一、精细突变小鼠模型的研究进展（论文文献综述）
杨韧[1]（2021）在《MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究》文中研究说明冠状病毒（Coronavirus）是一类含包膜结构的单股正链非节段的RNA病毒,广泛分布于多种哺乳动物宿主中,具有跨种传播能力。目前已知感染人类的冠状病毒有7种,其中严重急性呼吸综合征冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV）与 201 9 新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2,SARS-CoV-2）是三种高致病人感染冠状病毒,在不同地区国家都曾造成严重的疫情危害。MERS-CoV自2012年首次于中东地区发现,2015年曾在韩国引发严重疫情,而至今依旧在部分地区发现偶发病例。2019年12月底由SARS-CoV-2引起的COVID-19（Corona Virus Disease 2019）疫情快速在全球蔓延,至今依旧没有得到有效的控制。然而,针对几种高危冠状病毒,目前尚无特效治疗性药物。因此,开发安全且有效的疫苗是控制病毒感染的最有效手段。亚单位疫苗及核酸疫苗,具有安全性高,易于生产制备研发等良好特点。本文基于前期的研究结果,使用哺乳动物细胞表达系统制备了基于MERS-CoV S蛋白RBD结构域的亚单位疫苗蛋白,使用肌肉或滴鼻免疫的方式在小鼠体内评价了抗原蛋白免疫原性。另外,研究基于重组RBD蛋白设计制备了信使RNA（Messenger RNA,mRNA）疫苗与自扩增RNA（Self-amplify mRNA,saRNA）疫苗,并在小鼠体内对两种RNA疫苗的免疫原性进行初步的评价。COVID-19疫情早期,我们设计了密码子优化序列的SARS-CoV-2 S蛋白的DNA疫苗与mRNA疫苗,其中mRNA疫苗与上海斯微公司合作研制。两种核酸疫苗在不同品系小鼠内进行免疫应答研究,并进行攻毒保护实验,探究疫苗的保护性。具体研究内容如下:1.MERS-CoV RBD重组亚单位疫苗和mRNA疫苗的设计与免疫原性研究MERS-CoVRBD偶联不同三聚体基序在CHO细胞表达制备的蛋白具有不同的聚集倾向,偶联T4f基序的RBD蛋白可以形成以三聚体为主二聚体为辅的高聚集态。重组蛋白RBD-T4f配合铝佐剂或铝佐剂联合CpG ODN均可以有效在BALB/c小鼠内诱导高滴度中和活性的抗体,不同佐剂的使用在细胞免疫水平表现有所差异。重组蛋白RBD-T4f配合CTA1-DD或CpG ODN佐剂滴鼻免疫可以有效诱导系统性及呼吸道局部免疫应答,在血液及呼吸道黏膜均可检测到高滴度的中和活性抗体,并可在肺组织局部检测到的高水平特异性细胞免疫应答。重组抗原RBD-T4f序列插入体外转录载体,通过酶促反应制备了重组抗原的mRNA与saRNA疫苗。研究同时对SFV4骨架saRNA的体外转录反应进行优化,成功制备了完整专一的长链saRNA分子,优化后的saRNA进入小鼠体内后可以持续表达目的蛋白至少11天。使用LPP技术包裹的重组抗原RBD-T4fmRNA疫苗初免后可以诱导抗原特异性IgM应答,两次免疫可以诱导特异性IFN-γ分泌细胞,高剂量三次免疫可以诱导一定水平的中和活性抗体产生。使用in vivo jet-PEI包裹的saRNA疫苗在免疫两次后可诱导高水平的细胞免疫应答,但难以诱导产生体液免疫应答。2.SARS-CoV-2 DNA与mRNA核酸疫苗免疫原性与保护效果研究研究对SARS-CoV-2 S蛋白序列进行人源细胞密码子优化,基于该序列设计制备了 DNA疫苗与化学修饰的mRNA疫苗。DNA疫苗使用肌肉免疫附电穿孔免疫部署后,可以有效诱导具有中和活性的特异性体液免疫应答,并诱导高水平Th1偏向的特异性细胞免疫。高剂量两次免疫后可产生攻毒保护效果。mRNA使用LPP技术包裹后物理稳定性良好,该方法生产的mRNA-LPP疫苗具有良好的免疫原性。免疫后可诱导产生高滴度的中和抗体,且具有一定的广谱中和性,可中和多种突变株病毒。高剂量两次免疫后,高水平的中和抗体与Th1偏向的细胞免疫记忆可保持13周。SARS-CoV-2攻击后,高剂量单次与两次免疫的C57BL/6小鼠肺组织病毒滴度显着降低,并有效缓解炎症病变;高或低剂量两次免疫的BALB/c小鼠也表现出相似良好的攻毒保护效果。另外,mRNA-LPP疫苗在恒河猴中也表现出良好的免疫原性,诱导高滴度广谱中和抗体,并产生攻毒保护效果。综上所述,本研究使用CHO制备的MERS-CoVRBD-T4f重组抗原蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导高滴度的中和抗体,配合合适的佐剂可以用于传统疫苗及黏膜疫苗的制备。基于重组抗原RBD-T4f设计的mRNA与saRNA疫苗诱导体液免疫能力相对有限,但可以诱导高水平的特异性细胞免疫应答。基于SARS-CoV-2 S蛋白优化序列的DNA疫苗与含化学修饰的mRNA-LPP疫苗均具有良好的免疫原性,可诱导高滴度的中和抗体及高水平的Th1型细胞免疫应答。合适的免疫剂量与方案可以诱导足够强的免疫应答,产生攻毒保护效果。这些研究为冠状病毒的疫苗研发及应用奠定了理论基础。
李晶文[2]（2021）在《EPHA4敲除对大鼠心脏形态和功能的影响及其机制的初步探索》文中研究表明目的:EPHA4是受体酪氨酸激酶EPH家族中最为特别的成员之一,可以与包括A类和B类在内的几乎所有的ephrin配体相互作用,在不同的组织和细胞类型中激活不同的下游信号通路,进而发挥不同的生物学作用。EPHA4主要在胚胎和成年时期的中枢神经系统（central nervous system,CNS）表达,参与调控中枢神经系统的发育以及多种神经疾病的发生发展。但近年的研究发现,EPHA4在外周组织中也有一定程度的表达,并参与调控血管、肾、胸腺、甲状腺等组织器官的发育,激素分泌、单核细胞黏附等生理病理过程,以及多种癌症的发生、转移和预后等。为了探究EPHA4在外周组织中是否存在未发现的特殊表达及作用,我们的课题旨在（1）构建一种可以报告EphA4基因在组织中精确表达位置的大鼠模型,并同时通过插入报告基因取代EphA4的表达实现大鼠体内EPHA4蛋白的敲除;（2）利用大鼠模型EphA4基因表达示踪的功能,观察EPHA4是否在外周组织中存在之前未发现的特异性表达;（3）利用大鼠模型既可以报告EPHA4表达谱又可以实现基因敲除的特点,研究EPHA4在特异表达的组织中发挥的作用以及可能的机制。方法:通过在Sprague Dawley（SD）大鼠EphA4启动子后插入红色荧光蛋白mCherry的基因盒,取代EphA4的第一外显子,使得mCherry自发荧光可以报告EPHA4在大鼠体内的表达谱,同时实现大鼠体内EPHA4蛋白敲除。通过活体观察评价EphA4基因敲除大鼠（SD.EPHA4（TM-mCherry）-GC/ILAS,以下简写为EphA4-/-）的生存率、体重以及运动步态等表型;通过冰冻切片荧光扫描观察mCherry在EphA4-/-大鼠不同组织中的表达谱。在对mCherry存在特异表达的心脏组织的探索中,通过超声心动描记、磁共振成像、血流动力学检测等技术检测EphA4-/-大鼠心脏的形态和功能;通过心电图描记评价EphA4-/-大鼠心电传导功能;通过组织学染色分析EphA 4-/-大鼠心脏在组织水平上的改变;通过PCR、蛋白免疫印迹以及转录组测序等技术探究EPHA4敲除后分子水平的改变。结果:本课题成功构建了含有mCherry报告基因盒的EphA4基因敲除大鼠EphA4-/-,该大鼠与同窝阴性对照大鼠（EphA4+/+）相比表现出明显的发育迟缓、袋鼠式跳跃步态以及生存率下降。通过冰冻切片扫描,我们在EphA 4-/-大鼠不同组织中观察到精确至细胞水平的自发红色荧光表达,示踪EPHA4的自然表达谱。本文首次发现EPHA4在成年大鼠心脏组织中特异性地高表达于心房组织而非心室;并且,这种特异性表达在成人心房组织中同样存在。EPHA4敲除诱导大鼠自2月龄起出现心房扩张和渐进性肥厚,心房射血分数降低,中心静脉压升高;心室功能略有下降,但心室形态几乎没有改变。值得注意的是,EPHA4敲除诱导大鼠在更早的时间点产生异常的心电信号,表现为p波消失、QRS波宽大畸形以及QT间期延长。组织学染色显示,EphA4-/-大鼠心房肌细胞横截面积显着增加,胶原纤维表达量趋向增多,窦房结区域细胞组分发生改变。RNA测序显示,EPHA4敲除改变了转录和翻译调控、离子结合、代谢和细胞粘附相关的多个基因的转录。EphA4-/-大鼠心房离子通道的mRNA表达发生改变,并且EPHA4的缺失还降低了大鼠心房胰岛素样生长因子1（IGF1）mRNA和蛋白的表达;这些改变可能与EphA4-/-大鼠中心房结构和功能的重构有关。结论:本课题中我们成功构建了带有报告基因的EPHA4敲除大鼠模型,在不同组织中直观展示EPHA4表达谱,并可精确到特定细胞群。本课题首次发现EPHA4在成年大鼠心房组织中特异性高表达,并且EPHA4的缺失会导致大鼠心房功能障碍以及心电异常信号。EPHA4敲除引起大鼠心房组织中IGF1表达降低。另外,与心房重塑和心律失常相关的多条信号通路的转录组也发生改变。这些结果提示EPHA4在心电传导过程中扮演重要角色,并可能在与心房重构相关的多种疾病如心肌病、房颤及高血压中发挥生物学作用。
张小川[3]（2021）在《高精度高内涵小鼠全脑图谱构建及其在阿尔兹海默症小鼠中的应用》文中认为在全脑范围同时获取多种结构的高分辨图谱对于深入揭示脑功能及神经系统疾病的发病机制具有重要意义。目前已有的成像技术和方法在实现大尺度、高分辨率的多种脑结构元素同步成像方面面临着巨大的挑战。作为严重威胁人类生命健康的神经退行性疾病之一,阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）常伴随广泛的脑组织学和病理学变化:一方面,脑血管结构和功能异常在AD发生发展中的重要性日益得到认可,在全脑尺度介观水平上,脑血管特别是毛细血管在AD病理中的形态和解剖学改变仍有待阐明;另一方面,已有多种成像手段揭示了 Aβ斑块的结构和分布特征,也有多通道荧光标记等方法观察到Aβ斑块对脑结构的影响,然而依然缺乏在全脑范围内针对Aβ斑块及其周围环境三维构筑的高精度、跨尺度研究。针对上述问题,本文发展了一种全脑成像策略,并采用此策略构建了 AD小鼠多种脑结构的高精度图谱。本文第一部分进行了小鼠全脑成像技术的平台搭建及后续图像处理分析,以完成全脑高精度图谱绘制方法的建立。为了实现全脑高分辨率成像以及成像后海量复杂数据的处理与解读,本文首先开展显微光学切片断层成像（Micro-Optical Sectioning Tomography,MOST）技术的应用以及构建高效数据分析流程,主要包含样本制备、数据采集、图像预处理与优化、海马分割、三维可视化重建与定量分析、虚拟内窥等环节,解决了低信噪比图像增强、噪声图像质量优化、高空间复杂度三维数据的快速渲染和量化分析等在数据处理方面依然面临诸多挑战的难题。对C57BL/6小鼠的全脑血管网络精细可视化显示了皮层、丘脑和海马等区域具有各自独特血管模式,其中海马的平均血管直径、血管长度密度、血管体积分数均最低。完整海马的高精度重建揭示了其“耙”式血管分布模式,齿状回（DG-ml）分子层的主要血管在直径和分支角度上均发生突变,呈现出独特的梳状毛细血管分布模式。对单枝海马血管的虚拟内窥从独特的视角观察血管腔的内表面形态、平滑度以及分岔模式,可以提供常规可视化手段不能涉及的血管腔内信息。本文第二部分对APP/PS1转基因小鼠的全脑血管系统进行了高分辨的可视化重建和定量分析,首次在亚微米级别分辨率上系统性地描述了 AD病理相关的海马血管分布和形态模式的变化。运用已建立的MOST技术平台及数据分析路线率先获得了 APP/PS1转基因AD小鼠及其野生型对照的Nissl染色全脑数据集,构建了包含从直径几十微米的大血管到小于2微米的毛细血管的完整小鼠全脑跨尺度三维血管图谱。通过系统定量分析野生型与APP/PS1小鼠的脑血管网络,发现APP/PS1小鼠海马血管的平均血管直径、血管体积分数均显着降低。进一步对海马不同亚区的比较分析揭示了齿状回分子层（DG-ml）的平均血管直径、血管长度密度及血管体积分数的降低程度最为显着。对单枝血管分支模式的量化分析结果表明,APP/PS1小鼠血管分支角度显着变小,导致单枝海马血管的血液灌注面积减少。最后虚拟血管内窥检查揭示了 APP/PS1小鼠与野生型小鼠在血管管腔内壁粗糙度、分支节点平滑度上均有显着差异。上述结果证明了对小鼠脑血管的高分辨率跨尺度评估的能力,并系统揭示了海马微循环尤其是齿状回在AD病理中的损伤。本文第三部分对5×FAD转基因AD小鼠全脑Nissl染色数据集进行高精度的三维重建,首次实现基于Nissl染色的小鼠全脑Aβ斑块分布可视化,首次在同一小鼠全脑中构建了 Aβ斑块及其周围胞体、神经树突、神经束和血管的高精度全景图。针对高通量明场图像背景复杂、灰度异质性导致的高难度信号提取和图像处理问题,设计了包含“虚拟通道分割”和“特征融合”的多种结构信号提取和同步可视化方法,并据此开展多种结构的高精度跨尺度的全脑构筑研究。全脑Aβ斑块密度最大区域及大尺寸斑块分布最密集区域均为内嗅皮层和邻近的海马腹侧下托区域,提示Aβ病理可能最早出现在这些最密集的区域。在全脑范围,Aβ斑块分布较密集的区域通常具有相对较多的胞体且处于血管远端,而神经纤维束在Aβ斑块相对稀疏的区域较为密集;在局部脑区,皮层区域可视化和定量分析均显示Aβ斑块密集区靠近胞体丰富的深部区域,而海马内的Aβ斑块成层状分布在锥体细胞层和颗粒细胞层附近;在亚微米分辨水平,海马辐射层内Aβ斑块周围的神经树突显示出明显的弯曲或截断,海马下托的毛细血管穿过斑块内部或附近,也呈现一定程度截断或变形且表面粗糙度高。此外,本文最后选取了可能影响血管的舒尼替尼、西地那非和可替宁进行给药实验及行为学测试,然后选取行为学变化趋势最明显的可替宁给药小鼠进行多结构同步可视化方法,发现给药后皮层Aβ斑块数量呈下降趋势,而海马区域无明显变化;垂直于脑表面的较粗的皮层血管在给药后呈增多趋势,且皮层血管体积分数显着增加,而海马区域给药后血管形态参数无明显变化。这些结果显示了基于MOST技术的三维可视化方法可能用于研究药物效应。本文提供了一种针对高通量灰度图像进行信息提取和可视化重建的方法,从而完成了对全脑范围内多种结构元素的高精度同步可视化。对全脑范围内多种结构信息的清晰展示为深入理解AD相关病理状态下的大脑解剖结构特征提供了新思路。本文对正常小鼠全脑血管网络尤其是海马血管分布模式的清晰描绘、对AD小鼠脑血管的系统评估和Aβ斑块及其周围多结构的同步可视化,不但促进了在介观水平对正常以及AD病理状态下的小鼠脑基本结构的深入认识,也可能为AD相关药物临床前开发提供新参考。
吕静薇[4]（2021）在《人参皂苷Rg1和Rb1改善航天失重效应与睡眠干扰所致认知功能减退作用及机制研究》文中指出长期航天飞行中,航天失重、节律紊乱等因素引起的认知功能减退,严重影响航天员作业能力和航天飞行任务的完成。开展该条件下的认知损伤机制研究,寻找有效的防护措施,是国际航天医学领域重点关注的问题。航天特因环境应激所诱导的认知功能损伤,是正常健康人群在特因环境下,面临远超本底作业强度的任务时,诱发的认知功能减退。功能性损伤没有明确的病变部位,靶点不明确,现代医学难以发挥作用。中医药强调从整体出发,辨证施治,通过调节人体对外源性伤害性刺激的抵抗力发挥健康维护的作用,对于应激所致认知功能性损伤的防护具有独特优势。长期临床实践表明传统中药人参等具有延缓衰老、抗疲劳、促进学习记忆等作用。药理研究表明所含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1是其主要活性成分,并可以改善多种应激引起的认知损伤。本论文将采用两种常见的航天应激动物模型（模拟失重模型、睡眠干扰模型）,在建立操作任务下学习记忆能力评价方法的基础上,结合多种行为学评价方法,研究航天模拟动物模型的学习记忆能力改变的特征、损伤强度;研究人参皂苷Rg1、Rb1的改善作用和作用特点,并探讨其作用机制。全文研究内容和结果如下:1.失重效应对学习记忆能力特征的影响研究（1）基于自发活动原理（物体认知、Y迷宫）:Y迷宫实验中,经历两周和四周模拟失重的动物自发交替百分率未发生显着性改变,动物的工作记忆能力在模拟失重两周至四周诱导后未受影响,而在物体认知实验中,两周模型动物辨别指数显着降低,提示新物体识别能力在两周时即显着损伤。（2）基于惩罚原理（跳台、避暗、穿梭、水迷宫）:跳台实验中,获得阶段:两周和四周模型动物登台潜伏期显着延长,安全区时间显着缩短,表现出对躲避电击的学习能力较差。巩固阶段,两周和四周模型动物从台上跳下的潜伏期显着缩短,安全区时间显着缩短,表现出对安全区域的记忆较差。避暗实验中,两周及四周模型动物可能因动物嗜暗驱动力不足,避暗不适用于此模型评价。穿梭实验中,经过两周的模拟失重后动物主动穿梭次数减少,逃避失败次数显着增加,安全区时间显着缩短,提示模型动物联想学习记忆能力减退。水迷宫实验中,两周及四周模拟失重模型动物潜伏期显着升高,目标象限游程比和目标象限时间比显着降低,显示出空间记忆能力受损。（3）基于奖赏原理:首次设置踏板操作-多重颜色信号辨识-奖赏获取一体化联动的奖赏操作任务,对模拟失重动物执行操作任务时的决策、信号辩识等学习记忆行为进行检测。本研究表明,模拟失重四周后,模拟失重大鼠在单次操作条件反射模式中鼻触次数、踏板次数显着减少,完成时间、操作潜伏期延长,在信号辨识模式中辨别指数显着降低,模拟失重效应对动物复杂操作能力、注意力,决策能力,信号辨识能力等均有一定影响。2.人参皂苷Rg1和Rb1及其苷元PPT、PPD对模拟失重效应模型的空间和联想式学习记忆能力改善作用及作用机制研究通过两种行为学实验表明不同剂量的人参皂苷Rg1（30,60μmol/kg）和Rb1（30,60μmol/kg）及其苷元PPT、PPD（30,60μmol/kg）灌胃给药两周后对模拟失重所致认知障碍均具有一定的改善作用。采用液质联用法和免疫印迹实验分别测定海马组织中神经递质变化和蛋白表达水平,发现人参皂苷Rg1和Rb1对模拟失重所引起的学习记忆障碍的改善作用可能与调控线粒体分裂融合平衡,抑制细胞凋亡进程,增强突触可塑性,调节Ach、DA、5-HT、Glu等神经递质水平有关。3.人参皂苷Rg1和Rb1对航天特因环境所致复杂操作任务时学习记忆能力下降的改善作用及作用机制在训练动物学会单次操作条件反射后,筛选达标动物,经过四周的模拟失重效应诱导之后再进行奖赏操作条件反射实验（包括单次操作条件反射、逆转操作、视觉信号辨识三个模式）。实验结果表明,灌胃给药人参皂苷Rg1（30,60μmol/kg）和Rb1（30,60μmol/kg）、石杉碱甲（0.1mg/kg）两周可在一定程度上改善动物的探索兴趣、注意力、操作执行力等,其中以人参皂苷Rg1的改善效果更为显着。通过HE染色、液质联用法和免疫印迹实验等对动物执行功能的重要脑区前额叶皮层区组织的进一步检测显示,人参皂苷Rg1和Rb1改善动物复杂操作任务能力可能与调节线粒体氧化磷酸化功能,改善氧化应激,介导BDNF-TrkB/PI3K-AKT通路抑制细胞凋亡,从而调节突触可塑性相关。同时,在BDNF-TrkB/PI3K-AKT信号通路上,Rg1的调控作用优于Rb1,可能是Rg1发挥较好操作任务能力改善作用的原因之一。4.人参皂苷Rg1和Rb1对睡眠干扰所致认知功能减退的改善作用及机制研究通过两周的滚筒法睡眠干扰诱导动物认知功能改变,以灌胃方式给予两周的人参皂苷Rg1和Rb1（30,60μmol/kg）,提高了模型动物在Y迷宫实验中自发交替百分率（工作记忆能力）,缩短水迷宫实验中寻台潜伏期（空间记忆能力）,同时升高了物体认知实验中的辨别指数（物体辨识能力）。采用液质联用法和免疫印迹实验分别测定海马组织神经递质和蛋白水平改变发现,睡眠干扰会诱导动物海马组织GABA水平升高,干扰PI3K-AKT信号通路,影响突触可塑性,并可能诱导细胞凋亡增加。人参皂苷Rg1和Rb1给药后逆转以上睡眠干扰所致海马组织损伤。综上所述,本课题利用三类不同原理（自发、惩罚、奖赏）的7种行为学实验方法对模拟失重模型认知损伤进行了系统、全面的分析评价。明确了模拟失重诱导的学习记忆能力改变的特征、损伤强度,其中建立的动物执行复杂操作任务时学习记忆能力评价技术为国内外首次报道。证实了人参皂苷Rg1和Rb1能够改善不同类型应激致认知功能损伤,尤其是能够改善应激状态下执行复杂操作任务时学习记忆能力。聚焦线粒体结构和功能研究,发现其改善作用与调节神经递质水平,调控线粒体分裂融合平衡,调节线粒体氧化磷酸化功能,抑制线粒体损伤引发的细胞凋亡进程,增强突触可塑性等相关。本论文为航天在轨飞行应激所致认知功能损伤评价提供了一种与临床表观、结构、预测效度高度相似的实验技术,为航天特因环境下脑功能增强提供了有效的候选药物品种,为各种应激所致认知功能损伤及防护研究从实验方法及防护品种提供了重大战略储备。
陶攀峰[5]（2021）在《RIPK1切割位点变异导致新型自身炎症性疾病的分子机制研究》文中进行了进一步梳理自身炎症性疾病是指在没有高滴度自身抗体或抗原特异性T细胞参与的情况下,机体发生非诱发炎症的一类遗传疾病,例如家族性地中海热,主要临床表现包括周期性发热、皮疹、CRP升高、淋巴结肿大、肝脾肿大、关节炎、炎症性肠病、血管炎、结节性多动脉炎、基底节钙化或肺间质病等多种形式的系统性炎症。发现新致病基因并深入研究致病机制对患者的精准治疗和研究基因的生理功能都有重要意义。RIPK1在死亡受体或模式识别受体介导的细胞凋亡、程序性坏死和炎症信号通路的激活与转换中发挥着关键作用。肿瘤坏死因子TNF与受体TNFR1结合后,招募接头蛋白TRADD和RIPK1等形成复合体I,介导NF-κB通路的级联激活,起始促炎基因和促细胞存活基因的转录。在此过程中,RIPK1起着重要的支架作用,激酶活性受到泛素化和磷酸化修饰的限制。去泛素化或去磷酸化可以激活RIPK1,促进与FADD和caspase-8等蛋白组成复合物IIa,启动RIPK1依赖的细胞凋亡。若caspase-8酶活被抑制,激活的RIPK1会招募RIPK3和MLKL形成复合体IIb导致程序性坏死、细胞内容物泄露和炎症的发生。在小鼠模型中,Fadd敲除导致过度的细胞坏死和小鼠胚胎期死亡,通过敲除Ripk1可以挽救。Casp8敲除同样导致小鼠胚胎期死亡,通过敲除Ripk3或者Mlkl可以挽救。这提示FADD-caspase-8的激活可以抑制RIPK1/RIPK3/MLKL依赖的程序性坏死来保证小鼠胚胎发育,但具体的分子机制及在人类疾病中的生理意义尚不清楚。RIPK1第324位天冬氨酸是潜在的被caspase-8切割的位点,我们从未诊断的自身炎症性疾病病例中发现两个患病家系,分别携带新发的RIPK1杂合变异p.Asp324Val和p.Asp324His,患者主要表现出周期性发热和淋巴结肿大等症状。患者血清中炎症细胞因子和趋化因子水平升高,外周血单个核细胞（PBMCs）中炎症信号通路相关基因的转录水平升高。在机制的研究中,RIPK1切割位点变异促进了小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中TNF诱导的RIPK1激活及其介导的细胞凋亡、程序性坏死和促炎细胞因子IL-6的产生。同样的,切割位点变异也促进了患者PBMCs中TNF诱导的细胞凋亡、程序性坏死和IL-6转录水平的升高,且都依赖于RIPK1的激酶活性。与PBMCs相反,患者的成纤维细胞（Fibroblasts）中RIPK1、TNFR1等蛋白的表达水平和胞内活性氧水平降低,表现出对TNF诱导的细胞坏死和对erastin和RSL3诱导的铁死亡的抵抗。基于RIPK1切割位点变异能引起细胞因子IL-6的显着变化,我们建议患者用IL-6受体抑制剂进行治疗,取得了很好的疗效。综上所述,我们发现caspase-8在RIPK1 D324位点的切割负调控了RIPK1的激活及其介导的细胞程序性死亡,而切割位点的变异导致患者PBMCs中RIPK1的过度激活及其介导的细胞凋亡、程序性坏死和炎症信号通路激活水平的升高,最终导致了患者表现出反复发热和淋巴结肿大等症状。而患者fibroblasts发展出了多种补偿机制,使其可以抵抗不同的死亡刺激,这也可能使患者没有皮肤受累或病变。
吕子超[6]（2021）在《肺动脉高压遗传图谱绘制与遗传性肺动脉高压动物模型构建》文中认为背景:肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）是指由于肺动脉结构重塑和进行性狭窄导致肺动脉阻力持续增高的恶性血管疾病。PAH的血管病理改变是进行性的,主要表现为肺小动脉内膜损伤、中层平滑肌肥大,肥大的平滑肌延伸到肺小动脉使其异常肌化。编码骨形成蛋白受体2（bone morphogenetic protein receptor2,BMPR2）基因是PAH最常见的遗传危险因素。目前已经发现了BMPR2基因上600多个与肺动脉高压有关的变异。然而,与PAH相关的BMPR2罕见变异的特征却尚不清楚。我们认为PAH患者所携带的BMPR2罕见变异与健康人群所携带的罕见变异之间的对比可以突出PAH患者BMPR2基因突变的特征。方法:对670名PAH患者进行Sanger测序或全外显子组测序,筛选符合致病性变异判定标准的BMPR2基因变异。之后采用同样的致病性变异判定标准,在包含8,624名参考人群基因序列的GnomAD数据库,以及1,884名参考人群基因序列的诺禾致源-中华基因组数据库进行比对。结果:与参考人群相比,PAH患者中BMPR2基因罕见变异的比例显着升高（21.5%,144/670 vs 0.87%,91/10,508,p=1.3×10-118）。在 PAH 患者中,51%的 BMPR2 罕见变异属于错义突变,而在参考人群中,99%的BMPR2罕见变异属于错义突变。在参考人群中没有发现Arg491位点的突变,然而在PAH患者中属于热点突变,其携带率高达14.6%（21/144）。在PAH相关的BMPR2基因错义突变更倾向于分布在胞外配体结合域（ECD,29.7%vs 11.1%,p<0.001）,此外,与非PAH相关BMPR2罕见变异相比,PAH相关错义突变会干扰所编码氨基酸电荷状态（51.4%v.s.23.3%,p<0.001）。结论:因此,位于BMPR2胞外配体结合域,或者干扰所编码氨基酸电荷状态的BMPR2错义突变,致病性更高。背景:为了研究遗传性肺动脉高压（Heritable pulmonary arterial hypertension,HPAH）的发病机制,世界各地的研究人员建立了多种BMPR2基因功能缺失的转基因小鼠模型。然而,目前所报道的小鼠模型不能完全模拟临床上PAH患者的病理改变。为了更好的了解BMPR2突变在HPAH发生发展中的作用,我们构建了一种新的BMPR2热点突变大鼠模型,并对其血流动力学等表型进行了检测。方法:通过前期的研究基础,我们对670例特发性PAH以及家族性PAH患者进行BMPR2基因突变筛选,找到了热点突变Arg491。之后用CRISPR/Cas9技术构建了携带杂合子热点突变的SD（Sprague Dawley）大鼠模型——Bmpr2R491w大鼠。通过大鼠心脏超声、右心导管以及病理实验,检测Bmpr2R491W大鼠与野生型大鼠在基线水平和暴露于低压低氧（50Kpa,10%O2）环境中3周的表型特征。结果:Bmpr2R491W大鼠在基线时表型无异常,没有出现自发性肺动脉高压的病理表现。然而,经过低压低氧处理后,Bmpr2R491W大鼠肺血管重构表现更为严重,右室肥大。Bmpr2R491W大鼠RVSP和RV/（LV+S）分别比野生型高12%和21%。超声心动图显示Bmpr2R491W大鼠右室游离壁厚度是野生型大鼠的1.23倍,三尖瓣瓣环收缩期位移和右室流出道心输出量分别降低31%和37%。Bmpr2R491W大鼠全肌化动脉比例和肌化肺动脉壁厚（直径<75μm）均较大。结论:我们首次尝试构建了与PAH相关的热点错义突变的Bmpr2转基因大鼠模型Bmpr2R491W大鼠。Bmpr2R491W大鼠较野生型更易发生肺血管重构,是研究HPAH分子机制的理想啮齿动物模型。背景:肺动脉高压（PAH）是一种威胁生命的疾病,其发病过程易受遗传因子素的影响。PAH确定是一种遗传异质性疾病,有一部分特发性PAH患者表现出遗传倾向。现已发现21个PAH易感基因。BMPR2基因突变是特发性PAH患者最主要的遗传危险因素,携带BMPR2突变的患者血液动力学指标更差,死亡风险增加。在特发性PAH患者中,除BMPR2以外的易感基因罕见变异的相对分布和影响尚不明确。因此,更全面的诠释特发性PAH患者的遗传背景有助于对临床中患者管理进行更加清晰和精准的分型,为实现精细化管理和精准医学提供有力帮助。方法:对421名特发性PAH患者进行全外显子组测序,分析了 21种已知的PAH易感基因中的罕见变异。并进一步分析患者临床表型,包括心脏功能、血流动力学参数以及远期预后,并将这些临床表型与患者的遗传表型进行关联分析。结果:高达53.7%的特发性PAH患者携带易感基因罕见变异。其中BMPR2的突变频率最高（18.5%）,其次是 GDF2（5.2%）和ACVRL1（5.0%）。除了 BMP通路相关基因的变异,还有11.4%的患者携带非BMP信号通路的变异,包括RNF213（3.3%）,TBX4（2.4%）和ATP13A3（1.9%）等。与非携带者相比,携带罕见变异的患者在诊断时更年轻,而且平均肺动脉压以及肺血管阻力更高,此外男性患者中携带者比例更高。携带BMP通路相关基因突变患者与非BMP通路相关基因变异的患者,临床表型没有显着差异。通过随访,从远期来看,携带BMPR2突变的患者预后与非携带者无显着差异,而男性患者远期预后更差;与单药治疗相比,给予联合药物治疗能够显着缓解患者的预后。结论:在临床明确诊断的特发性PAH患者队列中评估21种已知PAH易感基因的分布,以及和患者临床表型的关联,能够进一步提高了对中国特发性PAH患者遗传背景的认识。我们通过证明突变携带者的发病年龄更小且临床表现较差,证实了有害遗传变异在特发性PAH疾病进展中的作用。我们还通过随访发现,早期诊断和联合药物治疗可以缓解由遗传性危险因素导致的疾病进展。
杨辰[7]（2021）在《视网膜色素变性致病基因的鉴定及基因治疗研究》文中指出背景:视网膜色素变性（RP）是一种遗传性疾病,涉及眼睛视网膜细胞的退化和死亡,会导致视力进行性下降,并最终导致失明。其在全球的发病率约为1/3000-1/7000,是单基因致盲性眼病最主要的原因。目前已经报道大约90个基因与视网膜色素变性发生相关,这些基因突变能解释约60%的RP病例,筛选RP致病基因的有效方法是全外显子组测序技术。突变基因鉴定之后则需进一步研究相关基因致病机制及寻找合适的治疗方式,基因治疗遗传性疾病是大势所趋,是将来用于治疗单基因疾病的重要手段,特别是对于遗传性RP疾病来说尤为关键。本课题在利用医学遗传学、生物信息学等手段筛选RP致病基因突变的同时,还进行了基因治疗的初步研究,为未来应用该技术在临床上治疗RP提供技术支撑。对象与方法:本文以收集到的两个常染色体隐性遗传视网膜色素变性家系（RP-2373和RP-2370）作为研究对象。所有家庭成员均进行了全面的临床眼科检查,利用全外显子组技术进行测序,并通过Sanger直接测序对候选基因突变位点进行验证。之后构建了RP相关基因缺陷小鼠模型Rpe65基因自发点突变小鼠,并初步建立了基因治疗的体系。结果:通过全外显子组测序技术,在家系RP-2373中的RP患者（I:2,I:3和I:5）和家系RP-2370中的RP患者（001）中分别筛选出了基因CDHR1的一个新的纯合致病突变位点c.1231C>T（p.Q411X）和基因CYP4V2的新的复合杂合致病突变位点c.958C>T（p.R320X）和c.1355G>A（p.R452H）,这些变异位点在正常家庭成员以及2010名健康对照中均未发现。同时在基因治疗体系的初步建立方面,构建了RP相关基因缺陷小鼠模型Rpe65基因自发点突变小鼠,扩增了小鼠基因Rpe65全长开放阅读框,将其克隆于p AAV-IRES-hr GFP载体,双酶切和DNA测序鉴定重组病毒载体,并将该质粒与腺相关病毒包装质粒（p AAV-RC2）、腺相关病毒辅助质粒（p AAV-Helper）共转染AAV-293细胞,通过包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液,测定重组腺相关病毒的滴度高于1012copies/m L,成功构建了表达Rpe65基因的重组腺相关病毒载体,注射了21天的Rpe65自发点突变小鼠的右眼视网膜下腔发现,病毒在其视网膜光感受细胞层中高度表达,与没有注射病毒的左眼相比,延缓了视网膜光感受细胞的凋亡,视网膜电生理结果也进一步证实了这一结论,注射了病毒后的右眼视功能有较为明显的改善。结论:我们鉴定出了CDHR1基因的一个新的纯合致病突变位点c.1231C>T（p.Q411X）和CYP4V2基因新的复合杂合致病突变位点c.958C>T（p.R320X）和c.1355G>A（p.R452H）,扩展了中国人群CDHR1和CYP4V2基因突变谱,为RP的遗传咨询和产前诊断提供了理论依据。并且初步建立起了基因治疗的整个流程和体系,为将来的基因治疗RP的广泛应用奠定基础。
朱雄[8]（2020）在《EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究》文中研究表明神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases）是一类以中枢神经系统（神经元）和（或）外周神经系统（髓鞘）的变性、凋亡所导致的结构和功能的进行性退化为特征的异质性疾病。随着人口老龄化问题日益突出,神经退行性疾病已成为世界范围内危害人类健康最严重的疾病之一。神经退行性疾病的发病机理极其复杂,至今尚不能被完全解释清楚,到目前为止缺少有效的诊断和治疗方法。目的:在神经退行性疾病中,脑和视网膜神经退行性病变是目前研究的热点。此类疾病引起损害的病理是神经元细胞的不可逆性损伤,目前临床上对此缺乏行之有效的治疗手段。视网膜营养不良（Retinal dystrophy）是一类因光感受器功能丧失而引起的异质性遗传性疾病。在全球尤其是工业化国家中,视网膜变性疾病是致盲的重要原因之一。这些疾病的临床表型复杂性和等位基因的异质性给疾病的正确诊断带来困难。内质网膜蛋白复合物（endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC）首先在酿酒酵母中被鉴定为内质网中蛋白质折叠所需的6亚单位跨膜蛋白复合物。EMC亚基的丢失会导致错误折叠的膜蛋白的积累和未折叠蛋白反应（UPR）的诱导。有研究报道,EMC1基因突变与视网膜营养不良及小脑发育退化综合征相关。在真核生物中,d Pob/EMC3定位于内质网,并与EMC1和钙连蛋白（calnexin）结合并相互作用。此外,内质网膜蛋白复合物（EMC）是其他多通道跨膜蛋白的稳定表达所必需的,如视紫红质和Na+K+-ATP酶等。另外,d Pob/EMC3缺失会导致果蝇单眼细胞的变性。这些结果共同表明,EMC是包括视紫红质1在内的多通道跨膜蛋白生物发生过程中的一个关键因素,其缺失会导致视网膜变性。EMC1和EMC3组成复合物参与内质网相关降解（ERAD）途径,表明EMC与ERAD途径之间存在密切联系。内质网结构和功能的紊乱在神经退行性疾病中已被广泛观察到,但内质网功能障碍是神经退行性疾病病变的原因,还是仅仅是神经元死亡的表现,目前尚不清楚。本论文重点研究EMC3在小脑和视网膜中的功能。方法:构建EMC3、EMC1等表达质粒载体（包括野生型和突变型）,分别进行细胞转染,结合免疫组化等方法,通过高分辨激光共聚焦显微镜、荧光共定位等分析其在细胞中的表达及定位情况,分析EMC1突变是否引起细胞中定位发生变化。研究EMC3与EMC其他亚基的表达及定位分析。在前期工作中,本研究发现小鼠Emc3基因胚胎敲除导致早期胚胎死亡。因此使用Pcp2-cre转基因小鼠和Emc3条件性敲除小鼠建立了一个在小脑浦肯野神经细胞和视网膜双极细胞中特异敲除Emc3基因的动物模型。本论文综合运用分子生物学,细胞生物学和免疫组化等方法,详细研究Emc3在双极细胞和小脑浦肯野细胞中的功能。利用双极细胞和小脑浦肯野细胞中特异蛋白标志物,对Emc3缺失的小鼠视网膜和小脑冰冻切片进行免疫染色,使用高分辨率激光共聚焦显微镜,详细分析这些关键蛋白的运输和定位。结果:EMC3由小鼠Tmem111基因编码,是高度保守的内质网膜蛋白复合物（EMC）的一个亚基。本研究发现Emc3的靶向缺失导致了小鼠严重的神经病变表型。同时Emc3lox P/lox P;Pcp2-Cre小鼠是可以长期存活并是可育的,但行为学上表现出类似于小脑共济失调的表型。与野生型小鼠相比较,三月龄的成年Emc3突变小鼠小脑中浦肯野细胞的树突发育有明显减少。本研究进一步发现,浦肯野细胞中Emc3的选择性缺失导致内质网错误折叠的膜蛋白的积累,阻碍了浦肯野细胞的分泌运输,并导致了树突萎缩。这些表型表现为小脑体积变小和浦肯野细胞数量减少,导致共济失调。浦肯野细胞丢失和共济失调最初出现在出生后两个星期左右,但随着年龄的增长逐渐恶化。Emc3的缺失导致浦肯野细胞缺失区域神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加和星形胶质细胞增生。C/EBP同源蛋白（CHOP）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78/BIP）表达水平升高表明浦肯野细胞在可见细胞丢失之前存在内质网应激（ER Stress）。TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）分析表明,小脑浦肯野细胞出现细胞凋亡。本文的数据表明,浦肯野细胞中Emc3的缺失导致蛋白质折叠和运输缺陷,树突密度显着降低,星形胶质细胞增生和浦肯野细胞死亡。此外,本研究发现Emc3突变小鼠视网膜中视杆双极细胞与野生型小鼠相比有进行性病变,这表明Emc3在小鼠的视网膜结构和功能维持发挥重要作用。结论:研究结果表明了Emc3在小鼠浦肯野细胞和视网膜双极细胞的发育和功能维持发挥重要作用。本文的研究揭示了EMC3蛋白在小脑浦肯野细胞和视网膜中的重要作用,为研究小脑共济失调和视网膜神经退行性疾病提供了新方向与思路。
肖锐[9]（2020）在《小脑异常神经发生参与自闭症模型小鼠运动障碍及其相关机制研究》文中研究说明研究背景:自闭症（Autism Spectrum Disorder,ASD）是一类以社会交互能力损害,兴趣狭窄和限制与重复刻板样行为为主要特点的临床征候群,发病率逐年升高。运动障碍是自闭症患者中最常见的合并症之一,包括震颤、共济失调、运动失能、肌张力障碍等。对于社会交流与社会适应能力已经受损的自闭症患者,运动障碍进一步限制了其生活独立性及生活质量。另外,运动影响高级认知行为,在语言交流、情感控制、执行能力、运动行为控制等方面发挥重要的作用,因此运动障碍可能参与自闭症行为的发生。小脑位于大脑半球后方,是相对独立的神经中枢,同时也是调节运动功能的重要脑区。小脑结构异常及其引起的功能障碍在临床自闭症患者和模型小鼠中得到广泛证实,因此,小脑亦是自闭症病理发生机制研究的一个重要脑区。研究小脑发育异常引起运动障碍发生发展的病理过程,有助于从运动障碍的角度理解自闭症的病理发生机制。小脑具有典型的三层板层样结构,包括分子层（Molecular Layer,ML）、蒲肯野细胞层（Purkinje Cell Layer,PCL）以及内颗粒层（Inner Granule Layer,IGL）。小脑的发育主要在生后早期完成,人类小脑发育在两岁内逐步完善,而小鼠则在2周内基本完成小脑的发育。小脑发育过程中,数十亿计的颗粒神经元由小脑外颗粒层（External Granule Layer,EGL）中的颗粒神经元前体细胞（Granule Cell Precursors,GCPs）增殖产生,随后沿着伯格曼细胞的放射状纤维向内迁移,到达IGL后形成成熟颗粒神经元。在此过程中,颗粒神经元发出平行于小脑皮层的“T形”纤维,穿行于分子层中,并与蒲肯野细胞向上生长到达ML中的树突形成突触联系。蒲肯野细胞的胞体则向下发出轴突联系至小脑深部的核团,并经此中转投射至更广泛的大脑区域。当所有的颗粒神经元完成迁移后,EGL消失,蒲肯野细胞也基本发育完善,由此形成小脑的三层板层结构。板层结构形成的过程中,小脑皮层特定部位颗粒神经元增殖速度变快,并通过蒲肯野神经元轴突的锚定向内牵引,小脑皮层在该部位形成向内的凹陷。随着小脑皮层向外地发育,逐渐形成了小脑的叶片状结构。在小脑发育的关键期,关键细胞学事件发生异常会导致小脑叶片和板层结构发育异常,进而引起神经网络形成的受阻及神经活动的异常。蒲肯野细胞是小脑内唯一的传出神经元,研究者在自闭症患者和模型小鼠中发现蒲肯野细胞的病理学改变和功能异常,并且这与自闭症患者中运动障碍行为的出现高度关联,然而其潜在的机制目前仍不明确。BTBR T+Itpr3tf/J（BTBR）小鼠是目前应用非常广泛的一种特发性自闭症模型小鼠,携带了Disc1del、T+、Itpr3tf、Cox7a2ll突变基因,从而表现出自闭症的一系列症状,包括社交功能障碍、重复刻板样行为等核心症状。近期的研究发现BTBR小鼠同时表现出感觉运动异常及空间感知异常,并且倾向于过度活跃及冲动行为。此外,在BTBR小鼠中亦观察到小脑中免疫、氧化应激等相关改变,而Haijie Yang在研究中发现BTBR小鼠小脑叶片异常增多。然而BTBR小鼠运动功能障碍是如何发展并影响自闭症行为,小脑发育参与运动功能障碍的途径和细胞学机制均需进一步阐明。在本研究中,我们进一步探索并明确了BTBR小鼠的肌张力障碍样行为和注意力缺失样行为。同时,我们发现BTBR小鼠生后小脑神经发生异常,并影响了叶片形成和蒲肯野细胞发育,这些发育关键期出现的细胞学事件异常可能与其运动障碍行为相关。研究方法:小鼠出生后3天（Postnatal day 3,P3）至P150通过悬尾实验连续观察比较BTBR小鼠及野生型（Wild Type,WT）小鼠肌张力障碍样行为。P14至P150通过金属网格悬挂实验观察比较BTBR小鼠及WT小鼠肢体协调能力及抓握能力。小鼠成年后（8周）通过水平爬梯实验、加速转棒实验及旷场实验观察比较BTBR小鼠及WT小鼠精细运动能力、运动学习能力、运动协调能力及整体运动性。分别收集P3、P7、P14及成年期（3月龄）BTBR小鼠及WT小鼠小脑标本,通过比较BTBR小鼠及WT小鼠小脑HE染色结果,观察BTBR小鼠小脑大体形态改变及其发育进程。通过BrdU及Ki67免疫荧光染色观察P3、P7时BTBR与WT小鼠GCPs增殖情况,NeuN免疫荧光染色、尼氏染色及HE染色观察颗粒神经元迁移进程及成熟颗粒神经元异位情况,GFAP及S100β免疫荧光染色观察P7时BTBR小鼠及WT小鼠伯格曼胶质细胞发育情况,CB免疫荧光染色及免疫蛋白印迹观察P14时BTBR小鼠及WT小鼠蒲肯野细胞的发育。通过高尔基染色观察P14时BTBR小鼠及WT小鼠蒲肯野细胞树突形态、树突棘数量及分型。通过GAD67及vGlut1免疫荧光染色及免疫蛋白印迹观察成年期BTBR小鼠及WT小鼠小脑兴奋性及抑制性神经递质表达情况。最后,在P14时收集BTBR小鼠及WT小鼠新鲜小脑样本,通过全转录组测序及实时荧光定量PCR技术,比较BTBR小鼠和WT小鼠小脑差异表达基因,并通过通路富集及蛋白互作分析以深入探索BTBR小鼠小脑异常发育及成年期BTBR小鼠运动障碍及异常行为表型的可能机制。研究结果:1、BTBR小鼠的运动障碍表型（1）悬尾实验中,成年期BTBR小鼠出现严重的肌张力障碍样行为,与WT小鼠相比较,BTBR小鼠后肢明显屈曲过度、双后爪及前后爪异常交错握爪、躯干过度扭转以及过度伸展。（2）悬尾实验追踪观察,BTBR小鼠肌张力障碍样行为出现在P10,随后其发病率逐渐上升,P14时90%的BTBR小鼠均出现肌张力障碍样行为,之后一直维持在该水平持续至成年期。（3）金属网络抓握实验中,在P21时,与WT小鼠相比较,BTBR小鼠抓握时间即掉落潜伏期明显缩短,之后至P150 BTBR小鼠掉落潜伏期持续下降并一直显着低于WT小鼠。（4）爬梯实验中,与WT小鼠相比较,成年期BTBR小鼠在规则模式及不规则模式其爪掉落总次数均显着增加,爬梯穿越时间则显着减少。（5）旷场实验中,与WT小鼠相比较,成年期BTBR小鼠其总运动路程及中央运动路程均显着增加,平均运动速度在第一个5分钟阶段显着增加。（6）加速转棒实验中,成年期WT小鼠第二天掉落潜伏期则相比第一天出现显着提升,之后三天提升更加明显,而成年期BTBR小鼠直至第五天时才相比第一天出现显着差异,BTBR小鼠与WT小鼠相比较,其运动学习能力显着更差,同时BTBR小鼠转棒运动学习过程中出现注意力缺失样行为。2、BTBR小鼠生后发育关键期小脑的异常神经发生（1）成年期小脑组织切片DAPI染色结果显示:BTBR小鼠小脑矢状切面面积较WT小鼠显着增大,主要为内颗粒层及分子层面积增大,BTBR小鼠小脑叶片平均数量较WT小鼠显着增多。P14时,BTBR小鼠小脑的重量较WT小鼠显着增加,且BTBR小鼠P14时小脑占大脑的质量百分比较WT小鼠明显增加。生后小脑发育关键期HE染色结果显示:BTBR小鼠与WT小鼠小脑叶片数量在P3时无明显差异,P7及P14时显着增多;BTBR小鼠小脑矢状切面面积较WT小鼠在P3、P7及P14时均显着增大,BTBR小鼠小脑矢状切面周长较WT小鼠在P3、P7及P14时均显着增加。（2）生后一周,小脑GCPs快速增殖并分化为颗粒神经元,BrdU和Ki67免疫荧光染色用于分析GCPs的增殖。在P3时,小脑BrdU免疫荧光染色结果显示:BTBR小鼠外颗粒层厚度较WT小鼠显着增厚,外颗粒层中BrdU密度、总数量及其占总细胞百分比均显着增加。Ki67免疫荧光染色结果显示:BTBR小鼠小脑外颗粒层Ki67免疫反应阳性细胞较WT小鼠在P3与P7时均显着增加。（3）P7时Neu N免疫荧光染色结果显示:NeuN标记的成熟颗粒神经元主要位于内颗粒细胞层,BTBR与WT小鼠小脑的外颗粒细胞层与分子层中均未观察到NeuN标记的异位神经元,DAPI染色显示两组间外颗粒层厚度无显着差异。HE染色中,分子层中梭形核可以标识迁移的颗粒神经元,我们发现P7时,BTBR小鼠分子层中梭形核数量较WT小鼠显着增加,但其百分比即迁移率无明显差异。小脑中的伯格曼胶质细胞胞体主要位于蒲肯野细胞层,伯格曼胶质纤维引导颗粒神经元的迁移,其胞体和放射状纤维可以用S100β和GFAP分别进行特异性标识。P7时S100β及GFAP免疫荧光染色结果显示:BTBR小鼠与WT小鼠相比较,小脑伯格曼细胞胞体数量及纤维密度均无明显差异。成年期小脑尼氏染色显示:BTBR小鼠分子层及颗粒层中成熟颗粒神经元数量及分布较WT小鼠无明显区别。以上结果提示BTBR小鼠小脑颗粒神经元的迁移以及伯格曼胶质细胞的发育均未受显着影响。（4）P14时,BTBR及WT小鼠小脑CB免疫荧光染色标记的蒲肯野细胞其胞体呈单层排布,树突位于分子层。BTBR小鼠小脑各叶片蒲肯野神经元密度与WT小鼠相比较无明显差异,而在叶片Ⅳ/Ⅴ、Ⅵ/Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ中蒲肯野神经元胞体横截面积较WT小鼠显着变小。蛋白印迹分析结果显示P14时BTBR小鼠小脑CB蛋白相对表达量较WT小鼠显着减少。成年期小脑CB免疫荧光染色结果显示:BTBR小鼠小脑叶片Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ中蒲肯野细胞密度较WT小鼠显着降低。（5）高尔基染色结果显示:P14时BTBR小鼠小脑内蒲肯野细胞树突覆盖面积、主树突长度及树突复杂程度sholl分析与WT小鼠相比较无明显差异,但是BTBR小鼠蒲肯野细胞树突棘密度较WT小鼠显着增加。根据树突棘的形态进行亚型分析,我们进一步发现BTBR小鼠蒲肯野细胞树突棘细长未成熟型较WT小鼠显着增多,而中间短粗型树突棘及成熟蘑菇状树突棘则较WT小鼠显着减少。（6）小鼠成年期,GAD67与CB免疫荧光双标染色结果显示:GAD67主要分布于蒲肯野神经元的胞质中,少量存在于树突底部,GAD67与CB间存在明显的双标重合,且WB检测进一步证实成年期BTBR小鼠小脑内GAD67蛋白表达较WT小鼠显着降低。vGlut1与CB免疫荧光双标染色结果显示:vGlut1大部分存在于分子层中的平行纤维,围绕蒲肯野神经元的树突,以及颗粒细胞层中的颗粒神经元中,并且vGlut1蛋白表达检测后发现,BTBR小鼠小脑中vGlut1蛋白表达较WT小鼠显着增加。3、BTBR小鼠生后发育关键期小脑的基因表达调控（1）P14时BTBR小鼠及WT小鼠小脑新鲜送检样本质检结果均较好,组内样本相关性较好,且组间基因表达模式存在一定差异。（2）P14小脑全转录组测序结果显示,BTBR小鼠与WT小鼠相比较共有3992个差异表达基因,其中1858个为上调表达基因,2134个为下调表达基因。（3）差异表达基因KEGG通路富集分析中,BTBR小鼠与WT小鼠相比较共有23条改变通路,其中涉及谷氨酸能、胆碱能、多巴胺能、γ-氨基丁酸能、5-羟色胺能等各类突触递质相关通路。（4）差异表达基因GO通路富集分析中,BTBR小鼠与WT小鼠相比较在生物过程水平共有16条改变通路,其中多数涉及神经发生,包括神经元分化负性调节、神经系统发育负性调节、神经发生负性调节、细胞生长分化调节、细胞发育负性调节等,而在细胞成分水平则共有50条改变通路,其中涉及很多与突触膜、轴突、突触前、突触后、树突、树突棘等突触成分相关通路。（5）蛋白互作分析中,改变较大及互作联系较多的基因主要为下调基因Dynlt1b、Draxin、Rbpj及上调基因Nog、Trpc6、Bdnf,经实时荧光定量PCR验证发现BTBR小鼠较WT小鼠这些基因均有显着改变且与测序结果一致。其中Trpc家族在小脑发育过程中发挥重要作用,而BTBR小鼠较WT小鼠Trpc家族相关Trpc4基因及Trpc6下游CamkⅣ基因表达显着上调,Trpc3基因表达显着下调。研究结论:BTBR小鼠有明显的肌张力障碍样行为、注意力缺陷样行为、多动样行为、运动协调能力下降、精细运动损害及运动学习能力下降等运动障碍,这些运动障碍可能与BTBR小鼠小脑发育关键期异常的小脑神经发生相关,包括叶片形成异常、颗粒神经元前体细胞异常增殖、蒲肯野神经元发育异常及突触联系异常,而究其原因可能是发育期BTBR小鼠基因表达调控模式的改变,在发育关键期影响了小脑的神经发生。
庄燕[10]（2020）在《神经遗传疾病及认知障碍相关基因的RNA选择性剪接调控机制研究》文中指出RNA选择性剪接（AS）是基因产生转录组、蛋白质组复杂性和多样性的关键机制,并在神经系统发育与正常功能维持中广泛存在。既有大量研究显示,AS的错误调控与人类神经退行性和认知疾病如阿尔茨海默症（Alzheimers disease,AD）、肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）、强直性肌营养不良（Myotonic dystrophy,DM）以及神经发育疾病自闭症（Autism spectrum disorder,ASD）等相关。但是,在众多已经检测到的AS事件中,究竟哪些事件提供了重要的生物学功能并未完全探明。因此,系统探索和定义AS在疾病背景下的作用,对了解人类遗传性神经疾病的发生、发展的分子基础具有重要意义。针对RNA选择性剪接与神经精神疾病发生相关联的机制,本项研究工作分为以下两部分:一、探究RNA剪接因子HNRNPA1在神经退行性疾病中的新作用。我们的研究揭示了RNA剪接因子HNRNPA1是1型强直性肌营养不良（Myotonic dystrophy type 1,DM1）的一个新致病因子。它在DM1中的作用与CELF1（已经被证明的DM1致病明星分子）相类似。HNRNPA1蛋白水平在正常发育过程中会逐渐下调,但在DM1患者中却表现出明显的上调,同时也可以促进DM1相关基因剪接形式由成年向胚胎形式的转变。但是HNRNPA1与CELF1作用的DM1靶位点池并不完全重叠。我们的研究结果证明DM1疾病特别是选择性剪接异常的发生是MBNLs功能丧失,CELF1和HNRNPA1异常上调所致的综合作用结果;二、探索认知障碍基因即ASD相关基因Neurexins（Nrxns）选择性剪接调控的机制及生理意义。我们的研究结果表明,Nrxns小外显子AS3、AS6的AS可受神经特异性RNA剪接因子SRRM3、SRRM4调控,其选择性剪接依赖于神经活性的变化。并且,我们的实验结果还表明,Nrxns小外显子AS3、AS6的AS会影响Nrxns对突触后标记分子PSD95和Gephyrin的募集,提示AS3、AS6的选择性剪接可能也参与调控兴奋性与抑制性突触的平衡。但是对于Nrxns小外显子AS与高级神经活动更为相关的潜在生理学意义,目前还缺乏研究证据,仍需要进一步探索。
二、精细突变小鼠模型的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、精细突变小鼠模型的研究进展（论文提纲范文）
（1）MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 1.1 冠状病毒结构 |
| 1.2 冠状病毒的感染与复制 |
| 1.3 人类冠状病毒 |
| 2. 冠状病毒动物模型研究进展 |
| 3. MERS-CoV与SARS-CoV-2疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活病毒疫苗 |
| 3.2 亚单位疫苗与病毒样颗粒疫苗 |
| 3.3 重组病毒载体疫苗 |
| 3.4 核酸疫苗 |
| 4. 研究背景与目的 |
| 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 生物学材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 质粒构建 |
| 2.2 疫苗制备 |
| 2.3 抗原检测及表达验证 |
| 2.4 动物免疫与分组 |
| 2.5 免疫学检测 |
| 2.6 攻毒保护实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 第一部分 MERS-CoV重组亚单位疫苗与mRNA疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) MERS-CoV重组RBD抗原亚单位疫苗研究 |
| 1. MERS-CoV RBD重组蛋白设计与制备 |
| 1.1 MERS-CoV RBD重组抗原设计与构建 |
| 1.2 MERS-CoV RBD重组抗原蛋白的制备与鉴定 |
| 2. 重组抗原蛋白RBD-T4f的免疫原性初步研究 |
| 2.1 重组蛋白RBD-T4f诱导高水平的中和抗体 |
| 2.2 重组蛋白RBD-T4f可以诱导特异性细胞免疫应答 |
| 3. 重组抗原蛋白RBD-T4f的黏膜免疫应用研究 |
| 3.1 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导系统性体液免疫应答 |
| 3.2 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导呼吸道高水平中和IgA |
| 3.3 重组蛋白RBD-T4f配合黏膜佐剂诱导肺组织细胞免疫应答 |
| (二) MERS-CoV mRNA疫苗研究 |
| 1. 自扩增mRNA疫苗制备优化与体内表达研究 |
| 1.1 自扩增mRNA分子体外转录制备优化 |
| 1.2 自扩增mRNA疫苗分子可在小鼠体内持续表达目的蛋白 |
| 2. 基于重组三聚体靶抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的设计与构建 |
| 2.1 重组抗原mRNA与自扩增mRNA疫苗设计 |
| 2.2 重组抗原mRNA与自扩增mRNA的表达验证 |
| 3. 重组抗原RBD-T4f的两种mRNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3.1 重组抗原mRNA疫苗可诱导有限的体液免疫应答 |
| 3.2 重组抗原mRNA疫苗与自扩增mRNA疫苗诱导较强的细胞免疫应答 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 SARS-CoV-2核酸疫苗研究 |
| 前言 |
| (一) SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 DNA疫苗构建与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 SARS-CoV-2 DNA疫苗可以诱导中和活性抗体 |
| 2.2 SARS-CoV-2 DNA疫苗诱导Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 DNA疫苗免疫后可产生攻毒保护效果 |
| (二) SARS-CoV-2 mRNA疫苗免疫原性与保护性研究 |
| 1. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗物理性状与表达鉴定 |
| 2. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗免疫原性研究 |
| 2.1 mRNA-LPP疫苗诱导高中和活性且较为持久的体液免疫应答 |
| 2.2 mRNA-LPP疫苗诱导广谱中和活性抗体 |
| 2.3 mRNA-LPP疫苗可以诱导高水平Th1型细胞免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗可产生持久的保护性 |
| 4. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗与DNA疫苗免疫效果比较 |
| 5. SARS-CoV-2 mRNA-LPP疫苗恒河猴攻毒保护效果评价 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）EPHA4敲除对大鼠心脏形态和功能的影响及其机制的初步探索（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1. 实验动物 |
| 1.2. 人组织样品 |
| 1.3. 实验仪器 |
| 1.4. 实验试剂 |
| 1.5. 主要试剂配制 |
| 1.6. 聚丙烯酰胺凝胶配制 |
| 1.7. 引物序列 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1. EphA4基因敲除大鼠模型建立 |
| 2.2. 基因组DNA提取与鉴定 |
| 2.2.1 DNA提取 |
| 2.2.2. 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.2.3. 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3. 生存率分析 |
| 2.4. 组织准备 |
| 2.4.1. 大鼠主要脏器冰冻切片准备 |
| 2.4.2. 大鼠主要脏器冻存组织准备 |
| 2.4.3. 大鼠心脏石蜡切片准备 |
| 2.4.4. 大鼠窦房结石蜡切片准备 |
| 2.4.5. 人心脏石蜡切片准备 |
| 2.5. mCherry荧光观察 |
| 2.6. H&E染色 |
| 2.7. Masson染色 |
| 2.8. 免疫荧光染色 |
| 2.9. 细胞凋亡原位检测(Tunel染色) |
| 2.10. 超声心动描记 |
| 2.11. 磁共振成像 |
| 2.12. 心脏血流动力学检测 |
| 2.13. 心电描记 |
| 2.14. 心率变异性分析 |
| 2.15. 逆转录PCR与实时定量PCR |
| 2.15.1. 逆转录PCR |
| 2.15.1.1. 总RNA提取 |
| 2.15.1.2. 去除基因组DNA |
| 2.15.1.3. 逆转录合成cDNA |
| 2.15.2. 实时定量PCR |
| 2.16. 蛋白印迹(western blot) |
| 2.16.1. 蛋白质提取 |
| 2.16.2. BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.16.3. 蛋白样品准备 |
| 2.16.4. 蛋白免疫印迹 |
| 2.16.5. 曝光 |
| 2.17. RNA测序 |
| 3. 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 1. EPHA4敲除大鼠的建立 |
| 2. EPHA4敲除大鼠基本表型分析 |
| 3. mCherry在EPHA4敲除大鼠不同组织中的表达模式 |
| 4. EPHA4在大鼠心脏组织中的表达 |
| 5. EPHA4在人心脏组织中的表达 |
| 6. EPHA4敲除引起大鼠心脏重构 |
| 6.1. EPHA4敲除引起大鼠心房重量增加 |
| 6.2. EPHA4敲除引起大鼠心房扩张 |
| 6.3. EPHA4敲除降低大鼠左心室功能但几乎不影响左心室形态 |
| 6.4. EPHA4敲除改变大鼠心房容积并降低心房射血分数 |
| 6.5. EPHA4敲除降低大鼠中心静脉压 |
| 6.6. EPHA4敲除诱导大鼠心电p波消失以及多项心电参数异常 |
| 6.7. EPHA4敲除引起大鼠心率变异性时域参数和频域参数改变 |
| 7. EPHA4敲除引起大鼠心脏组织学改变 |
| 7.1. EPHA4敲除引起大鼠心房心肌细胞肥厚 |
| 7.2. EPHA4敲除诱导大鼠胶原纤维表达呈升高趋势 |
| 7.3. EPHA4敲除对大鼠心房细胞凋亡没有明显影响 |
| 7.4. EPHA4敲除引起大鼠窦房结组织学改变 |
| 8. EPHA4敲除诱导大鼠心房结构和功能重塑的潜在分子机制 |
| 8.1. 配体ephrinA1和B2在野生大鼠心房组织中高表达 |
| 8.2. EPHA4敲除引起大鼠心房离子通道相关基因改变 |
| 8.3. EPHA4敲除诱导大鼠心房组织中IGF1表达量下降 |
| 9. EPHA4敲除引起大鼠心房组织转录组改变 |
| 9.1. EphA4基因敲除组与对照组大鼠心房差异表达基因GO分类 |
| 9.2. EphA4基因敲除组与对照组大鼠心房中Eph家族成员表达情况 |
| 9.3. EphA4基因敲除组与对照组大鼠心房差异基因功能和信号通路富集 |
| 第四章 讨论 |
| 1. EPHA4敲除大鼠动物模型 |
| 2. 成年大鼠中枢神经系统中EPHA4的表达 |
| 3. 成年大鼠外周组织中EPHA4的表达与作用 |
| 4. EPH家族成员在心脏组织中的表达及功能 |
| 5. EPHA4敲除诱导大鼠心房重塑的潜在机制 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文 |
| 文献综述 EPHA4在神经系统疾病中的作用 |
| 1. 前言 |
| 2. EphA4与神经退行性疾病 |
| 2.1. 阿尔兹海默症 |
| 2.2. 肌萎缩性侧索硬化症(渐冻症) |
| 2.3. EPHA4与多发性硬化症 |
| 3. EPHA4与中枢神经损伤 |
| 3.1. 脑外伤与脊髓损伤 |
| 3.2. 脑卒中/中风 |
| 4. EPHA4与癫痫 |
| 5. EPHA4与抑郁症 |
| 6. 小结 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）高精度高内涵小鼠全脑图谱构建及其在阿尔兹海默症小鼠中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 全脑尺度成像和标记技术的发展 |
| 1.2 显微光学切片断层成像技术用于全脑高分辨成像 |
| 1.3 AD相关的脑血管研究 |
| 1.3.1 AD相关脑血流变化 |
| 1.3.2 AD相关脑血管结构性变化 |
| 1.3.2.1 脑血管细胞病理变化 |
| 1.3.2.2 脑血管基底膜病理变化 |
| 1.3.3 全脑血管成像技术简述 |
| 1.3.3.1 脑血流变化的检测 |
| 1.3.3.2 全脑尺度血管构筑成像 |
| 1.4 淀粉样斑块及其周围多种结构的研究 |
| 1.4.1 Aβ斑块成像方法研究 |
| 1.4.2 Aβ斑块形态特征及分布 |
| 1.4.3 Aβ斑块对神经结构的影响 |
| 1.5 本文立题依据 |
| 1.6 本文研究内容 |
| 1.6.1 MOST技术应用平台与高通量图像数据分析流程搭建 |
| 1.6.2 获取高分辨全脑血管图谱跨尺度研究AD病理中脑血管的变化 |
| 1.6.3 全脑尺度多种结构信息的同步可视化 |
| 1.6.4 其他工作 |
| 第2章 MOST技术应用拓展与高通量数据分析流程搭建 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 材料与试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Nissl染色小鼠全脑样本制备方法 |
| 2.3.2 小鼠全脑样本数据采集 |
| 2.3.3 图像预处理与优化 |
| 2.3.4 海马结构的手动分割 |
| 2.3.5 血管网络的可视化 |
| 2.3.6 血管网络的定量分析 |
| 2.3.7 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 MOST系统整体工作流程 |
| 2.4.2 MOST图像预处理与优化处理 |
| 2.4.3 冠状面厚切片的直接体绘制与MIP渲染 |
| 2.4.4 海马结构手动分割及信息提取 |
| 2.4.5 海马内血管分布模式分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 AD模型小鼠全脑血管构筑研究 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 WT与APP/PS1小鼠海马血管网络的系列可视化与比较分析流程 |
| 3.2.2 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 APP/PS1小鼠海马血管系统异常 |
| 3.3.2 APP/PS1小鼠海马血管灌注面积降低 |
| 3.3.3 APP/PS1小鼠虚拟血管内窥影像分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 全脑Aβ斑块及其周围多结构同步可视化 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 5×FAD小鼠全脑Nissl染色样本的制备与采集 |
| 4.2.2 荧光标记方法验证全脑Nissl染色方法显示Aβ斑块的正确性 |
| 4.2.3 石蜡切片常规Nissl染色 |
| 4.2.4 全脑多种结构信息的同步可视化 |
| 4.2.5 5×FAD小鼠灌胃给药实验及后续图像分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 MOST结合小鼠全脑Nissl染色获得多结构信号的同步显示 |
| 4.3.2 不同灰度分布的多结构信号的同步可视化方法 |
| 4.3.3 Aβ斑块分布的全脑可视化 |
| 4.3.4 全脑Aβ斑块及其周围胞体、神经束、血管的同步可视化 |
| 4.3.5 皮层和海马局部区域Aβ斑块、胞体及血管的空间分布关联性 |
| 4.3.6 Aβ斑块周围神经树突的结构异常 |
| 4.3.7 Aβ斑块相关的血管损伤 |
| 4.3.8 全脑多种结构同步可视化评价可替宁对AD小鼠的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 主要内容总结 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 研究意义 |
| 5.4 展望 |
| 第6章 其他工作:MOST/FMOST技术应用于肺脏研究 |
| 6.1 材料与试剂配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 小鼠全肺Nissl染色样本的制备与采集 |
| 6.2.2 小鼠全肺荧光样本的制备与采集 |
| 6.2.3 全肺数据集的处理与可视化 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 MOST结合全肺Nissl染色实现小鼠全肺气道和血管系统的高精度重建 |
| 6.3.2 小鼠气道和血管系统的三维形态特征分析 |
| 6.3.3 全肺尺度可吸入制剂颗粒分布的高精度分析 |
| 6.3.4 局部区域呼吸道内表面聚集的可吸入颗粒分析 |
| 6.4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 已发表论文或授权专利 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ 英文缩写词表 |
（4）人参皂苷Rg1和Rb1改善航天失重效应与睡眠干扰所致认知功能减退作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 线粒体与认知功能障碍关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 模拟航天失重模型的建立与评价 |
| 第一节 模拟失重模型的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第二节 基于自发活动原理的认知行为改变的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第三节 基于惩罚原理的认知行为改变的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第四节 基于奖赏操作方法的认知行为改变的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 基于空间及联想记忆的人参皂苷Rg1和Rb1改善模拟失重所致认知减退作用及机制研究 |
| 第一节 人参皂苷Rg1和Rb1改善模拟失重所致认知功能减退药效学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第二节 人参皂苷Rg1和Rb1改善模拟失重所致认知功能减退作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 基于复杂操作任务的人参皂苷Rg1和Rb1改善模拟失重所致认知减退作用及机制研究 |
| 第一节 人参皂苷Rg1和Rb1改善模拟失重所致复杂操作能力下降的药效学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第二节 人参皂苷Rg1和Rb1改善模拟失重所致复杂操作能力下降的机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 人参皂苷Rg1、Rb1改善慢性睡眠干扰所致认知功能减退的作用及机制研究 |
| 第一节 人参皂苷Rg1、Rb1改善慢性睡眠干扰所致认知功能减退的药效学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 第二节 人参皂苷Rg1、Rb1改善慢性睡眠干扰所致认知功能减退的作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）RIPK1切割位点变异导致新型自身炎症性疾病的分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 自身炎症性疾病 |
| 1.1.1 自身炎症性疾病概述 |
| 1.1.2 炎性小体激活和白介素依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.3 NF-κB信号通路激活依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.4 I型干扰素信号通路激活依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.5 补体途径依赖的自身炎症性疾病 |
| 1.1.6 其他自身炎症性疾病 |
| 1.2 程序性细胞死亡 |
| 1.2.1 细胞凋亡 |
| 1.2.2 程序性坏死 |
| 1.2.3 细胞焦亡 |
| 1.2.4 其他形式的程序性细胞死亡 |
| 1.2.5 程序性细胞死亡与自身炎症性疾病 |
| 1.3 RIPK1及其参与的信号通路 |
| 1.3.1 RIP激酶家族概述 |
| 1.3.2 TNFR1 诱导的炎症和细胞死亡信号通路 |
| 1.3.3 TLR3和TLR4 信号通路 |
| 1.3.4 RLRs信号通路 |
| 1.3.5 RIPK1的促细胞存活功能 |
| 1.3.6 RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 1.3.7 靶向RIPK1的人类疾病研究 |
| 1.4 课题研究目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床样本和资料 |
| 2.1.2 细胞系、质粒和菌株 |
| 2.1.3 实验试剂、耗材及设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集和处理 |
| 2.2.2 质粒构建与制备 |
| 2.2.3 细胞的培养、冻存和复苏 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 基因敲除细胞系构建 |
| 2.2.6 荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.7 多重液相蛋白定量 |
| 2.2.8 酶联免疫吸附试验 |
| 2.2.9 细胞总RNA提取和反转录 |
| 2.2.10 实时荧光定量PCR |
| 2.2.11 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.12 细胞存活和死亡检测 |
| 2.2.13 流式细胞术 |
| 2.2.14 细胞内活性氧测定 |
| 2.2.15 RIPK1体外切割实验 |
| 2.2.16 转录组测序及数据分析 |
| 2.2.17 基因变异位点分析与预测 |
| 2.2.18 数据采集和统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 自身炎症性疾病患者携带新发的RIPK1切割位点变异 |
| 3.1.1 患者临床特征和遗传分析 |
| 3.1.2 RIPK1第324 位天冬氨酸的保守性和变异致病性分析 |
| 3.1.3 RIPK1第324 位天冬氨酸变异不影响其蛋白稳定性和蛋白互作 |
| 3.1.4 RIPK1第324 位天冬氨酸变异导致其不能被caspase-8 蛋白酶切割 |
| 3.2 携带RIPK1切割位点变异的患者细胞中炎症信号过度激活 |
| 3.2.1 患者体内炎性细胞因子水平升高 |
| 3.2.2 患者PBMCs中细胞因子水平升高 |
| 3.2.3 患者PBMCs中 MAPK和 IL-6/JAK/STAT3 信号通路激活水平升高 |
| 3.2.4 患者PBMCs中炎症信号通路激活水平升高 |
| 3.3 RIPK1切割位点变异促进小鼠MEFs中程序性坏死和细胞凋亡 |
| 3.3.1 RIPK1切割位点变异促进TNF诱导的细胞死亡 |
| 3.3.2 RIPK1切割位点变异促进复合体II的形成 |
| 3.3.3 RIPK1切割位点变异促进细胞死亡依赖其激酶活性 |
| 3.3.4 RIPK1切割位点变异促进TNF诱导的细胞凋亡 |
| 3.3.5 RIPK1切割位点变异促进其他死亡受体诱导的细胞死亡 |
| 3.4 RIPK1切割位点变异促进患者PBMCs中程序性坏死和细胞凋亡 |
| 3.4.1 患者PBMCs中细胞死亡相关基因的转录水平升高 |
| 3.4.2 RIPK1切割位点变异促进PBMCs中TNF诱导的细胞死亡 |
| 3.4.3 患者体内细胞坏死激活水平升高 |
| 3.4.4 患者PBMCs中细胞坏死依赖的IL6转录水平升高 |
| 3.5 携带RIPK1切割位点变异的患者fibroblasts抵抗细胞死亡诱导 |
| 3.5.1 患者fibroblasts抵抗TNF诱导的细胞坏死 |
| 3.5.2 患者fibroblasts抵抗细胞坏死的补偿机制 |
| 3.5.3 患者fibroblasts抵抗氧化应激诱导的铁死亡 |
| 3.6 RIPK1切割位点变异促进RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 3.6.1 TNF诱导患者PBMCs中RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 3.6.2 TNF诱导小鼠MEFs中RIPK1激活依赖的炎症反应 |
| 3.6.3 携带RIPK1切割位点变异的患者响应IL-6 受体抑制剂治疗 |
| 3.7 RIPK1切割位点变异不促进NF-κB信号通路激活 |
| 3.7.1 切割位点变异减弱了HEK293T细胞中RIPK1促进的NF-κB激活 |
| 3.7.2 RIPK1切割位点变异不影响MEFs中TRAIL诱导的NF-κB激活 |
| 3.7.3 RIPK1切割位点变异不影响fibroblasts中TNF诱导的NF-κB激活 |
| 4 结论 |
| 5 讨论和展望 |
| 5.1 RIPK1变异导致免疫缺陷或者自身炎症性疾病 |
| 5.2 RIPK1变异导致细胞程序性死亡的调节异常 |
| 5.3 RIPK1变异导致炎症信号通路的调节异常 |
| 5.4 针对RIPK1变异患者的临床治疗 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 7.1 实验抗体和试剂列表 |
| 7.2 实验耗材和设备列表 |
| 7.3 主要溶液及配制方法 |
| 作者简历及在读期间取得的科研成果 |
| 答辩决议书 |
（6）肺动脉高压遗传图谱绘制与遗传性肺动脉高压动物模型构建（论文提纲范文）
| 第一部分 中国肺动脉高压患者BMPR2基因突变图谱绘制 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 2. 研究队列与方法 |
| 2.1 研究队列 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 BMPR2罕见变异的特征 |
| 3.2 Arg491是BMPR2基因的热点突变 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 遗传性肺动脉高压大鼠模型构建 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 2. 研究对象与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计分析 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 构建Bmpr2 p.R491W突变定点敲入大鼠模型 |
| 3.2 Bmpr2~(+/R491W)大鼠低氧诱导的肺动脉高压表型更恶劣 |
| 3.3 Bmpr2~(+/R491W)大鼠BMPR2蛋白及其下游信号通路标记物表达量 |
| 3.4 Bmpr2~(+/R491W)大鼠出现明显肺血管重构 |
| 3.5 转录组学筛选下游靶点 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 特发性肺动脉高压患者遗传图谱绘制 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 前言 |
| 2. 研究队列与研究方法 |
| 2.1 研究队列 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 患者队列的描述 |
| 3.2 21个PAH易感基因罕见变异的分布 |
| 3.3 易感基因罕见变异携带者临床表型更差 |
| 3.4 儿童和成人特发性PAH患者易感基因罕见变异情况 |
| 3.5 男性和女性特发性PAH患者易感基因变异情况 |
| 3.6 易感基因罕见变异与长期预后的关联 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述1 肺动脉高压的分子遗传学基础 |
| 参考文献 |
| 综述2 肺动脉高压的主要动物模型特点 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 1. 基本信息 |
| 2. 教育背景 |
| 3. 学术会议发言 |
| 4. 在读期间发表论文 |
（7）视网膜色素变性致病基因的鉴定及基因治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 视网膜色素变性致病基因研究 |
| 1.1.1 视网膜色素变性的临床特征 |
| 1.1.2 视网膜色素变性基因研究现状 |
| 1.2 全外显子组测序技术是筛选遗传性疾病致病基因的有效方法 |
| 1.3 视网膜色素变性基因治疗研究 |
| 1.3.1 基因治疗研究现状 |
| 1.3.2 视网膜色素变性基因治疗研究的必要性及科学意义 |
| 1.4 本文的主要创新及结构安排 |
| 1.4.1 本文的主要创新 |
| 1.4.2 本文的结构安排 |
| 第二章 研究对象与实验材料及研究方法 |
| 2.1 研究对象与实验材料 |
| 2.1.1 两个视网膜色素变性家系 |
| 2.1.2 主要实验仪器和试剂耗材 |
| 2.1.3 实验质粒载体菌种和细胞系 |
| 2.1.4 实验小鼠 |
| 2.1.5 实验所用引物列表 |
| 2.1.6 实验所用抗体列表 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 全外显子组测序 |
| 2.2.2 Sanger测序验证 |
| 2.2.3 小鼠基因分型 |
| 2.2.4 小鼠视网膜蛋白免疫印迹实验 |
| 2.2.5 小鼠视网膜组织免疫组化实验 |
| 2.2.6 小鼠视网膜电生理 |
| 2.2.7 腺相关病毒质粒载体的构建 |
| 2.2.8 细胞培养及三元载体转染 |
| 2.2.9 病毒收集纯化浓缩 |
| 2.2.10 病毒滴度dd PCR定量及侵染能力检测 |
| 2.2.11 病毒注射 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 两个视网膜色素变性家系实验结果与讨论 |
| 3.1 临床信息与全外显子组测序结果 |
| 3.1.1 临床信息 |
| 3.1.2 全外显子组测序结果 |
| 3.2 Sanger测序验证结果及突变位点生物信息学分析结果 |
| 3.2.1 Sanger测序验证结果 |
| 3.2.2 突变位点生物信息学分析结果 |
| 3.3 相关基因研究与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基因治疗流程初步建立相关结果与讨论 |
| 4.1 Rpe65 基因自发点突变小鼠突变位点及表型鉴定结果 |
| 4.2 腺相关病毒质粒构建结果 |
| 4.3 三元载体转染细胞结果 |
| 4.4 病毒质量及体外侵染能力检测结果 |
| 4.5 体内评价病毒效果 |
| 4.6 初步研究结果与讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 本文工作总结 |
| 5.2 未来展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 硕士期间所取得的学术成果 |
（8）EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究工作的背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 神经退行性疾病国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 Emc3基因研究历史与现状 |
| 1.2.2 神经退行性疾病发病种类和机制研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.3.1 主要贡献 |
| 1.3.2 创新 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 EMC3基因在神经退行性疾病发病机制的功能研究 |
| 2.1 课题背景 |
| 2.1.1 脑神经元病变 |
| 2.1.2 视网膜神经元病变 |
| 2.2 选题依据 |
| 2.2.1 EMC1基因突变导致脑和视网膜退行性疾病 |
| 2.2.2 EMC3是果蝇感光细胞合成视紫红质和多通道膜蛋白所必需 |
| 2.2.3 EMC3和EMC1 是以复合物形式存在 |
| 2.3 研究背景 |
| 2.3.1 内质网相关蛋白的合成和降解途径 |
| 2.3.2 内质网应激介导的非折叠蛋白应答途径 |
| 2.4 研究流程和关键技术 |
| 2.5 前期研究 |
| 2.5.1 已经报道的EMC1突变进行WB分析 |
| 2.5.2 EMC3在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.3 EMC5在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.4 内质网膜蛋白复合物亚基免疫共沉淀及WB检测 |
| 2.6 展望未来 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 Emc3缺失导致小脑共济失调和浦肯野细胞变性 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验技术原理 |
| 3.2.2 实验所用材料 |
| 3.2.3 实验所用方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9-lox P系统构建Emc3 基因敲除小鼠模型 |
| 3.3.2 利用PCR技术对Emc3 CKO小鼠DNA进行基因分型 |
| 3.3.3 Emc3 CKO条件性敲除小鼠生长发育异常 |
| 3.3.4 Emc3 CKO条件敲除型小鼠小脑发育异常 |
| 3.3.5 Emc3 CKO条件敲除型小鼠行为学异常 |
| 3.3.6 Emc3 CKO条件型敲除小鼠的磁共振成像 |
| 3.3.7 Emc3 CKO条件型敲除小鼠进行性小脑萎缩和浦肯野细胞丢失 |
| 3.3.8 Emc3 CKO条件敲除型小鼠浦肯野细胞变性和星形胶质细胞增生 |
| 3.3.9 Emc3 CKO小鼠浦肯野细胞中Emc3 的缺失导致内质网应激 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 浦肯野细胞Emc3缺失影响小鼠的运动协调能力 |
| 3.4.2 星形胶质细胞激活与浦肯野细胞死亡的关系 |
| 3.4.3 浦肯野细胞Emc3缺失怎样激发内质网应激 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Emc3的丢失导致视网膜杆状双极细胞变性 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究目的 |
| 4.3 实验材料和方法 |
| 4.3.1 实验技术原理 |
| 4.3.2 实验所用材料 |
| 4.3.3 实验所用方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Emc3在视网膜上的表达定位 |
| 4.4.2 Emc3 CKO小鼠Emc3 表达水平降低 |
| 4.4.3 Emc3 CKO小鼠视网膜的生理功能分析 |
| 4.4.4 PKCα抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.5 感光细胞抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.6 免疫组化和H&E染色结果 |
| 4.4.7 Emc3缺失损害视杆细胞和视杆双极细胞之间的突触传递 |
| 4.4.8 Emc3 CKO视网膜中的反应性神经胶质增生 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 玻璃体视网膜病变FZD4和NDP基因突变研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 伦理声明 |
| 5.2.2 全外显子组测序和变异确认 |
| 5.2.3 表达质粒的构建 |
| 5.2.4 荧光素酶报告分析 |
| 5.2.5 FZD4在细胞中的表达研究 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 测序结果分析 |
| 5.3.2 突变FZD4 蛋白介导的Norrin信号缺陷 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩写表 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（9）小脑异常神经发生参与自闭症模型小鼠运动障碍及其相关机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 BTBR小鼠的运动障碍表型 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 BTBR小鼠生后发育关键期小脑的异常神经发生 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 BTBR小鼠生后发育关键期小脑的基因表达调控 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 自闭症与运动功能障碍相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究期间科研成果 |
| 致谢 |
（10）神经遗传疾病及认知障碍相关基因的RNA选择性剪接调控机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 选择性剪接机制 |
| 1.2 选择性剪接模式 |
| 1.3 神经系统中的RNA选择性剪接调节因子 |
| 1.3.1 神经特异性剪接调控因子SRRM4(nSR100)和SRRM3 |
| 1.3.1.1 SRRM4(nSR100) |
| 1.3.1.2 SRRM3 |
| 1.3.2 PTBP在神经发生中的作用 |
| 1.3.3 Nova蛋白 |
| 1.3.4 Rbfox家族 |
| 1.3.5 KHDRBSs(含KH结构域RNA结合信号转导相关蛋白) |
| 1.3.6 Hu/ELAV(神经元特异性哺乳动物胚胎致死异常视觉样蛋白) |
| 1.3.7 HNRNPA1 |
| 1.3.8 CELF1( CUGBP1) |
| 1.3.9 MBNL(类肌盲蛋白) |
| 1.4 选择性剪接与神经疾病的关系 |
| 1.4.1 选择性剪接与神经退行性疾病 |
| 1.4.1.1 Alzheimers disease(AD)阿尔茨海默症 |
| 1.4.1.2 Parkinson’s disease(PD)帕金森氏症 |
| 1.4.1.3 Amyotrophic Lateral Sclerosis-Frontotemporal Dementia肌萎缩侧索硬化症与额颞部痴呆 |
| 1.4.1.4 Myotonicdystrophy( DM)强直性肌营养不良 |
| 1.4.2 选择性剪接与神经发育疾病 |
| 1.5 Neurexins的选择性剪接 |
| 1.5.1 Neurexins的结构 |
| 1.5.2 Neurexins基因选择性剪接的调控 |
| 1.5.3 Neurexins的功能 |
| 1.6 展望 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 小鼠品系与饲养 |
| 2.2 重组质粒制备 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.3.1 常规细胞系培养、转染 |
| 2.3.2 神经元细胞的原代培养和共培养 |
| 2.3.3 小鼠成肌细胞的原代培养及慢病毒感染 |
| 2.4 免疫荧光染色 |
| 2.5 免疫印记 |
| 2.6 RNA提取及real-time RT-PCR |
| 2.7 小鼠脑组织原位杂交 |
| 2.7.1 脑组织冷冻切片的制备 |
| 2.7.2 原位杂交 |
| 2.8 图像采集与统计分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 第一节 HNRNPA1在DM1 疾病中的作用 |
| 3.1 在DM1 小鼠模型中全身性过表达HNRNPA1 |
| 3.2 在DM1 小鼠模型中过表达HNRNPA1 会诱导DM1 表型和肌肉病理改变 |
| 3.2.1 全身性过表达HNRNPA1 诱导DM1 表型的产生及缩短HSA~(LR)小鼠的寿命 |
| 3.2.2 全身性过表达HNRNPA1 诱导HSA~(LR)小鼠产生DM1相关肌肉病理改变 |
| 3.3 HNRNPA1在HSA~(LR)小鼠中诱导DM1 靶基因的错误剪接 |
| 3.3.1 HNRNPA1全身性过表达导致DM1靶基因剪接异常 |
| 3.3.2 HNRNPA1 肌肉过表达导致DM1 靶位点剪接异常 |
| 3.4 体外过表达HNRNPA1 导致DM1 靶基因剪接异常 |
| 3.4.1 成肌细胞体外分化体系的建立及内源性DM1 靶基因在该体系中的剪接变化 |
| 3.4.2 体外过表达HNRNPA1 导致内源DM1 靶基因剪接异常 |
| 3.5 HNRNPA1 直接结合DM1 靶基因进行剪接调控 |
| 3.6 HNRNPA1 直接与MBNL1 调控的外显子侧翼内含子上游结合拮抗MBNL1 的作用 |
| 3.7 HNRNPA1 主要在发育早期发挥作用 |
| 3.7.1 HNRNPA1 及相关RNA结合蛋白在肌肉发育过程中的表达谱系 |
| 3.7.2 肌肉再生实验进一步证明HNRNPA1 主要在发育早期发挥作用 |
| 3.8 HNRNPA1在DM1 活检肌肉样本中转录水平及蛋白质表达量均增加 |
| 3.9 DM1 发病机制中RNA结合蛋白共失调模型 |
| 3.10 讨论 |
| 3.10.1 HNRNPA1在DM1 中的作用 |
| 3.10.2 DM1 致病机制模型对其他非稳定微卫星疾病病理机制的意义 |
| 3.10.3 DM1 的潜在治疗途径 |
| 第二节 RNA剪接调控因子对Nrxns选择性剪接的调控 |
| 3.1 体外筛选调控Nrxns选择性剪接的RNA剪接调控因子 |
| 3.1.1 候选RNA剪接因子的筛选与构建 |
| 3.1.2 Nrxns的 mini-gene报告载体的构建 |
| 3.2 体外验证SRRM4与SRRM3对Nrxns的剪接调控作用 |
| 3.2.1 SRRM4对Nrxns选择性剪接位点的调控更广泛 |
| 3.2.2 SRRM3对Nrxns选择性剪接的调控作用 |
| 3.2.3 Nrxns AS6 的选择性剪接调控具有神经特异性 |
| 3.3 在原代神经元中过表达SRRM3和SRRM4 促进Nrxns小外显子的包含 |
| 3.4 SRRM4和SRRM3 在成年鼠中脑亚区的分布 |
| 3.5 SRRM3和SRRM4 干扰序列的筛选 |
| 3.6 在小鼠大脑亚区-海马体敲降SRRM3 抑制Nrxn1/3 小外显子(AS6)的包含效应 |
| 3.7 在小鼠大脑亚区-海马体敲降SRRM4抑制Nrxn1/3小外显子(AS6)的包含效应 |
| 3.8 不同Nrxns剪接产物对突触后配体的募集效应 |
| 3.8.1 构建包含特定剪接位点的Nrxns蛋白 |
| 3.8.2 Nrxns对兴奋性突触后骨架分子PSD95 的募集 |
| 3.8.3 Nrxns对抑制性突触后骨架分子Gephyrin的募集 |
| 3.9 Nrxns的选择性剪接依赖神经活性 |
| 3.10 SRRM4和SRRM3 的表达依赖神经活性 |
| 3.11 工作计划及展望 |
| 3.12 讨论 |
| 3.12.1 SRRM4 介导的神经小外显子的选择性剪接与ASD相关 |
| 3.12.2 SRRM4 调控Nrxns神经小外显子的选择性剪接 |
| 3.12.3 SRRM3与SRRM4 功能的冗余 |
| 3.12.4 Nrxns的选择性剪接调控是神经元活性依赖的 |
| 3.12.5 研究Nrxns基因小外显子选择性剪接的意义 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、精细突变小鼠模型的研究进展（论文参考文献）
- [1]MERS-CoV与SARS-CoV-2亚单位疫苗与核酸疫苗研究[D]. 杨韧. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]EPHA4敲除对大鼠心脏形态和功能的影响及其机制的初步探索[D]. 李晶文. 北京协和医学院, 2021
- [3]高精度高内涵小鼠全脑图谱构建及其在阿尔兹海默症小鼠中的应用[D]. 张小川. 华东理工大学, 2021(08)
- [4]人参皂苷Rg1和Rb1改善航天失重效应与睡眠干扰所致认知功能减退作用及机制研究[D]. 吕静薇. 北京协和医学院, 2021(02)
- [5]RIPK1切割位点变异导致新型自身炎症性疾病的分子机制研究[D]. 陶攀峰. 浙江大学, 2021(01)
- [6]肺动脉高压遗传图谱绘制与遗传性肺动脉高压动物模型构建[D]. 吕子超. 北京协和医学院, 2021(02)
- [7]视网膜色素变性致病基因的鉴定及基因治疗研究[D]. 杨辰. 电子科技大学, 2021(01)
- [8]EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究[D]. 朱雄. 电子科技大学, 2020(03)
- [9]小脑异常神经发生参与自闭症模型小鼠运动障碍及其相关机制研究[D]. 肖锐. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [10]神经遗传疾病及认知障碍相关基因的RNA选择性剪接调控机制研究[D]. 庄燕. 东南大学, 2020