一、新进奶牛巴贝斯焦虫病的诊治（论文文献综述）
简子健[1]（2009）在《建立牛梨形虫病血清学诊断方法及新疆流行病学调查》文中研究表明牛梨形虫病（piroplasmosis）主要是由巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和环形泰勒虫引起的一种蜱传性血液原虫病,多种动物可感染,尤其是反刍动物,有时也可感染人。本病共同的临诊特征是发热、贫血、血红蛋白尿,严重者可死亡。按照病程,可将牛的梨形虫病分为急性型和慢性型；按感染类型,可将其分为显性、亚临诊性以及持续性感染。传统的检测和鉴定主要依靠显微镜检查,主要用于急性临诊感染的诊断,但难以进行梨形虫虫种鉴定。在持续性感染的动物中,由于末梢血液中的原虫数量少,容易漏诊。血清学检测可诊断亚临诊性感染和持续性带虫感染,所用的方法主要包括补体结合试验（Complement Fixation Test,CFT）、间接血凝试验（Indirect Hemagglutination Test, IHA）、乳胶凝集试验（Latex Agglutination Test, LAT）、间接荧光抗体试验（Indirect Fluorescent Antibody test, IFAT）、酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, ELISA）等,但所使用的诊断抗原大多是粗制的自然抗原,难以克服抗原种间的交叉反应。分子生物学诊断方法例如DNA探针、rRNA探针和PCR方法因辐射、需要专业人员和特殊的实验室材料与仪器等原因仅限于实验室内使用。因此,提高血清学方法的特异性是诊断和鉴定牛梨形虫病的关键所在。目前发现牛巴贝斯虫的裂殖子表面抗原2c （MSA-2c）.牛双芽巴贝斯虫的热休克蛋白20（HSP20）,牛环形泰勒虫裂殖子表面抗原1（Tams1）的共同特点是保守性好、免疫原性和反应原性强、特异性高,不仅可以作为检测牛梨形虫病的诊断抗原,也可作为预防这些疾病的亚单位疫苗或核酸疫苗的候选者。我国尚未见相关的研究报道。本研究的目的是选择MSA-2C基因、HSP20基因以及Tamsl基因进行克隆与表达,通过优化基因表达获得相应的重组蛋白,初步建立牛梨形虫病的新型血清学诊断方法,并对新疆牛梨形虫病的流行病学进行调查,为制定新疆牛梨形虫病的防治计划提供了第一手资料。通过实验研究得到如下结果：1.通过分别设计MSA-2c基因、HSP20基因以及Tams1基因序列的特异性引物,经PCR扩增,从血液原虫病患牛的全血样品的基因组DNA中克隆到MSA-2c基因、HSP20基因和Tams1基因片段。又通过设计特异性引物,经RT-PCR扩增,从血液原虫病患牛的全血样品的总RNA中,获得HSP20外显子基因片段。经序列分析发现：（1）克隆出的MSA-2c基因全长798bp,有完整的开放阅读框,与国际标准虫株（德克萨斯株AY052538）的同源性高达99.90%,与其他14个不同国家和地区分离株的MSA-2c基因序列有97.7%的同源性；（2）克隆到HSP20基因和HSP20基因外显子,全长分别为699bp和534bp,与国际标准虫株（墨西哥株）的同源性分别为99.43%和99.63%。（3）克隆的Tams1基因全长846bp,有一个完整的开放阅读框,编码281个氨基酸,与国外虫株的同源性为99.36%～99.80%。系统进化树分析显示,新疆牛环形泰勒虫Tams1基因与印度株、毛利塔里亚株、土耳其、北非共和国株进化途径一致。抗原决定簇分析显示Tams1基因编码的氨基酸具有13个交叉的抗原决定簇。上述结果表明牛巴贝斯虫的MSA-2c基因、牛双芽巴贝斯虫的HSP20基因和HSP20外显子基因以及牛环形泰勒虫Tams1基因都具有高度的保守性。2.将克隆的MSA-2c基因、HSP20外显子基因以及Tams1基因片段分别再克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,将合成的构建物转入大肠杆菌中,进行IPTG诱导表达。通过优化这些基因表达获得了相应的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析发现,MSA-2c基因、HSP20外显子基因以及Tams1基因所表达的融合蛋白分别为55kDa、46kDa、56kDa,它们分别能被抗牛巴贝斯虫、抗双芽巴贝斯虫和抗环形泰勒虫的抗血清所识别。这一结果表明表达出的融合蛋白具有很强的免疫原性和反应原性,能够作为诊断抗原建立牛梨形虫病的新型血清学检测方法。3.分别以纯化的GST-MSA-2c融合蛋白、GST-HSP20（exon）融合蛋白和GST-Tams1融合蛋白作为诊断抗原,通过优化ELISA反应条件,分别建立了可以检测牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫和牛环形泰勒虫血清特异性抗体的新型间接ELISA方法。方阵试验确定（1）GST-MSA-2c抗原的最适包被浓度为2.5μg/ml,血清最佳稀释倍数为40倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450>0.347,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。（2）GST-HSP20抗原的最适包被浓度为5μg/ml,血清最佳稀释倍数为40倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450>0.292,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。（3）GST-Tams1抗原的最适包被浓度为10μg/ml,血清最佳稀释倍数为80倍,ELISA阳性反应的临界值为OD450>0.282,批内和批间重复试验的变异系数均小于15%。特异性试验结果为（1） MSA-2c间接ELISA可以检出已知的牛巴贝斯虫阳性血清,对已知的牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、东方巴贝斯虫的阳性血清和牛巴贝斯虫阴性血清为阴性。（2）HSP20间接ELISA可以检出已知的双芽巴贝斯虫阳性血清,对已知的牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、东方巴贝斯虫的阳性血清和双芽巴贝斯虫阴性血清为阴性。（3）Tams1司接ELISA可以检出已知的牛环形泰勒虫的阳性血清,对已知的牛双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫虫、东方巴贝斯虫的阳性血清和牛环形泰勒虫的阴性血清为阴性。这些结果表明检测牛梨形虫病的这三种新型间接ELISA方法特异性好,能进行梨形虫虫种的诊断与鉴定。与对应的三种巢式PCR检测结果相比,MSA-2c间接ELISA、HSP20间接ELISA以及Tams1间接ELISA的阳性符合率为96%。上述结果表明所建立的新型重组蛋白间接ELSIA检测方法法重复性好、特异性强、灵敏度高,为大规模地进行新疆牛梨形虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。4.使用所建立的牛梨形虫病新型血清学诊断方法对2006年～2008年新疆14个地州的牛梨形虫病流行病学进行了调查。检测结果显示（1）新疆存在着牛巴贝斯虫病。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清7份,感染率为2.52%。在2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清32份,感染率为3.13%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清43份,感染率为5.28%。2008年,在地方流行性疫病区牛巴贝斯虫感染率高达28%。牛巴贝斯虫病所在的地州由2006年的2个扩大到2008年的9个。（2）新疆还存在着牛双芽巴贝斯虫病,而且比牛巴贝斯虫病严重。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清11份,感染率为5.40%。在2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清25份,感染率为4.70%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清53份,感染率为7.17%。2008年,在地方流行性疫病区牛巴贝斯虫感染率高达30%。牛双芽巴贝斯虫病所在的地州由2006年的8个扩大到2008年的13个。（3）牛环形泰勒虫病仍是新疆牛梨形病的主要病原。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清31份,感染率为11.15%。在2007年的532份牛血清样品中检出阳性血清61份,感染率为11.47%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清61份,感染率为11.51%。2008年,在地方流行性疫病区牛环形泰勒虫感染率高达24%。（4）在三年采集的1340份血清样品中共检出牛梨形虫阳性血清280例,感染率为20.90%,其中牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、泰勒梨形虫单一感染率分别为8.21%（23/280）,15.71%（44/280）和43.93%（123/280）。新疆牛梨形虫混合感染为15.35%,甚至出现三重感染现象。2008年在流行区内的牛梨形虫感染率高达74%（37/50）,单一感染与混合感染率分别为64.85%（24/37）和35.15%（13/37）,流行区的混合感染率明显增高。这些结果表明新疆牛梨形虫病由原来的一种牛环形泰勒虫病增加到三种牛梨形虫病,其流行病学特征为感染率逐年增加,疫区不断扩大,混合感染使疫情趋于复杂化,对动物和人类构成一定的威胁,不容忽视。本研究是新疆首次利用新型血清学方法对全疆牛梨形虫病进行大规模的流行病学调查,初步掌握了新疆梨形虫病流行的第一手数据和流行特点,为今后制定包括牛巴贝斯虫病、牛双芽巴贝斯虫病和牛环形泰勒虫在内的新疆牛梨形虫防控计划和综合防治措施的制定提供了依据。
沈炯玉[2]（2009）在《牛巴贝斯虫MSA-2c-iELISA抗体检测方法的建立》文中研究表明牛巴贝斯虫病（Bovine babesiosis）是由媒介蜱传播的巴贝斯虫科巴贝斯虫属的多种病原体寄生于牛的红细胞内所引起的血液原虫病的总称。本病以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为主要特征,严重时常常引起发病动物死亡。目前对于牛巴贝斯虫的诊断主要还是通过显微镜检测到虫体来确诊,该方法直观,但也极易造成误诊,这给该病的诊断和预防带来了很大的困难。本研究主要针对以上情况,旨在建立一种特异、敏感、能够在感染早期对牛巴贝斯虫做出检测的血清学检测方法。将含有牛巴贝斯虫MSA-2c基因的质粒pGEX-4T-2转化到大肠杆菌BL21（DE3）。挑选出表达量高的克隆子,经IPTG诱导表达,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（GlutathioneSepharose 4B）纯化后,SDS-PAGE和Western-Blot分析结果表明,诱导表达的pGEX-4T-2/MSA-2c阳性菌株表达出大小为55kDa,具有反应活性的重组蛋白。ELISA试验显示,重组蛋白免疫的试验小鼠抗体效价可达1∶5,120,000以上,证明MSA-2c基因的重组蛋白可作为牛巴贝斯虫病检测的一种稳定的诊断工具。采用纯化的重组牛巴贝斯虫MSA-2c蛋白为检测抗原,辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗牛IgG为二抗,建立了牛巴贝斯虫MSA-2c间接酶联免疫吸附试验检测技术（MSA-2c-iELISA）。通过优化试验确定了最佳工作条件:抗原包被浓度为2.5μg/mL,4℃过夜,血清和酶标抗体分别作1∶20倍、1∶1000倍稀释,以0.05M/pH8.5的碳酸盐缓冲液为包被液,1%BSA/PBS-T为封闭液,0.1%BSA/PBS-T为稀释液,血清与酶标抗体的最佳反应条件为37℃孵育60 min,底物显色条件为室温20-25 min。收集无牛巴贝斯虫感染的健康小牛血清95份,分别最佳稀释,用已建立间接ELISA方法检测,根据统计学原理,OD450nm值＞（?）+3S的样品,可以将其判断为阳性。计算出95份血清的平均值（（?））=0.197,S=0.05。因此,样品的阴性、阳性的临界值=0.197+3×0.05=0.347。即样品判定标准为,样本OD450nm≥0.347时判为阳性;OD450nm值＜0.347时判为阴性。交叉试验表明重组MSA-2c抗原不与其它梨形虫阳性血清反应,有较强的抗原特异性。此法稳定性和重复性较好,批内、批间变异系数能控制在10%以内。多例血清检测结果表明,所建立的ELSIA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高。
徐明勇[3]（2004）在《新进奶牛巴贝斯焦虫病的诊治》文中研究表明巴贝斯焦虫病是牛的一种原虫病。主要是靠硬蜱传播,以急性发热、贫血、血红蛋白尿为临床特征。本病的发生有明显的季节性和地区性,在我国南方各省发病较重,一般在4-9月为发病高峰期,北方发病较轻,是一种世界性的血液原虫病。本病一旦发生,传播迅速,若防治措施不当,死亡率很
二、新进奶牛巴贝斯焦虫病的诊治（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新进奶牛巴贝斯焦虫病的诊治（论文提纲范文）
（1）建立牛梨形虫病血清学诊断方法及新疆流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 梨形虫病概况 |
| 1.1 梨形虫病的分类 |
| 1.2 牛梨形虫病的流行病学 |
| 1.3 梨形虫的致病机理 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 牛梨形虫病的诊断 |
| 第二章 牛梨形虫相关重要基因的研究现状 |
| 2.1 牛巴贝斯虫MSA-2c基因的研究现状 |
| 2.2 牛双芽巴贝斯虫HSP20基因的研究现状 |
| 2.3 牛环形泰勒虫Tams1基因研究现状 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 牛梨形虫基因的克隆 |
| 第一节 牛巴贝斯虫裂殖子表面抗原MSA-2C基因的克隆与序列分析 |
| 1.1 材料和主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 牛双芽巴贝斯虫小分子热休克蛋白HSP20基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 材料和主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 新疆牛环形泰勒虫裂殖体表面抗原TAMS1基因的克隆与序列分析 |
| 3.1 材料与主要试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 基因表达 |
| 第一节 新疆牛巴贝斯虫MS-2C基因的原核表达 |
| 1.1 材料和主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 新疆牛双芽巴贝斯虫HSP20外显子基因的原核表达 |
| 2.1 材料和主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 新疆牛环形泰勒虫TAMS1基因的原核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 ELISA诊断方法的建立 |
| 第一节 新疆牛巴贝斯虫MSA-2C融合蛋白EHSA检测方法的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 新疆牛双芽巴贝斯虫GST-HSP20(EXON)融合蛋白ELISA检测方法的建立 |
| 2.1 材料和主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 新疆牛环形泰勒虫GST-TAMS1融合蛋白ELISA检测方法的建立 |
| 3.1 材料和主要试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 新疆牛梨形虫病分子流行病学调查 |
| 第一节 牛巴贝斯虫病的流行病学调查 |
| 1.1 材料和主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 牛双芽巴贝斯虫病的流行病学调查 |
| 2.1 材料和主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 牛环形泰勒虫虫病的流行病学调查 |
| 3.1 材料与主要试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四节 牛梨形虫病单一与混合感染的流行病学调查 |
| 4.1 材料和主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录Ⅰ 常用试剂及配制 |
| 附录Ⅱ 仪器设备 |
| 附录Ⅲ 常用缩略语中英文对照表 |
| 致谢 |
| 参编教材与发表的相关论文情况 |
（2）牛巴贝斯虫MSA-2c-iELISA抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 牛巴贝斯虫病研究进展 |
| 1.1 巴贝斯虫的分类 |
| 1.2 牛巴贝斯虫病的流行病学 |
| 1.3 巴贝斯虫致病的机理 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 病理变化 |
| 1.6 牛的巴贝斯虫病的诊断 |
| 1.7 牛巴贝斯虫病的防治 |
| 第二章 融合蛋白MSA-2c的制备 |
| 2.1 主要试剂材料和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 牛巴贝斯虫MSA-2c基因原核表达条件的优化及纯化 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 牛巴贝斯虫GST-MSA-2c融合蛋白ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 常用试剂及配制 |
| 附录Ⅱ 仪器设备 |
| 附录Ⅲ 常用缩略语中英文对照表 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、新进奶牛巴贝斯焦虫病的诊治（论文参考文献）
- [1]建立牛梨形虫病血清学诊断方法及新疆流行病学调查[D]. 简子健. 南京农业大学, 2009(06)
- [2]牛巴贝斯虫MSA-2c-iELISA抗体检测方法的建立[D]. 沈炯玉. 新疆农业大学, 2009(12)
- [3]新进奶牛巴贝斯焦虫病的诊治[J]. 徐明勇. 贵州畜牧兽医, 2004(06)