一、In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases（论文文献综述）
Muhammad Umer[1]（2021）在《葡萄座腔菌内一种新环状RNA的鉴定与特性分析》文中研究指明葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）是世界范围内梨果实轮纹病、茎腐病和茎瘤病的病原真菌,引起梨的产量和品质降低,造成巨大的经济损失。在本实验室前期研究中,根据对黄冠梨枝条的致病力测定,确定B.dothidea菌株MAO-2为强致病力菌株而XA-3为弱致病力菌株。转录组分析显示XA-3是环状RNA（circRNAs）的天然宿主。然而,circRNAs对宿主的生物学影响尚不清楚。本研究旨在探讨B.dothidea与circRNAs的关系及其在致病力方面的作用。主要研究结果如下:通过RT-PCR从XA-3中初步鉴定出1条单链（ss）circRNA（307 nt）,命名为葡萄座腔菌环状RNA12944（B.dothidea circRNA,BdCR12944）。利用软件CLC Main Workbench v.21.0.4预测BdCR12944的二级结构,显示其为复杂的多分支链结构。BdCR12944包含72个腺嘌呤、55个尿嘧啶、78个鸟嘌呤和102个胞嘧啶碱基,其中鸟嘌呤和胞嘧啶的含量分别为58.6%和58.6%。BLASTn分析显示BdCR12944与其他生物的RNA序列无同源性,表明它是一种新的外源环状RNA。将单体cDNA以两种不同的方向克隆到pGEM-T-easy载体上,用限制性内切酶获取线性化片段后进行体外转录,得到地高辛标记的探针。利用地高辛标记的探针,通过Northern blot检测BdCR12944的积累量,确定了BdCR12944的正负极性:前者比后者在菌株XA-3中的积累量要高。双向电泳结合Northern blot显示BdCR12944迁移速率比真菌RNA在聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上的迁移速率慢,进一步证实了BdCR12944的环状性质。将BdCR12944的二聚体cDNA进行体外转录,通过聚乙二醇介导转化MAO-2原生质体细胞。用RT-PCR和斑点杂交鉴定了24个原生质体长出的菌落,显示11个再生亚株转染后呈阳性。而通过RT-qPCR定性鉴定,转化子12的BdCR12944效价最高（6.88E+04 copies/μL）。利用斑点杂交和绝对RT-qPCR检测BdCR12944在第1代和第10代亚株之间的滴度变化,以分析其从亲本到后代的遗传能力。结果显示,BdCR12944在真菌内的滴度具有一定的波动性,但对比的两代之间没有明显差异,表明BdCR12944可以稳定地从亲本真菌遗传到后代。将转染的MAO-2亚株与对照菌株（XA-3和MAO-2）放在PDA或添加了细胞胁迫成分[包括细胞壁破坏成分（0.04%SDS）、氧化胁迫成分（0.05%H2O2）和渗透胁迫成分（1.5 M/L Na Cl、1 M/L KCl、0.5 M/L CaCl2和1 M/L葡萄糖）]的PDA培养基上培养,分析BdCR12944对宿主真菌的生物学效应。在PDA培养基上,转化子的生长速率和生物量与MAO-2相比显着降低（9.38%±0.209至11.44±0.096 mm/d vs 12.52±0.127 mm/d,0.164±0.004 g/d～0.262±0.007 g/d vs 0.286±0.010 g/d）;除转化子12与XA-3相似外,其余转化子的形态无明显改变。在添加有不同细胞胁迫成分的PDA上,葡萄糖和H2O2促进它们的生长,Na Cl降低了它们的生长速度,而其余化学物质（KCl、CaCl2和SDS）对它们的生长没有明显的影响。分别在接种后第4天和第10天测定了它们对黄冠梨果实和枝条的致病力。结果表明,转化子对枝条不致病,而MAO-2引起枝条的病斑大小为28.42±14.67 mm;转化子在果实上引起的病斑大小为24.85±11.14 mm～37.71±16.78 mm,与XA-3相似,但明显弱于MAO-2。结果表明,转染BdCR12944后,转化子分别丧失对梨枝的致病性及减弱了对果实的致病力,表明BdCR12944侵染MAO-2后可以使其致病力减弱。为了验证BdCR12944是否能够侵染其他真菌,将BdCR12944二聚体cDNA体外转录得到的二聚体RNA转染Diaporthe eres（DK-362）、Alternaria alternata（GS-18）Colletotrichum fructicola（ZGTL）的原生质体,通过斑点杂交和RT-PCR进行检测。结果表明,BdCR12944能够侵染D.eres（DK-362）和A.alternata（GS-18）,侵染率分别为29.1%和20.83%,而不侵染C.fructicola（ZGTL）。此外,为了检测BdCR12944是否能侵染烟草或从菌丝体向植物中传播,我们将其二聚体RNA和阳性转化子12分别接种到本氏烟植株上,并用Northern blot进行鉴定。结果表明,无论是从接种的RNA还是从菌丝体中,BdCR12944都能扩散到新发育的烟草叶片中并在其中复制。反之亦然,即接种本氏烟幼苗后,BdCR12944能从本氏烟传播到MAO-2中。为检测BdCR12944是否调控宿主代谢过程,将转化子12与MAO-2进行了转录组分析,发现存在754个差异表达基因（DEGs）,其中有311个下调和443个上调基因。其中,在GO数据库中注释到了311个DEGs,包含25个细胞成分相关基因、98个生物过程相关基因和92个分子功能相关基因。在肽酶活性途径中表达下调的基因显着富集,其表达趋势（10个下调的DEGs）通过qRT-PCR进一步验证。综上所述,本研究在B.dothidea菌丝中发现了一种新的环状RNA,命名为BdCR12944,并证明其能够独立复制和转染其它真菌甚至植物。BdCR12944对宿主真菌的形态、生长速度和毒力等生物学特性具有调控作用,为深入了解真菌中的环状RNA奠定了基础。
李妍[2]（2021）在《S100A10调控胃癌转移和增殖的机制研究》文中研究说明研究背景:胃癌是世界上发病率最高的癌症之一,胃癌的复发率高,预后较差。近年来,随着人们健康意识的增强和内镜技术的发展,早期胃癌的诊断率大大提高。没有发生淋巴结转移的早期胃癌患者可通过内镜下切除达到治愈性治疗,而胃癌一旦发生淋巴结转移,则只能通过外科手术进行切除,病人的预后和生存质量均较差。胃癌发生淋巴转移的前提条件是胃癌细胞不断增殖突破基底膜限制,向下浸润性生长,诱导淋巴管内皮细胞迁移至肿瘤细胞周围,形成新的毛细淋巴管,然后胃癌细胞与淋巴管内皮细胞紧密黏附,侵入淋巴管腔,到达淋巴结,进而形成远处转移。因此,深入揭示胃癌淋巴转移的分子机制,鉴定新的治疗靶点,是当前转化医学研究的热点。胃癌作为一种实体肿瘤,随着瘤体的不断增大,为了满足自身快速增殖的需求,肿瘤细胞常改变其能量代谢方式,由正常的氧化磷酸化转变为有氧糖酵解。糖酵解的中间产物也为肿瘤细胞快速合成腺苷酸和脂质等生物大分子提供了必要的物质基础,进而促进肿瘤细胞的无限增殖。此外,糖酵解产生的大量乳酸能够促使肿瘤微环境酸化,促进肿瘤细胞浸润转移和免疫逃逸。深入了解肿瘤细胞有氧糖酵解的调控机制,选取合适的靶点进行新药开发,具有深远的应用背景。近年来,随着人类基因组学和转录组学的不断发展,很多异常表达的癌基因被发现与肿瘤的转移密切相关。对胃癌早期发生发展过程中的某些异常表达的分子进行挖掘,进而开发新的具有重要临床价值的分子标志物,是肿瘤研究领域的热点。S100A10,作为钙结合蛋白家族S100的一员,参与体内多种生理病理过程,例如胞吞胞吐、纤溶酶生成、信号转导和细胞增殖等。近来也有研究表明S100A10的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关,如胰腺癌、卵巢癌和肝癌等。在胃癌的淋巴结转移灶中,S100A10也存在异常高表达。但是它在胃癌淋巴转移和恶性增殖中的具体作用及调控机制尚无详细研究。因此,本研究分为三个部分,对S100A10在早期胃癌组织中的异常表达、S100A10促进胃癌转移的机制以及S100A10通过调控糖酵解促进胃癌增殖的机制进行研究。第一部分S100A10在早期胃癌组织中的表达及其临床意义研究目的:1.分析S100A10在Oncomine、TCGA数据库以及临床收集的样本组织中的表达情况。2.分析S100A10在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的表达情况。3.分析S100A10与早期胃癌临床病理学参数的相关性。研究方法:1.通过Oncomine数据库、TCGA数据库、UALCAN网站分析S100A10在大规模癌症样本组织中的表达情况,并通过Kaplan-Meierplotter数据库分析S100A10在胃癌中的预后价值。2.使用实时定量PCR（RT-qPCR）检测S100A10在17例正常胃粘膜组织、23例萎缩性胃炎组织、17例早期胃癌组织以及24例进展期胃癌组织中的表达情况。3.使用免疫组化检测S100A10在92例早期胃癌组织石蜡切片的表达情况,并收集患者的临床病理资料,分析S100A10与临床病理学参数的相关性。研究结果:1.生物信息学分析显示S100A10在胃癌组织中的表达量显着高于正常胃黏膜组织。Kaplan-Meierplotter数据库显示S100A10高表达的胃癌患者预后不良。2.RT-qPCR结果显示S100A10在胃癌组织中的表达量显着高于其在正常胃黏膜组织和萎缩性胃炎组织中的表达量,而S100A10在早期胃癌组织和进展期胃癌组织中的表达量无统计学差异。3.免疫组化结果显示,S100A10在正常胃黏膜组织、未发生淋巴结转移的早期胃癌组织、发生淋巴结转移的早期胃癌组织中呈递增式表达。S100A10与早期胃癌的肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期和脉管浸润密切相关。结论:S100A10在早期胃癌组织中即存在着较高水平的表达,尤其是在发生淋巴结转移的早癌组织。S100A10的高表达与早期胃癌的淋巴结转移、肿瘤直径和肿瘤分期等密切相关。S100A10是一个有价值的生物标志物,对预测早期胃癌的淋巴结转移有重要的提示作用。第二部分S100A10促进胃癌转移的机制研究研究目的:1.探究S100A10在胃癌中的生物学功能。2.探究S100A10上游调控机制。3.探究S100A10参与调控的下游信号通路。4.探究体内条件下靶向抑制S100A10的表达对胃癌生长和转移的影响。研究方法:1.S100A10在胃癌中的生物学功能在胃癌细胞中过表达或敲低S100A10后,利用Transwell实验检测S100A10对胃癌细胞转移和浸润能力的影响,并利用Western blot实验检测S100A10对胃癌细胞上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响;利用CCK8、EdU和平板克隆实验检测S100A10对胃癌细胞增殖能力的影响;利用流式细胞术检测S100A10对胃癌细胞凋亡能力的影响。收集细胞上清培养人淋巴管内皮细胞（human lymphatic vessel endothelial cell,HLEC）,观察S100A10对HLEC小管形成能力和转移能力的影响,并通过Western blot实验和酶联免疫标记实验（ELISA）检测细胞上清中人血管生成因子C（VEGF C）的蛋白表达及分泌水平;通过内皮细胞黏附实验检测S100A10对胃癌细胞与HLEC黏附能力的影响。2.S100A10的上游调控机制研究（1）为研究S100A10的上游调控机制,利用Ensembl数据库查询S100A10转录起始位点上游2000bp的启动子区域序列,并通过双荧光素酶实验确定核心启动子区。利用生物信息学软件预测可能与S100A10核心启动子区结合的转录因子,并通过双荧光素酶实验、Western blot实验和染色质免疫共沉淀（ChIP）实验验证转录因子对S100A10的调控作用。（2）通过Transwell实验和CCK8实验检测c-Jun过表达对胃癌细胞迁移浸润和增殖能力的影响,免疫组化实验检测胃癌组织中c-Jun的表达情况。3.S100A10的下游调控信号通路的研究（1）Western blot实验检测S100A10对下游信号通路Src/ANXA2/AKT/mTOR信号通路的调控作用,以及对下游效应分子VEGF C、E-Cadherin和c-Jun的影响。（2）在过表达S100A10的胃癌细胞中,加入AKT通路抑制剂MK-2206,观察MK-2206是否能逆转S100A10介导的胃癌细胞的恶性表型。4.靶向抑制S100A10的表达对胃癌细胞在体内生长和转移的影响（1）将胃癌细胞种植到裸鼠皮下,随后定期向瘤体内多点注射干扰慢病毒LV-shS100A10及对照慢病毒LV-NC,定期记录瘤体的生长曲线以及实验终点时瘤体重量的差异。（2）提取瘤体组织的蛋白,Western blot实验检测S100A10下游信号通路相关分子的表达情况。（3）利用慢病毒系统构建S100A10稳定敲低细胞系,进行尾静脉注射,观察裸鼠肺转移灶的形成。研究结果:1.S100A10促进胃癌细胞的恶性生物学行为胃癌细胞过表达S100A10后,胃癌细胞的转移、浸润、增殖能力明显提高,细胞凋亡能力被抑制,诱导EMT的发生。而干扰S100A10表达后,胃癌细胞的迁移、浸润、增殖能力明显下降,细胞凋亡数增多。过表达S100A10的胃癌细胞通过诱导VEGF C的分泌,从而促进HLEC的迁移和淋巴管新生。过表达S100A10的胃癌细胞与HLEC的黏附能力也增强。2.c-Jun与S100A10的核心启动子区域结合并激活S100A10转录双荧光素酶实验证明转录因子c-Jun可与S100A10的核心启动子区结合,并促进S100A10的转录。胃癌细胞过表达c-Jun后,细胞的迁移、浸润和增殖能力明显增强。3.S100A10通过激活Src/ANXA2/AKT/c-Jun正反馈环路发挥作用（1）S100A10的异常高表达会激活Src激酶,诱导ANXA2磷酸化,进而激活AKT/mTOR信号通路,c-Jun作为AKT信号通路的下游分子促进胃癌细胞的迁移浸润,由此构成正反馈环路加速胃癌细胞的转移和增殖。（2）AKT通路抑制剂MK-2206可以逆转S100A10介导的胃癌细胞的恶性表型,抵消S100A10对胃癌细胞迁移、浸润和增殖的促进作用。4.靶向抑制S100A10的表达阻碍胃癌细胞在体内的生长和转移（1）裸鼠荷瘤实验结果显示瘤体内多点注射LV-shS100A10慢病毒抑制Src/ANXA2/AKT信号通路的激活,进而抑制瘤体的生长和局部浸润。（2）S100A10稳定敲低组裸鼠肺转移灶的数量及大小均显着低于对照组。结论:C-Jun可激活S100A10转录,从而上调S100A10在胃癌细胞中的表达。S100A10激活Src/ANXA2/AKT/mTOR信号通路,促进下游c-Jun和VEGF C表达,形成正反馈环路诱导胃癌的淋巴转移。第三部分S100A10通过调控糖酵解促进胃癌增殖的机制研究研究目的:1.探究S100A10对胃癌细胞有氧糖酵解的调控作用。2.探究S100A10调控胃癌细胞有氧糖酵解的分子机制。研究方法:1.S100A10对胃癌细胞有氧糖酵解的调控作用（1）通过GEPIA数据库分析和RT-qPCR实验检测S100A10对糖酵解相关分子表达水平的影响。（2）有氧糖酵解测定包括:检测葡萄糖消耗量和葡萄糖转运蛋白GLUT1的表达;检测乳酸生成量和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性及表达水平;检测腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）的生成量;检测细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）。2.S100A10调控糖酵解参与的信号通路研究利用Western blot实验检测S100A10过表达或敲低后mTOR信号通路的变化。并进一步检测加入mTOR通路抑制剂雷帕霉素和LDHA抑制剂GSK-2837808A是否可以阻断S100A10介导的糖酵解恶性表型。3.体内荷瘤实验验证过表达S100A10对于胃癌细胞生长的影响以及雷帕霉素的抑制作用构建S100A10过表达及空白对照的胃癌稳筛细胞系并注射到裸鼠腋窝皮下,待瘤体长出后,定期注射雷帕霉素或PBS,记录肿瘤大小变化。剥离瘤体提取蛋白,Western blot实验验证瘤体组织中S100A10及下游信号通路相关分子的蛋白表达情况。研究结果:1.GEPIA分析及RT-qPCR结果显示S100A10的表达与糖酵解关键分子的表达密切相关。2.S100A10促进GLUT1的表达从而增加葡萄糖消耗,并能增加乳酸脱氢酶的活性和LDHA的表达从而促进乳酸的生成。干扰S100A10的表达能恢复氧化磷酸化从而增加ATP的生成。3.S100A10通过激活mTOR通路促进胃癌细胞糖酵解,在S100A10过表达的胃癌细胞中加入雷帕霉素和GSK-2837808A,胃癌细胞的增殖能力下降,葡萄糖消耗和乳酸生成量明显降低,ATP生成增多。4.皮下荷瘤实验证明S100A10过表达组的肿瘤体积和瘤体重量高于对照组,而定期注射雷帕霉素可以有效抑制S100A10介导的胃癌恶性生长。结论:S100A10通过激活mTOR通路促进有氧糖酵解,加速胃癌细胞的快速增殖,这一促进作用可被雷帕霉素抑制,从而阻碍胃癌细胞的恶性增殖。
Muhammad Tahir[3]（2020）在《IGF2BP2（IMP2）是小鼠早期合子基因组激活的关键调控因子》文中研究指明背景:哺乳动物配子受精前,其基因组处于无转录活性状态;经过减数分裂形成的卵子和精子在受精过程后相互识别并结合,遗传物质融合并形成合子,进一步发育成新的个体。受精卵基因表达受到合子基因组激活（ZGA）的调控,此前转录沉默的基因组进行重编程,建立其特有的全能性,并进一步激活早期胚胎发育所需的基因表达。ZGA是细胞核重编程的过程,可使合子基因组从受精时的转录沉默状态转变为后期的激活状态,合子基因的表达产物能够逐渐替代卵母细胞中贮存的母源因子维持早期胚胎发育,是哺乳动物及其他脊椎动物早期胚胎发育的关键阶段。不同物种ZGA的发生时间不同,在小鼠中ZGA开始于2细胞期,而人类则为4-8细胞期。这个合子发育过程中基因表达模式的剧变均发生在转录和翻译水平,基因组激活的差异可能导致的不同结果,并对哺乳动物的妊娠结局产生一定影响。根据功能和转录活性可将ZGA分为次要和主要两个阶段:起始阶段即次要ZGA,发生在1细胞胚胎期的S相到2细胞期的G1相,为缓慢发育阶段;而主要ZGA发生在2细胞晚期,大量转录过程快速发生,基因调控机制开始运行。两个阶段的正确激活和调节对于基因的表达至关重要,并在细胞增殖和早期胚胎发育中发挥关键作用。由于次要ZGA阶段产物中转录活性相对较低,并存在大量的无效剪切,而且其在2细胞期后的胚胎发育过程中的作用仍需要进一步研究;相反,主要ZGA在2细胞期后胚胎发育中所发挥的作用较为明确,其功能异常可导致胚胎发育停滞于2细胞期。因此,ZGA异常不仅会影响基因表达,还可导致早期胚胎发育停滞。主要ZGA阶段发生的基因表达重编程对于后续的早期胚胎发育至关重要,异常可致与早期胚胎发育相关基因表达数目下调,胚胎质量受损以及不孕的发生。现已发现多个与ZGA相关的基因及母源蛋白,主要有YAP1、TLE6、BTG4、MED13和OCT4等,但小鼠体内与ZGA直接相关的RNA结合母源因子的作用尚不明确。本文中我们主要的研究对象是母源RNA结合蛋白,胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2,又称IMP2）。IMP2属于RNA结合蛋白家族,在小鼠和其他动物的卵母细胞、胚胎和性腺中大量表达,已有研究证实其在癌细胞、2型糖尿病等疾病或细胞代谢、翻译起始等生物学过程中发挥重要作用,但是尚无有关IMP2在小鼠ZGA及早期胚胎发育中作用的研究。在过去的40多年中,人类辅助生殖技术（ART）广泛应用,但如何提高胚胎种植率和妊娠率仍是较大挑战,因此越来越多的研究旨在完善胚胎培养策略（尤其是受精到移植的阶段）。由于体外胚胎培养与胚胎的早期发育及其种植率密切相关,因此优化体外培养方案是改善辅助生殖技术妊娠结局的关键因素之一。胚胎体内和体外培养之间发育潜能有差异的主要原因可能是体外培养缺乏特定的卵母细胞及胚胎相关的生长因子。尽管与女性生殖有关的生长因子已得到广泛研究,但是临床应用时体外胚胎培养液中并未添加充足的胚胎发育所必需的生长因子,可能进一步导致早期胚胎生长发育受限、胚胎种植失败等,最终致不良妊娠结局的发生。胰岛素样生长因子2（IGF2）是所有已知生殖相关生长因子中最为复杂的调节因子,并可能是人类卵泡中的存在的主要生长因子,已有研究表明其在猪卵母细胞减数分裂成熟中具有促进作用,但是IGF2在早期胚胎发育中的作用及机制仍有待进一步研究。方法:Imp2基因敲除小鼠的构建及动物实验均符合山东大学伦理委员会对动物实验的相关要求和规定,本研究所使用的小鼠为ICR和C57BL/6J杂交遗传背景的Imp2敲除小鼠。首先,为构建Imp2基因敲除小鼠,将loxP位点引入Imp2的第3个和第4个外显子两侧,后将Imp2flox/flox小鼠与Vasa-Cre转基因小鼠杂交以获得Imp2flox/+,再次杂交获得敲除Imp2的小鼠,其中Vasa-Cre小鼠也称为Ddx4-Cre小鼠,是生殖细胞特异性表达Cre的工具鼠。基因敲除小鼠模型构建成功后,向24-28日龄对照组野生型雌性小鼠和Imp2基因敲除的雌性小鼠体内注射孕马血清促性腺激素（PMSG）及人绒毛膜促性腺激素（hCG）进行超数排卵,分别收集两组小鼠的卵母细胞和胚胎,在M16培养液中进行体外培养,以观察其胚胎的早期发育能力;并评估Imp2基因敲除小鼠及对照组小鼠在6个月内的产仔总数,以测试Imp2基因敲除小鼠生育力。借助RNA测序和定量蛋白质组学分析,观察比较Imp2基因敲除小鼠与对照组小鼠2细胞期胚胎的基因表达情况;运用蛋白质印迹实验、免疫组化和共聚焦显微镜成像等技术分析比较Imp2敲除小鼠及对照组小鼠卵母细胞和胚胎中相关蛋白质的表达情况。进一步利用实时定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）技术分析Imp2基因敲除小鼠卵母细胞和胚胎中下调基因的基因表达情况。运用细胞培养、质粒转染和荧光素酶测定法等探究IMP2与IGF2的关系以及样本中下调的IMP2结合基因的表达情况,并研究对照组和Imp2敲除小鼠的2细胞期胚胎翻译和转录差异的机制。除此之外,我们将对照组和Imp2敲除小鼠卵母细胞取出后进行体外受精及培养,并向受精后的胚胎培养液中添加浓度为50nM的IGF2,以探究其对早期胚胎发育的影响;随后将IGF2处理及对照组胚胎移植入假孕雌鼠体内,用以研究IGF2处理对胚胎体内发育情况的影响。结果:通过对卵母细胞及胚胎中IMP2表达情况检测我们发现,IMP2在不同发育阶段的卵母细胞和胚胎中均有表达,但表达量存在差异。小鼠胚胎中Imp2对于卵泡形成、卵母细胞减数分裂成熟及胚胎发育必不可少。在体外培养环境中,Imp2敲除小鼠的卵母细胞受精后大多数受精卵停滞在2细胞期,只有少数胚胎（6%）发育到4细胞阶段。对小鼠2细胞期胚胎进行转录组学和蛋白质组学分析显示,IMP2的缺失下调了 RNA结合及蛋白质结合的相关基因,而这些基因对早期胚胎发育的至关重要。蛋白质印迹实验和qRT-PCR实验结果进一步证明,Imp2基因敲除小鼠的2细胞期胚胎中,前述下调的基因表达量确有所降低。根据相关下调基因的mRNA表达情况以及荧光素酶活性测定结果,我们确定了Imp2的两个靶基因,Ccar1和Rps14。Ccar1及Rps14均为早期胚胎发育所必需,在野生型小鼠胚胎中Ccar1和Rps14缺失会导致胚胎发育停滞在不同阶段,主要停在2细胞期胚胎,且胚胎的发生也有一定程度的损伤。同时,Imp2敲除小鼠早期胚胎中基因转录及翻译受损,与对照组胚胎相比,Imp2敲除小鼠中获得的2细胞期胚胎的总RNA和总蛋白质合成减少了 2倍。此外,IGF2是IMP2的靶分子,向野生型胚胎的培养液中添加50 nM IGF2后,可使其囊胚率由对照组的29%提高至65%;然而向Imp2基因敲除胚胎的培养液中添加50 nM IGF2则对其早期发育无影响,大部分胚胎仍停滞在2细胞期。胚胎移植结果表明,向假孕小鼠体内移植经过50nM IGF2处理的早期胚胎,与移植对照组胚胎的小鼠相比,妊娠率及产仔数量均明显升高。萤光素酶测定实验结果证明,IMP2可与IGF2的5’端的非翻译区结合,通过添加IGF2可以提高下调基因的翻译活性,作用呈剂量依赖性。用ELISA法测定卵母细胞、胚胎及其培养液中的IGF2含量结果显示,Imp2敲除小鼠与对照小鼠相比IGF2水平降低2倍。最后,我们还收集了临床废弃的未成熟捐赠GV期卵母细胞,进行体外培养及受精,将正常受精的双原核（2PN）受精卵随机分为处理组与对照组,向处理组培养液中添加50nM IGF2,结果显示处理组的囊胚率较对照组有明显升高。此外,我们还发现与对照组相比,IGF2处理组胚胎评分也有显着提高。结论:通过研究,我们发现并证明了小鼠体内RNA结合蛋白IMP2在合子基因组激活及胚胎植入前的早期胚胎发育过程中有重要作用。IMP2可以上调合子基因组激活时重要相关基因的表达,缺失时主要导致胚胎停滞在2细胞期,最终可导致小鼠的胚胎异常,进一步影响妊娠结局。此外,我们的研究结果还揭示了生长因子IGF2在胚胎发育及动物生物技术和人类辅助生殖技术等方面的应用价值及前景。
SANAD ABDALBAGE MOHAMMED ABDALSADEG（萨那德）[4]（2018）在《乳腺癌血清肿瘤标志物适配体的筛选及其检测》文中研究说明自20世纪70年代末,全球乳腺癌发病率呈上升趋势。乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题。提高乳腺癌的早期诊断,实现有效筛查,结合腺癌综合治疗,可提高乳腺癌治疗疗效。癌症病例中,许多蛋白质作为信号蛋白参与细胞分化和细胞生长等多种功能,同时可作为致癌基因并动员细胞转化。认为这些蛋白分子是癌症检测和治疗领域的一个有吸引力的靶向蛋白,因此,这一靶向蛋白现在引起进行广泛的研究和调查。将适体定义为小核酸分子,由一个命名为SELEX的程序的组合库分离提供。适体可以通过在目标分子中嵌入特定数目的特定的、特定的和特定的接触点来限制结合。研究目的:利用靶标替换消减SELEX技术从乳腺癌血清中筛选肿瘤标志物核酸适配基。研究内容:利用乙腈法去除血清中高丰度蛋白;用羧基琼脂磁珠作为载体结合乳腺癌血清蛋白;再利用靶标替换消减SELEX技术,经过9轮筛选,获得了乳腺癌血清特异核酸配体的二级文库。结果:获得了乳腺癌血清特异性核酸配体的ssDNA二级文库。这一ssDNA文库能够特异性结合乳腺癌血清靶向蛋白。在每一轮的选择过程,数字凝胶成像系统和实时定量PCR技术检测目标DNA的浓度和规范,直到目标ssDNA富集达到最高点。到目前为止,筛选完毕。
王小茜[5]（2016）在《新型细胞因子IL-39（IL-23p19/Ebi3）的鉴定及其在系统性红斑狼疮中的功能研究》文中指出背景：IL-12家族成员不仅在感染及炎症过程中起着重要的调节作用,而且与脑脊髓炎、多发性硬化症、克罗恩病、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发病和治疗密切相关。白细胞介素-12（Interleukin-12,IL-12）家族已发现4个：IL-12、IL-23、IL-27及其新成员IL-35。该家族每个成员均是由一个α亚基（p19,p28或p35）和一个β亚基（p40或Ebi3）组成异源二聚体,这样,IL-12家族成员在结构上相互交叉重叠（如下图所示）。根据IL-12家族成员分子异源二聚体构成特点,我们和其他研究者推测p28和p40,或者p19和Ebi3也能组成新的分子（如图所示）。虽然有研究已经显示p28和P40能构成新分子并具有抑制免疫反应的功能,但是研究者没能发现体内存在p28/p40复合物。因此,我们的研究重点为p19能否与Ebi3结合成新的细胞因子?如果能够结合,那么这种新型细胞因子在自身免疫性疾病中功能是什么?这样,我们就围绕新型细胞因子p19/Ebi3（我们命名为IL-39）的鉴定及在自身免疫性疾病系统性红斑狼疮中的作用和可能机制做了初步探究,力图为系统性红斑狼疮的致病机理提供依据、为该病的治疗提供新的可行性思路。目的：鉴定新型细胞因子IL-39 （p19/Ebi3）是否天然存在,探究其在自身免疫性疾病系统性红斑狼疮中的作用和机制。方法与结果：一、鉴定新型细胞因子IL-39及其受体、信号通路1.细胞因子IL-39 （p19/Ebi3）的鉴定：为了验证IL-12家族分子亚基p19与Ebi3是否能够相互结合形成复合物,我们通过蛋白表达、纯化等实验手段,结合PCR、免疫共沉淀、双抗夹心ELISA等方法检测不同细胞亚群是否表达p19/Ebi3复合物,,得出以下结果：（1）通过免疫共沉淀实验发现,人源和鼠源的p19、Ebi3均可以互相结合,构建表达载体并纯化p19/Ebi3复合物,经鉴定,p19/Ebi3复合物是54kD的异源二聚体,我们命名该复合物为IL-39；（2）通过PCR结果发现,RAW264.7细胞系、骨髓来源的树突状细胞等抗原提呈细胞存在p19、Ebi3共表达现象；（3）通过双抗夹心ELISA结果发现,RAW264.7细胞系的细胞培养上清中存在天然形式的IL-39 （P19/Ebi3）;（4）通过双抗夹心ELISA结果发现,LPS活化的B细胞可分泌天然形式的IL-39 （p19/Ebi3）;2、IL-39信号通路的鉴定：为了鉴定IL-39发挥生物学功能的信号通路,我们结合IL-12家族受体分子亚基配对规律,应用受体敲低、蛋白质印迹法、流式细胞术等方法检测IL-39的受体及其诱导STAT家族成员磷酸化,实验结果发现：（1）B细胞中表达IL-12家族的受体；随着LPS刺激时间增加,B细胞表面受体IL-23R、gp130的表达量增多；（2）IL-39可以促进B细胞中STAT1及ATAT3的磷酸化,而对其他STAT家族成员如STAT4、STAT5等无影响；当敲低IL-23R或gp130后,IL-39不能诱导STAT1和STAT3磷酸化。二、鉴定分泌IL-39的B细胞前面的研究已经显示抗原提呈细胞如DC、巨噬细胞和B细胞都有表达IL-39的能力。成熟或LPS活化的DC、巨噬细胞表达IL-39水平降低,而只有B细胞是活化后增强IL-39,显示了活化的B细胞分泌IL-39可能有病理意义而不成熟DC、巨噬细胞表达的IL-39可能有生理意义。我们认为研究IL-39的病理意义更大,因此详细地分析分泌IL-39的B细胞,我们设计了体内外实验：1)体外分离小鼠脾脏B细胞,用LPS刺激B细胞活化,通过PCR、流式细胞术、ELISA等不同方法研究活化B细胞表达IL-12家族5亚基的情况,同时抑制B细胞活化观察其表达情况；2)体内实验引用了B细胞异常活化的系统性红斑狼疮小鼠模型,通过流式细胞术、PCR等方法观察脾脏B细胞中IL-39的表达。实验结果主要有：（1）体外研究发现经LPS活化的B细胞（如GL7+B细胞）主要表达p19与Ebi3,双抗夹心ELISA法结果进一步证实了活化的B细胞可以分泌天然形式存在的IL-39；当用IFN-γ、Bcl-6抑制剂等抑制B细胞活化后,IL-39的表达量明显下降。（2）体内实验验证了系统性红斑狼疮小鼠发病后脾脏B细胞异常活化,与体外实验结果一致,体内异常活化的GL7+B细胞是产生IL-39的主要来源。三、鉴定IL-39在系统性红斑狼疮中的作用为了探究IL-39在系统性红斑狼疮中的作用,通过流式分选的方法的得到GL7+B细胞,然后用shRNA慢病毒感染的方法在GL7+B细胞中分别敲低IL-12家族的5个亚基,最后回输给未发病的系统性红斑狼疮模型鼠和CD19cre小鼠体内观察对病情发生发展的影响；另外,制备了抗IL-39多克隆抗体对系统性红斑狼疮发病鼠进行治疗，通过尿蛋白、抗体产生、肾脏病理等指标检测治疗效果。研究发现：（1）GL7+B细胞可诱导系统性红斑狼疮,出现尿蛋白升高、脾脏肿大、脾重增加、脾脏B细胞异常活化等,而给予敲低p19或Ebi3的GL7+B细胞的小鼠发病明显降低；（2）将抗1L-39多克隆抗体给予系统性红斑狼疮发病鼠后,病情缓解,出现皮肤溃疡缓解、尿蛋白下降、脾肿大减轻、脾脏异常活化的B细胞数目减少、抗体分泌减少、肾脏病理炎症程度下降等。四、分析1L-39在系统性红斑狼疮中的作用机制为了探究IL-39在系统性红斑狼疮中促炎作用的可能机制。通过体内外实验应用流式细胞术观察IL-39对T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞亚群的影响,并在方法三的疾病模型中进行反向验证。研究结果如下：（1）体内外研究表明IL-39可以促进中性粒细胞的分化发育；（2）敲低p19、Ebi3或抗体阻断IL-39后,中性粒细胞数目降低：（3）系统性红斑狼疮小鼠的中性粒细胞分泌致病因子BAFF;（4）通过体外实验,证明了IL-39可能通过IL-39-BAFF正反馈环促进系统性红斑狼疮小鼠中性粒细胞比例上升。结论：我们发现了IL-12家族亚基p19与Ebi3能组成新的复合物并命名为IL-39。系统性红斑狼疮样小鼠异常活化的GL7+B细胞可分泌高水平的IL-39。IL-39可以通过受体IL-23R/gp130诱导STAT1、STAT3磷酸化而发挥生物学功能。IL-39通过诱导中性粒细胞分泌B细胞活化因子（BAFF）等机制介导狼疮样小鼠炎症反应,而应用抗IL-39抗体等方法阻断IL-39的效应能有效地减轻狼疮样小鼠炎症反应和自身免疫症状。总之,在本研究中我们发现了介导炎症反应的IL-12家族新分子IL-39。随着深入研究IL-39在系统性红斑狼疮中的作用及机制,也许能为系统性红斑狼疮的治疗提供了新的思路和潜在应用价值。
Prince Amoah Barnie[6]（2015）在《HMGB1参与EAM心肌纤维化的机制及对固有免疫细胞功能的影响》文中研究指明背景高迁移率族蛋白l（HMGB1）,是一种重要的炎症介质,可由免疫细胞和一些非免疫细胞主动分泌,或受损及坏死细胞被动释放。HMGB1与许多炎症性疾病的发生发展有着密切的关系,诸如：超敏反应、自身免疫性疾病、感染性疾病等。本实验室已有的研究数据表明,HMGB1在实验性自身免疫性心肌炎（EAM）小鼠心脏组织或血清中表达上调；封闭HMGB1可以改善EAM后期的心肌纤维化。然而,迄今为止,没有数据能够直接表明HMGB1与心肌纤维化的关系。据此,本研究旨在探讨：①上调HMGB1有无可能直接导致EAM的心肌纤维化；②在EAM,心肌成纤维细胞／肌纤维母细胞能否分泌HMGB1,可否作为另一高水平]HMGB1源头；③HMGB1阻断能否有效地防止EAM后期的心肌纤维化。此外,对可能参与自身免疫性心肌炎的免疫失调因素进行了初步探讨,包括Toll样受体（TLR）及Runt相关转录因子3（Runx3）/CpG ODN对细胞增殖的影响,及其与IMGB1分泌或释放的关系；妊娠相关疾病患者血清HMGB1的水平及作用。方法本研究所采用的试验方法包括：流式细胞分析、实时荧光定量PCR试验、Western印迹、酶联免疫吸附试验（ELISA）、细胞培养和增殖试验（MTT）、细胞迁移试验以及组织病理学分析等。1.实验性自身免疫性心肌炎小鼠模型的建立BALB/c小鼠,6-8周龄,由扬州大学实验动物中心购买并在江苏大学实验动物中心饲养。本研究使用的所有动物试验过程,均按实验动物管理使用指南（美国国立卫生研究院出版no.85-23,1996修订）操作。小鼠实验性自身免疫性心肌炎模型的诱导方法简介如下：于0天和7天接种含有100ggMyHC-α（MyHC-α614-629; Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH）的1:1PBS/CFA乳化物。在接种的第54天,诱模小鼠经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后颈椎脱位处死,并取相关检材进行分析。所有实验均获江苏大学研究与教学用动物实验委员会批准。2.流式细胞仪分析研究选用了十五例慢性糖尿病患者、十四例妊娠糖尿病患者和十七例先兆子痫患者,年龄从19岁到41岁不等。经免疫荧光染色后,应用流式细胞仪分析计数外周血单个核细胞（PBMC）中Thl7细胞的比率。3.荧光定量]PCR （qRT-PCR）应用RT-qPCR方法,分别检钡TLR2、TLR4、TLR9、RAGE、HMGB1、Ⅰ/Ⅲ胶原（Col1/3）、骨桥蛋白（OPN）、Hlx、Runx3、MMP1和TIMP1/2的mRNA表达水平。4.免疫印迹Western blot检测心肌成纤维细胞/肌纤维母细胞中胶原I、胶原]Ⅲ、P-PKC-β、p-EIK-1/2、f-erk-1/2和HMGB1的蛋白表达水平；同法检测有或无CpG ODN诱导的A549细胞中Runx3的蛋白表达水平。5. ELISA酶联免疫吸附试验（ELISA）用于定量检测慢性糖尿病患者、妊娠糖尿病和先兆子痫患者血浆中的干扰素γ、IL-17、IL-1β和高迁移率族蛋白l（HMGB1）的水平。6.细胞培养与增殖试验根据参考文献[31,32],取1-2周龄BALB/c小鼠,分离心脏成纤维细胞。细胞培养液DMEM（含10%胎牛血清）被用于培养心肌成纤维细胞。用MTT法检测心肌成纤维细胞、肌成纤维细胞的增殖。同时,MTT法也用于分析CpG ODN对Runx3基因特异性siRNA转染的细胞生长的影响。7.迁移试验迁移试验选用6孑LTranswell板与8-1m-pore-size聚碳酸酯过滤器。在有或无外源性HMGB1存在的条件下,分析心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞的迁移作用。8.组织病理学分析HE染色方法用于观察实验性自身免疫性心肌炎模型的组织病理学改变；用Sirius red染色法检测心肌纤维化；免疫荧光染色分析在脂多糖刺激下,心肌成纤维细胞、肌成纤维细胞分泌HMGB1的能力。9.统计分析所有数据均显示为平均值士标准差（SD）。Student’s test或双向方差分析用于评价组间差异的显着性。统计学分析采用GraphPad Prism 5和／或SPSS11.5软件,P值<0.05被认为有意义。结果我们的研究结果表明：1.HMGB1可能直接导致心肌胶原沉积,这与PKCβ/ERK1/2信号转导通路相关；此外,在外部应力下,心肌成纤维细胞／肌纤维母细胞主动分泌HMGB1;心脏成纤维细胞／肌纤维母细胞分泌的HMGB1,可通过PKCβ激活以自分泌方式导致心肌纤维化。在EAM小鼠,阻断HMGB1能有效地改善心脏的纤维化。2.在外部压力下,HMGB1可从心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞的细胞核穿梭至胞质。本研究还表明,除免疫细胞、内皮细胞、心肌细胞和坏死细胞外,同样作为心脏重要组成的心脏成纤维细胞/肌纤维母细胞,是否在EAM时也充当HMGB1的重要来源。3.在妊娠相关疾病,升高的血浆HMGB1水平很有可能导致ILC的分化和随后生产的IL-17。此外,在包括先兆子痫和妊娠糖尿病在内的妊娠相关性疾病中,增高的IL-17表达水平可能产生于ILC3,并在失控性炎症应答时构成胎儿流产的威胁。4. CpG ODN可显着抑制A549细胞的增殖。在CpG ODN刺激A549细胞,Runx3的表达在mRNA和蛋白水平均增多。CpG ODN对A549细胞增殖的抑制能力,在]Runx3基因siRNA转染后受到明显地控制。这一结果表明,TLR9活化和Runx3基因表达之间存在着密切的关系,也可能与HMGB1分泌有关,需要进一步证实。结论本研究表明,HMGB1可通过PKCβ/ERK1/2-依赖的信号通路直接导致心肌胶原沉积；在外界应力下,心肌成纤维细胞/肌纤维母细胞分泌的HMGB1,通过激活PKCβ以自分泌的方式导致心脏的纤维化；封闭HMGB1都能有效地改善EAM小鼠的心肌纤维化。此外,在妊娠相关疾病的血浆中,HMGB1增高并可导致ILC的分化和随后产生IL-17、TLR9活化与RUNX3基因表达,参与某些细胞的生长调控,并推测可能与IMGB1的分泌相关。
Jieliang Chen,Min Wu,Kuancheng Liu,Wen Zhang,Yaming Li,Xiaohui Zhou,Lu Bai,Zhenghong Yuan[7]（2015）在《New insights into hepatitis B virus biology and implications for novel antiviral strategies》文中提出Hepatitis B virus（HBV）, a small DNA virus with a unique replication mode, can cause chronic hepatitis（CHB）, which is characterized by the persistence of the viral covalently closed circular DNA that serves as the template for HBV replication and the production of large amounts of secreted HBV surface antigen（HBs Ag） that is present in excess of the levels of infectious virus. Despite the success of currently approved antiviral treatments for CHB patients, including interferon and nucleotide analogs, which suppress HBV replication and reduce the risk of CHB-related liver diseases, these therapies fail to eradicate the virus in most of the patients. With the development of the cell and animal models for HBV study, a beter understanding of the HBV life cycle has been achieved and a series of novel antiviral strategies that target diferent stages of HBV replication have been designed to overcome the viral factors that contribute to HBV persistence. Such basic HBV research advancements and therapeutic developments are the subject of this review.
Si-Xue Liu,Zhong-Sheng Xia,Ying-Qiang Zhong[8]（2014）在《Gene therapy in pancreatic cancer》文中研究指明Pancreatic cancer（PC） is a highly lethal disease and notoriously difficult to treat. Only a small proportion of PC patients are eligible for surgical resection, whilst conventional chemoradiotherapy only has a modest effect with substantial toxicity. Gene therapy has become a new widely investigated therapeutic approach for PC.This article reviews the basic rationale, gene delivery methods, therapeutic targets and developments of laboratory research and clinical trials in gene therapy of PC by searching the literature published in English using the PubMed database and analyzing clinical trials registered on the Gene Therapy Clinical Trials Worldwide website（http://www. wiley.co.uk/genmed/ clinical）. Viral vectors are main gene delivery tools in gene therapy of cancer, and especially, oncolytic virus shows brighter prospect due to its tumor-targeting property.Efficient therapeutic targets for gene therapy include tumor suppressor gene p53, mutant oncogene K-ras,anti-angiogenesis gene VEGFR, suicide gene HSK-TK,cytosine deaminase and cytochrome p450, multiple cytokine genes and so on. Combining different targets or combination strategies with traditional chemoradiother-apy may be a more effective approach to improve the efficacy of cancer gene therapy. Cancer gene therapy is not yet applied in clinical practice, but basic and clinical studies have demonstrated its safety and clinical benefits. Gene therapy will be a new and promising field for the treatment of PC.
李芳芳[9]（2014）在《单链抗体融合人血清白蛋白的制备及对重症肌无力患者血清的抑制作用》文中研究说明重症肌无力（myasthenia gravis, MG）是累及神经肌肉接头处的某些成分而导致突触后膜信号传导障碍的一种自身免疫病,以反复出现的肌肉收缩无力,用力时恶化,休息后缓解为特征。在80%～85%的MG患者中,其主要的靶抗原是肌肉的乙酰胆碱受体（muscle acetylcholine receptor, AChR）。单链抗体（single-chain fragment variable, scFv）是由免疫球蛋白的重链可变区（variable region of heavy chain, VH）和轻链可变区（variable region of light chain, VL）经一条柔软可弯曲的肽链连接而成。scFv完整的保留了抗原结合的能力,由于它没有抗体的Fc段,因此不能激活补体。然而,scFv小分子的生理特点决定了它可以从体内经肾脏快速清除。scFv637是MG抗原特异性scFv,由人AChR a亚单位上67～76位氨基酸（即主要免疫原区,main immunogenic region, MIR）组成。它可以结合MG患者血清中的抗MIR的自身抗体,从而保护人AChR,这使它有可能成为一种MG特异性免疫抑制治疗剂。与scFv一样,scFv637具有快速从血液中清除的缺点。因此,在本项研究中,我们将scFv637基因与半寿期较长的人血浆白蛋白（human serum albumin, HSA）基因连接,以延长scFv637的半寿期,增加其在血中的稳定性。这使得scFv有可能成为MG的一种特异性免疫抑制剂。目的：制备单链抗体融合人血清白蛋白,以延长单链抗体的半寿期并增加其在血中的稳定性,为重症肌无力的免疫治疗奠定基础。方法：将scFv637与HSA基因连接后转入毕赤酵母菌（Pichia pastoris）中表达出融合蛋白scFv637-HSA。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹试验确定其分子量；通过免疫荧光试验检测融合蛋白scFv637-HSA与人肋间肌AChR的结合情况；经竞争性ELISA检测融合蛋白抑制MG患者血清中的自身抗体与AChR的结合能力,以及融合蛋白在健康血清中的稳定性。结果：融合蛋白在毕赤酵母菌中成功表达,其分子量约为89kD；免疫荧光试验结果显示,融合蛋白可以与人肋间肌神经肌肉接头处的AChR结合；经12例MG患者血清检测发现,融合蛋白对AChR的抑制率为2%～77.4%；融合蛋白在静态健康血清中可以维持大约3天。结论：成功制备出scFv-HSA融合蛋白,并且其保留了保护AChR的能力。这使得scFv-HSA融合蛋白有望成为一种特异性免疫抑制治疗MG的手段。
王丽娟[10]（2014）在《薯蓣皂苷逆转阿霉素多药耐药、增加甲氨蝶呤吸收的分子药理学机制》文中研究说明多药耐药是癌症化疗成功的主要障碍,而癌细胞能对结构各异机制不相关的药物产生耐药性,一个主要的原因就是多药耐药（multidrug resistance,MDR）,多药耐药和药物外排转运体MDR1（multidrug resistance 1,MDR1）过表达相关。MDR1是一个被多药耐药1基因编码的170KD的膜糖蛋白,是ATP依赖的具有药物外排功能的转运蛋白。在肿瘤细胞中,MDR1泵出抗癌药物导致肿瘤细胞产生耐药性,NF-κB（nuclear factor κ-B,NF-κB）是作为转录因子介导MDR1导致耐药的蛋白复合物。NF-κB的激活需要IκB-α的磷酸化,即p-IκB-α（phosphorylation of inhibitor κB-α,p-IκB-α）显着的增加导致 NF-κB 激活。克服MDR1介导的耐药性可以通过阻碍外排泵的功能和抑制它的表达来实现。因此,抑制MDR1介导的药物外排将引起化疗药治疗的多药耐药癌细胞的复敏,可以被认为是对具有多药耐药癌症患者的有效治疗方法。目前,临床上的一些抗癌药如生物碱、蒽环类抗生素和表鬼臼毒素很容易产生多药耐药,因此急需开发有效的多药耐药逆转剂。另外,大剂量甲氨蝶呤可以达到常规化疗剂量、化疗方案作用不到的盲区部位,从而提高化疗的效果,但甲氨蝶呤具有潜在的细胞毒性,且剂量越大,出现不良反应的机会越大,会引起胃肠道黏膜损伤,表现出恶心、胀气、呕吐、厌食、腹泻和腹痛等症状,导致患者的体重下降和营养不良。甲氨蝶呤是MDR1的底物,寻找一种多药耐药的抑制剂,抑制MDR1,在降低甲氨蝶呤的剂量的同时提高甲氨蝶吟的小肠吸收,可以有效减轻甲氨蝶呤致消化道黏膜炎。薯蓣皂苷是一个天然药物的有效成分,广泛存在于一些药用植物中,如穿龙薯蓣、盾叶薯蓣和山药中,药理学研究已证实这个化合物具有抗氧化、降脂、抗癌、保肝的作用,而且是合成甾体激素类药物的重要原料,因此含此类成分生药的应用前景十分广阔。多药耐药机制的研究依赖于对经过选择的且对广谱抗癌药存在交叉反应性的癌细胞系的分析。已有研究结果证实,薯蓣皂苷能逆转肝癌细胞HepG2对阿霉素（adriamycin,ADR）的耐药性,其在白血病和乳腺癌中对阿霉素的耐药和甲氨蝶呤吸收的影响还未见报道。我们利用了一个阿霉素敏感的白血病细胞系（Human doxorubicin-sensitive erythroleukemic cells,K562 cells）、来源亲本细胞 K562 的阿霉素耐药的细胞系（Human doxorubicin-res的磷酸化抑制了 NF-κB的活性进而下调了 MDR1的表达。istant erythroleukemic cells,K562/ADR cells）、表达分化的小肠细胞特征的细胞系（human colon adenocarcinoma cells,Caco-2 cells）、一个阿霉素敏感乳腺癌细胞系（human adriamycin-sensitive breast cancer cells,MCF-7 cells）、来源亲本细胞MCF-7的阿霉素耐药的细胞系（human adriamycin-resistant breast cancer cells,MCF-7/ADR cells）等肿瘤细胞模型和大鼠小肠来研究薯蓣皂苷对阿霉素耐药和甲氨蝶呤吸收的影响,旨在阐明此效果及其分子药理学机制即薯蓣皂苷对MDR1表达的影响及MDR1的表达和NF-κB信号通路的关系。第一部分 薯蓣皂苷对人白血病细胞K562/ADR多药耐药的逆转效果及分子药理学机制目的:研究薯蓣皂苷对白血病细胞多药耐药的逆转效果,探讨薯蓣皂苷逆转白血病细胞多药耐药的分子药理学机制。方法:以人红白血病细胞系K562及其阿霉素耐药细胞系K562/ADR为研究对象,采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝）（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphe-nyltetrazolium bromide,MTT）法检测细胞毒性作用;以流式细胞术测定两种细胞系内薯蓣皂苷对阿霉素细胞内蓄积的影响来反映薯蓣皂苷对MDR1外排功能的影响;Western Blotting检测MDR1、phospho-IκB-α的蛋白表达水平;Quantitative PCR法检测MDR1的mRNA表达水平;双荧光素酶报告分析系统检测MDR1和NF-κB启动子活性。结果:与K562细胞系相比,K562/ADR耐药细胞系中MDR1的mRNA和蛋白均高表达,且耐药细胞中的阿霉素细胞内潴留减少。薯蓣皂苷对K562和K562/ADR表达出大致相同的细胞毒性,由此计算出薯蓣皂苷无毒性的浓度即IC10（10%inhibiting concentration,IC10）为0.3 μM。此浓度的薯蓣皂苷显着增加了阿霉素在耐药细胞中的蓄积,导致阿霉素在耐药细胞中的IC50（50%inhibiting concentration,IC50）值由42.4±2.6 μM减少到2.4±0.1 μM,即薯蓣皂苷显着增加了阿霉素的细胞毒性,表明薯蓣皂苷通过增加阿霉素在耐药细胞内的蓄积增加了阿霉素的细胞毒性。而且,薯蓣皂苷呈浓度依赖性和时间依赖性抑制了 K562/ADR细胞的MDR1的mRNA和蛋白的表达,表明薯蓣皂苷通过抑制MDR1的表达增加了阿霉素的细胞内蓄积进而逆转了阿霉素的耐药。另外,薯蓣皂苷抑制了 MDR1和核因子NF-κB的启动子活性以及IκB-α的磷酸化,表明薯蓣皂苷通过抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB的活性进而下调了 MDR1的表达。结论:薯蓣皂苷在白血病细胞K562/ADR中通过抑制NF-κB信号通路抑制了MDR1转运体,恢复阿霉素的敏感性,逆转了白血病细胞的耐药,表明薯蓣皂苷和阿霉素合用能有效提高白血病的治疗效果,薯蓣皂苷可能是一个新的多药耐药逆转剂和潜在的肿瘤化疗辅助剂。第二部分 薯蓣皂苷对甲氨蝶呤吸收的影响及其分子药理学机制目的:研究薯蓣皂苷在体内外对甲氨蝶呤吸收的增强效果,探讨其分子药理学机制。方法:利用MTT法分析薯蓣皂苷在Caco-2细胞对甲氨蝶呤细胞毒性的影响,Caco-2细胞双向转运实验分析薯蓣皂苷对甲氨蝶呤转运的影响,体外翻转肠和原位肠灌注实验考察薯蓣皂苷对甲氨蝶吟体内外吸收的影响,液相色谱串联质谱（chromatography andem mass spectrometry,LC-MS/MS）方法测定生物样品中甲氨蝶呤的浓度,大鼠小肠切片病理学检查考察薯蓣皂苷对甲氨蝶呤诱导的肠道粘膜损伤的影响,Western blotting、Quantitative RT-PCR（Quantitive Real Time-polymerase chain reaction,Quantitative RT-PCR）、双荧光素酶报告基因分析系统等分子生物学技术考察薯蓣皂苷对甲氨蝶呤吸收影响的分子药理学机制。结果:薯蓣皂苷在Caco-2细胞中72小时细胞毒性作用最明显,72小时作为整个试验的检测时间。用甲氨蝶呤和薯蓣皂苷处理72小时后,仅有甲氨蝶呤和薯蓣皂苷+甲氨蝶呤的IC50值分别是19.5±0.9 μM和7.7±0.1μM,也就是合用薯蓣皂苷减少了甲氨蝶呤的IC50值,表明薯蓣皂苷增加了甲氨蝶呤在Caco-2细胞的毒性。薯蓣皂苷还增加了甲氨蝶吟在吸收方向的转运,减少了甲氨蝶吟在分泌方向的转运,显着抑制了 Caco-2细胞中MDR1的mRNA和蛋白的表达,表明薯蓣皂苷通过抑制Caco-2细胞中MDR1的表达,增加了甲氨蝶呤的吸收方向的转运。而且,薯蓣皂苷抑制了 MDR1和NF-κB启动子的活性以及IκB-α的磷酸化,表明薯蓣皂苷通过抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB信号通路,进而下调了 MDR1的表达,增加了甲氨蝶呤的转运。薯蓣皂苷体内外通过下调MDR1的表达增加了甲氨蝶呤的小肠吸收。另外,尽管甲氨蝶呤吸收进入了肠细胞,但没有观察到毒性的增加,而且,事实上,观察到毒性减少了。结论:薯蓣皂苷通过抑制NF-κB信号通路抑制Caco-2细胞MDR1转运体,增加甲氨蝶吟吸收方向上的转运,在大鼠中薯蓣皂苷通过抑制MDR1转运体,体内外增加了甲氨蝶呤的小肠吸收,但没有增加甲氨蝶呤诱导的肠道粘膜损伤,表明薯蓣皂苷在降低甲氨蝶呤剂量的同时可能提高其治疗效果,其可能作为甲氨蝶呤吸收的多药耐药调节剂。第三部分 薯蓣皂苷对乳腺癌细胞及其耐药细胞的增敏效果及其分子药理学机制目的:研究薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中对阿霉素活性的增敏效果及其分子药理学机制。方法:利用MTT分析在人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药细胞系MCF-7/ADR薯蓣皂苷本身的毒性及薯蓣皂苷对阿霉素活性的影响,Western blotting、Quantitative RT-PCR、双荧光素酶报告基因分析系统等分子生物学方法来检测其分子药理学机制。结果:薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞的IC50分别是6.5±0.4μM和7.3±0.2μM,即薯蓣皂苷对药物敏感的亲本乳腺癌细胞和多药耐药乳腺癌细胞具有大致相同的抗性,由此得出薯蓣皂苷对MCF-7/ADR和MCF-7细胞没有毒性的浓度,即IC10,均为0.4±0.1μM。0.4μM的薯蓣皂苷分别将MCF-7和MCF-7/ADR细胞中IC50 值由 1.5±0.1μM 和 34.7±1.1μM 减少到 0.4±0.1 和 0.7±0.1μM,表明薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均有增加阿霉素细胞毒性的效果。薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均呈浓度依赖性和时间依赖性抑制了 MDR1的mRNA和蛋白的表达,表明薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均是通过抑制MDR1增加阿霉素细胞内的毒性。而且,薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均抑制了 MDR1和NF-κB启动子的活性和IκB-α的磷酸化,表明薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均通过抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB信号通路进而下调了 MDR1的表达增加了阿霉素细胞内的毒性。结论:薯蓣皂苷通过抑制NF-κB信号通路下调药物转运体MDR1的表达,增加了 MCF-7和MCF-7/ADR细胞中阿霉素的化学敏感性,表明薯蓣皂苷和阿霉素合用能有效提高乳腺癌的治疗效果,这一发现为薯蓣皂苷作为化疗辅助剂进一步临床应用提供了又一有力的证据。
二、In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases（论文提纲范文）
（1）葡萄座腔菌内一种新环状RNA的鉴定与特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| LIST OF ABBREVIATIONS |
| CHAPTER 1 LITERATURE REVIEW |
| 1.1 Pear and fungal pathogens |
| 1.1.1 Pear is an important fruit in the world as well in china |
| 1.1.2 Botryosphaeria dothidea is a major fungal pathogen that infects pear and other fruit trees |
| 1.1.3 Mechanism of pathogenesis |
| 1.1.4 Management strategies for plant diseases |
| 1.2 Research progress in the field of circular RNAs |
| 1.2.1 Classification of circRNAs |
| 1.2.1.1 Endogenous circRNAs |
| 1.2.1.1.1 Discovery of endogenous circRNAs |
| 1.2.1.1.2 Identification of endogenous circRNAs |
| 1.2.1.1.3 Functions of endogenous circRNAs |
| 1.2.1.1.3.1 Specific functions related to a developmental stage |
| 1.2.1.1.3.2 Acting biomarkers |
| 1.2.1.1.3.3 Transporting functions |
| 1.2.1.1.3.4 Functions of circRNAs under the influence of biotic and abiotic stresses |
| 1.2.1.2 Viroids belongs to a class of exogenous circRNAs |
| 1.2.1.2.1 Discovery of viroids |
| 1.2.1.2.2 Structure of viroids |
| 1.2.1.2.3 Classification of viroids |
| 1.2.1.2.4 Replication strategy of viroids |
| 1.2.1.2.5 Biological functions of viroids |
| 1.2.1.2.5.1 Viroid infection influenced on the expression of host proteins |
| 1.2.1.2.5.2 Viroid infection role in gene silencing |
| 1.2.1.2.5.3 Potential targets of viroid-derived s RNAs |
| 1.3 Detection techniques |
| 1.4 Fungi modulated by mycoviruses and circRNAs |
| 1.5 Objectives of the study |
| CHAPTER 2 SCREENING,IDENTIFICATION,AND VALIDATION OF BDCR12944 |
| 2.1 Introduction |
| 2.2 Materials and methods |
| 2.2.1 Fungal strains,cultural conditions,and virulence assays |
| 2.2.2 RNA extraction and synthesis of cDNA |
| 2.2.3 RNA sequencing data analysis of XA-3 for the diversity of hypothetical circRNAs |
| 2.2.4 Designing and synthesis of primers |
| 2.2.5 Amplification of cDNA,cloning,and sequencing |
| 2.2.6 Cloning in pGEM-T vector and sequencing |
| 2.2.7 In vitro transcription of monomer BdCR12944 RNAs and chemical labeling of RNA probes |
| 2.2.8 Enzymatic treatment of BdCR12944 to confirm nature of RNA |
| 2.2.9 Prediction of BdCR12944 secondary structure |
| 2.2.10 Northern blot hybridization to confirm in vivo replication of BdCR12944 |
| 2.2.11 Two-dimensional gel combined northern blot hybridization analysis to confirm the circular nature of BdCR12944 |
| 2.2.12 Statistical analysis |
| 2.3 Results |
| 2.3.1 Fungal strains morphology and virulence |
| 2.3.2 RNA sequencing data analysis of XA-3 for the diversity of hypothetical circRNAs |
| 2.3.3 Screening and detection of circRNAs |
| 2.3.4 In vitro transcription of monomer BdCR12944 RNAs and chemical labeling of RNA probes |
| 2.3.5 Enzymatic treatment of BdCR12944 to confirm nature of RNA |
| 2.3.6 Prediction of BdCR12944 secondary structure |
| 2.3.7 Confirmation and validation of the in vivo self-replication and circularity of BdCR12944 in natural host XA-3 |
| 2.4 Discussion |
| CHAPTER 3 IMPACT OF BDCR12944 ON THE BIOLOGICAL TRAITS OF TRANSFECTED FUNGAL ISOLATES |
| 3.1 Introduction |
| 3.2 Materials and methods |
| 3.2.1 Fungal strains and growing conditions |
| 3.2.2 RNA extraction and cDNA synthesis |
| 3.2.3 Synthesis of chemical labeled RNA probes and infectious dimer RNA of BdCR12944 |
| 3.2.4 Protoplasts preparation |
| 3.2.5 In vitro transfected fungal protoplasts with in vitro dimerized and transcribed BdCR12944 by PEG-mediated transformation |
| 3.2.6 Identification and confirmation of in vitro transfected isolates |
| 3.2.6.1 RT-PCR analysis for the detection of transfected isolates |
| 3.2.6.2 Dot blot hybridization analysis for the detection of transfected isolates |
| 3.2.6.3 RT-qPCR analysis for the titer of BdCR12944 in transfectants |
| 3.2.7 Biological characterization of BdCR12944 transfected isolates of MAO-2 |
| 3.2.8 Assessment of autonomous replication of BdCR12944 |
| 3.2.9 Statistical analysis |
| 3.3 Results |
| 3.3.1 Synthesis of infectious RNA of BdCR12944 |
| 3.3.2 Confirmation of BdCR12944 infectious RNA transfection in MAO-2 |
| 3.3.2.1 Dot blot hybridization for the detection of successful transfection |
| 3.3.2.2 RT-qPCR analysis for the titer of BdCR12944 in transfectants |
| 3.3.3 Impact of BdCR12944 on phenotype,growth rate,and biomass production |
| 3.3.4 Effect of the chemical stressors on phenotype and growth rate of transfectants |
| 3.3.4.1 Response of transfectants against cell wall disruption with0.04%SDS |
| 3.3.4.2 Response of transfectants against osmotic stress with0.5 M/L CaCl_2 |
| 3.3.4.3 Response of transfectants against osmotic stress with1 M/L glucose |
| 3.3.4.4 Response of transfectants against osmotic stress with1.5 M/L NaCl |
| 3.3.4.5 Response of transfectants against osmotic stress with1 M/L KCl |
| 3.3.4.6 Response of transfectants against oxidative stress with 0.05% H_2O_2 |
| 3.3.5 Impact of BdCR12944 on virulence |
| 3.3.6 Assessment of autonomous replication of BdCR12944 |
| 3.3.6.1 Dot blot hybridization for the detection of autonomous replication of BdCR12944 |
| 3.3.6.2 RT-qPCR analysis for the titer of BdCR12944 in sub-isolates |
| 3.4 Discussion |
| CHAPTER 4 BDCR12944 CAN INFECT NON-HOST PHYTOPATHOGENIC FUNGI AND PLANTS |
| 4.1 Introduction |
| 4.2 Materials and methods |
| 4.2.1 Fungal strains,plant materials,and growing conditions |
| 4.2.2 RNA extraction |
| 4.2.3 Synthesis of chemical labeled RNA probes and infectious dimer RNA of BdCR12944 |
| 4.2.4 Protoplasts preparation |
| 4.2.5 In vitro transfected fungal protoplasts with in vitro dimerized and transcribed BdCR12944 by PEG-mediated transformation |
| 4.2.6 In vitro inoculation of MAO-2,transfectant-12 and BdCR12944 infectious RNA on N.benthamiana plants |
| 4.2.6.1 Horizontal transformation of BdCR12944 from infected N.benthamiana plants to pathogenic fungi |
| 4.3 Results |
| 4.3.1 BdCR12944 can infect non-host fungi |
| 4.3.2 BdCR12944 can infect model plant N.benthamiana |
| 4.3.2.1 Horizontal transformation of BdCR12944 from infected N.benthamiana plants to pathogenic fungi |
| 4.4 Discussion |
| CHAPTER 5 TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF TRANSFECTED STRAIN WITH BDCR12944 |
| 5.1 Introduction |
| 5.2 Materials and methods |
| 5.2.1 Fungal strains and growing conditions |
| 5.2.2 RNA extraction,quantification,and qualification |
| 5.2.3 Library preparation for transcriptome sequencing |
| 5.2.4 Clustering and sequencing |
| 5.2.5 Transcriptomic raw data analysis |
| 5.2.5.1 Quality control |
| 5.2.5.2 Read mapping to the reference genome |
| 5.2.5.3 Novel genes prediction |
| 5.2.5.4 Quantification of gene expression level |
| 5.2.5.5 Differential expression analysis |
| 5.2.5.6 GO enrichment analysis of differentially expressed genes |
| 5.2.5.7 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes |
| 5.2.5.8 RT-qPCR validation of down-regulated differentially expressed genes |
| 5.2.6 Statistical analysis |
| 5.3 Results |
| 5.3.1 Quality control |
| 5.3.2 Read mapping to the reference genome |
| 5.3.3 Differentially expressed genes |
| 5.3.4 Differentially expressed genes and their pathways |
| 5.3.5 RT-qPCR validation of down-regulated differentially expressed genes |
| 5.4 Discussion |
| CHAPTER 6 SUMMARY,CONCLUDING REMARKS AND FUTURE PROSPECTS |
| 6.1 Summary |
| 6.2 Advantages or achievements and shortcomings of the study |
| 6.2.1 Advantages or achievements |
| 6.2.2 Limitation or shortcomings |
| 6.3 Concluding remarks and future prospects |
| REFERENCES |
| APPENDIX |
| Appendix-Ⅰ.Preparation of reagents used in this study |
| Appendix-Ⅱ.Primer sets used in this study |
| ACKNOWLEDGEMENTS |
| LIST OF PUBLICATION |
（2）S100A10调控胃癌转移和增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 S100A10在早期胃癌组织中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 S100A10促进胃癌转移的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 S100A10通过调控糖酵解促进胃癌增殖的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 S100A10与恶性肿瘤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英语论文1 |
| 英语论文2 |
（3）IGF2BP2（IMP2）是小鼠早期合子基因组激活的关键调控因子（论文提纲范文）
| Abstract in Chinese |
| Abstract in English |
| Symbol description |
| Introduction |
| Methods |
| Results |
| Discussion |
| Conclusion |
| References |
| Acknowledgements |
| Catalogue of Publications |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件 |
（4）乳腺癌血清肿瘤标志物适配体的筛选及其检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| List of Abbreviations |
| CHAPTER 1 INTRODUCTION |
| 1.1 BACKGROUND AND MOTIVATION |
| CHAPTER 2 LITERATURE REVIEW |
| 2.1 BREAST CANCER FACTS: |
| 2.2 BREAST CANCER OCCURRENCE |
| 2.3 SYMPTOMS |
| 2.4 SCREENING: |
| 2.5 SERUM TUMOR MARKERS AND APTAMER SENSING DETECTION |
| 2.6 SELEX TECHNOLOGY TO GENERATE NUCLEIC ACID APTAMERS |
| 2.7 HISTORY AND THEORETICAL BACKGROUND |
| 2.7.1 In Vitro Selection of Functional Oligonucleotides and the Origins of Biochemical Activity |
| 2.7.2 A Brief History of In Vitro Selection |
| 2.7.3 Lessons from the Aptamers, Ribozymes, Deoxy ribozymes Generated by In Vitro Selection |
| 2.7.4 Synthetic Approaches to Understanding the Natural Origins of Function |
| 2.8 SOME NON-CLASSICAL APPROACHES OF APTAMERS SELECTION |
| 2.9 THE RECENT PROGRESS OF SOME MODERN-APPROACHES OF APTAMERS SELECTION |
| 2.9.1 Libraries Optimization for Aptamer Selection |
| 2.9.2 Primer sites reduction |
| 2.9.3 The methods of in-vitro selection |
| 2.9.4 SELEX-on-a-chip |
| 2.9.5 Other Optional separation methods |
| 2.10 A NEW ASSAY FOR APTAMER DETERMINATION BY USING NGS |
| 2.10.1 Determination of high quality of resolution |
| 2.10.2 Determination in Precocious selection round |
| 2.10.3 Aptamer and Sequence Clustering Assays |
| 2.11 APTAMERS: CURRENT CHALLENGES AND FUTURE PROSPECTS |
| CHAPTER 3 MATERIALS AND METHODS |
| 3.1. MATERIALS |
| 3.2 METHODS |
| 3.2.1 Serum collection and processing |
| 3.2.2 Brest cancer serum-magnetic beads combination and combined serum-magnetic beads treatment |
| 3.2.3 Brest cancer serum proteins screening aptamers |
| 3.2.4 Ds DNA library Preparation |
| 3.2.5 Ss DNA library Preparation |
| 3.2.5.1 Quantitive real time PCR for ssDNA production: |
| 3.2.5.2 Polyacrylamide Gel electrophoresis for ssDNA library Preparation and ss DNA purification |
| 3.2.6 SsDNA library concentration detection |
| 3.2.7 Specificity detection for the ss DNA combined to target protein |
| 3.2.7.1 Gel electrophoresis (PAGE) test |
| 3.2.7.2 Real time quantitative PCR method |
| CHAPTER 4 RESULTS, DISCUSSION AND CONCLUSION |
| 4.1 RESULTS |
| 4.1.1 Brest cancer serum proteins-aptamer screening results |
| 4.1.1.1 Quantitive Real time PCR Result for First and second Rounds of Screening |
| 4.1.1.2 Quantitive Real time PCR Result for Fourth Round of Screening |
| 4.1.1.3 Quantitive Real time PCR Result for 5th Round of Screening |
| 4.1.1.4 Quantitive Real time PCR Result for 9th Round of Screening |
| 4.1.2 SsDNA secondary library preparation |
| 4.1.3 Sequencing |
| 4.2 DISCUSSION |
| 4.3 CONCLUSION AND FUTURE WORK |
| REFERENCES |
| ACKNOWLEDGEMENTS |
| LIST OF PUBLICATIONS |
（5）新型细胞因子IL-39（IL-23p19/Ebi3）的鉴定及其在系统性红斑狼疮中的功能研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 IL-39(p19/E-bi3)的鉴定及信号通路的研究 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 小结 |
| (四) 讨论 |
| 第二部分 分泌IL-39的B细胞鉴定 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 小结 |
| (四) 讨论 |
| 第三部分 IL-39在系统性红斑狼疮中的功能研究 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 小结 |
| (四) 讨论 |
| 第四部分 IL-39在系统性红斑狼疮中促炎作用的机制分析 |
| (一) 材料与方法 |
| (二) 结果 |
| (三) 小结 |
| (四) 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 |
| 附发表论文 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）HMGB1参与EAM心肌纤维化的机制及对固有免疫细胞功能的影响（论文提纲范文）
| ABSTRACT |
| 摘要 |
| CHAPTER 1 GENERAL REVIEW(BACKGROUND) |
| 1.1 MYOCARDITIS:THE DISEASE |
| 1.1.1 Causes and Epidemiology of Myocarditis |
| 1.1.2 The structure of the Human Heart |
| 1.1.3 Cells of the Heart |
| 1.1.3.1 Cardiac fibroblast cells |
| 1.1.3.1.1 Origin and organization of Cardiac fibroblast |
| 1.1.3.1.2 Proteins expressed on Cardiac fibroblast cells |
| 1.1.3.1.2.1 FSP1 |
| 1.1.3.1.2.2 α-SMA |
| 1.1.3.1.2.3 DDR1 and DDR2 |
| 1.1.3.1.2.4 Periostin |
| 1.1.3.2 Cardiomyocytes |
| 1.1.3.3 Cardiac Endothelial cells |
| 1.2. ANIMAL MODEL:EXPERIMENTAL AUTOIMMUNE MYOCARDITIS |
| 1.2.1 Suppressor Cellular Therapies in Myocarditis |
| 1.3 IMMUNE RESPONSES |
| 1.3.1 Innate Immunity |
| 1.3.1.1 Dendritic cells |
| 1.3.1.2 Macrophages |
| 1.3.1.3 Neutrophils |
| 1.3.2 Adaptive Immunity |
| 1.3.2.1 Th1 & Th2 |
| 1.3.2.2 Th17 |
| 1.3.2.3 Th22 |
| 1.3.2.4 T regulatory Cells |
| 1.3.2.5 B cells |
| 1.3.3 Cardiac fibroblast cells,dendritic cells,macrophages and CD4+T cells in myocarditis |
| 1.4 MYELOID-DERIVED SUPPRESSOR CELLS |
| 1.4.1 Origin and subsets of MDSCs |
| 1.4.2 Transcription factors relating to MDSC |
| 1.4.3 MDSC Activation and Expansion |
| 1.4.4 Suppressive Activity of MDSC |
| 1.4.5 MDSC in Experimental Autoimmune myocarditis |
| 1.5 STATEMENT OF PROBLEM,HYPOTHESIS AND EXPERIMENTAL DESIGN |
| 1.6 OBJECTIVES OF THE STUDY |
| 1.6.1 Specific Aim 1 |
| 1.6.2 Specific Aim 2 |
| 1.6.3 Specific Aim 3 |
| CHAPTER 2 UP-REGULATED HIGH MOBILITY GROUP BOX-1 IN EXPERIMENTAL AUTOIMMUNEMYOCARDITIS(EAM)DIRECTLY LED TO COLLAGEN DEPOSITION BY A PKCB/ERK1/2-DEPENDENT PATHWAY |
| 2.1 Introduction |
| 2.2 MATERIALS AND METHODS |
| 2.2.1 Experimental apparatus and materials |
| 2.2.2 Methods |
| 2.2.2.1 Cardiac fibroblasts isolation,culture and treatment |
| 2.2.2.2 RT-qPCR Assay |
| 2.2.2.3 Western blot analysis |
| 2.2.2.4 Histopathology |
| 2.2.2.5 Migration experiments |
| 2.2.2.6 MTT assay |
| 2.2.2.7 Statistical analysis |
| 2.3 RESULTS |
| 2.3.1 HMGB1 could directly lead to cardiac collagen deposition of cardiac fibroblasts/myofibroblasts by a PKCβ/Erk1/2-dependent signalling pathway |
| 2.3.2 Cardiac collagens deposition accompanying HMGB1 up-regulation and HMGB1 blockade ameliorated cardiac fibrosis in EAM mice |
| 2.4 DISCUSSION |
| CHAPTER 3 CARDIAC FIBROBLAST/MYOFIBROBLAST MIGHT BE ANOTHER SOURCE OF HMGB1 |
| 3.1 INTRODUCTION |
| 3.2 MATERIALS AND METHODS |
| 3.2.1 Mice |
| 3.2.2 Experimental methods |
| 3.2.2.1 Cardiac fibroblasts isolation,culture and treatment |
| 3.2.2.2 RT-qPCR Assay |
| 3.2.2.3 Western blot analysis |
| 3.2.2.4 Migration experiments |
| 3.2.2.5 MTT assay |
| 3.2.2.6 siRNA experiment in cardiac fibroblasts/myofibroblasts |
| 3.2.2.7 Statistical analysis |
| 3.3 RESULTS |
| 3.3.1 External stress could up-regulate HMGB1 expression of cardiac fibroblasts/myofibroblasts |
| 3.3.2 HMGB 1,secreted by cardiac fibroblast/myofibroblast under external stress,up-regulated Col1,Col3 and OPN expression via PKCβ activation by autocrine means |
| 3.4 DISCUSSION |
| CHAPTER 4 CPG-OLIGODEOXYNUCLEOTIDES SUPPRESS THE PROLIFERATION OF A549 LUNGADENOCARCINOMA CELLS VIA TOLL-LIKE RECEPTOR 9 SIGNALING ANDUPREGULATION OF RUNT-RELATED TRANSCRIPTION FACTOR 3 EXPRESSION |
| 4.1 INTRODUCTION |
| 4.2 MATERIALS AND METHODS |
| 4.2.1 Experimental apparatus and materials |
| 4.2.2 Expeiimental methods |
| 4.2.2.1 Cell culture |
| 4.2.2.2 Reverse transcription-PCR(RT-PCR) and quantitative PCR(qPCR) |
| 4.2.2.3 Western blot analysis |
| 4.2.2.4 Design of Runx3 siRNA |
| 4.2.2.5 Transfection of Runx3 siRNA |
| 4.2.2.6 Proliferation assay |
| 4.2.2.7 Statistical analysis |
| 4.3 RESULTS |
| 4.3.1 EXPRESSION OF RUNX3 IN CPG-ODN-INDUCED A549 CELLS |
| 4.3.2 INHIBITORY EFFECT OF SIRNA ON RUNX3 EXPRESSION IN A549 CELLS |
| 4.3.3 Effect of Runx3 siRNA transfection on the proliferation of A549 cells stimulated by CpG-ODN |
| 4.4 DISCUSSION |
| CHAPTER 5 IL-17 PRODUCING INNATE LYMPHOID CELLS 3(ILC3)BUT NOT TH17 CELLS MIGHTBE THE POTENTIAL DANGER FACTOR FOR PREECLAMPSIA AND OTHER PREGNANCYASSOCIATED DISEASES |
| 5.1 INTRODUCTION |
| 5.2 MATERIALS AND METHODS |
| 5.2.1 Experimental apparatus and materials |
| 5.2.2 Patients |
| 5.2.3 Experimental methods |
| 5.2.3.1 Cell preparation |
| 5.2.3.2 Flow cytometry |
| 5.2.3.3 Lymphocyte cell counts |
| 5.2.3.4 Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) |
| 5.3 RE-SULTS |
| 5.3.1 Characteristics of Pregnant women enrolled for the study |
| 5.3.2 Elevated Lymphocyte counts among the PE,CD and GD patients |
| 5.3.3 Increased IFN-γ,IL-17,IL-1β and HMGB1 in plasma from PE,CD and GD patients |
| 5.3.4 IL-17 producing ILCs 3 not Th17 cells might be a potential danger factor for PE,CD and GD patients |
| 5.4 DISCUSSION |
| CHAPTER 6 |
| 6.1 MAIN CONCLUSIONS |
| 6.2 MAIN INNOVATIONS |
| 6.3 RESEARCH PROSPECTS |
| REFERENCES |
| PUBLICATIONS |
| LIST OF ABBREVIATIONS |
| LIST OF FIGURES |
| ACKNOWLEDGEMENTS |
（8）Gene therapy in pancreatic cancer（论文提纲范文）
| INTRODUCTION |
| STRATEGIES FOR GENE THERAPY |
| Gene replacement |
| Gene modification |
| Gene augmentation |
| Gene blockade |
| METHODS FOR GENE DELIVERY |
| Ex vivo delivery |
| In vivo delivery |
| VECTOR SYSTEMS FOR GENE DELIVERY |
| Non-viral vector systems |
| Physical delivery |
| Chemical vectors |
| Biological vectors |
| Viral vector systems |
| Target genes and efficacy |
| Tumor suppressor genes |
| Drug sensitivity genes/suicide genes |
| HSV-TK/ganciclovir |
| CD/5-fluorocytosine (5-FC) |
| Nitroreductase/CB1954 |
| Cytochrome P450/cyclophosphamide |
| ANTI-ANGIOGENESIS GENES |
| Soluble VEGFR |
| Soluble fibroblast growth-factor receptors (FGFRs) |
| Endostatin (ES) , thrombospondin-1 (TSP-1) , angiostatin (AS) and vasostatin |
| NK4 |
| Matrix metalloproteinase (MMP) inhibitors |
| Somatostatin (SST) receptors (SSTRs) |
| IMMUNE RELATED GENES |
| MHC molecules and co-stimulatory molecules |
| Inflammatory cytokines |
| Tumor antigens |
| APOPTOSIS RELATED GENES |
| ONCOGENES |
| K-ras |
| LSM1 |
| HER-2/Erb B-2 |
| MULTIDRUG RESISTANCE GENES |
| PROLIFERATION RELATED GENES |
| VEGF |
| Human telomerase reverse transcriptase |
| COX-2 |
| Clinical research of gene therapy |
| Conclusions and prospects |
（9）单链抗体融合人血清白蛋白的制备及对重症肌无力患者血清的抑制作用（论文提纲范文）
| Abbreviations |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| Chapter 1 Introduction |
| 1.1 Myasthenia gravis |
| 1.2 Acetylcholine receptor |
| 1.3 Single-chain fragment variable |
| 1.3.1 Constrction of scFv |
| 1.3.2 Expression of scFv |
| 1.3.3 Application of scFv |
| 1.4 Single-chain fragment variable 637 |
| Chapter 2 Materials |
| 2.1. Bacteria and yeast strains |
| 2.2 Vector |
| 2.3 Others |
| 2.4 Reagents |
| 2.5 Instruments |
| 2.6 Culture media |
| 2.7 Solutions |
| Chapter 3 Methods |
| 3.1 Construction of recombination plasmid |
| 3.1.1 Construction of plasmid pHEN2-scFv637-HSA |
| 3.1.2 Construction of plasmid pPIC9K-scFv637-HSA |
| 3.2 Expression of plasmid pPIC9K-scFv637-HSA in Pichia pastoris |
| 3.2.1 Electroporation |
| 3.2.2 PCR analysis of positive transformants |
| 3.2.3 Selection of positive transformants |
| 3.3 Expression and screening of scFv637-HSA |
| 3.3.1 Expression of scFv637-HSA |
| 3.3.2 Screening of scFv637-HSA |
| 3.4 Immunofluorescence staining of scFv637-HSA in human intercostal muscle |
| 3.4.1 Preparation of frozen section |
| 3.4.2 Immunofluorescence staining |
| 3.5 Inhibition of scFv637-HSA on the binding of MG patient sera to hAChR |
| 3.6 Stability of scFv637-HSA in static heathy sera |
| 3.7 Statistical analysis |
| Chapter 4 Results |
| 4.1 Construction of scFv637-HSA |
| 4.2 Determination of scFv637-HSA |
| 4.3 Selection of multicopy strains by G418 |
| 4.4 Expression of fusion protein |
| 4.5 Detection of fusion protein |
| 4.6 Binding of scFv637-HSA to AChR in human intercostal muscle |
| 4.7 Inhibition of scFv637-HSA in MG patient sera |
| 4.8 Stability of scFv637-HSA in static healthy sera |
| 附图 |
| Chapter 5 Discussion |
| Conclusions |
| References |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的科研业绩 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（10）薯蓣皂苷逆转阿霉素多药耐药、增加甲氨蝶呤吸收的分子药理学机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分: 薯蓣皂苷对人白血病细胞K562/ADR多药耐药的逆转效果及分子药理学机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一. 材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 二. 方法 |
| 2.1 溶液的配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞活性的测定 |
| 2.4 Quantitive Real-Time PCR |
| 2.5 Western Blotting |
| 2.6 瞬时转染与荧光素酶活性分析 |
| 2.7 薯蓣皂苷对阿霉素细胞内蓄积的影响 |
| 2.8 统计分析 |
| 结果 |
| 3.1 K562和K562/ADR细胞的特征 |
| 3.2 薯蓣皂苷的细胞毒性 |
| 3.3 薯蓣皂苷对阿霉素细胞毒性的影响 |
| 3.4 薯蓣皂苷对K562/ADR细胞MDR1 mRNA和蛋白表达的影响 |
| 3.5 薯蓣皂苷对阿霉素细胞内积累的影响 |
| 3.6 薯蓣皂苷对NF-κB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分: 薯蓣皂苷体对甲氨蝶呤吸收的影响及其分子药理学机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一. 材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 动物及细胞 |
| 二. 方法 |
| 2.1 溶液的配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞活性测定 |
| 2.4 经上皮转运研究 |
| 2.5 Quantitive Real-Time PCR |
| 2.6 Western Blotting |
| 2.7 瞬时转染与荧光素酶活性分析 |
| 2.8 大鼠空肠和回肠翻转液囊的制备 |
| 2.9 组织学检查 |
| 2.10 原位肠灌注研究 |
| 2.11 LC-MS/MS分析 |
| 2.12 统计分析 |
| 结果 |
| 3.1 薯蓣皂苷对甲氨蝶呤Caco-2细胞毒性的影响 |
| 3.2 薯蓣皂苷对甲氨蝶吟经Caco-2细胞转运影响 |
| 3.3 薯蓣皂苷对Caco-2的MDR1 mRNA和蛋白表达的影响 |
| 3.4 薯蓣皂苷对Caco-2细胞的NF-κB信号通路的影响 |
| 3.5 薯蓣皂苷在大鼠翻转肠中对甲氨蝶呤吸收的影响 |
| 3.6 薯蓣皂苷对大鼠小肠的MDR1 mRNA和蛋白表达的影响 |
| 3.7 小肠组织病理学 |
| 3.8 原位肠灌注中薯蓣皂苷对甲氨蝶呤吸收的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分: 薯蓣皂苷对乳腺癌细胞及其耐药细胞的增敏效果及其分子药理学机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一. 材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 二. 方法 |
| 2.1 溶液的配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞活性的测定 |
| 2.4 Quantitive Real-Time PCR |
| 2.5 Western Blotting |
| 2.6 瞬时转染与荧光素酶活性分析 |
| 2.7 统计分析 |
| 结果 |
| 3.1 薯蓣皂苷对MCF-7和MCF-7/ADR细胞毒性的影响 |
| 3.2 薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞对阿霉素毒性的影响 |
| 3.3 薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞对MDR1基因和蛋白表达的影响 |
| 3.4 薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞对NF-κB信号通路的影响 |
| 3.5 薯蓣皂苷对MCF-7和MCF-7/ADR细胞中NF-kIB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases（论文参考文献）
- [1]葡萄座腔菌内一种新环状RNA的鉴定与特性分析[D]. Muhammad Umer. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]S100A10调控胃癌转移和增殖的机制研究[D]. 李妍. 山东大学, 2021(11)
- [3]IGF2BP2（IMP2）是小鼠早期合子基因组激活的关键调控因子[D]. Muhammad Tahir. 山东大学, 2020
- [4]乳腺癌血清肿瘤标志物适配体的筛选及其检测[D]. SANAD ABDALBAGE MOHAMMED ABDALSADEG（萨那德）. 兰州理工大学, 2018(09)
- [5]新型细胞因子IL-39（IL-23p19/Ebi3）的鉴定及其在系统性红斑狼疮中的功能研究[D]. 王小茜. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(11)
- [6]HMGB1参与EAM心肌纤维化的机制及对固有免疫细胞功能的影响[D]. Prince Amoah Barnie. 江苏大学, 2015(10)
- [7]New insights into hepatitis B virus biology and implications for novel antiviral strategies[J]. Jieliang Chen,Min Wu,Kuancheng Liu,Wen Zhang,Yaming Li,Xiaohui Zhou,Lu Bai,Zhenghong Yuan. National Science Review, 2015(03)
- [8]Gene therapy in pancreatic cancer[J]. Si-Xue Liu,Zhong-Sheng Xia,Ying-Qiang Zhong. World Journal of Gastroenterology, 2014(37)
- [9]单链抗体融合人血清白蛋白的制备及对重症肌无力患者血清的抑制作用[D]. 李芳芳. 延边大学, 2014(01)
- [10]薯蓣皂苷逆转阿霉素多药耐药、增加甲氨蝶呤吸收的分子药理学机制[D]. 王丽娟. 大连医科大学, 2014(05)