一、瑞典科学家用细胞移植治疗糖尿病（论文文献综述）
李碧欣[1]（2021）在《MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的作用研究》文中认为目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,Hu MSCs）向胰岛素分泌细胞（insulin-producing cells,IPCs）分化的潜能,为1型糖尿病患儿的干细胞治疗提供新的细胞来源。方法:（1）用组织贴壁培养法分离、培养、扩增Hu MSCs,并用流式细胞术鉴定Hu MSCs。（2）构建、包装、浓缩MAFA-PDX1过表达慢病毒载体。（3）用不同浓度梯度感染复数（MOI）的MAFA-PDX1过表达慢病毒感染Hu MSCs,培养72h后用倒置荧光显微镜和流式细胞术检测感染效率,选择最适MOI进行后续试验。（4）用细胞形态学、RT-qPCR法、双硫腙染色比较三种方案（方案A:单纯慢病毒组、方案B:先药物诱导再加慢病毒组、方案C:慢病毒和药物诱导同时进行组）诱导Hu MSCs分化为胰岛素分泌细胞的效率和潜能。结果:（1）从脐带华尔通胶中成功分离、培养出HuMSCs,流式细胞仪结果显示Hu MSCs稳定高表达CD73,CD90,CD105,低表达或者不表达CD11b,CD19,CD34,CD45,HLA-DR;并扩增出足够多的细胞满足后续实验需求;（2）成功构建MAFA-PDX1过表达慢病毒载体,并获得高浓度的慢病毒原液（HBLV-Zs Green-PURO,浓度滴度结果为3*10^8TU/m L;HBLV-h-MAFA-PDX1-3xflag-Zs Green-PURO,浓度滴度结果为1*10^8TU/m L）。（3）当MOI=5时,慢病毒感染率为52.6%,MOI为10,20,30时感染率分别为99%,100%,100%;最适MOI是选择细胞感染率大于90%同时细胞状态良好情况下的最小MOI值。因此,本实验选择MOI=10的MAFA-PDX1过表达慢病毒载体感染Hu MSCs。（4）不同方案诱导MAFA-PDX1修饰Hu MSCs向胰岛素分泌细胞分化结果:（1）细胞形态学改变:经三种方案诱导后细胞形态均发生了改变:诱导后细胞失去典型的成纤维细胞形状,开始出现圆形或多角形改变,随后慢慢出现细胞聚集成团,细胞团块逐渐变大,最后呈胰岛状细胞改变;三种诱导方案中,方案B（先药物诱导再加慢病毒组）在第11天的细胞聚集生长最为明显,出现聚集生长的胰岛样细胞团。（2）RT-qPCR检测胰岛相关基因的表达差异:方案A（单纯慢病毒组）:诱导第5天:MAFA、PDX1、GCG、GLUT2、NKX6.1基因表达升高（P<0.05）,INS和NEUROG3基因表达在统计学上无明显差异。诱导第11天:MAFA、PDX1、GCG、NKX6.1基因表达升高（P<0.05）,INS、GLUT2和NEUROG3基因表达在统计学上无明显差异。诱导第5、11天比较:MAFA、PDX1、GCG、NKX6.1基因在诱导第5、11天均表达升高,诱导第5天表达量均高于第11天。GLUT2基因在诱导第5天表达量升高,第11天无明显变化。方案B（先药物诱导再加慢病毒组）:诱导第5天:MAFA、GCG、INS、NKX6.1基因表达升高（P<0.05）;PDX1、GLUT2、NEUROG3基因表达在统计学上无明显差异。诱导第11天:MAFA、PDX1、GCG、INS、GLUT2基因表达升高（P<0.05）,NKX6.1、NEUROG3基因表达在统计学上无明显差异。诱导第5、11天比较:MAFA、GCG、INS基因在诱导第5、11天均表达升高,其中MAFA和INS基因第11天表达量显着高于第5天,GCG基因第5天表达量高于第11天。PDX1、GLUT2基因在诱导第5天无明显表达,第11天表达量升高。NKX6.1基因在诱导第5天升高,第11天无明显表达。方案C（慢病毒和药物诱导同时进行组）:诱导第5天:MAFA、PDX1、GCG、INS基因表达升高（P<0.05）,GLUT2、NKX6.1、NEUROG3基因表达在统计学上无明显差异。诱导第11天:MAFA、PDX1、INS基因表达升高,GLUT2基因表达降低（P<0.05）,GCG、NKX6.1、NEUROG3基因表达在统计学上无明显差异。诱导第5、11天比较:MAFA、PDX1、INS基因在诱导第5、11天均表达升高,其中MAFA、PDX1基因第5天表达量高于第11天,INS基因第11天表达量高于第5天。GCG在诱导第5天表达升高,第11天无明显表达。GLUT2基因在诱导第5天无明显表达,第11天表达下降。三种方案诱导后细胞胰岛相关基因表达差异:同一诱导时间点三种方案横向比较,在诱导第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表达量最高;在诱导第11天,方案B的MAFA和PDX1基因表达量最高。方案B在诱导第5天GCG基因表达,第11天INS和GLUT2基因表达是三种方案中最高的。因此,方案B具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能。（3）双硫腙染色鉴定锌离子:在倒置相差显微镜下可观察到,经三种方案诱导第11天的部分细胞被双硫腙染成棕红色,其中方案B中呈小岛状细胞染色颜色较深（阳性表达）,而对照组未表达。结论:（1）MAFA和PDX1共过表达可促进Hu MSCs向IPCs分化。（2）MAFA-PDX1基因修饰联合药物诱导方案诱导HuMSCs向IPCs分化优于单纯基因修饰方案,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能。
于海滨[2]（2020）在《线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响》文中提出随着畜牧业的快速发展和人类生活水平的提高,消费者对牛乳品质的需求也逐渐增加,对乳品质的要求也越来越高。牛乳品质性状是复杂经济性状,多基因共同调控其表型变化。随着后基因组学时代的到来,筛查与挖掘奶牛乳脂性状相关且具有重大遗传效应的候选功能基因,成为当前奶牛遗传育种科研工作者的主要挑战。甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体（GPAM）基因,属于GPAT基因家族,该基因定位在牛第26q22号染色体上。有研究表明,GPAM基因催化磷脂和甘油三酯（TG）生物合成的第一步反应。基于课题组前期组学分析结果,GPAM基因可能对牛乳脂代谢具有重要影响。本研究以GPAM为候选基因,在敲除细胞水平验证目的基因与牛脂质代谢的功能,同时在模式动物的基础上,解析GPAM基因对乳脂代谢的调控作用机制。利用CRISPR-Cas9技术,以牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建GPAM基因敲除细胞系,同时利用本课题组前期构建的GPAM基因过表达和干扰载体,分别检测目的基因过表达、干扰和敲除后,基因m RNA和蛋白水平的表达情况,检测细胞内甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量,并利用RT-q PCR和Western-blot技术,在m RNA和蛋白水平上验证GPAM基因对牛乳脂代谢相关基因的调控作用。研究结果表明:目的基因敲除后,细胞内GPAM在m RNA和蛋白水平的表达均降低;GPAM基因敲除细胞系内的甘油三酯和胆固醇的含量相对于野生型细胞均显着降低;细胞内脂肪酸含量检测结果显示:GPAM基因过表达能够降低细胞内丁酸的含量,沉默GPAM基因能够促进细胞内丁酸和辛酸含量显着升高;GPAM基因敲除能够促进辛酸的含量增加;乳脂代谢相关基因表达量的检测结果显示:敲除GPAM基因能够降低细胞内脂代谢相关基因ACSL5、FABP3、HSL、PRSS2、AGPAT4的表达,进而调控乳脂代谢通路。GPAM基因转录组测序共获得360个上调基因和570个下调基因;差异基因中的352个基因共富集在3196个GO terms,其中613个GO terms显着富集,包括402个生物过程的GO terms,72个细胞成分GO terms和139个分子功能GO terms;差异表达基因中共富集237个Pathway,其中139个Pathway显着富集（P<0.05）,下调基因富集在78个通路中,上调基因富集在61个通路中。GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析结果表明,GPAM敲除后在对糖代谢信号通路的作用,主要是通过影响丙酸（PATH:00640）和丙酮酸（PATH:00620）代谢通路,使其表达水平上调,提示GPAM基因可能对丙酸和丙酮酸起调控作用,从而对细胞内糖酵解产生一定的影响。同时在转录组测序结果中也发现GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。根据转录组的数据分析结果表明;GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。转录组数据分析发现,GPAM基因参与丙酸、丙酮酸代谢进程,该基因敲除后细胞内丙酸、丙酮酸代谢发生了变化,预测可能对线粒体能量代谢和糖酵解产生影响。同时,GPAM基因作为一种线粒体基因,研究其表达对细胞线粒体功能的影响具有重要意义,根据以上推断我们展开了敲除细胞内线粒体能量代谢的研究。以牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系为研究对象,研究GPAM基因敲除后细胞中线粒体数量、线粒体呼吸能力、线粒体糖酵解速率、细胞对ATP需求的变化。线粒体能量代谢实验结果表明:在GPAM基因敲除细胞系中,细胞内线粒体呼吸能力降低。同时,GPAM敲除后导致线粒体糖酵解所需的重要调节酶活性降低,从而最终导致细胞线粒体糖酵解过程受到显着抑制。同时影响了细胞内Na+/K+的转运;敲除GPAM基因后细胞内线粒体含量减少。实验表明,敲除细胞中GPAM含量的降低导致了细胞线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环过程受到显着抑制。以上这些结果都说明,GPAM的敲除能够影响乳腺上皮细胞的线粒体能量代谢。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,建立GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上验证基因表达调控作用。结果表明:GPAM基因敲除小鼠的生长、发育和繁殖无明显的变化。血清学检测结果发现:GPAM基因敲除小鼠的血清中甘油三酯含量显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）,而血清中胆固醇的含量变化并不显着;组织中甘油三酯和胆固醇的检测结果发现:敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织中甘油三酯、胆固醇的含量均显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）;小鼠乳汁甘油三酯酶联免疫吸附实验结果显示:与野生鼠相比,GPAM基因敲除小鼠乳汁中的甘油三酯含量明显降低（p<0.05）;组织形态学观察表明,敲除小鼠脂肪组织中脂肪细胞的胞体直径略小于野生型小鼠,肌间脂肪含量明显少于与野生型小鼠,乳腺组织中野生型小鼠的脂肪细胞的直径略大于敲除型小鼠,其他组织无明显形态学变化;乳腺组织的脂肪酸含量检测结果显示:敲除小鼠乳腺组织中肉豆蔻酸、棕榈硬脂酸、花生四烯酸盐和亚麻酸盐上显着高于野生型小鼠。本研究在前期转录组学分析的基础上,以GPAM为候选基因,在敲除细胞系水平上验证GPAM基因对细胞内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量的影响,并对GPAM基因敲除细胞系进行转录组分析,解析该基因敲除后对乳脂代谢相关基因的分子机制;同时检测了敲除GPAM基因乳腺上皮细胞内线粒体活性及能量代谢改变情况,阐明GPAM基因是参与线粒体能量代谢的重要基因,并对糖酵解产生影响;构建了GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上进一步验证GPAM基因对乳脂代谢的调控作用。为奶牛乳脂性状的改良和新品种的培育提供优质的基因资源和理论基础。
杨玉花[3]（2020）在《人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究》文中指出背景:体细胞重编程可以产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）。产生的患者特异性干细胞不仅能模拟人类疾病过程,研究发病机制,还能用于药物开发和筛选,以及为个性化再生细胞疗法提供新的机会。目的:探索一种快速简便、不损伤细胞活性、能高效产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）的方法,并评价应用该法获得的iPSCs在体外诱导为皮肤黑素细胞的可能性,为临床治疗色素性疾病提供研究基础。方法:1.分离酶消化修剪后包皮,获得表皮片,一部分做组织培养,另一部分进一步消化成细胞悬液培养。健康个体包皮来源的表皮片平铺在基质胶包被的培养板上培养3周,获得KCs,并进行KSCs标志物K15免疫荧光染色,证实表皮中KSCs的存在。胰酶消化表皮获得表皮KCs悬液,接种在预先IV型胶原包被的六孔培养板,留取15min内贴壁的细胞继续培养。培养24 h后,采用K15抗体、SOX2和OCT4抗体以及干细胞活细胞染料CDy1,进行染色。未染色孔的细胞用胚胎干细胞培养基继续培养1周,观察细胞形态,70%融合后传代培养。15 min未贴附的细胞也同步培养,作为对照研究。拔取的毛囊放入基质胶包被的培养板进行体外培养,分析毛囊KCs的OCT4和NANOG的DNA甲基化水平,与表皮中的KCs相比较。2.用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒转染富集的表皮KSCs获得iPSCs。观察和记录产生的克隆的形态和时间,采用干细胞标记物的相应抗体、碱性磷酸酶检测试剂盒、干细胞活细胞CDy1染料进行检测。分析OCT4和NANOG启动子区域的DNA甲基化水平,RT-PCR检测多潜能基因表达。采用含有不同因子的诱导培养基,诱导iPSCs分别分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs等。用携带4种转录因子的慢病毒转染毛囊KCs,观察iPSCs的形成。将iPSCs种植到SCID小鼠的后肢皮下,观察畸胎瘤的形成,获取畸胎瘤后,进行组织病理和免疫组化检测。从畸胎瘤中获取细胞,分别在KCs培养基、M254培养基和DMEM培养基中培养,观察细胞形态。3.分离酶消化修剪后包皮获得表皮片,通过不同培养方法分别获得KCs、MCs、成纤维细胞（fibroblasts,FBs）。用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒分别转染KCs、MCs并获得相应的iPSCs,FBs通过长时间胰酶消化获得Muse细胞。透射电镜观察人皮肤KCs、MCs及重编程产生的iPSCs和Muse细胞的超微结构。结果:1.表皮片贴附在基质胶包被的培养板底部,产生外向性生长的KCs,中心区域细胞体积小,表皮片外缘的细胞体积逐渐变大,细胞呈多边形。K15抗体染色显示,皮片中心区域阳性细胞密集,周边区阳性数目减少,证实KSCs的存在和大致分布。用胰酶消化未培养的表皮片,获得细胞悬液,这些细胞接种到IV型胶原包被的培养板后,15 min内大约有20～30%的细胞贴壁。快速贴壁的细胞体积较小。24 h后,细胞黏附牢固,部分开始增殖,K15染色和干细胞活细胞染料CDy1染色,明显阳性。而针对干性特异性标志物SOX2和OCT4的染色呈弱阳性。用胚胎干细胞培养基继续培养快速贴壁细胞1周,可见大小不等的克隆形成。相比之下,同步培养的慢贴壁细胞也有克隆形成,但比快速贴壁细胞的克隆小。拔取的毛囊很容易贴附到基质胶上,从毛外根鞘处爬出很多KCs,其中许多呈克隆样生长。传代培养的毛囊KCs和表皮KCs的SOX2和OCT4的甲基化水平相近。2.获得的表皮KSCs传代培养后,进行细胞转染。最早在第7天出现第一个克隆,在10天可见很多典型的iPSCs。干细胞特异性标记物SOX2、OCT4、NANOG和SSEA3染色阳性。干细胞活细胞CDy1染料呈阳性,碱性磷酸酶染色细胞呈紫红色。与亲本KCs相比,获得的iPSCs显示OCT4和NANOG启动子DNA去甲基化。RTPCR检测结果示:iPSCs中SOX2、OCT4、NANOG基因表达水平高于亲本的KCs,而亲本KCs的KLF4基因表达水平高于iPSCs。拟胚体在明胶包被的培养板生长良好,自分化培养可出现外胚层、中胚层和内胚层细胞。用不同分化培养基,诱导iPSCs逐渐分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs,特异性染色相应为AFP（+）、油红O染色（+）、βIII-微管蛋白（+）、神经丝（+）、HMB45（+）和TYR（+）。用四种因子转染毛囊KCs,同样可获得iPSCs。将产生的iPSCs注射到4周龄SCID小鼠后肢皮下,第8周肿瘤长到足够大小,切取畸胎瘤组织进行病理和免疫病理学检查。结果显示:Vimentin（+）、CK（pan）（+）和KI-67（+）阳性,GFAP和AFP染色为阴性。从畸胎瘤组织获得的单细胞,在KCs培养基中生长3周细胞小而圆体,核浆比大,细胞荧光仍然很强,培养6周后细胞排列紧密,细胞活力好,增殖快速。在DMEM培养基中生长3周时细胞主要是圆形,部分有突起,培养6周的细胞,细胞显出扁平形,类似纤维细胞的形态。在M254培养基中生长3周以细小圆形细胞为主,可见部分细胞有少量突触样结构,培养6周的细胞显示出细长的树突,类似MCs的形态。3.透射电镜显示KCs胞体大致呈方形,细胞核大,有一个核仁。MCs呈椭圆形,并且细胞核染色质聚集性差,胞质中可见膜包裹的黑素小体。MCs和KCs重编程产生的iPSCs的超微结构大致相同,细胞呈圆形,具有多个核仁,细胞质稀少,核浆比高,可见发育不良的内质网和高尔基复合体。FBs胞体呈梭型或不规则形,细胞核呈椭圆形或圆形,染色质丰富,细胞器较多。Muse细胞核质比高,细胞核有较多突起,核仁体积较大,细胞质内细胞器较少,相对幼稚。结论:1.KCs混悬液接种在IV型胶原包被的培养板中,15 min内贴壁的细胞富含KSCs。拔取毛发可获得大量的KCs,与表皮来源的KCs类似,包含大量的KSCs。2.用携带四种转录因子的慢病毒转染表皮KSCs,可高效率和较短时间出现iPSCs。这些细胞具有多能性,并可被诱导分化成为不同类型细胞。拔取毛发获的KCs可被重编产生iPSCs。iPSCs接种到SCID小鼠皮下,可产生肿瘤。畸胎瘤细胞在不同培养基中生长呈现不同形态。3.透射电镜显示KCs重编程产生得iPSCs的超微结构与MCs来源的iPSCs超微结构以及Muse细胞的超微结构近似,核浆比高,多个核仁,细胞浆中细胞器较少,且发育不成熟。
马晓洁[4]（2020）在《利用基因编辑和干细胞技术进行人胰腺分化及糖尿病预防和治疗研究》文中研究指明糖尿病是一种世界范围内高发的代谢性疾病,患者体内的胰岛β细胞缺失或功能障碍导致胰岛素分泌不足,进而诱发慢性高血糖症。因此,在体外产生大量有功能的胰岛β细胞对于胰腺发育学研究和糖尿病治疗至关重要。近期的研究报道了很多具有前景的研究方案,其中包括由人多能干细胞向胰岛β细胞的定向分化法。通过对定向分化体系的优化,我们获得了大量有功能的胰岛β细胞。这些细胞高表达胰岛β细胞的标志基因、具有胰岛素分泌囊泡的亚显微结构且可以感应葡萄糖浓度的变化来分泌胰岛素,并且具有一定的体内功能,因而在疾病建模、药物开发和细胞治疗等方面有广阔的应用前景。精准的基因编辑有助于高效地构建疾病模型。然而,在人多能干细胞中进行精准的基因编辑仍然非常耗时耗力。CRISPR-Cpf1是新开发的一种基因编辑工具酶,具有很多独特的优势,包括具有较短的crRNA和低脱靶率等。因此,在人多能干细胞中开发基于CRISPR-Cpf1的精准基因编辑系统具有十分广阔的应用前景。而化学小分子具有使用简便、高效以及非整合等特点,可以用于提高基因编辑效率。在这里,我们在人多能干细胞中构建了 CRISPR-Cpf1基因编辑体系,并且开发了一种无偏好的药物筛选平台。利用该系统,我们在人多能干细胞中进行了高通量药物筛选,并且最终发现了两个小分子VE-822和AZD-7762,可以显着提高CRISPR-Cpf1介导的基因编辑效率。CRISPR-Cpf1体系与化学小分子相结合,为精准高效的基因编辑提供了简单有效的方法。本研究中,我们将人多能干细胞向胰岛β细胞定向分化体系与CRISPR-Cpf1基因编辑体系相结合,构建了 CLEC16A敲除的糖尿病疾病模型,发现CLEC16A参与了人胰腺分化的过程,并且对胰岛β细胞的功能具有一定的影响。这些结果为深入研究CLEC16A对人胰岛β细胞分化调控及分子机制奠定了基础。综上所述,干细胞技术、基因编辑、生物医学工程、高通量遗传和化学筛选以及生物信息学的快速发展,将极大促进疾病建模、药物开发和细胞治疗的进展,帮助解决基本生物学问题并推进临床应用的发展。
王超炜[5]（2020）在《褪黑素通过调控成骨/破骨分化平衡延缓骨质疏松症进程的机制研究》文中提出研究背景褪黑素是一种神经激素,参与调节多种生理活动,尤其是骨稳态的维持。骨质疏松症作为常见的骨代谢疾病,主要表现为骨生成与骨吸收维持的骨稳态失衡而导致的骨量下降和骨结构紊乱,患者骨脆性和骨折发生率增加,而口腔颌面的骨质疏松不利于颌面部骨缺损修复和口腔种植治疗。流行病学研究发现,补充褪黑素可以有效延缓绝经妇女骨质疏松疾病进程。但是,褪黑素如何调节骨重建、骨生成骨吸收平衡,以及骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）在其中的作用和具体机制仍不明确。研究目的本课题拟在去势雌性小鼠骨质疏松模型的基础上,以骨生成与骨吸收平衡作为切入点,研究:1.褪黑素对骨质疏松的治疗效果;2.褪黑素对BMMSCs成骨分化能力的影响及其分子机制;3.褪黑素对BMMSCs介导的破骨细胞分化功能的影响及其作用机制。研究方法1.建立C57BL/6J背景去势雌性小鼠骨质疏松模型,给予褪黑素治疗,通过μCT和H&E染色观察骨骼微结构改变,通过q RT-PCR、免疫组化和ELISA检测各个成骨、破骨和炎症相关指标在骨组织及血清中的表达水平。2.使用搭载sh RNA的慢病毒敲减细胞内褪黑素受体（melatonin receptor,MT受体）后,通过ALP染色、茜素红染色、q RT-PCR、ELISA和western blot明确褪黑素及其受体对BMMSCs成骨分化能力的影响,探索褪黑素、MT受体、NF-κB通路之间的关系,并用NF-κB抑制剂JSH-23验证该通路在其中的作用。3.分别建立直接接触、非直接接触共培养体系,研究BMMSCs与破骨前体细胞之间相互作用的模式,通过TRAP染色、western blot评估破骨细胞分化成熟的水平,并探讨褪黑素在整个过程中的作用。研究结果1.褪黑素显着提高了骨组织、血清中成骨相关基因的转录水平和蛋白的翻译水平,明显抑制了破骨相关蛋白及炎症因子的表达,有效缓解了骨质疏松小鼠的骨流失,改善了紊乱的骨微结构。2.近生理浓度的褪黑素（10-100n M）有效提高了BMMSCs的成骨分化能力,在表象上表现为BMMSCs的ALP水平、钙化结节明显增加,在分子水平上表现为Runx2、Osterix、OCN显着升高,但Col-I水平不受影响。3.褪黑素主要通过MT2受体调节BMMSCs的成骨分化能力。敲减BMMSCs的MT2受体后,褪黑素提高其成骨分化能力（表现为ALP、Runx2、Osterix和OCN表达水平升高,矿化结节生成增加）的作用被显着削弱;而当MT1受体被敲减后,BMMSCs的成骨分化能力无显着变化。4.褪黑素通过抑制MT2受体-NF-κB通路提高BMMSCs的成骨分化能力。褪黑素处理BMMSCs后,细胞内IκBα、p65、IKKα/β的磷酸化水平明显降低,提示NF-κB通路被显着抑制;敲减MT2受体后,褪黑素诱导的NF-κB通路的抑制状态被缓解,而敲减MT1受体无此作用;此外,抑制NF-κB通路具有协同褪黑素促进BMMSCs成骨分化的作用。5.褪黑素不直接影响破骨细胞分化,但可以通过MT2受体-NF-κB通路抑制BMMSCs中RANKL的产生,并提高opg/rankl比值。6.褪黑素通过MT2受体-NF-κB通路调节BMMSCs的旁分泌功能,继而间接抑制破骨细胞分化。在BMMSCs与破骨前体细胞非直接接触共培养体系中,我们发现褪黑素间接抑制了破骨细胞分化;但在直接接触共培养体系中,未观察到该现象。另外,与BMMSCs中RANKL的产生规律一致的是,抑制NF-κB通路能促进褪黑素的破骨抑制作用,MT1受体敲减对该过程无任何影响,而MT2受体敲减却显着减弱了褪黑素的破骨抑制作用。结论本研究证实,褪黑素在延缓骨质疏松进展中有效地发挥了维持骨稳态及抗炎的双重作用,极有可能成为治疗骨质疏松症的潜在药物。此外,我们首次发现MT2受体-NF-κB通路积极地参与了褪黑素促进成骨及抑制破骨的作用过程。值得注意的是,褪黑素是通过干预BMMSCs的旁分泌间接发挥破骨抑制作用,而RANKL/RANK极可能是BMMSCs和破骨细胞分化之间重要的信号轴。总的来说,我们充分证实了褪黑素在生理浓度下能够通过抑制MT2受体-NF-κB通路提高BMMSCs的成骨分化并抑制BMMSCs介导的破骨细胞分化,从而延缓骨质疏松症的疾病进程。
陈亚[6]（2019）在《初步探讨P-糖蛋白过表达对胰岛β细胞生物表型影响的机制》文中研究说明目的:课题组前期实验结果表明P-gp（P-glycoprotein,P-gp）过表达能增加大鼠胰岛β细胞株（INS-1）高糖刺激下胰岛素的分泌,并不影响胰岛素的生物合成,但其中的具体机制尚不清楚。本研究在进一步探讨P-gp过表达促进INS-1细胞胰岛素分泌的机制的同时,通过构建大鼠胰岛β细胞特异性P-gp过表达模型,观察体内环境中P-gp过表达对胰岛β细胞分泌、分化、增殖以及凋亡的影响。方法:（1）实验对象为INS-1细胞和SD大鼠胰岛;（2）INS-1细胞:将Ad-abcb1b腺病毒和阴性对照病毒以浓度50×106/m L在无血清培养基中感染INS-1细胞4小时后,换成正常含有胎牛血清的培养基,置于培养箱继续孵育44小时;（3）用弱RIPA萃取细胞总蛋白,胞浆/胞膜蛋白提取试剂盒萃取细胞膜蛋白和浆蛋白,Western Blot法检测P-gp、L型钙离子通道蛋白（Cav1.2）、小窝蛋白-1（CAV1）、PKA、CREB、SNAP25、STX1A、SYT1、p-CREB、GAPDH、Tublin等相关蛋白的表达;（4）应用染色质免疫沉淀（Ch IP）方法检测CREB与Cav1.2启动子之间是否有结合,并通过实时定量荧光PCR（q PCR）判断其结合的强度;（5）通过免疫共沉淀（Co-IP）方法检测P-gp与CAV1、SNAP25之间的相互作用关系;（6）通过荒漠区基因随机插入法（Ins2-Abcb1b）在大鼠体内构建胰岛P-gp过表达动物模型;（7）用胶原酶体外消化胰腺法人工挑取大鼠胰岛,培养过夜后进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验,并通过ELISA方法测定胰岛素分泌量;（8）提取细胞和胰岛组织总RNA,逆转录成c DNA后进行实时定量荧光PCR检测与β细胞分化相关基因Pdx1、Ins1、Ins2、Ngn3、Mafb、Nkx6.1、Nkx2.2、Neurod1、Mafa、Pax6等的表达情况;（9）取大鼠新鲜的胰腺组织,经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋、切片,用免疫组织化学法检测胰岛组织P-gp、caspase3、caspase8、caspase9、BCL-2、Ki67等相关蛋白的表达,用TUNEL法检测胰岛组织内细胞凋亡。结果:（1）INS-1细胞中,与对照组（Ad-control）相比,P-gp过表达组（Ad-abcb1b）细胞膜、细胞浆Cav1.2表达增加,但是细胞膜/细胞浆比值未增加（P>0.05）;（2）与对照组相比,P-gp过表达组p-CREB、PKA定量增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;（3）Ch IP实验结果表明INS-1细胞内CREB与Cav1.2有结合,且P-gp过表达后CREB与Cav1.2结合增加（P<0.05）;（4）Western Blot结果显示:与对照组相比,P-gp过表达组CAV1、SNAP25表达增加（P<0.05）,STX1A和SYT表达未见明显差异（P>0.05）;P-gp与CAV1、SNAP25具有相互作用,与STX1A无相互作用;随着P-gp表达的增加,P-gp与CAV1相互作用增加（P<0.05）、与SNAP25的相互作用减少（P<0.05）;（5）与对照组相比,P-gp过表达后,INS-1细胞Ngn3、Mafb转录水平升高（P<0.05）,Mafa转录水平降低（P<0.05）,Pdx1、Ins1、Ins2、Nkx6.1、Nkx2.2、Neurod1、Pax6等基因的表达差异无统计学意义（P>0.05）;在野生型和转基因大鼠胰岛组织中,各基因转录水平均无明显差异（P>0.05）;（6）与野生型大鼠相比,过表达P-gp的转基因大鼠胰岛GSIS水平无明显变化（P>0.05）;（7）免疫组化结果:与野生型大鼠相比,转基因大鼠胰岛组织caspase3、caspase8、caspase9、BCL-2、Ki67等的表达差异无统计学意义（P>0.05）;（8）TUNEL结果:与野生型大鼠相比,转基因大鼠胰岛组织凋亡水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论:体内外实验初步表明P-gp过表达对胰岛β细胞表型的影响包括:1.P-gp通过增加Cav1.2的表达促进INS-1细胞胰岛素分泌,与Cav1.2的膜转位无关;P-gp可能通过PKA/CREB途径调节Cav1.2的表达。2.P-gp过表达增加CAV1、SNAP25的表达;P-gp与CAV1和SNAP25具有相互作用;P-gp与CAV1相互作用的增加导致P-gp与SNAP25之间的相互作用减少,以释放更多的SNAP25参与INS-1细胞的胰岛素分泌。3.P-gp过表达可能使INS-1细胞去分化,而对胰岛β细胞的分化无明显影响。4.大鼠胰岛P-gp过表达对胰岛β细胞的GSIS、凋亡、增殖无明显影响。
马双羽[7]（2018）在《利用β细胞体外分化与CRISPR技术模拟和修复人糖尿病的研究》文中研究指明糖尿病是目前影响数亿人群的一类代谢性疾病。随着人类生活水平的不断提高,糖尿病在全世界的发病率逐年上升。常见的糖尿病可分为Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病（Type 1 diabetes mellitus,T1DM;Type 2 diabetes mellitus,T2DM）,其最终都是由于β细胞损失或功能异常导致。因此,揭示β细胞如何通过调控细胞内自身的分子机制响应外界因素（如葡萄糖、脂肪酸、免疫细胞因子等）的刺激成为糖尿病研究的新热门。由于遗传性的永久性新生儿发病型糖尿病（Permanent neonatal diabetes mellitus,PNDM）属于单基因型疾病,受外界因素影响较小,而且致病基因主要通过影响β细胞自身功能而导致糖尿病,因此PNDM模型逐渐成为科学家研究糖尿病中β细胞损失与功能异常（如胰岛素分泌受损）机制的有力工具。近年来,对于PNDM的深入研究极大地促进了科学家对T2DM和其他复杂型糖尿病发病机制的认识。目前,对人糖尿病研究和治疗具有重大推动作用的干细胞胰腺定向分化技术正在兴起,这项技术使得研究人员可以从病人或健康人多能性干细胞中获得大量分化的β细胞用于疾病研究,甚至进行β细胞移植治疗。由于此技术针对人的β细胞进行研究,因此在一定程度解决了动物模型与人生理功能先天性差异而导致的研究结果转化性差的难题。作为导致PNDM的致病基因,PERK是细胞内质网应激反应中重要的信号转导基因,突变后产生以严重的糖尿病、骨骺发育异常和智力发育迟缓为特征的Wolcott-Rallison综合征（WRS）,本研究将WRS病人体细胞重编程为诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）,测序发现该病人在PERK基因第9号外显子上存在GAAA四个碱基的缺失,随后利用CRISPR/Cas9技术将该病人特异性突变引入正常的人胚胎干细胞系Mell后,蛋白印迹实验发现该移码突变导致PERK蛋白翻译失败。接着将PERK野生型与突变型多能性干细胞定向分化为胰腺β细胞,发现PERK突变并不影响β细胞的发育形成,但是,与野生型β细胞相比,PERK突变细胞的胰岛素（Insulin,INS）总量下降、胰岛素前体蛋白（Pro-insulin,Pro-INS）与成熟胰岛素比例升高以及β细胞分泌能力下降,这在一定程度预示了PERK基因突变通过影响β细胞的胰岛素正常合成和分泌过程导致糖尿病。为了理解PERK突变对β细胞中的内质网应激反应和转录组的影响,对野生型和突变型β细胞进行了内质网应激反应检测和转录组测序分析。结果显示以剪切XBP1（XBP1s）为代表的一部分内质网应激基因表达急剧升高以及PERK靶基因EIF2α失去PERK的抑制而持续激活,与以上结果相一致,转录组测序结果发现帮助蛋白质翻译后进入内质网的辅助因子在PERK突变后显着上调并富集。这些发现为揭示内质网应激反应对β细胞损失和功能的影响研究奠定了基础和提供了重要线索。β细胞移植治疗糖尿病一直受到科学家的关注,直到近年来才逐步取得了一些重大进展。本研究通过结合人多能性干细胞胰腺定向分化技术和CRISPR/Cas9基因组编辑技术探索治疗单基因型糖尿病（尤其是PNDM）的可能性。首先通过获取PNDM病人的体细胞,重编程为诱导多能性干细胞,测序鉴定了该病人在INS基因起始密码子处存在单碱基突变,利用CRISPR/Cas9技术纠正该突变后,将突变和修复的干细胞定向分化为β细胞,发现突变的β细胞无法产生胰岛素蛋白和C肽（C-PEP）,但是修复的β细胞恢复了胰岛素蛋白的翻译,进一步通过糖尿病小鼠模型的体外分化β细胞移植实验证明,只有INS修复的β细胞能够拯救小鼠的糖尿病表型,表明了该基因修复和体外分化的β细胞移植方法有望治疗单基因型糖尿病。综上所述,本研究利用人诱导多能性干细胞技术、干细胞胰腺定向分化技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了PERK基因突变导致的PNDM模型,初步解析了PERK突变对人β细胞功能的影响;同时,鉴定了一个新的PNDM糖尿病的胰岛素基因突变,并成功通过CRISPR/Cas9技术纠正该突变并修复突变的β细胞功能。为利用干细胞分化的β细胞移植方法治疗糖尿病奠定了基础以及提供了新的证据,展示了诱导多能性干细胞的胰腺定向分化技术在人类疾病模拟与细胞治疗领域的巨大应用价值。
吴晓丽[8]（2016）在《2015年生命科学热点回眸》文中研究说明2015年无疑在生命科学历史画卷上写下了浓墨重彩的一笔。站在新起点,本文盘点2015年生命科学领域取得的重大研究进展,回顾基因组编辑技术、图谱、结构生物学、干细胞、埃博拉、艾滋病、癌症、糖尿病等研究领域的热点突破。
赵贵英,张树庸[9]（2011）在《2010年下半年生命科学、生物技术研究动态（国外篇）》文中研究表明笔者仅就2010年下半年生命科学、生物技术国外相关研究动态,以信息形式加以总结,供读者参考。1脂肪细胞经再编程可形成iPS新出版的《细胞移植》杂志报道,澳大利亚科学家成功地对成年实验鼠脂肪细胞和神经细胞进行"再编程"（reprogramming）,从而获得了能够分化成各种各样细胞的多能干细胞。这些称为诱导多能干细胞（iPS）的细胞与自然形成的多能干细胞（如胚胎干细胞）十分接近。
张树庸,赵贵英[10]（2009）在《2008年国内外生物技术研究进展（上）——干细胞、人造生命、器官移植》文中研究指明2008年国内外生物技术领域研究发展迅速:干细胞研究有了新突破,可以避开伦理学的限制开展广泛研究;人工合成生命有了新进展,表现出了巨大的生命力和广阔的应用前景;基因组快速测序技术的出现,使人类个性化医疗向前迈出了重要的一步;对癌基因进行测序,发现了更多的致癌基因和器官移植的成功实例,使人们看到了治疗疑难病的希望……
二、瑞典科学家用细胞移植治疗糖尿病（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、瑞典科学家用细胞移植治疗糖尿病（论文提纲范文）
（1）MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略语中英文对照表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 HuMSCs原代培养和传代 |
| 3.2 HuMSCs表面生物学标志物检测与鉴定 |
| 3.3 h-MAFA-PDX1过表达慢病毒载体成功构建 |
| 3.4 h-MAFA-PDX1过表达慢病毒感染HuMSCs的MOI摸索 |
| 3.5 MAFA-PDX1修饰的HuMSCs向IPCs分化 |
| 3.6 双硫腙染色 |
| 第4章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 基因编程干细胞疗法治疗糖尿病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（2）线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 GPAM基因的研究进展 |
| 1.1 GPAM基因家族基因 |
| 1.2 GPAM基因的生物学作用 |
| 1.3 线粒体GPAM的功能 |
| 1.4 酵母中的GPAT表达 |
| 1.5 GPAM在甘油三酯合成中的调控作用 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 影响乳品质的重要因素及乳脂代谢通路的研究进展 |
| 2.1 甘油三酯的在乳品质评价中意义 |
| 2.2 哺乳动物乳腺中的甘油三酯合成 |
| 2.3 乳脂代谢相关基因的简介 |
| 2.4 多不饱和脂肪酸在乳脂中的调控作用 |
| 2.5 乳汁中的甘油三酯表达 |
| 2.6 结语 |
| 第三章 线粒体基因及线粒体能量代谢的研究进展 |
| 3.1 线粒体的主要功能 |
| 3.2 线粒体在生命活动中的重要意义 |
| 3.3 线粒体在细胞死亡过程中的作用 |
| 3.4 线粒体能量代谢 |
| 3.5 结语 |
| 第四章 基因编辑技术的研究进展 |
| 4.1 转基因技术概况 |
| 4.2 精原干细胞技术 |
| 4.3 原始生殖细胞技术 |
| 4.4 胚胎干细胞基因打靶技术 |
| 4.5 条件基因靶向技术 |
| 4.6 诱导多能干细胞技术 |
| 4.7 CRISPR-CAS9 技术 |
| 4.8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系的建立及其对细胞内乳脂代谢的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验用酶 |
| 1.1.4 其他药品及试剂 |
| 1.1.5 试剂的配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.2.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆及鉴定 |
| 1.2.3 GPAM基因敲除靶位点的设定以及sg RNA的设计 |
| 1.2.4 gRNA的体外筛选 |
| 1.2.5 GPAM基因g RNA表达载体的构建 |
| 1.2.6 细胞培养及传代 |
| 1.2.7 敲除载体的的转染 |
| 1.2.8 细胞内编辑效率验证 |
| 1.2.9 敲除细胞的筛选、培养及鉴定 |
| 1.2.10 实时荧光定量PCR和 Western Blot检测候选基因的表达 |
| 1.2.11 GPAM基因表达载体与干扰载体鉴定 |
| 1.2.12 细胞内甘油三酯和胆固醇含量检测 |
| 1.2.13 细胞内脂肪酸含量的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.3.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆和鉴定 |
| 1.3.3 gRNA浓度的测定 |
| 1.3.4 gRNA的体外筛选结果 |
| 1.3.5 敲除载体的构建及细胞转染 |
| 1.3.6 细胞内敲除效率验证 |
| 1.3.7 阳性细胞测序验证 |
| 1.3.8 GPAM过表达和干扰载体鉴定与检测结果 |
| 1.3.9 牛GPAM基因敲除后细胞内m RNA和蛋白表达的检测 |
| 1.3.10 GPAM基因表达对细胞内甘油三酯含量的影响 |
| 1.3.11 GPAM基因表达对细胞内胆固醇含量的影响 |
| 1.3.12 GPAM基因表达对细胞内脂肪酸含量的影响 |
| 1.3.13 GPAM敲除对脂代谢相关基因的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其他药品及试剂 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA提取及质量检测 |
| 2.2.2 文库建立及测序 |
| 2.2.3 原始数据质量控制 |
| 2.2.4 Mapping结果统计及基因结构分析 |
| 2.2.5 差异基因表达分析 |
| 2.2.6 差异基因GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.7 差异基因表达水平验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞总RNA提取及检测 |
| 2.3.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序数据筛选及分析 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 |
| 2.3.4 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.5 差异基因蛋白互作预测分析 |
| 2.3.6 GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析 |
| 2.3.7 基因共表达网络关系预测分析 |
| 2.3.8 差异基因的表达水平验证 |
| 2.3.9 GPAM基因对甘油三酯合成相关基因的调控作用 |
| 2.3.10 GPAM基因对脂肪酸合成相关基因的调控作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛GPAM基因对乳腺上皮细胞线粒体能量代谢的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 其他药品及试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞线粒体的提取 |
| 3.2.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体呼吸的检测 |
| 3.2.3 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.2.4 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.2.5 敲除细胞对ATP 需求的影响 |
| 3.2.6 细胞线粒体数量的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除细胞中线粒体呼吸的检测 |
| 3.3.2 敲除细胞中线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.3.3 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.3.4 GPAM基因敲除后细胞内线粒体数量的改变 |
| 3.3.5 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中三羧酸循环检测分析 |
| 3.3.6 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中氧化磷酸化检测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于敲除小鼠模型验证GPAM基因对脂肪代谢的调控作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 其他药品及试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GPAM基因敲除小鼠模型的制备 |
| 4.2.2 GPAM基因敲除小鼠的扩繁 |
| 4.2.3 GPAM基因敲除小鼠的鉴定 |
| 4.2.4 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.2.5 目的基因敲除小鼠相关生长性状的测定 |
| 4.2.6 组织形态学的检测 |
| 4.2.7 敲除小鼠血清学相关指标的检测 |
| 4.2.8 敲除小鼠组织中甘油三酯和胆固醇含量的检测 |
| 4.2.9 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的检测 |
| 4.2.10 敲除小鼠组织中脂肪酸成分及含量的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 敲除小鼠的阳性鉴定 |
| 4.3.2 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.3.3 目的基因敲除小鼠相关生长性状测定 |
| 4.3.4 目的基因敲除小鼠各组织形态学分析 |
| 4.3.5 敲除小鼠血清中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.6 敲除小鼠血清中胆固醇含量的测定 |
| 4.3.7 敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织甘油三酯和胆固醇含量的测定 |
| 4.3.8 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.9 敲除小鼠乳腺脂肪酸含量的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表的文章及专利 |
| 致谢 |
（3）人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一章 富含干细胞的人皮肤角质形成细胞的获取 |
| 一、试剂和材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 人皮肤角质形成细胞重编程产生诱导性多能干细胞 |
| 一、试剂、材料和使用设备 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 诱导性多能干细胞超微结构的对比研究 |
| 一、试剂材料和仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 总结和展望 |
| 第四章 综述 |
| 综述 1 表皮干细胞增殖和分化机制研究 |
| 参考文献 |
| 综述 2 皮肤干细胞在皮肤再生及创伤修复中的作用 |
| 参考文献 |
| 综述 3 人皮肤源性多潜能干细胞的研究现状和应用前景 |
| 参考文献 |
| 负责科研项目 |
| 参与科研项目 |
| 读博期间发表的论文 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（4）利用基因编辑和干细胞技术进行人胰腺分化及糖尿病预防和治疗研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 CRISPR基因编辑系统的发展与应用 |
| 1.1.1 基因编辑技术的早期发展 |
| 1.1.2 CRISPR-Cas9基因编辑系统 |
| 1.1.3 CRISPR-Cpf1基因编辑系统 |
| 1.1.4 CRISPR基因编辑系统的近期发展 |
| 1.1.5 CRISPR基因编辑系统的应用 |
| 1.2 人胰腺的基本介绍 |
| 1.3 糖尿病的相关介绍 |
| 1.4 体外获得胰岛β细胞的方法 |
| 1.4.1 人多能干细胞研究的发展 |
| 1.4.2 人多能干细胞定向分化为胰岛β细胞 |
| 1.4.3 胰岛β细胞的体细胞重编程法 |
| 1.4.4 促进胰岛β细胞增殖的方法 |
| 1.5 人胰岛β细胞的应用 |
| 1.5.1 分化的人胰岛β细胞在疾病模型中的应用 |
| 1.5.2 体外获得的胰岛β细胞在药物筛选中的应用 |
| 1.6 CLEC16A的研究背景与现状 |
| 1.7 本课题的研究方向及内容 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 主要仪器及设备 |
| 2.2 主要试剂及耗材 |
| 2.3 细胞系及菌株 |
| 2.4 质粒 |
| 2.5 小鼠品系及饲养 |
| 2.6 实验常用细胞培养基及试剂溶液 |
| 2.6.1 MEF培养基 |
| 2.6.2 人多能干细胞培养基 |
| 2.6.3 干细胞定向分化的培养基 |
| 2.6.4 胰岛前体细胞培养基 |
| 2.6.5 胰岛β细胞分化培养基 |
| 2.6.6 50× TAE溶液 |
| 2.6.7 10×磷酸缓冲液(PBS) |
| 2.6.8 PBST溶液 |
| 2.6.9 免疫荧光染色封闭液 |
| 2.6.10 4%多聚甲醛溶液 |
| 2.6.11 液体LB培养基 |
| 2.6.12 固体LB培养基 |
| 2.6.13 琼脂糖电泳胶 |
| 2.6.14 5×KRB溶液 |
| 2.6.15 1 M HEPES溶液 |
| 2.6.16 KRBH溶液 |
| 2.7 实验方法及操作 |
| 2.7.1 细胞基因组提取 |
| 2.7.2 PCR实验 |
| 2.7.3 PCR产物割胶回收 |
| 2.7.4 crRNA的设计与构建 |
| 2.7.5 基因组片段和质粒的酶切 |
| 2.7.6 目的片段与载体连接实验 |
| 2.7.7 大肠杆菌转化实验 |
| 2.7.8 质粒扩增及抽提实验 |
| 2.7.9 T7EI实验 |
| 2.7.10 RFLP实验 |
| 2.7.11 RNA提取与反转录实验 |
| 2.7.12 RT-qPCR实验 |
| 2.7.13 免疫荧光染色实验 |
| 2.7.14 FACS流式细胞分析实验 |
| 2.7.15 细胞复苏与培养 |
| 2.7.16 细胞传代与冻存 |
| 2.7.17 人多能干细胞定向分化实验 |
| 2.7.18 细胞电转染实验 |
| 2.7.19 普通细胞转染实验 |
| 2.7.20 细胞凋亡实验 |
| 2.7.21 NHEJ报告实验 |
| 2.7.22 透射电镜观察细胞内胰岛素分泌囊泡 |
| 2.7.23 GSIS葡萄糖应激实验 |
| 2.7.24 小鼠体内移植实验 |
| 2.7.25 组织包埋和冰冻切片染色实验 |
| 2.7.26 统计学分析 |
| 2.7.27 基因编辑脱靶率分析 |
| 2.7.28 RNA-seq分析 |
| 2.7.29 全基因组测序分析 |
| 2.8 课题中使用的各种核苷酸序列 |
| 2.8.1 构建crRNA表达载体的核苷酸序列 |
| 2.8.2 构建质粒载体相关的引物 |
| 2.8.3 基因型鉴定相关引物 |
| 2.8.4 T7EI实验相关引物 |
| 2.8.5 RFLP实验相关引物 |
| 2.8.6 脱靶位点分析相关引物 |
| 2.8.7 潜在脱靶位点信息 |
| 2.8.8 qPCR实验相关引物 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CRISPR-Cpf1系统在人多能干细胞中的应用 |
| 3.1.1 CRISPR-Cpf1基因编辑体系的建立 |
| 3.1.2 CRISPR-Cpf1在人多能干细胞中的作用 |
| 3.1.3 构建基因敲除的人多能干细胞系 |
| 3.1.4 基因编辑的脱靶率分析 |
| 3.1.5 基因敲入的人多能干细胞系的构建 |
| 3.1.6 促进CRISPR-Cpf1基因编辑的化学小分子筛选 |
| 3.1.7 VE-822和AZD-7762的功能鉴定 |
| 3.1.8 VE-822和AZD-7762在构建报告细胞系中的作用 |
| 3.1.9 VE-822和AZD-7762在构建点突变细胞系中的作用 |
| 3.1.10 VE-822和AZD-7762在构建双基因敲入细胞系中的作用 |
| 3.1.11 VE-822和AZD-7762的分子作用机制 |
| 3.1.12 VE-822和AZD-7762的细胞毒性分析 |
| 3.2 人多能干细胞向胰岛β细胞高效分化体系的建立 |
| 3.2.1 人多能干细胞向胰岛前体细胞定向分化体系的建立 |
| 3.2.2 胰岛前体细胞向胰岛β细胞分化体系的建立 |
| 3.2.3 PBE1的功能鉴定 |
| 3.2.4 人胰岛β细胞定向分化过程的RNA-seq分析 |
| 3.2.5 分化的胰岛β细胞的体外功能鉴定 |
| 3.2.6 分化的胰岛β细胞的体内功能鉴定 |
| 3.3 CLEC16A在胰腺分化过程中的功能 |
| 3.3.1 CLEC16A敲除的人多能干细胞系的构建 |
| 3.3.2 CLEC16A在人胰岛β细胞分化中的作用 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（5）褪黑素通过调控成骨/破骨分化平衡延缓骨质疏松症进程的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 褪黑素在骨质疏松症中的作用 |
| 引言 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二部分 褪黑素对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响及机制研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三部分 褪黑素对骨髓间充质干细胞介导的破骨细胞分化的影响及机制研究 |
| 引言 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞临床治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）初步探讨P-糖蛋白过表达对胰岛β细胞生物表型影响的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、P-糖蛋白过表达促进INS-1 细胞分泌的机制研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 实验试剂和仪器 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 P-gp过表达对Cav1.2 表达的影响 |
| 1.2.2 P-gp过表达对CAV1、SNAP25 及其之间的相互作用的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 P-gp过表达对INS-1 细胞Cav1.2 及胰岛素分泌的影响 |
| 1.3.2 P-gp调节Cav1.2 表达的机制 |
| 1.3.3 P-gp通过CAV1、SNAP25 及其之间的相互作用调节INS-1 细胞胰岛素的分泌 |
| 1.4 小结 |
| 二、P-糖蛋白过表达对INS-1 和胰岛β细胞分化的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 实验试剂和仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 转基因大鼠基因鉴定结果 |
| 2.2.2 P-gp过表达对INS-1 细胞分化的影响 |
| 2.2.3 P-gp过表达对胰岛β细胞分化的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、P-糖蛋白过表达对大鼠胰岛增殖、凋亡、分泌的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 实验试剂和仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 P-gp过表达对大鼠胰岛素分泌的影响 |
| 3.2.2 P-gp过表达对大鼠胰岛素增殖、凋亡的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）利用β细胞体外分化与CRISPR技术模拟和修复人糖尿病的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 引言 |
| 1.1 胰岛素和胰腺的研究背景 |
| 1.1.1 胰岛素的介绍 |
| 1.1.2 胰腺的结构及其生理功能 |
| 1.1.3 β细胞分泌胰岛素的分子机制 |
| 1.2 糖尿病分类和致病基因的研究进展 |
| 1.2.1 Ⅰ型糖尿病(T1DM) |
| 1.2.2 Ⅱ型糖尿病(T2DM) |
| 1.2.3 单基因型糖尿病(Monogenic diabetes) |
| 1.2.4 单基因型糖尿病研究对理解Ⅱ型糖尿病和其他复杂型糖尿病的意义 |
| 1.3 内质网应激反应在糖尿病中的作用研究 |
| 1.3.1 非折叠蛋白质反应与内质网应激反应简介 |
| 1.3.2 人PERK基因突变导致的Wolcott-Rallison综合征 |
| 1.3.3 Perk基因敲除小鼠的研究 |
| 1.4 小鼠与人胰腺发育生物学研究进展 |
| 1.5 胰腺细胞转分化与定向分化技术研究进展 |
| 1.5.1 胰腺细胞转分化技术研究进展 |
| 1.5.2 胰腺细胞定向分化技术研究进展 |
| 1.6 CRISPR/Cas基因编辑技术的研究进展 |
| 1.6.1 细菌CRISPR/Cas系统的抗噬菌体感染的机制 |
| 1.6.2 CRISPR/Cas系统在真核生物基因组编辑中的应用 |
| 1.7 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒 |
| 2.1.2 细胞系和实验动物 |
| 2.1.3 实验仪器和耗材 |
| 2.1.4 分子生物学常用试剂及抗体 |
| 2.1.5 细胞生物学常用试剂 |
| 2.1.6 常用溶液及培养基配制 |
| 2.1.7 实验分析软件和网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞基因组快速提取 |
| 2.2.2 微量细胞及多量细胞RNA提取 |
| 2.2.3 细胞蛋白质提取 |
| 2.2.4 感受态细胞转化及单克隆挑取 |
| 2.2.5 PCR反应条件、体系及电泳条件 |
| 2.2.6 PCR产物纯化及浓缩 |
| 2.2.7 限制性内切酶反应体系、胶回收及连接反应 |
| 2.2.8 质粒DNA小量及大量提取 |
| 2.2.9 反转录及荧光实时定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.2.10 蛋白质浓度测定及Western Blot |
| 2.2.11 多能性干细胞体外培养 |
| 2.2.12 多能性干细胞体外转染及流式细胞分析分选 |
| 2.2.13 免疫荧光染色 |
| 2.2.14 人β细胞体外分化及聚合实验 |
| 2.2.15 KCl刺激的Insulin分泌及细胞内总Insulin收集实验 |
| 2.2.16 酶联免疫吸附分析 |
| 2.2.17 人β细胞小鼠体内实验 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 利用多能性干细胞和定向分化技术制备病人特异性胰腺祖细胞和β细胞 |
| 3.1.1 病人诱导多能性干细胞的建系与培养 |
| 3.1.2 构建CRISPR/Cas9基因编辑与定点修饰质粒 |
| 3.1.3 构建多能性干细胞定向分化制备胰腺祖细胞和β细胞技术 |
| 3.2 利用人多能性干细胞定向分化技术构建内质网应激介导的糖尿病模型 |
| 3.2.1 构建病人诱导多能性干细胞系及其遗传性PERK基因突变的鉴定 |
| 3.2.2 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术修复PERK遗传突变 |
| 3.2.3 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PERK突变的胚胎干细胞系 |
| 3.2.4 PERK野生与突变型细胞分化能力比较分析 |
| 3.2.5 PERK野生型与突变型的β细胞的功能比较分析 |
| 3.2.6 PERK野生型与突变型的β细胞的转录组比较分析 |
| 3.3 利用人多能性干细胞定向分化技术和基因编辑技术修复单基因型糖尿病 |
| 3.3.1 病人多能性干细胞中INS基因突变鉴定 |
| 3.3.2 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术修复病人iPSCs的INS遗传突变 |
| 3.3.3 利用多能性干细胞胰腺定向分化技术比较突变与修复细胞的分化能力 |
| 3.3.4 INS突变与修复的β细胞中内质网应激通路的比较分析 |
| 3.3.5 INS突变与修复的β细胞体外功能的比较分析 |
| 3.3.6 INS突变与修复的β细胞在小鼠体内功能的比较分析 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 制备人遗传性异常内质网应激反应介导的糖尿病模型 |
| 4.2 利用CRISPR/Cas9技术纠正新发现的INS突变并修复糖尿病表型 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录一 实验所用引物序列 |
| 附录二 CRISPR/Cas9系统gRNA及ssDNA |
| 附录三 抗体稀释比例 |
| 附录四 基因序列 |
| 个人简介 |
四、瑞典科学家用细胞移植治疗糖尿病（论文参考文献）
- [1]MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的作用研究[D]. 李碧欣. 汕头大学, 2021(02)
- [2]线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响[D]. 于海滨. 吉林大学, 2020
- [3]人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究[D]. 杨玉花. 苏州大学, 2020(06)
- [4]利用基因编辑和干细胞技术进行人胰腺分化及糖尿病预防和治疗研究[D]. 马晓洁. 浙江大学, 2020(08)
- [5]褪黑素通过调控成骨/破骨分化平衡延缓骨质疏松症进程的机制研究[D]. 王超炜. 浙江大学, 2020(01)
- [6]初步探讨P-糖蛋白过表达对胰岛β细胞生物表型影响的机制[D]. 陈亚. 天津医科大学, 2019(02)
- [7]利用β细胞体外分化与CRISPR技术模拟和修复人糖尿病的研究[D]. 马双羽. 中国农业大学, 2018(02)
- [8]2015年生命科学热点回眸[J]. 吴晓丽. 科技导报, 2016(01)
- [9]2010年下半年生命科学、生物技术研究动态（国外篇）[J]. 赵贵英,张树庸. 生物产业技术, 2011(03)
- [10]2008年国内外生物技术研究进展（上）——干细胞、人造生命、器官移植[J]. 张树庸,赵贵英. 生物产业技术, 2009(03)