一、GNA和α-PAP双抗表达载体的构建及对烟草的遗传转化（论文文献综述）
刘方方[1]（2017）在《转蜡样芽孢杆菌acdS基因生菜幼苗耐盐性的提高》文中研究说明全球有近10%的耕地属于盐碱地,土壤盐渍化是影响农业生产和限制农作物产量的重要因素之一,严重影响耕地的有效利用,影响了农业的可持续发展。生菜（Lactuca）以其营养价值高,低热量,可生食而成为人们所喜爱的重要蔬菜作物。生菜在栽培过程中经常因为干旱、盐渍、高温的影响,导致品质和产量下降。利用基因工程进行种质创新和品种改良成为提高作物耐盐性的一个快速有效的方法,建立稳定高效的生菜转化体系,培育耐盐生菜新品种,为盐碱地的生菜及作物种植提供技术支撑和理论依据。ACC脱氨酶可以将乙烯的合成前体ACC（1-氨基环丙烷-1羧酸）水解成氨和α-酮丁酸,从而减少植物中产生的乙烯量,以提高植物抗性。论文克隆了蜡样芽孢杆菌（HK）编码ACC脱氨酶的acd S基因,构建植物表达载体35S::acd S-GFP,并利用农杆菌介导的叶盘法转化香港玻璃生菜。本实验优化了香港玻璃生菜的遗传转化体系。先将生菜叶片在分化培养基上预培养2d,其中分化培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L,然后在OD600为0.6的农杆菌菌液中浸泡8min进行转化,转化后共培养3d,移入分化筛选培养基,筛选抗生素选择Hyg10mg/L,抑菌抗生素选择Cef300mg/L,选用1/2MS+0.05mg/L NAA+Hyg10mg/L作为生根培养基。经融合基因PCR分析和Western blot蛋白表达鉴定,融合基因成功整合到生菜基因组中,获得了转蜡样芽孢杆菌acd S基因稳定表达的转基因生菜幼苗株系,融合基因定位在根系细胞的细胞膜上。外源acd S基因的导入使转基因生菜表现出明显的ACC脱氨酶活性。转基因生菜在盐胁迫实验结果表明,转基因生菜在盐胁迫下的生长优于野生型,在最高盐处理时优势更明显。转基因生菜中脯氨酸含量在300mmol/LNa Cl时达到802.02μg/g,是野生型的1.36倍;在300mmol/L Na Cl时,转基因生菜中可溶性糖含量为43033.80μg/g,是野生型的2.09倍,野生型植株为20533.80μg/g;在Na Cl 300mmol/L时,野生型生菜SOD活性为不加盐对照组的2.14倍,转基因生菜SOD活性为不加盐对照组的3.47倍,活性显着高于野生型植株;在Na Cl200mmol/L时,转基因生菜中叶绿素含量为0.16mg/g,非转基因生菜叶绿素含量为0.09mg/g;在Na Cl 300mmol/L时,转基因生菜叶片相对含水量为70.95%,而野生型相对含水量为60.95%;在Na Cl 300mmol/L时,野生型植株的MDA含量为4.80×10-3μmol/g,转基因生菜的MDA含量为4.00×10-3μmol/g,显着低于WT植株（P<0.05）。综上所述,导入acd S基因可有效消除盐胁迫对生菜的损害,提高了转基因生菜的耐盐性。本实验中,蜡样芽孢杆菌的ACC脱氨酶基因被导入生菜,获得ACC脱氨酶含量显着增加的转基因生菜株系,并通过模拟盐胁迫研究导入acd S基因对转基因生菜耐盐性的影响,为培育耐盐生菜品种奠定了基础。
李文枫[2]（2014）在《番茄高色素hp2基因的克隆、遗传转化及功能验证》文中指出番茄（Lycopersicon esculentem.Mill）营养丰富,风味香郁,适应性广,产量高,在世界各地被广泛种植,并成为人们日常的主要蔬菜作物之一。在番茄突变体的果实中含有丰富的番茄红素,而番茄红素具有抗氧化、延缓衰老、提高免疫力和抗癌等功能,因而其食用价值和经济价值倍受关注,已成为国际功能性食物营养指标研究的热点之一,但我国在该方向的研究还处初级阶段。为了增加番茄采收时间、在市场上的上架时间,减少运输过程中的损伤率,近年耐贮型番茄已成为育种的主要目标,但耐贮型番茄普遍存在果实番茄红素含量较低的品质缺陷、并难以有效对其进行选择。随着分子生物学及基因组学的迅猛发展,运用重组DNA技术即基因工程改良作物品质已成为作物分子育种的主要高效途径。近年来,研究者发现了许多影响植物光代谢的单基因突变体,其中番茄高色素hp基因突变体能够提高类胡萝卜素含量,尤其对番茄红素含量的提高最为显着,为此,引起了众多育种者和研究者的高度重视。目前,已发现的hp类突变体中hp1,hp2和hp3对番茄红素含量的影响作用显着。而对于耐贮型番茄果实的番茄红素含量均普遍偏低的问题,已成为现今和未来商业及市场品质需求的一重大缺陷,快速、高效选育高番茄红素的耐贮型番茄品种已成为目前番茄品质育种中急于解决的主要问题之一,而关于耐贮型番茄相关的遗传转化报道也甚少,所以给耐贮型番茄的高效分子品质育种带来了诸多不便。为此,本研究以从美国番茄遗传研究所引进含有3种不同hp基因（hp1, hp2和hp3）类型的7个突变体和加工番茄为对照,通过番茄红素和品质的差异分析及相关分析,筛选其中1个对番茄红素起主导作用同时兼顾其他主要优良品质的hp基因类型为耐贮型番茄转hp基因的研究供体；建立和优化耐贮型番茄的再生体系和遗传转化体系；克隆该hp2基因全长并构建带有attR重组位点的pCAMBIA-1301入门载体；通过农杆菌介导方法将hp2基因导入耐贮型番茄中,获得转基因植株,并对其进行分子和生理指标检测分析,为hp基因在耐贮型番茄中的应用研究提供理论依据,为含高番茄红素的番茄创造新的种质资源。具体研究结果如下：（1）以含3种不同hp基因突变类型和不含hp基因类型番茄为材料,经其果实番茄红素含量的差异分析表明,含不同的hp基因类型番茄果实中番茄红素含量存在显着和极显着差异,含量趋势表现为hp2>hp1>hp3>无hp类型,其中hp2基因对番茄中番茄红素含量具有重要的主导作用,并且果实其他主要综合品质优良。（2）以含3种不同hp基因突变类型和不含hp基因类型番茄为材料,经其果实番茄红素与主要品质含量的相关分析表明,含不同hp基因番茄果实中番茄红素含量与其它5个主要果实品质指标相关性不显着,但均具有正向相关趋势,其相关大小分别为糖酸比>维生素C含量>可溶性蛋白含量>可溶性总糖含量>酸度含量。（3）以含hp2基因突变类型的LA3006和LA4013番茄为材料,通过RT-PCR方法对其进行基因克隆及载体构建分析表明,在番茄LA3006和LA4013中均可以成功获得含有attB序列的hp2全长基因,并构造了带有ccdB基因的重组位点的入门载体,命名为pCAMBIA一1301-ccdB和含hp2基因的植物双元表达载体,命名为pCAMBIA一1301-hp2。（4）以耐贮型番茄品种08076和09836为材料,通过子叶高频再生的方法,对其再生体系中的主要影响因子进行差异分析表明,在耐贮型番茄子叶高频再生体系中,不同番茄品种间仅在出芽数存在极显着差异,其他诱导和再分化影响因子指标差异不显着；其中耐贮型番茄子叶最优高频再生体系为：无菌苗的培养采用,种子用10%NaClO浸种15mmin消毒, MS培养基（进口,2.215g/L）+0.70%琼脂+2%蔗糖；无菌苗培养基采用1/2MS+0.7%琼脂+1%蔗糖；诱导愈伤养培养基为MS+6-BAlmg/L+IAA0.2mg/L；不定芽分化养培养基为MS+6-BA1.5mg/L+IAA0.75mg/L；生根培养基为MS+IAA2.0mg/L,其获得的耐贮型番茄再生频率表现为09836和08076的子叶分化率分别为100%、98.25%。（5）以耐贮型番茄品种09836为材料,利用农杆菌介导方法,对其进行遗传转化分析表明,hp2基因可以较好导入耐贮型番茄09836,其中在共培养时期,成活169份,成活率为42%；在不定芽分化时期,成活65个不定芽,成活率为38%；在生根苗时期,成活38份,成活率为58%；在抗性植株培养时期,最终获得到抗性植株14株,成活率为36%。（6）以遗传转化获得抗性植株为材料,经“目的PCR"."NPTII基因”和“半定量RT-PCR"检测验证分析表明,确定8株表现阳性,分别为T0-01、T0-02、T0-05、T0-06、T0-08、T0-10、T0-12、 T0-14,转化株的阳性率为57.14%。（7）以获得的阳性植株为材料,经方差和多重比较分析表明,果实中番茄红素含量、叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量均极显着获得提高,其中果实中番茄红素含量分别提高了309.64%-1571.08%；阳性番茄植株叶片中叶绿素a提高了139.45%-295.11%,叶片中叶绿素b提高了152.58%-376.29%,叶片中类胡萝卜素含量提高了20.32%-95.72%。（8）以获得的阳性植株为材料,阳性植株的果实番茄红素含量与叶片中叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量进行相关分析表明,T。代阳性株果实中番茄红素含量与其叶片中叶绿素a含量和类胡萝卜素含量呈正向显着相关,而与其叶片中叶绿素b含量呈正向极显着相关（r=0.79）；阳性株叶片叶绿素a含量、叶绿素b含量和类胡萝卜素含量间存在极显着正相关。（9）通过转基因技术获得了3个转hp2基因的T2代耐贮型番茄09836株,其中T2-1、T2-5和T2-10的果实番茄红素含量分别为33.9.83.7.94.6mg/kg,较非转基因番茄对照提高了3.8-10.6倍；其果实的AS1分别为2.1、1.9和2.3,较对照下降了45.24%-54.76%；其果实货架期分别为48、42和53天,相比对照下降了27.4%-42.47%；其果实硬度分别为3.35kg/cm-2、3.02kg/cm-2和4.05kg/cm-2,相比对照下降了27.68%-46.07%。
王桂英[3]（2012）在《双Bt基因对杨树的遗传转化及外源基因表达研究》文中进行了进一步梳理为鉴定并筛选出转双Bt基因741杨对鳞翅目和鞘翅目害虫同时具有较强抗性的株系，明确联合使用两种或两种以上的抗虫基因的抗虫效果。以8个转三基因双Bt （Cry3Aa+Cry1Ac+API）741杨株系、1个转双抗虫基因（Cry1Ac+API）741杨株系和3个转单抗虫基因（Cry3Aa）741杨株系为实验材料，未转基因741杨为对照，进行了外源基因表达测定和抗虫性对比试验。同时借助农杆菌介导，采用共转化法，用构建在同一表达载体pCAMBIA1305-Cry1Ac-Cry3Aa上的双Bt基因对巨霸杨进行遗传转化，获得了4株潮霉素抗性植株。经过PCR初步检测，表明双Bt基因已经整合进了巨霸杨基因组中。主要研究结果如下：1.转抗虫基因741杨分别为：单转Bt Cry3Aa基因741杨pCC系列3个株系pCC11、pCC53、pCC84；转双抗虫基因（Cry1Ac+API）741杨1个株系pB29；在pB29基础上通过二次转化法将Cry3Aa基因转入获得的转三基因双Bt（Cry3Aa+Cry1Ac+API）741杨pCCA系列8个株系pCCA1、pCCA2、pCCA3、pCCA4、pCCA5、pCCA6、pCCA7和pCCA9。对各转基因株系及对照进行组培快繁，筛选确立了诱导741杨分化和生根的适宜培养基。分化培养基为：MS+6BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1；生根培养基为：1/2MS+IBA0.3mg·L-1。2.转双Bt基因741杨等13个参试材料经特异引物PCR扩增Cry1Ac基因和Cry3Aa基因： pB29和转双Bt基因pCCA系列均扩增得到了Cry1Ac基因特异条带，对照741和pCC系列基因组未出现扩增条带。pCC系列和转双Bt基因pCCA系列均得到了Cry3Aa基因特异条带，对照741和pB29基因组未出现扩增条带。说明pB29中Cry1Ac基因和pCC系列中的Cry3Aa基因稳定存在。在pB29基础上，通过二次介导法外源Cry3Aa基因已整合到pCCA各无性系基因组中。3.通过RT-PCR和荧光定量PCR结合，在转录水平对外源基因的表达进行了检测。实时荧光监测表明：8个双Bt株系即检测到了Cry1Ac荧光扩增信号又检测到了Cry3Aa基因的荧光扩增信号。pCC-11、53、84只有Cry3Aa基因的荧光信号表达，而pB29只有Cry1Ac基因的荧光信号表达，对照741没有显现双Bt基因的荧光扩增信号。根据测得的Ct值，计算出了各样品中Cry1Ac基因和Cry3Aa基因在mRNA转录本中的表达量。双Bt株系pCCA系列及pB29中Cry1Ac基因的起始表达量在3.26×1047.50×105之间；双Bt株系pCCA系列及pCC系列Cry3Aa基因的起始表达量在1.79×1086.05×109之间。数据显示Cry3Aa基因的起始表达量在108109数量级，比Cry1Ac的起始表达量（104105数量级）高出了一万倍。4.用Bt-Cry1Ab/1Ac和Bt-Cry3A ELISA蛋白检测试剂盒，检测Cry1Ac蛋白：双Bt741杨pCCA系列的8个系号和pB29呈现蓝色阳性反应，蛋白含量在16.4460.32ng·g-1（FW）；pCC系列和对照741无显色反应。检测Cry3Aa蛋白：双Bt741杨8个系号及pCC系列呈现黄色阳性反应，蛋白含量在2.2413.30μg·g-1（FW）；pB29和对照741无显色反应。检测结果表明，双Bt株系能同时表达两种Bt毒蛋白，单Bt株系也表达了与各自所含基因相应的蛋白。从毒蛋白表达量看Cry3Aa蛋白表达量远远高于Cry1Ac蛋白表达量。Cry3Aa蛋白表达量在微克级，Cry1Ac蛋白表达量在纳克级。5.用转基因株系新鲜叶片进行柳蓝叶甲（Plagiodera versicolora）13龄幼虫和成虫及美国白蛾（Hyphantria cunea）1龄和4龄幼虫室内饲虫实验表明：转入不同抗虫基因的杨树对昆虫的抗性具有选择性，对非靶标昆虫没有毒杀作用。转双Bt基因741杨对鳞翅目的美国白蛾和鞘翅目的柳蓝叶甲具有双抗性，不同转基因株系表现出高中低的抗性水平。pCCA-1、2、5、6、9对柳蓝叶甲表现高抗，pCCA-3、4、7表现中低抗性。5个高抗株系的抗性水平明显比单Bt Cry3Aa基因的3个高抗株系(pCC-11、53、84)的抗虫性高，用这5个系号饲喂的柳蓝叶甲成虫3天时60%以上死亡，5天时死亡率达到85%100%；而pCC的3个系号3天时死亡率在50%以下，5天时也只有60%70%。在对美国白蛾的抗性上，有7个双Bt株系（pCCA2-7和pCCA9）的抗性水平与pB29表现一致，4龄幼虫在第79天时死亡率达100%；只有1个系号pCCA1对美国白蛾表现出了极低的抗性，4龄幼虫在第7天和第9天时的死亡率分别只有7%和23%。pCC系列不含抗鳞翅目的Bt Cry1Ac基因，对美国白蛾未表现抗虫性。6.饲虫结果还表明无论是柳蓝叶甲还是美国白蛾，1龄幼虫对Bt毒蛋白的耐受性比较差，取食23天全部死亡；柳蓝叶甲成虫及美国白蛾4龄幼虫耐受性明显增强，取食可延长到711天。通过对取食叶片实时拍照记录的取食危害面积来看，转基因株系同对照比，即使中低抗株系也能对叶片起到很好的保护作用。7.对美国白蛾4龄幼虫的总排粪量和体长调查表明：低抗株系pCCA1的总排粪量是高抗株系pCCA2-7、pCCA9和pB29的723倍，但跟对照的总排粪量比，只有对照的25%。从体长来看，未转基因741杨上的美国白蛾幼虫体长达到了19mm，pCCA2-7、pCCA9和pB29的体长在1012mm之间，而取食低抗株系pCCA1的最后体长也只有13mm（为对照的68%）。从虫粪和体长这两个指标分析来看，充分说明了转基因植株对昆虫的生长发育起到了明显的抑制作用。8.采用农杆菌介导法，以潮霉素做筛选标记，用构建在同一表达载体上的双Bt基因（Cry3Aa+Cry1Ac）对巨霸杨进行遗传转化。实验对诱导叶片分化适宜培养基和适宜潮霉素浓度这两个影响转化的关键因素进行了深入研究。确定诱导叶片分化不定芽的最佳培养基为MS+6BA0.25mg·L-1+IBA0.1mg·L-1。通过潮霉素在0mg·L-115mg·L-1范围内不同浓度梯度对叶片分化和茎尖生长影响的实验，确定诱导抗性芽分化的潮霉素临界筛选浓度为5mg·L-1。经过对再生抗性芽的多次潮霉素筛选，获得抗性稳定的转双Bt基因巨霸杨无性系4个，编号为JB1、JB2、JB3和JB4。9.用特异引物分别对获得的转双Bt基因巨霸杨无性系进行PCR检测，结果显示：JB1、JB2、JB3和JB4均扩增得到一条与阳性质粒作模板PCR扩增条带大小相同的749bp（Cry1Ac基因）和612bp（Cry3Aa基因）的特异条带，而对照未转化巨霸杨基因组未出现PCR扩增特异条带。初步证明双Bt基因已经整合进了巨霸杨基因组中。
营文文[4]（2012）在《3α-HSD/CR、aiiA和3α-HSD/CR-aiik基因转化烟草及表达分析》文中指出人类经济快速发展，大量的废气、废水、废物等排放到环境中，导致环境污染日益严重。3α-HSD/CR基因是睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）的关键酶3α-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶（3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase，3α-HSD/CR）基因，对环境污染物中的类固醇化合物有很好的降解作用。aiiA基因是从苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis, Bt）中克隆的一种酰基高丝氨酸环内酯酶（acyl homoserine lactones, AHLs）基因。AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌（Erwinia carotovora）引起的软腐病具有抑制作用，其机制是将该菌产生的AHLs分子的内酯键打开，使其结构改变，失去信号分子的功能，进而减弱病害。近年来，植物基因工程迅速发展，“超级生物”备受关注，转基因由单基因向多基因方向发展。但是，由于受到目前可选择的载体数目和载体容量的限制，多基因转化困难。融合基因转化以及融合表达载体构建技术的发展，为多基因的遗传转化开辟了一条新途径。本研究构建3α-HSD/CR基因和aiiA基因融合基因植物表达载体并转化烟草，初步研究了融合基因在烟草中的表达。主要方法和结果如下：1.构建了融合基因3α-HSD/CR-aiiA植物表达载体pTCK303-3α-HSD/CR-aiiA，同时构建了两个单基因（3α-HSD/CR和aiiA）植物表达载体pTCK303-3α-HSD/CR和pTCK303-aiiA作为对照，研究融合基因的表达。通过酶切验证及测序表明载体构建成功。2.利用农杆菌介导法将融合基因3α-HSD/CR-aiiA及两个单基因3α-HSD/CR和aiiA转化烟草。经PCR检测及GUS组织化学染色结果表明成功获得转融合基因3α-HSD/CR-aiiA烟草及转单基因3α-HSD/CR和aiiA烟草。3.利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测3α-HSD/CR蛋白在转融合基因3α-HSD/CR-aiiA烟草和转单基因3α-HSD/CR烟草中均成功的表达了。4.采用胆固醇降解试验检测转3α-HSD/CR-aiiA和3α-HSD/CR基因烟草对胆固醇的降解率均达到70%左右，远远高于对照。5.对转3α-HSD/CR-aiiA和aiiA基因烟草离体叶片针刺法接种胡萝卜软腐欧文氏杆菌，结果表明转基因烟草离体叶片对胡萝卜软腐欧文氏杆菌引起的软腐病具有抑制作用。6.由胆固醇降解试验及抗病试验结果表明：转3α-HSD/CR-aiiA融合基因的烟草同时表达了3α-HSD/CR蛋白和AiiA蛋白的功能，获得了对环境具有修复作用的抗病性烟草。
刘晓娜,冯翠莲,张树珍[5]（2010）在《GNA基因表达载体的构建及遗传转化甘蔗》文中提出利用经人工改造的gna基因分别与Ubi、Rbcs启动子组合,构建抗虫植物表达载体pUNG和pRNG,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经PPT筛选和PCR检测,获得Ubi-gna转基因植株124株,Rbcs-gna转基因植株35株。对部分转基因植株进行RT-PCR检测,初步证明外源基因已经整合到甘蔗基因组中,并得到有效表达;对RT-PCR阳性植株进行GNA（植物外源凝集素）活性测验,结果表明,甘蔗叶片表达的凝集素可以使健康公鸡的红细胞凝集,初步证明表达的GNA具有正常的生物学活性。
刘晓娜[6]（2010）在《植物凝集素基因植物表达载体的构建及遗传转化甘蔗》文中进行了进一步梳理甘蔗（Saccharum officinarum L.）是我国最重要的糖料作物,同时也是一种重要的能源经济植物。甘蔗粉蚧和绵蚜是甘蔗的重要害虫,它们不但直接造成甘蔗减产、糖含量降低,而且还是多种甘蔗病毒的传播媒介,间接传播病毒引起的病害损失比虫害直接造成的损失更为严重。利用植物基因工程技术把抗虫基因导入优良甘蔗品种中使其得到有效的表达从而表现出抗虫性是培育甘蔗抗虫品种最有效的途径。雪花莲凝集素（gna）是目前研究较多的一种单子叶植物甘露糖结合凝集素,广泛应用于植物害虫的治理。它能结合到昆虫消化道上皮细胞糖蛋白受体上,对昆虫产生局部或系统毒害,抑制害虫的生长发育及繁殖,对蚜虫和叶蝉等同翅目害虫具有高效毒性,同时对鳞翅目、鞘翅目的害虫也有一定的毒性。因此把gna基因转入高产高糖甘蔗品种中使其得到高效的表达,以期提高甘蔗对绵蚜和粉蚧等同翅目害虫的抗虫性。本研究成功构建了中间表达载体pUN和一个组成型启动子Ubi驱动gna基因的植物表达载体pUNG,并用“冻融法”将其导入根癌农杆菌EHA105中；通过农杆菌介导法对甘蔗进行遗传转化,获得抗性植株227株,对其中的183株进行PCR检测,有124株呈阳性。另外转化了Rbcs驱动的gna基因的植物表达载体prG,获得54株抗性植株,PCR结果表明有35株抗性植株呈阳性。初步证明gna基因已整合到甘蔗的基因组中。随机选取6株转Ubi驱动的gna PCR阳性植物进行RT-PCR,检测植株均呈阳性。对这些阳性植株进行进一步GNA凝集素体外活性测验,结果表明甘蔗叶片表达的GNA粗提物可以使鸡红细胞凝集,6株均表现不同的凝血活性,初步证明转化植株叶片表达的GNA具有生物学活性。另外随机选取2株Rbcs驱动的gna基因PCR阳性植株进行RT-PCR检测,1株呈阳性。由此进一步证明外源基因在转录水平得到了表达。
安娜[7]（2010）在《根癌农杆菌介导D32基因和芪合酶基因转化普通烟草的研究》文中进行了进一步梳理干旱、低温、盐渍等逆境胁迫以及各种病害的发生对当今农业的发展产生了很大的影响,如何合理开发和利用盐碱化土地,以及如何提高作物的抗病性已经成为当今农业生产急需解决的问题。培育耐盐、抗旱及抗病作物新品种已经成为作物品种改良的重要课题。随着转基因技术的不断完善,利用基因工程手段培育作物新品种为增加粮食产量和维持农业可持续发展提供了新的途径和方法。DREB是一类和植物脱水条件下的抗逆性反应有关的调节因子蛋白,是可以同时调控多个逆境诱导基因表达的转录因子。D32基因产物是DREB转录因子的一种,当植物受到干旱、低温、高盐等非生物胁迫时,D32基因本身会发生一系列的生理生化反应,从而对逆境刺激作出相应的反应以增强植物的抗逆性。芪类化合物是一类具有均二苯乙烯母核或其聚合物的物质的总称,其多存在于植物的木质部,当植物受到虫害或外界刺激时,芪类化合物在植物体内起到植保素的作用,植物受激部位的芪类化合物含量将显着增加,以防止病原菌入侵,从而提高植物的抗病能力,芪合酶（Stilbene synthase, STS）是芪类物质合成的关键酶,它催化产生含二苯乙烯母核的芪类物质基本分子,再经修饰聚合等作用形成不同的芪类化合物,由芪合酶催化底物丙二酰-CoA和香豆酰-CoA合成的白藜芦醇（trans-resveratrol,RL）对真菌、细菌等具有毒性,其对子囊菌亚门和半知菌亚门近26种真菌具有抑菌活性,主要表现为对菌丝生长或孢子萌发的抑制。陕西烟草是黄淮烟区的主要烟草类型之一,其种植面积较小,但地处烟草的优质气候生态带,日照充足,土壤水分适宜,具有高产、优质的特点,在经济作物生产中占有重要地位。通过根癌农杆菌介导的D32基因和芪合酶基因转化烟草,可以提高烟草的抗盐、抗旱和抗病等特性。本研究以陕西烟草种植品种“中烟99”为受体材料,采用农杆菌介导的叶圆盘法对其进行D32基因和芪合酶基因的转化,探索农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素,获得了以下主要研究结果:1.以“中烟99”无菌叶片为受体,进行卡那霉素水平的敏感性试验,得到了该品种的最佳抗性苗筛选浓度,为转基因株系的选择提供了有效依据,卡那霉素敏感性试验表明:50mg/L是“中烟99”转化植株抗性筛选的最佳浓度。2.优化了农杆菌介导的烟草遗传转化体系,研究了侵染时间、菌液浓度、共培养时间、抗生素的抑菌效果等影响遗传转化的因素,通过对农杆菌介导烟草遗传转化条件的探索,建立了快速高效的烟草遗传转化体系。3.优化的农杆菌介导D32基因的遗传转化条件为:用稀释10倍的农杆菌菌液（OD600,0.7）浸泡8min,转至分化培养基上共培养2d,无菌水冲洗34次,置于含50mg/L卡那霉素和400mg/L羧苄青霉素的筛选分化培养基上诱导烟草叶圆片产生抗性愈伤组织和不定芽,最后转至含50mg/L卡那霉素和400mg/L羧苄青霉素的筛选生根培养基生根成苗。4.优化的农杆菌介导芪合酶基因的遗传转化条件为:用稀释10倍的农杆菌菌液（OD600,0.6）浸泡8min,转至分化培养基上共培养3d,无菌水冲洗34次,置于含50mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的筛选分化培养基上诱导其产生抗性芽,最后转至含50mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的筛选生根培养基生根成苗。5.通过农杆菌介导和卡那霉素抗性筛选,获得9株经PCR检测的D32转基因株,转化率达28.1%,转化株的获得为进一步验证D32基因的抗逆机理和作物抗逆特性的改良奠定了基础。6.通过农杆菌介导和卡那霉素抗性筛选,获得7株经PCR检测的烟草转芪合酶基因株,转化率为25%,初步证明芪合酶基因已整合到“中烟99”基因组中。
曾黎琼,段玉云,张云孙,程在全,黄兴奇[8]（2009）在《云南转基因农作物研究与产业化:现状及其发展》文中指出基因转化在农作物新品种培育中发挥着重要的作用.综述云南在农作物基因转化研究和产业化发展方面所做的工作,并提出了今后开展此项工作的设想和建议.
霍雪梅[9]（2009）在《抗虫基因植物表达载体构建、遗传转化及表达研究》文中指出本研究在王彦平构建的植物表达载体基础上构建Bt抗虫基因表达载体,并转化烟草,对Bt基因表达水平进行检测。试验进一步以普通741杨和转双抗虫基因pB29无菌苗为试验材料,建立了叶片再生体系并对农杆菌介导的遗传转化体系进行了优化。通过农杆菌介导法将Bt cry3A （Bt3）基因转入已含Bt cry1A（c） （Bt1）基因的pB29中,获得转双Bt基因741毛白杨,对部分转化植株进行了DNA水平和蛋白质水平的检测。主要研究结果如下:利用植物表达载体pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3,通过DNA重组技术,分别将Bt1和Bt3基因正向插入植物表达载体pCAMBIA3301中,成功构建了pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3植物表达载体。此可读框架通过组成型启动子CaMV35S启动,携带PPT乙酰基转移酶（PAT）基因作为选择标记基因,并将构建的表达载体导入根癌农杆菌EHA105。确定烟草转化的潮霉素临界筛选浓度为50 mg.L-l,头孢噻肟钠的抑菌浓度为200 mg.L-l。采用农杆菌介导法,将植物表达载体载体pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3及构建的植物表达载体pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3转入烟草中,均得到完整再生植株。经PCR检测,初步证明目的基因已整合到烟草的基因组中。ELISA检测表明,大部分转基因株系中Bt1和Bt3毒蛋白表达量均高于对照。在5株携带双价Bt基因的转基因烟草中,Bt1毒蛋白和Bt3毒蛋白的表达量最高分别达0.030 1%和0.293 8%。对农杆菌介导的741杨遗传转化体系进行了优化,确定叶片诱导分化不定芽的适宜培养基为MS+ 6-BA 1.0 mg.L-l + NAA 0.1 mg.L-l,生根培养基为1/2 MS+ NAA 0.1 mg.L-l。潮霉素临界筛选浓度为10 mg.L-l,抗生素头孢噻肟钠的抑菌浓度为400 mg.L-l。遗传转化的适宜菌液浓度为OD600 = 0.4,浸菌时间为810 min,共培养时间以2 d为宜。采用农杆菌介导法,将Bt3基因转入已转Bt1基因的杂种741毛白杨无性系pB29中,获得转双Bt基因741毛白杨。在含Hyg的培养基中进行多次继代筛选,获得抗性稳定的无性系9个,编号为pC1pC9。采用特异引物分别对获得的转双Bt基因741杨无性系进行PCR检测,结果表明:Bt1基因稳定存在于pB29无性系中,Bt3基因已整合到各无性系的基因组DNA中。对杂种741毛白杨转化植株进行毒蛋白表达的ELISA检测,结果表明,所选转双价Bt基因的741杨的2个无性系pC1和pC2,均检测到Bt1和Bt3毒蛋白的表达。Bt1毒蛋白的表达量分别为0.009 4%和0.011 0%;Bt3毒蛋白的表达量分别为0.217 0%和0.149 4%,高于对照pB29及转单一Bt3基因的741杨无性系CC71的Bt3蛋白表达量（0.033 7%）。
张婷婷[10]（2009）在《表达AMV，WCMV外壳蛋白基因的红三叶T1，T2代分子生物学检测及抗病性分析》文中研究指明红三叶病毒病是除根节线虫之外的一大病害,其中尤以苜蓿花叶病毒（Alfalfa Mosaic Virus, AMV）和白三叶花叶病毒（White Clover Mosaic Virus, WCMV）最为猖獗。大面积草地喷施农药不仅成本高,而且会造成环境污染,对畜产品的安全性也有影响。培育抗AMV和WCMV的转基因红三叶新品种是解决问题的根本途径。要实现转基因植物的多抗效果,目前常用的方法有:构建双元、多元载体,然后进行遗传转化;给已经转入一个抗性基因的植株用转基因手段再转入另外一个抗性基因;在不同的抗病转基因植株之间进行人工杂交。本研究以抗苜蓿花叶病毒（AMV）转基因红三叶和抗白三叶花叶病毒（WCMV）的转基因红三叶人工杂交后代T1,T2代植株为研究对象,探讨目的基因在人工杂交后代中的表达情况及其抗病性强弱。研究结果如下:1)分别用改进的CTAB法和植物基因组试剂盒提取34个T1代植株DNA样品和30个T2代植株DNA样品及1个非转基因对照DNA样品,经琼脂糖凝胶电泳检测,所有条带均清晰无污染,利用试剂盒提取DNA较手提法时间短、质量好。对提取的30个T2代植株的RNA进行琼脂糖凝胶电泳分析,条带完整、清晰。2) 34株T1代植株PCR检测结果显示,5株AMV、WCMV阳性,6株WCMV阳性,1株AMV阳性,3株仅nptⅡ阳性。3)30株T2代PCR检测结果显示所有T2代植株nptII均呈阳性,其中10株AMV、WCMV均阳性,13株WCMV阳性、3株AMV阳性。4)对T2代转基因红三叶进行RT-PCR检测,分别得到预期大小的条带。其中,9个正常转录并表达AMV和WCMV外壳蛋白基因,3个表达AMV外壳蛋白基因,6个表达WCMV外壳蛋白基因,3个表达nptII基因。5)30株T2代植株有21株能够表达外壳蛋白基因,表明外源基因可以通过人工杂交遗传至后代,并在大部分植株中能够正常转录,并且,通过人工杂交能够实现两种外源基因在同一植株中的累集。6)对T2代阳性植株进行苜蓿花叶病毒和白三叶花叶病毒的抗病性检测。与对照相比,转基因红三叶T2代整体抗性水平明显高于对照,回接转基因植株与对照的汁液至寄主豇豆,转化植株产生的枯斑数也明显小于对照。表明通过人工杂交获得的T2代转基因植株具有较强的抗病性。
二、GNA和α-PAP双抗表达载体的构建及对烟草的遗传转化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、GNA和α-PAP双抗表达载体的构建及对烟草的遗传转化（论文提纲范文）
（1）转蜡样芽孢杆菌acdS基因生菜幼苗耐盐性的提高（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 生菜 |
| 1.1.1 生菜 |
| 1.1.2 生菜的耐盐性 |
| 1.1.3 生菜转基因研究 |
| 1.2 盐胁迫对植物造成的伤害 |
| 1.3 ACC脱氨酶与植物耐盐性 |
| 1.4 ACC脱氨酶的研究现状 |
| 1.4.1 ACC脱氨酶 |
| 1.4.2 含有ACC脱氨酶基因的植物促生菌的研究现状 |
| 1.4.3 acd S基因转化植物的研究 |
| 1.5 研究目的意义 |
| 第二章 生菜遗传转化体系的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 生菜无菌苗培养 |
| 2.1.3 生菜愈伤组织和不定芽的诱导 |
| 2.1.4 生菜不定芽诱导生根 |
| 2.1.5 潮霉素选择压的确定 |
| 2.1.6 预培养时间对转化的影响 |
| 2.1.7 头孢霉素浓度的确定 |
| 2.1.8 农杆菌菌液最佳侵染时间的确定 |
| 2.1.9 最佳共培养时间的确定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同激素浓度对生菜叶片再生率的影响 |
| 2.2.2 诱导生根培养基 |
| 2.2.3 选择培养基中潮霉素浓度的确定 |
| 2.2.4 预培养时间对生菜转化的影响 |
| 2.2.5 抑菌抗生素Cef的选择 |
| 2.2.6 不同侵染时间对生菜遗传转化的影响 |
| 2.2.7 不同共培养时间对生菜转化的影响 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 2.3.1 不同激素浓度对生菜再生的影响 |
| 2.3.2 遗传转化过程中各因素的影响 |
| 第三章 转蜡样芽孢杆菌acd S基因生菜幼苗的获得 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 acd S基因的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1.3 植物表达载体的构建 |
| 3.1.4 生菜的转化 |
| 3.1.5 转基因生菜的PCR鉴定 |
| 3.1.6 转acd S基因生菜的蛋白表达分析 |
| 3.1.7 荧光观察 |
| 3.1.8 转基因生菜ACC脱氨酶活性的检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 蜡样芽孢杆菌acd S基因的克隆及生物信息学分析 |
| 3.2.2 含acd S基因的表达载体的鉴定 |
| 3.2.3 蜡样芽孢杆菌acd S基因对生菜的转化 |
| 3.2.4 转基因生菜的PCR结果分析 |
| 3.2.5 转基因生菜的蛋白表达分析 |
| 3.2.6 转基因生菜的荧光观察 |
| 3.2.7 转基因植株与非转基因植株中ACC脱氨酶活性的比较 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 3.3.1 acd S基因的克隆和表达载体的构建 |
| 3.3.2 生菜遗传转化植株的获得 |
| 第四章 转acd S基因生菜耐盐性评价 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 盐胁迫处理 |
| 4.1.3 盐胁迫处理后生理生化指标的测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 T2代转基因生菜PCR鉴定 |
| 4.2.2 盐胁迫处理对转基因生菜生长的影响 |
| 4.2.3 盐胁迫处理对转基因生菜叶片相对含水量的影响 |
| 4.2.4 盐胁迫处理对转基因生菜叶绿素含量的影响 |
| 4.2.5 盐胁迫处理对转基因生菜丙二醛含量的影响 |
| 4.2.6 盐胁迫处理对转基因生菜细胞内游离脯氨酸含量的影响 |
| 4.2.7 盐胁迫处理对转基因生菜可溶性糖含量的影响 |
| 4.2.8 盐胁迫处理对转基因生菜抗氧化物酶系统的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 生菜离体再生体系的构建 |
| 5.2 根癌农杆菌介导的生菜遗传转化体系的构建 |
| 5.3 转基因植株的获得及鉴定 |
| 5.4 acd S转基因生菜功能分析 |
| 主要试剂和配方 |
| 试剂 |
| 配方 |
| 实验仪器 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）番茄高色素hp2基因的克隆、遗传转化及功能验证（论文提纲范文）
| CONTENTS |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 研究的目的和意义 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 番茄果实中番茄红素研究进展概述 |
| 1.2.2 hp基因研究进展 |
| 1.2.3 转基因遗传转化方法的研究进展 |
| 1.2.4 利用基因工程进行番茄品种改良的研究进展 |
| 1.2.5 色素基因在其他作物上的研究进展 |
| 1.2.6 Gateway克隆技术在植物中应用进展概述 |
| 1.3 主要研究内容 |
| 1.3.1 含番茄高色素hp基因突变体的筛选 |
| 1.3.2 番茄再生体系的优化 |
| 1.3.3 目的(hp2)基因全长序列的获取 |
| 1.3.4 利用GATEWAY方法构建含目的(hp2)基因表达载体 |
| 1.3.5 番茄对hp2基因的遗传转化研究 |
| 1.3.6 遗传转化株系的鉴定与分析 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 高色素番茄hp突变体果实品质性状的基础研究 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 统计分析 |
| 2.2 hp基因的克隆 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 利用GATEWAY克隆技术构建植物表达载体 |
| 2.3.1 试验材料 |
| 2.3.3 试验方法 |
| 2.4 番茄叶盘法高频再生体系的优化 |
| 2.4.1 试验材料 |
| 2.4.2 试验方法 |
| 2.4.3 统计与分析 |
| 2.5 番茄遗传转化体系的建立 |
| 2.5.1 试验材料 |
| 2.5.2 试验方法 |
| 2.5.3 统计与分析 |
| 2.6 番茄hp2基因的功能验证 |
| 2.6.1 试验材料 |
| 2.6.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 含高色素不同hp基因番茄品种之间品质性状比较及相关性分析 |
| 3.1.1 不同hp基因番茄间番茄红素含量比较分析 |
| 3.1.2 不同hp基因番茄间果实间产量及品质比较分析 |
| 3.1.3 番茄果实品质性状的相关分析 |
| 3.2 hp2基因的克隆与检测分析 |
| 3.2.1 RNA的提取与检测分析 |
| 3.2.2 RT-PCR扩增hp2基因全长序列分析 |
| 3.2.3 胶回收产物的连接、转化与鉴定分析 |
| 3.2.4 克隆基因全长的生物信息学比对分析 |
| 3.3 pCAMBIA-1301-hp2植物表达载体的构建 |
| 3.3.1 带有attB序列hp2全长基因的构建与检测 |
| 3.3.2 含有attR的pCAMBIA-1301-ccdB表达载体的构建 |
| 3.3.3 pCAMBIA-1301-hp2植物表达载体的鉴定分析 |
| 3.4 耐贮型番茄子叶高频再生体系的优化 |
| 3.4.1 不同消毒方法和无菌苗培养基对番茄实生苗发生效果的影响 |
| 3.4.2 不同激素与浓度对耐贮型番茄不定芽的诱导和分化的影响 |
| 3.4.3 激素6BA+IAA的不同处理水平对番茄品种09836生根的影响 |
| 3.5 农杆菌介导的耐贮型番茄09836的遗传转化 |
| 3.5.1 pCAMBIA-1301-hp2植物表达载体转化农杆菌的分析 |
| 3.5.2 耐贮型番茄09836的遗传转化 |
| 3.6 hp2基因功能的验证分析 |
| 3.6.1 T_0代转基因植株DNA检测分析 |
| 3.6.2 转hp2基因抗性番茄植株的分子检测分析 |
| 3.6.3 转hp2基因抗性番茄植株的半定量RT-PCR检测分析 |
| 3.6.4 T_0代转基因植株番茄红素含量及相关叶片生理指标的检测分析 |
| 3.6.5 番茄09836转hp2基因后代(T_1和T_2)的遗传稳定性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 含不同hp基因番茄果实番茄红素含量与主要品质性状的关系 |
| 4.2 影响耐贮型番茄高频再生体系建立的主要因素 |
| 4.2.1 外植体类型 |
| 4.2.2 无菌苗的培养 |
| 4.2.3 基因型 |
| 4.2.4 激素组合 |
| 4.3 影响耐贮型番茄遗传转化的主要因素 |
| 4.3.1 预培养 |
| 4.3.2 侵染时间 |
| 4.3.3 共培养时间 |
| 4.4 在耐贮型番茄转基因过程中应注意的几个问题 |
| 4.5 利用Gateway构建表达载体的优越性 |
| 4.5.1 带有attB位点目的片段 |
| 4.5.2 构建适合的带有attR重组位点的植物表达载体 |
| 4.6 番茄转基植株的后期检测验证探讨 |
| 4.6.1 PCR扩增检测 |
| 4.6.2 半定量RT-PCR检测 |
| 4.6.3 生理指标的检测 |
| 4.7 hp2基因遗传机制及其利用展望 |
| 4.7.1 hp2基因的调控功能及分子机制 |
| 4.7.2 hp2基因的利用及展望 |
| 4.8 创新点 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）双Bt基因对杨树的遗传转化及外源基因表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 抗虫基因来源及杀虫机理 |
| 1.1.1 微生物来源的抗虫基因－Bt 基因 |
| 1.1.2 植物来源的抗虫基因 |
| 1.1.3 动物来源的抗虫基因 |
| 1.2 农杆菌介导的遗传转化 |
| 1.2.1 农杆菌（Agrobacterium） |
| 1.2.2 Ti 质粒及 T-DNA |
| 1.3 多基因聚合的复合性状转基因植物发展趋势 |
| 1.4 获得基因叠加的主要方法 |
| 1.4.1 二次转化法 |
| 1.4.2 杂交聚合法 |
| 1.4.3 共转化法 |
| 1.5 转基因植物的筛选鉴定方法 |
| 1.5.1 选择标记基因与报告基因 |
| 1.5.2 DNA 水平的分子鉴定 |
| 1.5.3 外源基因在转录水平的分子鉴定 |
| 1.5.4 外源基因在翻译水平的分子鉴定 |
| 1.6 抗虫基因在杨树中的应用研究现状 |
| 1.6.1 单 Bt 基因在杨树中的应用 |
| 1.6.2 蛋白酶抑制剂等其它抗虫基因在杨树中的应用 |
| 1.7 转双价或多价抗虫杨研究 |
| 1.7.1 Bt 基因与慈姑蛋白酶抑制剂 API 基因联合策略 |
| 1.7.2 Bt 基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂 CpTI 基因联合策略 |
| 1.7.3 Bt 基因和马铃薯蛋白酶抑制剂基因联合策略 |
| 1.7.4 Bt 基因和水稻巯基蛋白酶抑制剂基因 OC-I 联合策略 |
| 1.7.5 蛋白酶抑制剂基因之间的联合策略 |
| 1.7.6 Bt 基因和半夏凝集素基因 pta 联合策略 |
| 1.7.7 Bt 基因和蜘蛛杀虫肽联合策略 |
| 1.7.8 双 Bt 基因联合策略 |
| 1.8 转双价或多价抗虫基因植物对昆虫的致死效应 |
| 1.9 本课题研究的目的及意义 |
| 2 转单、双 BT 基因 741 杨外源基因表达及抗虫性对比研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 测试昆虫 |
| 2.1.4 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 适宜分化和生根培养基筛选 |
| 2.2.2 转基因植株炼苗移栽及田间管理 |
| 2.2.3 转基因植株的 PCR 检测 |
| 2.2.4 转基因 741 杨的 RT-PCR 和荧光定量 PCR 检测 |
| 2.2.5 转基因植株 Bt 毒蛋白测定 |
| 2.2.6 转基因植株的抗虫性检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 适宜分化培养基的确定 |
| 2.3.2 适宜生根培养基的确定 |
| 2.3.3 生根苗移栽及管理 |
| 2.3.4 转基因 741 杨外源基因的 PCR 检测 |
| 2.3.5 转基因植株的 RT-PCR 和荧光定量 PCR 检测 |
| 2.3.6 转基因植株 Bt 毒蛋白的 ELISA 检测 |
| 2.3.7 转基因株系对柳蓝叶甲的致死效应对比 |
| 2.3.8 转基因株系对美国白蛾的致死效应对比 |
| 2.4 小结 |
| 3 巨霸杨双 BT 基因遗传转化及转基因植株的检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 主要试剂、酶和试剂盒 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试验药品的配制 |
| 3.2.2 巨霸杨再生体系的建立 |
| 3.2.3 潮霉素（Hyg）对叶片分化及茎尖生长的影响 |
| 3.2.4 农杆菌介导的巨霸杨遗传转化 |
| 3.2.5 转基因植株的抗性鉴定 |
| 3.2.6 转基因植株的 DNA 水平检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 无菌组培苗建立 |
| 3.3.2 叶片再生体系的确立 |
| 3.3.3 潮霉素（Hyg）对叶片分化及茎尖生长的影响 |
| 3.3.4 转双 Bt 基因巨霸杨植株的获得 |
| 3.3.5 转基因植株的抗性鉴定 |
| 3.3.6 转基因植株的 PCR 检测 |
| 3.4 小结 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RT-PCR 与荧光定量 PCR 技术结合 |
| 4.2 多抗虫基因聚合的抗虫效应 |
| 4.3 转基因植株中外源基因的表达与沉默 |
| 4.4 农杆菌介导遗传转化的影响因素 |
| 4.5 抗生素在转基因研究中的作用 |
| 4.6 筛选标记潮霉素的使用浓度 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）3α-HSD/CR、aiiA和3α-HSD/CR-aiik基因转化烟草及表达分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 植物遗传转化的研究与应用 |
| 1.1.1 植物遗传转化的方法 |
| 1.1.2 多基因植物遗传转化的研究 |
| 1.1.2.1 多基因植物遗传转化的方法 |
| 1.1.2.2 多基因表达载体的构建 |
| 1.1.3 烟草遗传转化的研究与应用 |
| 1.1.3.1 抗性转基因烟草的研究与应用 |
| 1.1.3.2 转基因烟草用于基础理论研究 |
| 1.1.3.3 转基因烟草作为生物反应器 |
| 1.2 融合基因的研究概况 |
| 1.2.1 融合基因的基本概念及分类 |
| 1.2.2 融合基因的研究与应用 |
| 1.3 睾丸酮丛毛单胞菌 3α-羟类固醇脱氢酶基因(3α-HSD/CR)研究概况 |
| 1.3.1 睾丸酮丛毛单胞菌简介 |
| 1.3.2 3α-羟类固醇脱氢酶基因(3α-HSD/CR)研究概况 |
| 1.4 aiiA 基因的研究现状 |
| 1.4.1 aiiA 基因及其功能简介 |
| 1.4.2 aiiA 基因的应用研究进展 |
| 1.4.2.1 aiiA 基因的发现及在微生物中的表达 |
| 1.4.2.2 aiiA 基因在转基因植物中的应用研究 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 真核表达载体的构建 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.1.2 酶及试剂盒 |
| 2.1.1.3 仪器 |
| 2.1.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 引物设计 |
| 2.1.2.2 大肠杆菌质粒的提取——碱裂解法 |
| 2.1.2.3 大肠杆菌感受态的制备—TSS 法 |
| 2.1.2.4 农杆菌电击感受态的制备 |
| 2.1.2.5 真核表达载体的构建 |
| 2.1.2.6 质粒转化农杆菌——电击法 |
| 2.1.2.7 转化子 PCR 鉴定 |
| 2.2 转基因烟草的获得及阳性植株的分子检测 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 植物材料 |
| 2.2.1.2 培养基 |
| 2.2.1.3 药品及试剂 |
| 2.2.1.4 仪器 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 烟草无菌苗的培养 |
| 2.2.2.2 根癌农杆菌的培养 |
| 2.2.2.3 叶盘法转化烟草 |
| 2.2.2.4 阳性植株的检测 |
| 2.3 目的基因在转基因烟草阳性植株中的表达分析 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.1.1 植物材料 |
| 2.3.1.2 药品与试剂 |
| 2.3.1.3 仪器 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.2.1 ELISA 检测转基因烟草中 3α-HSD/CR 蛋白的表达 |
| 2.3.2.2 转基因烟草对胆固醇降解能力测定 |
| 2.3.2.3 转基因烟草对胡萝卜软腐欧文氏杆菌抗病性测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 真核表达载体的构建 |
| 3.1.1 真核表达载体质粒的酶切鉴定 |
| 3.1.2 农杆菌中质粒目的基因的 PCR 鉴定 |
| 3.1.3 测序结果 |
| 3.2 再生芽及转基因烟草阳性株的生长 |
| 3.3 转基因烟草阳性植株的检测 |
| 3.3.1 PCR 检测结果 |
| 3.3.2 转基因烟草 GUS 组织化学染色结果分析 |
| 3.4 目的基因在转基因烟草中的表达与分析 |
| 3.4.1 ELISA 检测转基因烟草中 3α-HSD/CR 蛋白的表达 |
| 3.4.2 转基因烟草降解胆固醇的能力测定 |
| 3.4.3 转基因烟草对胡萝卜软腐欧文氏杆菌抗病性测定 |
| 3.4.4 融合基因 3α-HSD/CR-aiiA 在转烟草中的表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 3α-HSD/CR 和 aiiA 基因 |
| 4.2 融合基因 3α-HSD/CR-aiiA 的表达 |
| 4.3 融合基因基因表达载体的构建 |
| 4.4 融合基因中不同来源的基因的表达及各基因之间的干扰作用 |
| 4.5 转基因植物抗病试验病原菌接种的方式的选择 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 试验所用部分试剂配方 |
| 附录Ⅱ 缩略词 |
| 致谢 |
（5）GNA基因表达载体的构建及遗传转化甘蔗（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 表达载体构建 |
| 1.2.1 植物表达载体p UNG的构建 |
| 1.2.2 植物表达载体p RNG的构建 |
| 1.3 植物表达载体p UNG和p RNG导入农杆菌 |
| 1.4 甘蔗遗传转化 |
| 1.5 转化植株的PCR检测 |
| 1.6 转化植株TR-PCR分析 |
| 1.7 转化植株叶片蛋白提取液凝血活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 植物表达载体p UNG的构建 |
| 2.2 植物表达载体p RNG的构建 |
| 2.3 植物表达载体p UNG和p RNG导入农杆菌 |
| 2.4 转化植株的PCR检测 |
| 2.5 部分PCR阳性植株RT-PCR检测结果 |
| 2.6 凝血实验数据及SAS分析结果 |
| 3 讨论 |
（6）植物凝集素基因植物表达载体的构建及遗传转化甘蔗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 甘蔗的重要性 |
| 1.1.1 重要的糖料作物 |
| 1.1.2 重要的能源作物 |
| 1.1.3 其它用途 |
| 1.2 甘蔗虫害 |
| 1.3 植物抗虫基因工程的研究进展 |
| 1.3.1 雪花莲凝集素基因的研究进展 |
| 1.3.1.1 雪花莲凝集素的定义,结构 |
| 1.3.1.2 雪花莲凝集素的抗虫机理 |
| 1.3.1.3 雪花莲凝集素基因的应用 |
| 1.3.1.4 凝集素检测方法 |
| 1.3.2 杀虫晶体蛋白的研究进展 |
| 1.3.2.1 Bt杀虫晶体蛋白的分类 |
| 1.3.2.2 苏云金杆菌毒蛋白基因的杀虫机理 |
| 1.3.2.3 Bt杀虫晶体蛋白基因的应用 |
| 1.3.3 蛋白酶抑制剂基因 |
| 1.3.4 淀粉酶抑制剂基因 |
| 1.3.5 其它抗虫基因 |
| 1.3.5.1 异戊烯转移酶基因(ipt) |
| 1.3.5.2 胆固醇氧化酶基因 |
| 1.3.5.3 动物的抗虫基因 |
| 1.3.5.4 麦胚凝集素基因 |
| 1.3.5.5 半夏凝集素基因 |
| 1.3.5.6 几丁质酶基因及其应用 |
| 1.3.6 植物抗虫基因工程存在的问题及其对策 |
| 1.4 甘蔗遗传转化的国内外研究现状 |
| 1.4.1 抗病性改良 |
| 1.4.2 抗菌性改良 |
| 1.4.3 抗虫性改良 |
| 1.4.4 抗旱基因改良 |
| 1.4.5 提高甘蔗蔗糖含量和改良蔗糖色泽的转基因研究 |
| 1.4.6 甘蔗生物反应器研究进展 |
| 1.5 本论文研究的目的、内容和技术路线 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料及试剂 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3.1 主要试剂 |
| 2.1.3.2 主要仪器 |
| 2.2 实验室常用溶液及培养基配制 |
| 2.2.1 培养基配制 |
| 2.2.2 溶液配制 |
| 2.2.3 抗生素及激素的配制 |
| 2.3 植物表达载体的构建 |
| 2.3.1 构建策略 |
| 2.3.2 pNU中间表达载体的构建 |
| 2.3.2.1 载体质粒的大量提取与纯化 |
| 2.3.2.2 载体质粒的酶切 |
| 2.3.2.3 目的片段的回收 |
| 2.3.2.4 目的片段(Ubi)与载体pNOS的连接 |
| 2.3.2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.3.2.6 连接产物的转化 |
| 2.3.2.7 重组质粒DNA的小量提取 |
| 2.3.2.8 重组质粒pUN的电泳分析 |
| 2.3.2.9 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3.2.10 重组菌pUN的保存 |
| 2.3.3 植物表达载体pUNG的获得 |
| 2.3.3.1 质粒pUN和GNA-T的提取 |
| 2.3.3.2 酶切 |
| 2.3.3.3 目的片段的回收 |
| 2.3.3.4 回收片段的连接 |
| 2.3.3.5 连接产物的转化 |
| 2.3.3.6 重组质粒DNA的小量提取 |
| 2.3.3.7 重组质粒pUNG的电泳分析 |
| 2.3.3.8 重组质粒pUNG的酶切鉴定 |
| 2.3.3.9 重组菌pUNG的保存 |
| 2.4 植物表达载体转化农杆菌 |
| 2.4.1 转化方法 |
| 2.4.1.1 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.4.1.2 农杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.4.2 重组子PCR鉴定 |
| 2.4.2.1 目的基因GNA的PCR鉴定 |
| 2.5 雪花莲凝集素基因遗传转化甘蔗 |
| 2.5.1 甘蔗转化材料及其农杆菌菌液的准备 |
| 2.5.1.1 甘蔗培养基的成分 |
| 2.5.1.2. 外植体的处理 |
| 2.5.1.3 农杆菌菌液的准备 |
| 2.5.1.4 转化材料的预处理 |
| 2.5.2 农杆菌菌液浸染愈伤组织及共培养 |
| 2.5.3 农杆菌浸染后的愈伤组织分化成苗 |
| 2.5.4 甘蔗小植株的筛选培养 |
| 2.5.5 甘蔗抗性苗的炼苗 |
| 2.6 转化植株的分子检测 |
| 2.6.1 植物总DNA的小量提取 |
| 2.6.2 转化植株的PCR检测 |
| 2.6.2.1 Ubi启动子驱动的GNA基因转化植株的PCR检测 |
| 2.6.2.2 Rbcs启动子驱动的GNA基因转化植株的PCR检测 |
| 2.6.3 RT-PCR检测 |
| 2.6.3.1 转化植株的总RNA的提取 |
| 2.6.3.2 RT-PCR的扩增 |
| 2.6.4 转化植株叶片蛋白提取液凝血活性测定 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 植物表达载体的构建 |
| 3.1.1 中间载体pUN的构建 |
| 3.1.2 植物表达载体pUNG的构建 |
| 3.1.3 植物表达载体导入农杆菌 |
| 3.2 农杆菌介导的甘蔗转化 |
| 3.3 转基因植株的分子检测 |
| 3.3.1 植物总DNA的提取 |
| 3.3.2 转化植株的PCR检测 |
| 3.3.2.1 Ubi启动子驱动的gna基因转化植株的PCR检测 |
| 3.3.2.2 Rbcs启动子驱动的gna基因转化植株的PCR检测 |
| 3.3.3 RNA的小量提取 |
| 3.3.4 部分转化植株RT-PCR检测结果 |
| 3.3.4.1 Ubi启动子驱动的gna基因部分转化植株的RT-PCR检测 |
| 3.3.4.2 Rbcs启动子驱动的gna基因部分转化植株的RT-PCR检测 |
| 3.3.5 凝血实验数据及SAS分析结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 关于GNA基因 |
| 4.2 关于叶肉特异表达启动子rbcs和玉米泛素基因ubi启动子 |
| 4.3 关于转化及筛选 |
| 5. 结论 |
| 6. 本实验的后续工作 |
| 参考文献 |
| 8. 缩写词(Abbreviation) |
| 致谢 |
（7）根癌农杆菌介导D32基因和芪合酶基因转化普通烟草的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物遗传转化的方法 |
| 1.1.1 根癌农杆菌介导法 |
| 1.1.2 基因枪转化法 |
| 1.2 烟草遗传转化的研究进展 |
| 1.2.1 烟草遗传转化的研究现状 |
| 1.2.2 烟草遗传转化的应用 |
| 1.2.3 烟草转基因的前景与展望 |
| 1.3 DREB 转录因子及其研究进展 |
| 1.3.1 转录因子概述 |
| 1.3.2 DREB 转录因子基因 |
| 1.3.3 DREB 基因在改良植物抗逆性方面的应用 |
| 1.4 芪合酶基因及其研究进展 |
| 1.4.1 芪合酶基因的种类 |
| 1.4.2 芪合酶基因的结构特征和功能 |
| 1.4.3 芪合酶的表达调控及基因工程研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 根癌农杆菌介导 D32 基因转化烟草的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 卡那霉素质量浓度对烟草叶片出愈率的影响 |
| 2.2.2 农杆菌介导D32 基因的遗传转化条件的优化 |
| 2.2.3 转基因植株的获得 |
| 2.2.4 转基因植株的分子检测 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 根癌农杆菌介导芪合酶基因转化烟草的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 农杆菌介导芪合酶基因的遗传转化体系的优化 |
| 3.2.2 转基因烟草的获得 |
| 3.2.3 转基因烟草的PCR 检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 英文缩写词表（Abbreviations） |
| 附录2 植物培养基的配制 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）云南转基因农作物研究与产业化:现状及其发展（论文提纲范文）
| 1 转基因农作物发展概况 |
| 2 云南转基因农作物研究现状 |
| 2.1 水稻 |
| 2.2 小麦 |
| 2.3 马铃薯 |
| 2.4 番茄 |
| 2.5 烟草 |
| 2.6 油菜 |
| 2.7 非洲菊 |
| 2.8 香石竹 |
| 3 云南转基因农作物的发展设想 |
| 3.1 充分利用资源优势, 分离克隆具有自主知识产权的重要功能基因 |
| 3.2 进一步完善云南农作物基因转化相应平台 |
| 3.3 大力推进云南特色农作物转基因新品种的选育 |
| 3.4 加快云南转基因农作物产业化进程 |
（9）抗虫基因植物表达载体构建、遗传转化及表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌基因 |
| 1.1.1 Bt 毒蛋白杀虫机理 |
| 1.1.2 Bt 毒蛋白的分类 |
| 1.2 转Bt 基因植物研究 |
| 1.3 影响Bt 基因在转基因植物中表达的因素 |
| 1.3.1 表达单元及辅助因子 |
| 1.3.2 植物发育 |
| 1.3.3 外部环境条件 |
| 1.3.4 受体植物的遗传背景 |
| 1.3.5 Bt 基因在受体细胞染色体上的插入位点 |
| 1.3.6 转基因植物中Bt 基因的沉默 |
| 1.4 解决害虫对转Bt 基因作物产生抗性的策略 |
| 1.4.1 选择启动子 |
| 1.4.2 同时使用两种以上的Bt 基因转化 |
| 1.4.3 联合使用Bt 基因和其它类型的抗虫基因 |
| 1.5 获得多价转基因植物策略 |
| 1.6 杨树Bt 抗虫基因工程的研究 |
| 1.6.1 国外杨树Bt 抗虫基因工程研究进展 |
| 1.6.2 国内杨树Bt 抗虫基因工程研究进展 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 植物表达载体构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 酶及生化试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 常用培养基和试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 pCAMBIA3301-Bt1 表达载体的构建 |
| 2.2.2 pCAMBIA3301-Bt3 表达载体的构建 |
| 2.2.3 pCAMBIA3301-Bt1-Bt3 表达载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 质粒pCAMBIA1305-Bt1 的PCR 检测结果 |
| 2.3.2 pCAMBIA3301-Bt1 阳性克隆的酶切及PCR 鉴定 |
| 2.3.3 质粒pCAMBIA1305-Bt3 的PCR 检测结果 |
| 2.3.4 pCAMBIA3301-Bt3 阳性克隆的酶切及PCR 鉴定 |
| 2.3.5 质粒 pCAMBIA1305-Bt1-Bt3 的酶切及 PCR 检测 |
| 2.3.6 pCAMBIA3301-Bt1-Bt3 阳性克隆鉴定 |
| 3 烟草遗传转化及转化植株的检测 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种和质粒 |
| 3.1.2 植物材料 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 抗生素 |
| 3.1.5 重要试剂、酶和试剂盒 |
| 3.1.6 重要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 选择压浓度的确定 |
| 3.2.2 抑菌抗生素浓度的确定 |
| 3.2.3 菌株培养及菌液制备 |
| 3.2.4 农杆菌介导的基因转化 |
| 3.2.5 转基因烟草的抗性鉴定 |
| 3.2.6 转基因烟草的DNA 水平检测 |
| 3.2.7 转基因烟草的蛋白质水平检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 潮酶素(Hyg)对烟草叶片分化的影响 |
| 3.3.2 潮酶素(Hyg)对嫩茎生根的影响 |
| 3.3.3 头孢噻肟钠(CTX)对叶片分化的影响 |
| 3.3.4 头孢噻肟钠(CTX)对农杆菌的抑制能力 |
| 3.3.5 遗传转化单、双价Bt 基因转基因烟草的获得 |
| 3.3.6 转化植株抗性鉴定 |
| 3.3.7 转基因烟草植株的PCR 鉴定 |
| 3.3.8 转基因烟草Bt 毒蛋白的ELISA 检测 |
| 4 741 杨遗传转化及转化植株的检测 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 菌种和质粒 |
| 4.1.3 培养基 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 叶片再生体系的确立 |
| 4.2.2 选择压浓度的确定 |
| 4.2.3 抑菌抗生素浓度的确定 |
| 4.2.4 农杆菌介导的741 杨遗传转化体系的优化 |
| 4.2.5 农杆菌介导法转化741 杨 |
| 4.2.6 转基因植株的抗性鉴定 |
| 4.2.7 转基因植株的PCR 检测 |
| 4.2.8 转基因植株Bt 毒蛋白的ELISA 检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 741 杨叶片再生体系的确立 |
| 4.3.2 潮霉素(Hyg)对叶片分化的影响 |
| 4.3.3 潮霉素(Hyg)对嫩茎生根的影响 |
| 4.3.4 头孢噻肟钠(CTX)对叶片分化的影响 |
| 4.3.5 头孢噻肟钠(CTX)抑菌浓度的确定 |
| 4.3.6 影响农杆菌转化效率因素的优化 |
| 4.3.7 转双 Bt 基因741 杨的筛选及获得 |
| 4.3.8 转基因植株的抗性鉴定 |
| 4.3.9 转基因植株的PCR 检测 |
| 4.3.10 转基因植株Bt 毒蛋白的ELISA 检测 |
| 5 讨论 |
| 5.1 植物表达载体构建 |
| 5.2 标记基因的选择 |
| 5.3 Bt 毒蛋白表达的分析 |
| 5.4 转双Bt 基因741 杨的获得 |
| 5.5 转Bt 抗虫基因植物潜在的生态风险性 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）表达AMV，WCMV外壳蛋白基因的红三叶T1，T2代分子生物学检测及抗病性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 植物抗病毒基因工程的研究进展 |
| 1.2.2 转基因植物检测与鉴定研究现状 |
| 1.2.3 植物病毒检测方法概述 |
| 1.2.4 红三叶基因工程及抗病分子育种研究现状 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验使用的主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 常用溶液及缓冲液 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 转基因红三叶T1 代植株外源基因整合检测 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 转基因红三叶T1 代植株的人工杂交及穴盘育苗 |
| 2.3.1 人工杂交 |
| 2.3.2 穴盘育苗 |
| 2.4 转基因红三叶T2 代植株外源基因整合检测 |
| 2.4.1 材料 |
| 2.4.2 方法 |
| 2.5 转基因红三叶T2 代植株外源基因转录水平检测 |
| 2.5.1 试验材料 |
| 2.5.2 RNA 实验器皿的预处理 |
| 2.5.3 方法 |
| 2.6 转基因红三叶T2 代植株对AMV、WCMV 的抗性检测 |
| 2.6.1 材料 |
| 2.6.2 试验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转基因红三叶T1 代植株外源基因整合检测 |
| 3.1.1 T1 代植株及对照DNA 琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 3.1.2 转基因红三叶T1 代植株外源基因整合PCR 检测 |
| 3.2 转基因红三叶T1 代植株人工杂交 |
| 3.3 转基因红三叶T2 代植株外源基因整合检测 |
| 3.3.1 转基因红三叶T2 代植株及对照DNA 提取 |
| 3.3.2 转基因红三叶T2 代植株外源基因整合PCR 检测 |
| 3.4 转基因红三叶T2 代植株外源基因转录水平检测 |
| 3.4.1 转基因红三叶T2 代植株及对照RNA 提取 |
| 3.4.2 转基因红三叶T2 代植株外源基因整合RT-PCR 检测 |
| 3.5 转基因红三叶T2 代植株对AMV、WCMV 的抗性检测 |
| 3.5.1 T2 代接种AMV、WCMV 病毒结果 |
| 3.5.2 接种后AMV、WCMV 在转基因与对照植株体内积累的差异 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DNA、RNA 提取及RT-PCR 技术要点 |
| 4.2 目的基因在转基因红三叶后代中的累集 |
| 4.3 外源基因在转基因植株后代中的遗传 |
| 4.4 转基因植株的抗病性检测 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ 主要实验试剂及配置 |
| 附录Ⅱ 主要实验仪器 |
| 作者简介 |
四、GNA和α-PAP双抗表达载体的构建及对烟草的遗传转化（论文参考文献）
- [1]转蜡样芽孢杆菌acdS基因生菜幼苗耐盐性的提高[D]. 刘方方. 郑州大学, 2017(11)
- [2]番茄高色素hp2基因的克隆、遗传转化及功能验证[D]. 李文枫. 东北农业大学, 2014(01)
- [3]双Bt基因对杨树的遗传转化及外源基因表达研究[D]. 王桂英. 河北农业大学, 2012(06)
- [4]3α-HSD/CR、aiiA和3α-HSD/CR-aiik基因转化烟草及表达分析[D]. 营文文. 福建农林大学, 2012(11)
- [5]GNA基因表达载体的构建及遗传转化甘蔗[J]. 刘晓娜,冯翠莲,张树珍. 热带作物学报, 2010(06)
- [6]植物凝集素基因植物表达载体的构建及遗传转化甘蔗[D]. 刘晓娜. 海南大学, 2010(05)
- [7]根癌农杆菌介导D32基因和芪合酶基因转化普通烟草的研究[D]. 安娜. 西北农林科技大学, 2010(11)
- [8]云南转基因农作物研究与产业化:现状及其发展[J]. 曾黎琼,段玉云,张云孙,程在全,黄兴奇. 云南大学学报(自然科学版), 2009(S2)
- [9]抗虫基因植物表达载体构建、遗传转化及表达研究[D]. 霍雪梅. 河北农业大学, 2009(10)
- [10]表达AMV，WCMV外壳蛋白基因的红三叶T1，T2代分子生物学检测及抗病性分析[D]. 张婷婷. 甘肃农业大学, 2009(06)