的建立与血管生成研究进展[J]. 孙俊杰,尹利荣. 医学综述, 2012(07)